CN110438108B

CN110438108B - 一种β-琼胶酶及其基因与应用

Info

Publication number: CN110438108B
Application number: CN201910657356.5A
Authority: CN
Inventors: 产竹华; 易志伟; 陈兴麟; 金敏; 曲武; 曾润颖
Original assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); Third Institute of Oceanography MNR
Current assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); Third Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2039-07-19
Also published as: CN110438108A

Abstract

本发明涉及一种β‑琼胶酶及其基因与应用，该β‑琼胶酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。编码所述β‑琼胶酶的基因来源于海洋沉积物微生物宏基因组测序数据集，本发明对该酶进行了异源表达与纯化，经检测，该酶可催化琼胶降解为新琼四糖和新琼六糖，具有广泛的温度作用范围和pH作用范围，且在50℃条件下保温超过20h或在pH为5.0‑10.0的缓冲液中温浴60h仍保持较强的水解性能，具有较高的稳定性。本发明提供的β‑琼胶酶具有良好的实用性，为琼胶水解及新琼寡糖的工业生产提供了优异的基因资源和酶资源，具有广泛的应用前景。

Description

一种β-琼胶酶及其基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种β-琼胶酶及其基因与应用。

背景技术

琼胶是一类从海洋红藻中提取得到的多糖衍生物。通过一定方式可以将大分子的琼胶多糖降解为小分子的琼胶寡糖，而琼胶寡糖具有包括抗炎、抗癌、美白、抗氧化等在内的许多重要生物学活性，在食品、药品及化妆品领域都有着重要的应用价值。

琼胶酶(Agarase)是能够催化水解琼胶多糖，形成聚合度为2-10的琼胶寡糖的一类多糖降解酶的总称。在自然环境中，琼胶酶的分布比较广泛，很多微生物和一些海洋软体动物都能产生琼胶酶。目前报道的琼胶酶大多来自海洋细菌，包括弧菌属、假单胞菌属、假交替单胞菌属、交替单胞菌属、食琼脂菌属、噬糖菌属、微颤菌属和假左贝尔氏菌属等。另外，从土壤和淡水中也发现了一些能够产生琼脂酶的细菌，如纤维弧菌属、不动杆菌属、芽孢杆菌属、噬细胞菌属等。

根据琼胶酶降解琼脂糖作用方式不同，可以把琼脂酶分为两大类：α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶裂解琼脂糖的α-1,3糖苷键，生成以β-D-半乳糖作为非还原性末端和以3,6-内醚-α-L-半乳糖作为还原性末端的琼寡糖系列；而β-琼胶酶裂解琼脂糖的β-1,4糖苷键，生成以β-D-半乳糖作为还原性末端和以3,6-内醚-α-L-半乳糖为非还原性末端的新琼寡糖系列。

β-琼胶酶在新琼寡糖的生物法制备中发挥关键作用，但是，目前研究中所报道的β-琼胶酶的热稳定性及pH稳定性较差，使得大部分β-琼胶酶在高温或复杂pH下作用较短时间后便丧失大部分酶活性，这限制了该类酶在新琼寡糖工业生产中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高稳定性的β-琼胶酶及其基因与应用。该β-琼胶酶的基因(命名为agaM2)来源于海洋沉积物微生物宏基因组测序数据集，该酶可催化琼胶降解为新琼四糖和新琼六糖，且具有广泛的温度作用范围和pH作用范围，具有较高的稳定性。

为此，第一方面，本发明提供一种β-琼胶酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

第二方面，本发明提供一种基因，其编码所述β-琼胶酶。

进一步，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

第三方面，本发明提供一种核酸构建体，其包含本发明所述的基因。

第四方面，本发明提供一种细胞，其表达本发明所述的β-琼胶酶，和/或包含本发明所述的基因或核酸构建体。

进一步，所述细胞可为原核细胞或真核细胞。

进一步，所述细胞包括但不限于：大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、乳酸杆菌细胞、放线菌细胞、酵母菌细胞或藻类细胞等。

第五方面，本发明提供一种生产β-琼胶酶的方法，其包括以下步骤：在允许表达所述β-琼胶酶的条件下培养本发明所述的细胞；和从所得培养物中纯化β-琼胶酶。

第六方面，本发明提供所述β-琼胶酶在琼胶水解和/或获得新琼寡糖中的应用。

本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了一种β-琼胶酶(命名为rAgaM2)，该酶可催化琼胶降解为新琼四糖和新琼六糖。

