KR101864350B1 - 베타-아가레이즈, 카파-카라기나아제 및 무수갈락토시다아제를 함유하는 효소 복합체 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 키메릭 카파-카라기나아제 및 키메릭 베타-아가레이즈 및 키메릭 무수갈락토시다아제를 함유하는 효소 복합체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 베타-아가레이즈와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 베타-아가레이즈, 카파-카라기나아제와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 카파-카라기나아제, 무수갈락토시다아제와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 무수갈락토시다아제 및 소형 셀룰로즈-결합 단백질 A가 결합 되어 있는 효소 복합체 및 이를 이용한 홍조류 바이오매스의 분해 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 아가 분해 생산물 제조에 있어서 물리적, 화학적 전처리 공정에 의존하였던 기존의 방식에서 엔자임을 이용한 분해 공정을 도입함으로써 뛰어난 효율성, 생산물의 제어, 간편한 활용성, 저비용 고효율의 친환경적 분해 시스템을 이용하여 해양조류부터 가치 있는 생산물을 효율적으로 전환하는데 크게 기여할 것으로 기대된다.
본 발명에 따르면, 아가 분해 생산물 제조에 있어서 물리적, 화학적 전처리 공정에 의존하였던 기존의 방식에서 엔자임을 이용한 분해 공정을 도입함으로써 뛰어난 효율성, 생산물의 제어, 간편한 활용성, 저비용 고효율의 친환경적 분해 시스템을 이용하여 해양조류부터 가치 있는 생산물을 효율적으로 전환하는데 크게 기여할 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 키메릭 카파-카라기나아제 및 키메릭 베타-아가레이즈 및 키메릭 무수갈락토시다아제를 함유하는 효소 복합체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 베타-아가레이즈와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 베타-아가레이즈, 카파-카라기나아제와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 카파-카라기나아제, 무수갈락토시다아제와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 무수갈락토시다아제 및 소형 셀룰로즈-결합 단백질 A가 결합 되어 있는 효소 복합체 및 이를 이용한 홍조류 바이오매스의 분해 방법에 관한 것이다.
한천(agar)은 홍조류의 세포벽에서 주로 발견되는 다당류로, 일종의 식이섬유원이며, 주로 미생물 배양을 위한 고체 배지에 사용되고, 제과, 제육가공에서는 안정제로 사용되며, 화장품이나 음식물에서는 겔화제로 사용되기도 한다. 이러한 아가는 약 70%의 아가로스(agarose)와 약 30%의 아가로펙틴(agaropectin)으로 구성되어 있다. 상기 아가로스는 중성 다당류로서, 아가로스 내에는 갈락토스(galactose)간의 α-1,3 결합과 β-1,4 결합이 번갈아 존재하고 있다. 한편, 아가로펙틴은 산성 다당류로서, 아가로펙틴은 아가로스에 황산기, 구체적으로 황산염, 글루콘 산(gluconic acid)이나 피루베이트(pyruvate)가 결합된다. 아가로스 이외 홍조류의 다른 구성물 중 카라기난(Carrageenan)은 선형 다당류로서 갈락토스 잔기로 연결된 갈락탄 구성물인데, 보다 정확하게는 α-1,3 결합과 β-1,4 결합이 번갈아가며 결합된 갈락토스 잔기가 연결된 갈락탄이다. 그 구조적으로는 아가로스와 동일하나, 3,6-anhydro-D-galactose와 sulphate ester 그룹이 모든 혹은 몇몇 갈락탄 유닛에 결합되어 있는 형태가 나타나며, 잔기의 위치에 따라 구조적인 변형이 되는 것이 차이점이다. 대표적인 이상화된 구조로는 카파(Kappa), 아이오타(Iota), 람다(Lambda)구조가 있다.
한천을 분해하는 효소인 아가레이즈는 아가로스의 갈락토스 중합체 내의 β-1,4 결합을 분해하여 네오아가로올리고당으로 가수분해하여 이당 혹은 삼당의 갈락토스 잔기를 만들어내며, 카파-카라기난을 분해하는 효소인 카파-카라기나아제는 카파-카라기난의 3-,4-결합 갈락토스 유닛을 끊어냄으로 이당류의 카라기난 잔기를 만들어낸다.