(2)本发明提供的β-琼胶酶的最适作用温度为50℃，且在30℃-60℃的温度范围内均能保持较强的琼胶酶水解活性，具有较宽的温度作用范围；最适作用pH值为7.0，在6.0-9.0的pH范围内仍能保持较强的琼胶酶水解活性，具有广泛的pH作用范围。

(3)本发明提供的β-琼胶酶具有良好的热稳定性，在50℃条件下保温超过20h，依然可保持50％以上的相对活性；具有良好的pH稳定性，在pH为5.0-10.0的缓冲液中温浴60h仍保持较强的水解性能，表明本发明提供的β-琼胶酶可以在pH复杂的实际生产过程中保持酶活性。

综上，本发明提供的β-琼胶酶具有良好的实用性，为琼胶水解及新琼寡糖的工业生产提供了优异的基因资源和酶资源，具有广泛的应用前景。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：

图1为重组β-琼胶酶rAgaM2纯化后的SDS-PAGE电泳图；

图2为TLC法鉴定rAgaM2蛋白降解琼胶的产物；

图3为温度对rAgaM2蛋白的相对酶活的影响；

图4为pH对rAgaM2蛋白的相对酶活的影响；

图5为rAgaM2蛋白的热稳定性检测结果；

图6为rAgaM2蛋白的pH稳定性检测结果。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

除非另外定义，本公开中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1β-琼胶酶基因agaM2基因的获取

本实施例的β-琼胶酶基因通过分析海洋沉积物微生物宏基因组测序数据集得到，命名为agaM2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列。对agaM2基因进行全序列合成，即得到β-琼胶酶基因agaM2基因。

实施例2agaM2基因的克隆表达

将实施例1合成的agaM2基因连接至pEASy^@-Blunt E1载体(购自全式金)，连接方法按照载体的说明书进行，获得pEASy-agaM2重组载体；将获得的重组载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养平板上，37℃培养过夜；将阳性克隆接种至含有100μg/mL氨苄青霉素和0.7％葡萄糖的2×YT液体培养基中，37℃培养至菌液OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为1mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在25℃条件下，经10h诱导目的蛋白rAgaM2的表达。

实施例3rAgaM2蛋白的分离纯化

离心收集实施例2诱导表达得到的菌体，重悬于裂解缓冲液(0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)中进行裂解，将裂解得到的悬液在4℃条件下以4000rpm，20min进行离心，收集上清液。将上清液与预先与NiSO₄结合的R10-Flammable(购自GEHealthcare)混匀，用浓度为200mM的咪唑进行洗脱，即得重组β-琼胶酶rAgaM2蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，进行SDS-PAGE电泳分析，电泳检测结果见图1，第3泳道即为纯化后的rAgaM2蛋白，其大小与预计分子量一致(83.5kD)。

实施例4功能验证

通过薄层层析(TLC)的方法对β-琼胶酶rAgaM2的酶解产物进行鉴定，具体操作方法如下：

将10μL实施例3制备得到的rAgaM2蛋白纯化液与240μL 0.2％(w/v)琼胶溶液混合，将酶水解后不同时间点(0min、20min、40min和60min)的产物通过100℃水浴灭活其中的琼胶酶，再将水解产物和新琼寡糖标准品点样于TLC硅胶板(Silica Gel 60，德国默克)，将吹干后的硅胶板置于展层液(正丁醇：乙酸：水＝2：1：1，v/v/v)中，直至展层液到达距硅胶板上沿1-2cm时取出吹干。均匀喷涂10％的硫酸溶液后，置于100℃下加热至样品显色。

所得结果如图2所示，图2中1、2道依次分别为新琼四糖和新琼六糖的标准品，3-6道依次分别为琼胶酶在0min、20min、40min和60min时的降解产物。由图2可见，重组琼胶酶rAgaM2作用于琼胶的降解产物为新琼四糖和新琼六糖。

实施例5温度及pH对rAgaM2活性的影响

本实施例检测温度及pH值对rAgaM2活性的影响。rAgaM2的相对酶活检测步骤如下：将10μL实施例3制备得到的rAgaM2蛋白纯化液与240μL 0.2％(w/v)琼胶溶液混合，于不同温度、pH下水浴20min后，100℃金属浴10min灭活蛋白；加入750μL DNS溶液(酒石酸钾钠18.2g，3，5-二硝基水杨酸0.63g，NaOH 2.1g，苯酚0.5g，加蒸馏水至100mL)，混匀后于100℃金属浴10min，再置于冰上3min；最后使用紫外分光光度计在550nm波长下测定吸光值，并以此计算还原糖含量。琼胶酶酶活(U)定义为：一定条件下，每分钟生成1μmol还原糖所需的酶量。在最适条件下的相对酶活定义为100％，并据此确定温度及pH对rAgaM2活性的影响。检测结果见图3和图4所示。

由图3可知，β-琼胶酶rAgaM2在30℃-60℃的温度范围内均能保持较强的琼胶酶水解活性，具有较宽的温度作用范围；由图4可知，其在6.0-9.0的pH范围内仍能保持较强的琼胶酶水解活性，具有广泛的pH作用范围。

实施例6稳定性检测

对rAgaM2蛋白的热稳定性和pH稳定性分别进行检测。具体如下：

(1)将实施例3纯化得到的rAgaM2蛋白纯化液分别在40℃和50℃进行保温，在保温后的不同时间点(0h、10h、20h、30h、40h、50h、60h)，检测经保温的rAgaM2蛋白的相对酶活，检测方法同实施例5所述的酶活检测步骤。检测结果见图5所示，由图5可知，rAgaM2蛋白具有良好的热稳定性，在50℃条件下保温超过20h，依然可保持50％以上的相对活性。

(2)将实施例3制备得到的rAgaM2蛋白纯化液分别在以下pH值的缓冲液中温浴：pH＝4、5、6、7、8、9、10，在温浴后的不同时间点(3h、6h、12h、24h、36h、60h)，检测经缓冲液温浴的rAgaM2蛋白的相对酶活，检测方法同实施例5所述的酶活检测步骤。检测结果见图6所示，由图6可知，rAgaM2蛋白具有良好的pH稳定性，在pH为5.0-10.0的缓冲液中温浴60h仍保持较强的水解性能，表明本发明提供的β-琼胶酶可以在pH复杂的实际生产过程中保持酶活性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 自然资源部第三海洋研究所

中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）

<120> 一种β-琼胶酶及其基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 737

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Arg Asn Ile Leu Val Leu Ile Gly Ile Ala Leu Tyr Leu Phe