또한, 신규 효소 무수갈락토시다아제는 베타-아가레이즈와 카파-카라기나아제 효소로 가수분해된 가수분해물인 네오아가로올리고당의 1,3-α-3,6-l-galacosidic 결합을 끊어내는 역할을 하여 단당류로 분해시킴으로써 발효가능 당 전환이 가능하다.
한편, 목질계 섬유소는 식물의 세포벽의 구성 성분이며 셀룰로즈와 헤미셀룰로즈의 복합체로 이루어져 있다. 셀룰로즈는 β-1,4-glucose 복합체이며 자연상태에서 가장 풍부한 재생 가능한 물질이다(Reiter et al. CurrOpinPlant Biol 5: 536, 1998). 비록 화학적 구성은 단순하지만 효율적으로 셀룰로즈를 분해하기 위해서는 여러 개의 다른 효소들의 작용이 필요하다(Ximenes et al. Hemicellulases and biotechnology. Recent Res Develop Microbiol 2:165, 1998). 헤미셀룰로즈에는 β-1.4-xylose인 자일란과 β-1,4 glucose, mannose인 글루코만난 등이 있다. 대부분의 셀룰로즈를 분해 할 수 있는 혐기성 미생물들은 셀룰로좀이라는 효소복합체를 형성한다(Roy H. Doi, The Chemical Record 1:24, 2001). 셀룰로좀은 결정형 셀룰로즈나 자일란, 만난, 펙틴과 같은 다양한 기질에 대하여 작용하고 셀룰로좀 형성 효소들과 지지체 단백질로 이루어져 있다. 셀룰로좀의 형성은 하나의 셀룰로좀 형성 효소의 도커린 모듈과 지지체 단백질의 여러 개의 코히신 모듈 중 하나의 결합으로 이루어진다. 모든 셀룰로좀 형성 효소들은 도커린 모듈을 가지고 있고 도커린 모듈이 없는 효소들은 비셀룰로좀 형성 효소이다(Bayer et al. Annual Review of Microbiol 58:521, 2004).
기존 기술에서는 한천 분해효소 베타-아가레이즈를 이용한 효소 복합체를 통해 한천 분해능을 증진한 연구와 카라기난 분해효소인 카파-카라기나아제와 람다-카라기나아제를 이용한 효소 복합체를 통해 카라기난 분해능을 증진한 것을 선행연구로 다루고 있다.
이에, 본 발명자들은 기존 효소들과 신규 효소의 조합으로 고활성 가수분해 효소 복합체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 베타-아가레이즈, 카파-키라가나아제 및 무수갈락토시다아제를 함유하는 효소 복합체가 높은 홍조류 바이오매스 분해능을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 베타-아가레이즈, 카파-카라기나아제 및 무수갈락토시다아제를 함유하는 홍조류 바이오매스 분해능이 우수한 효소 복합체를 제공하는데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 효소 복합체를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물을 제공하는데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 효소 복합체의 제조방법을 제공하는데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 효소 복합체를 이용하여 홍조류 바이오매스를 분해하는 방법을 제공하는데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 베타-아가레이즈와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 베타-아가레이즈, 카파-카라기나아제와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 카파-카라기나아제, 무수갈락토시다아제와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 무수갈락토시다아제 및 소형 셀룰로즈-결합 단백질 A가 결합 되어 있는 효소 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 베타-아가레이즈와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 베타-아가레이즈를 코딩하는 유전자, 카파-카라기나아제와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 카파-카라기나아제를 코딩하는 유전자, 무수갈락토시다아제와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 무수갈락토시다아제를 코딩하는 유전자 및 소형 셀룰로즈-결합 단백질 A를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 효소 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 효소 복합체를 이용하여 홍조류 바이오매스를 분해하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 아가 분해 생산물 제조에 있어서 물리적, 