1 5 10 15

Pro Gly Gln Gly His Ser Gln Val Ala Val Asp Val Asn Met Asn Val

20 25 30

Lys His Ile Val Gly Gly Lys Ser Glu Phe Asp Arg Ser Lys Tyr Ile

35 40 45

Val Leu His Ala Gly Leu Gly Asp Gly Glu Trp Pro Asn Arg Thr Met

50 55 60

Glu Asp Thr Phe Leu Val Asn Tyr Asp Ala Tyr Leu Gly Arg Leu Asn

65 70 75 80

Gly Lys Leu Pro Ser Ile Ile Lys Lys Val Lys Glu Asp Pro Asn Lys

85 90 95

Pro Gly Trp Pro Gln Ile Asp Asp Ile Ile Thr Glu Gly Ala Gln Met

100 105 110

Arg Ala Asp Tyr Ala Ala Lys Thr Ser Ile Gln Lys Asn Glu Ser Arg

115 120 125

Asn Leu Leu Met Ile Gly Gly Gln Glu Gly Asn Tyr Pro Ser Gly Glu

130 135 140

Pro Ile Ala Thr Cys Cys Gly Ile Thr Pro Trp Thr Val Ala Ser Asn

145 150 155 160

Glu Ser Ala Ala Glu Tyr Tyr Ala His Phe Ile Lys Glu Ala Tyr Gly

165 170 175

Ser Gly Gly Ser Thr Gly Glu Ala Arg Pro Gln Tyr Val Glu Val Ile

180 185 190

Asn Glu Pro Met Val Lys Ala Lys Thr Leu Asn Thr Thr Lys Glu Asp

195 200 205

Ile Ser Arg Phe His Ala Ala Val Ala Lys Arg Val Lys Glu Leu Asn

210 215 220

Pro Glu Val Lys Val Gly Gly Phe Thr Asp Ala His Val Gln Phe Glu

225 230 235 240

Asn Gly Thr Pro Glu Phe Ser Leu Trp Asn Asp Asn Trp Lys Gln Phe

245 250 255

Ile Asp Ile Ala Gly Ala Asp Met Asp Phe Tyr Ser Met His Ile Tyr

260 265 270

Asp Thr His Lys Lys Gly Thr Glu Ile Thr Asp Tyr Arg Ala Gly Ser

275 280 285

Asn Ile Glu Ala Leu Phe Asp Met Ile Glu Thr Tyr Ser Lys Leu Lys

290 295 300

Leu Asn Glu Val Lys Pro Phe Ile Ile Ser Glu Tyr Gly Phe Tyr Lys

305 310 315 320

Pro Asn Phe Ile Cys Thr Ala Tyr Ser Arg Glu Leu Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Leu Arg Ser Tyr Ser Ser Met Met Met Gln Phe Met Glu Lys Pro Asp

340 345 350

Leu Ile Ala Lys Ala Ile Pro Phe Met Ile Leu Lys Ala Arg Trp Phe

355 360 365

Thr Pro Pro Ala Ser Asn Pro Asp Ala Ile Tyr Met Tyr Arg Leu Leu

370 375 380

Arg Gln Lys Asn Glu Val Ala Gly Glu Thr Gly Thr Asp Trp Val Phe

385 390 395 400

Thr Asp Phe Val Lys Phe Phe Gln Leu Trp Ser Asp Val Lys Gly Thr

405 410 415

Arg Ile Asp Thr Lys Pro Tyr Asp Leu Asp Ile Gln Val Asp Ala Tyr

420 425 430

Val Asp Gly Lys Lys Met Tyr Leu Ile Leu Asn Asn Leu Glu Leu Ser

435 440 445

Ala Gln Asn Ile Asp Leu Asn Leu Val Asp Thr Lys Asn Asn Thr Ile

450 455 460

Glu Lys Ile Arg Met Lys His Leu His Glu Val Asn Lys Val Gly Val

465 470 475 480

Leu Asp Glu Lys Glu Leu Asp Ile Asn Thr Thr Thr Ile Asn Leu Gly

485 490 495

Lys Glu Ala Thr Met Ile Leu Glu Tyr Thr Phe Ser Asn Asp Ile Val

500 505 510

Ile Asp Glu Thr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Tyr Ala Asn Thr Tyr Leu

515 520 525

Lys Pro Ile Ser Ala Gly Gln Thr Asn Ser Phe Lys Phe Lys Thr Ser

530 535 540

Glu Leu Ser Lys Asn Glu Tyr Gly Glu Met Val Ile Arg Leu Gly Ile

545 550 555 560

Gly Arg Asn His Pro Thr Val Ala Glu Gln Phe Val Tyr Pro Lys Val

565 570 575

Ser Phe Asn Gly Thr Glu Ile Gln Val Pro Lys Asp Trp Arg Gly Tyr

580 585 590

Asn Gln Asn Thr Arg Asp Arg Phe Phe Gly Val Leu Glu Ile Pro Val

595 600 605

Pro Tyr Asp Leu Ile Asp Met Asn Arg Val Glu Asn Thr Val Asp Ile

610 615 620

Ser Phe Ser Gln Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Val Val Leu Gln Lys

625 630 635 640

Phe Asp Phe Ser Thr Asp Leu Lys Arg Lys Thr Asp Val Ser Val Lys

645 650 655

Asp Ile Arg Asp Lys Lys Lys Ile Asn Ile Tyr Pro Asn Pro Ala Ser

660 665 670

Asp Thr Ile Glu Leu Ser Gly Glu Leu Pro Ile Gly Gly Lys Ala Tyr

675 680 685

Phe Tyr Asp Ile Ser Gly Lys Leu Val Lys Glu Thr Gln Leu Asn Gly

690 695 700

Gln Asn Gln Thr Ile Asp Ile Ala Asn Leu Lys Gln Gly Thr Tyr Val

705 710 715 720

Leu Lys Val Ser Gly Asp Arg Ile Ser Asn Gly Leu Lys Phe Ile Lys

725 730 735

Gln

<210> 2

<211> 2214

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaaagaa acattttagt acttatcgga atcgcacttt atctgtttcc cggccaaggc 60