화학적 전처리 공정에 의존하였던 기존의 방식에서 효소 복합체를 이용한 분해 공정을 도입함으로써 뛰어난 효율성, 생산물의 제어, 간편한 활용성, 저비용 고효율의 친환경적 분해 시스템을 이용하여 해양조류부터 가치 있는 생산물을 효율적으로 전환하는데 크게 기여할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에서 제시된 키메릭 카파-카라기나아제, 키메릭 베타-아가레이즈, 키메릭 무수갈락토시다아제 유전자 및 소형 골격 단백질 miniCbpA 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pET22(+)cCgkA, pET22(+)cAgaB, pET22(+)cAhgA 및pET22b(+)mCbpA의 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 제시된 키메릭 제조합 백터 pET22b(+)cCgkA, pET22b(+)cAgaB, pET22b(+)cAhgA 및 pET22b(+)mCbpA의 크기를 확인한 SDS-PAGE 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 A는 소형 골격 단백질 miniCbpA의 셀룰로즈 결합 모듈(Cellulose binding module;CBM)을 이용한 정제결과를 나타낸 것이고, B는 Ni-NTA(Nickel-nitrilotriacetic acid;NTA)를 이용한 정제 결과를 나타낸 것이다. 또한, C는 다양한 조합의 가수분해 효소 복합체의 크기를 확인하기 위한 Non-denaturing PAGE 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 4의 A는 다양한 조합의 가수분해 효소 복합체의 아가와 카라기난 기질에서의 환원당 측정 결과를 나타낸 것이며, B는 다양한 조합의 가수분해 효소 복합체의 아가 기질에서의 환원당 측정 결과를 나타낸 것이다. 또한, C는 다양한 조합의 가수분해 효소 복합체의 카라기난 기질에서의 환원당 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 A는 아가와 카라기난 기질에서, 혹은 아가 기질에서, 혹은 카라기난 기질에서의 mCbpA, cCgkA, cAgaB 및 cAhgA 조합의 가수분해 효소 복합체를 이용한 환원당 생산 평균을 단합체효소(monomeric enzyme)를 이용한 환원당 생산 평균과 비교한 결과를 나타낸 것이며, B는 아가와 카라기난 기질에서의 mCbpA, cCgkA, cAgaB 및 cAhgA 조합의 가수분해 효소복합체를 이용한 환원당 생산값을 단합체효소(monomeric enzyme) cAgaB를 이용한 환원당 생산값과 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 전체적인 공정 전략도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 제시된 키메릭 제조합 백터 pET22b(+)cCgkA, pET22b(+)cAgaB, pET22b(+)cAhgA 및 pET22b(+)mCbpA의 크기를 확인한 SDS-PAGE 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 A는 소형 골격 단백질 miniCbpA의 셀룰로즈 결합 모듈(Cellulose binding module;CBM)을 이용한 정제결과를 나타낸 것이고, B는 Ni-NTA(Nickel-nitrilotriacetic acid;NTA)를 이용한 정제 결과를 나타낸 것이다. 또한, C는 다양한 조합의 가수분해 효소 복합체의 크기를 확인하기 위한 Non-denaturing PAGE 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 4의 A는 다양한 조합의 가수분해 효소 복합체의 아가와 카라기난 기질에서의 환원당 측정 결과를 나타낸 것이며, B는 다양한 조합의 가수분해 효소 복합체의 아가 기질에서의 환원당 측정 결과를 나타낸 것이다. 또한, C는 다양한 조합의 가수분해 효소 복합체의 카라기난 기질에서의 환원당 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 A는 아가와 카라기난 기질에서, 혹은 아가 기질에서, 혹은 카라기난 기질에서의 mCbpA, cCgkA, cAgaB 및 cAhgA 조합의 가수분해 효소 복합체를 이용한 환원당 생산 평균을 단합체효소(monomeric enzyme)를 이용한 환원당 생산 평균과 비교한 결과를 나타낸 것이며, B는 아가와 카라기난 기질에서의 mCbpA, cCgkA, cAgaB 및 cAhgA 조합의 가수분해 효소복합체를 이용한 환원당 생산값을 단합체효소(monomeric enzyme) cAgaB를 이용한 환원당 생산값과 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 전체적인 공정 전략도를 나타낸다.
본 발명에서는 한천 분해효소인 베타-아가레이즈와 카라기난 분해효소인 카파-카라기나아제와 함께 신규 효소인 무수갈락토시다아제를 이용한 효소 복합체를 통해 한천 분해에 더욱 효과적인 가수분해능을 갖도록 하는 연구를 진행하였다. 기존 기술에서 개발된 효소복합체는 효소-기질 특이성에 의한 제한된 기질에서의 각각의 가수분해 활성을 보였다면, 본 발명에서는 선행 연구를 통해 개발된 복합체 기술을 응용하여 한천 가수분해를 서로 다른 효소들의 단계적인 가수분해 과정을 통하여 기존 기술 결과보다 향상된 가수분해능을 가진 고활성 가수분해 효소 복합체 기술을 보여준다. 따라서 본 발명에 따른 고활성 가수분해 효소 복합체를 이용하여 저부가가치의 한천을 고부가가치의 발효성 단당과 무수갈락토오스로의 효율적인 전환의 가능성을 제시한다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 베타-아가레이즈와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 베타-아가레이즈, 카파-카라기나아제와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 카파-카라기나아제, 무수갈락토시다아제와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 무수갈락토시다아제 및 소형 셀룰로즈-결합 단백질 A가 결합되어 있는 효소 복합체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 상기 무수갈락토시다아제는 조벨리아 갈락토니보란스(zobellia galactanivorans) 또는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 또는 아가리보란스 길버스(Agarivorans gilvus)로부터 유래한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 클로스트리디움 속 균주의 도커린 모듈이란 클로스트리디움 속의 셀룰로즈-결합 단백질의 일부분인 코히즌 모듈과의 상호작용으로 효소 복합체인 셀룰로좀을 형성하는 섬유소 분해효소인 셀룰라아제(cellulosomal cellulase) 단백질이 가지는 모듈을 의미한다.
본 발명에서 소형 셀룰로즈-결합 단백질 A는(mCbpA)는 셀룰로좀 기본골격 소단위체를 만드는 셀룰로즈에 결합하는 단백질을 의미하며, 본 발명에서 사용한 소형 셀룰로즈-결합 단백질 A는 mCbpA란 클로스트리디움 속의 셀룰로즈-결합 단백질의 하나인 셀룰로즈-결합 단백질-에이(CbpA) 중에서 하나의 셀룰로즈 결합 모듈(Cellulose binding module; CBM)과 두 개의 코히즌 모듈(Cohesin module)을 가지는 소형 셀룰로즈-결합 단백질을 의미한다.
셀룰로좀 조합체 (Cellulosomal complex)의 기본적인 구조는 하나의 Cellulose binding module(CBM)을 가지고 있는 기본 골격 소단위체 (Primary scaffolding subunit)가 주축이 되어 Catalytic module을 가진 셀룰라아제 혹은 헤미셀룰라아제의 효소 소단위체 (Enzyme Subunits)들이 합쳐져서 이루어진다. 이 구조를 이루기 위해 기본 골격 소단위체에 있는 9개의 Cohesin module이 강력하게 각각의 효소 소단위체에 있는 Dockerin module에 단백질 간의 상호작용 (Protein-Protein interaction)에 의해 결합하게 된다.
본 발명은 다른 관점에서, 베타-아가레이즈와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 베타-아가레이즈를 코딩하는 유전자, 카파-카라기나아제와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 카파-카라기나아제를 코딩하는 유전자, 무수갈락토시다아제와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 무수갈락토시다아제를 코딩하는 유전자 및 소형 셀룰로즈-결합 단백질 A를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능 할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.
"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합 될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나, 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 곰팡이 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다.