cattctcagg ttgctgttga tgttaatatg aatgtaaaac acatcgtagg tgggaaatca 120

gaattcgaca ggtctaaata tattgtcctt catgcaggtt taggagatgg cgaatggccc 180

aaccgaacta tggaagatac ttttttggta aactacgatg catacttagg caggttgaac 240

ggcaaattgc ctagtattat taaaaaggtt aaggaagatc ccaacaaacc cggatggccc 300

caaattgacg atataataac agagggtgct caaatgcgcg ctgattatgc agctaaaaca 360

agcatacaaa aaaatgaaag ccgaaatctt ttaatgattg gtggtcagga aggtaattat 420

ccttccggtg agccaatagc cacttgttgt ggaattacac catggacagt tgcaagtaat 480

gagtctgcgg ccgagtatta tgcccacttc attaaagaag catacggcag tggcgggtca 540

accggagaag caaggcctca atatgttgaa gtgattaacg aaccaatggt taaggcaaaa 600

acattgaaca caaccaaaga ggacatttcc agattccacg cagctgtagc taagagagtc 660

aaagaattaa acccggaagt aaaggttggt ggctttactg acgctcatgt acagtttgaa 720

aacggaactc cagaatttag tttatggaat gataactgga aacaatttat tgatatagca 780

ggtgccgata tggattttta ttccatgcat atttacgata cccacaaaaa gggaaccgag 840

attactgatt accgtgccgg aagtaatata gaagccttat ttgatatgat tgaaacatat 900

agtaagctga agctaaacga ggtgaagcct tttatcattt ccgaatacgg tttttacaaa 960

cctaatttta tatgcaccgc atattcccgc gaactggatt ggcttaattt aaggtcttat 1020

tcctctatga tgatgcaatt tatggagaag cccgacttga tagccaaggc catccctttt 1080

atgattttaa aggcaagatg gtttacgcca ccagcaagca atccggatgc aatttatatg 1140

tatcgtttat tacgccaaaa aaatgaagtg gcaggggaaa ccggcactga ttgggtattc 1200

accgactttg ttaagttttt ccaactgtgg agcgatgtta aaggtacgag aatagatacc 1260

aaaccatacg atttagatat tcaggtggat gcgtatgttg atggaaaaaa gatgtactta 1320

attttaaaca accttgaact gagtgctcaa aatattgatt tgaatcttgt agatactaaa 1380

aacaatacga ttgaaaaaat aagaatgaaa caccttcatg aggtgaataa agtaggcgtt 1440

ttggatgaaa aggaattgga cataaataca actacaatta acctaggcaa agaagcgaca 1500

atgatattgg agtatacatt cagtaatgat atcgtaattg atgaaacatt aaccgaaact 1560

aaaatatacg ctaatactta cctgaaacct atttctgccg gtcaaaccaa tagttttaag 1620

ttcaaaacaa gcgaattatc gaaaaacgaa tatggagaaa tggttatccg tctgggtata 1680

ggtcgcaacc atccgacagt agccgaacaa tttgtatacc caaaagtatc ctttaacggc 1740

accgaaattc aggtaccaaa agattggcgt ggttacaatc aaaatacaag agatagattt 1800

ttcggagttt tggagatccc tgttccatac gatttaattg atatgaatcg tgtagaaaat 1860

actgttgata tttcattttc tcaaagtgga ggttcaataa gtagtgtggt gttacaaaag 1920

tttgatttca gtaccgattt gaaaagaaag actgatgtat ctgttaaaga tattagagac 1980

aaaaaaaaaa taaacatcta tccaaatcct gcatctgata caattgaact ttcaggagaa 2040

ttaccaatag gtggcaaagc atatttttat gatatttcag gaaaacttgt aaaagaaacg 2100

caactaaacg gtcaaaatca gacaattgat attgctaact taaaacaagg aacatatgtt 2160

ttgaaagtat ccggtgacag aattagtaac gggttgaaat ttataaaaca ataa 2214

Claims

1.一种β-琼胶酶，其特征在于，所述β-琼胶酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的β-琼胶酶。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包含权利要求2或3所述的基因。

5.一种细胞，其特征在于，所述细胞表达权利要求1所述的β-琼胶酶，和/或包含权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的核酸构建体。

6.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞为原核细胞或真核细胞。

7.如权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、乳酸杆菌细胞、放线菌细胞、酵母菌细胞或藻类细胞。

8.一种β-琼胶酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：在允许表达权利要求1所述β-琼胶酶的条件下培养权利要求5-7任一项所述的细胞；和从所得培养物中纯化β-琼胶酶。

9.如权利要求1所述的β-琼胶酶在琼胶水解和/或获得新琼寡糖中的应用。