예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩 시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 NSP 단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 효소 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 효소 복합체를 이용하여 홍조류 바이오매스를 분해하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 홍조류 바이오매스는 아가나 카라기난인 것을 특징으로 할 수 있다.
아울러, 본 발명에서는 셀룰로즈 결합 모듈(CBM)을 이용한 가수분해 효소 복합체의 분리정제를 수행하였으며, 수득된 mCbpA, cCgkA, cAgaB 및 cAhgA 조합의 가수분해 효소 복합체가 순수한 베타-아가레이즈 cAgaB보다 아가와 카라기난 기질에서 3.9배 높은 환원당 생산값을 가지는 것을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
섬유소 분해효소의
도커린
도메인의 유전자,
카파
-
카라기나아제와
베타-
아가레이즈
및
무수갈락토시다아제
유전자의 증폭
한천 분해 효소 복합체 형성을 위한 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자를 클로닝하기 위하여 클로스트리디움 셀룰로보란스의 지노믹디엔에이로부터 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 부분의 염기서열 서열번호 4를 참고로 하여 서열번호 6의 정방향 프라이머(Forward primer)의 5'에는 슈도알테로모나스 카라기노보라로부터 유래한 카파-카라기나아제 CgkA와 조벨리아 갈락타니보란스로부터 유래한 베타-아가레이즈 AgaB 그리고, 무수갈락토시다아제 AhgA 유전자의 C-terminal 부분에서 각각 10bp 크기의 서열이 들어가도록 하고, 서열번호 7의 역방향 프라이머(Reverse primer)의 5'에는 제한효소 인식서열이 삽입되도록 프라이머를 디자인하여 합성하였다. 이후 상기 합성된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 212bp의 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 부분의 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 각각 확인할 수 있었다.
프라이머 서열번호 6: GCGCggatccATTCACCGCAAT
프라이머 서열번호 7: ATATccatggATGCATCTATGCAACC
슈도알테로모나스 카라기노보란스로부터 유래한 키메릭 카파-카라기나아제 cCgkA 유전자를 클로닝하기 위하여 조벨리아 갈락토니보란스의 지노믹디엔에이로부터 시그널 펩타이드 부분을 제외한 염기서열을 참고로 하여 서열번호 8의 정방향 프라이머(Forward primer)의 5'에는 제한효소 SacI, 서열번호 9의 역방향프라이머(Reverse primer)의 5'에는 NotI 인식서열이 삽입되도록 하고, 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 부분의 N-terminal 부분의 10bp 크기의 서열이 삽입된 프라이머를 디자인하여 합성하였다. 이후, 상기 합성된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여서 그 결과 1311bp의 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자가 연결된 키메릭 카파-카라기나아제 cCgkA 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 확인할 수 있었다.
프라이머 서열번호 8: ccatggATTCTCAATCGGCTATTAAAAGTA
프라이머 서열번호 9: ggatccACGAACACTATGACGTGAATTTTCT
또한, 조벨리아 갈락토니보란스로부터 유래한 키메릭 베타-아가레이즈 cAgaB 유전자를 클로닝하기 위하여 조벨리아 갈락토니보란스의 지노믹디엔에이로부터 시그널 펩타이드 부분을 제외한 염기서열을 참고로 하여 서열번호 10의 정방향 프라이머(Forward primer)의 5'에는 제한효소 SacI, 서열번호 11의 역방향프라이머(Reverse primer)의 5'에는 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 부분의 N-terminal 부분의 10bp 크기의 서열이 각각 삽입된 프라이머를 합성하였다. 그 결과 1201bp의 슈도알테로모나스 카라기노보란스로부터 유래한 베타-아가레이즈 cAgaB 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 확인할 수 있었다.
프라이머 서열번호 10: GCGCgagctcCGGCGACAATTCAAAATTTGATA
프라이머 서열번호 11: CAGCggatccTTTCTCTACAGGTTTATAGATC
또한, 조벨리아 갈락토니보란스로부터 유래한 키메릭 무수갈락토시다아제 cAhgA 유전자를 클로닝하기 위하여 조벨리아 갈락토니보란스의 지노믹디엔에이로부터 시그널 펩타이드 부분을 제외한 염기서열을 참고로 하여 서열번호 12의 정방향 프라이머(Forward primer)의 5'에는 제한효소 EcoRI, 서열번호 13의 역방향 프라이머(Reverse primer)의 5'에는 HindIII 인식서열이 삽입되도록 하고, 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 부분의 N-terminal 부분의 10bp 크기의 서열이 삽입된 프라이머를 디자인하여 합성하였다. 이후, 상기 합성된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여서 그 결과 1382bp의 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자가 연결된 키메릭 무수갈락토시다아제 cAhgA 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 확인할 수 있었다.
프라이머 서열번호 12: GCGCgaattcGATGAACAAATACTCCCAATTTTTAAT
프라이머 서열번호 13: tgttaacatcTTGTTTTTTTACTCCTTTAGCTA
그리고 클로스트리디움 유래의 셀룰로보란스의 기본 골격 소단위체 (primary scaffolding subunit)인 셀룰로즈-결합 단백질-에이(Cellulose-binding protein A) 중 셀룰로즈 결합 모듈(Cellulose binding module; CBM)과 두 개의 코히즌 모듈(Cohesin module)을 가진 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이(Mini-Cellulose-binding protein A) 유전자를 클로닝하기 위해 염기서열을 참고로 하여 서열번호 14의 정방향 프라이머 (Forward primer)의 5'에는 제한효소 BamHI, 서열번호 15의 역방향 프라이머(Reverse primer)에는 제한효소 KpnI 인식서열이 각각 삽입된 프라이머를 합성하였다. 그 결과 1647bp의 클로스트리디움 유래의 셀룰로보란스의 셀룰로즈-결합 단백질-에이 유전자의 일부인 mCbpA 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 확인할 수 있었다.
프라이머 서열번호 14: ggatccGCAGCGACATCATCAAT
프라이머 서열번호 15: GCGCggtaccGCTATAGGATCTCCAATATTTATT
섬유소 분해효소의
도커린
도메인과 연결된 유전자의
클로닝
실시예 1에서 얻은 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자와 각각의 CgkA, AgaB와 AhgA 증폭산물을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하였고 아가로스 겔 상의 DNA 절편은 Gel extraction kit (GeneAll)를 사용하여 회수하였다.
그 후 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자와 카파-카라기나아제, 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자와 베타-아가레이즈, 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자와 무수갈락토시다아제 유전자를 연결하기 위해 회수한 DNA 절편을 이용하여 오버랩(overlap) PCR 반응을 각각 수행하였다. 회수한 두 DNA 절편으로부터 서열번호 16의 정방향 프라이머(Forward primer)의 5'에는 제한효소 SacI, 서열번호 17의 역방향 프라이머(Reverse primer)의 5'에는 제한효소 NotⅠ 인식서열이 삽입되도록 프라이머를 디자인하여 합성하였다. PCR 반응을 수행하여 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자가 연결된 슈도알테로모나스 카라기노보란스로부터 유래한 1311bp의 키메릭 카파-카라기나아제 cCgkA 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 각각 확인할 수 있었다.
프라이머 서열번호 16: ATATccatggATGCATCTATGCAACC
프라이머 서열번호 17: GCGCggatccATTCACCGCAAT
서열번호 18의 정방향 프라이머(Forward primer)의 5'에는 제한효소 SacI, 서열번호 19의 역방향 프라이머(Reverse primer)의 5'에는 제한효소 SalⅠ 인식서열이 삽입되도록 프라이머를 디자인하여 합성하였다. PCR 반응을 수행하여 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자가 연결된 조벨리아 갈락토니보란스로부터 유래한 1217bp의 키메릭 베타-아가레이즈 cAgaB 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 각각 확인할 수 있었다.
프라이머 서열번호 18: GCGCgagctcCGGCGACAATTCAAAATTTGATA
프라이머 서열번호 19: GCGCggccgcTCAATGATGATGATGATGATGTAAAAGCATTTTTTTAAG
서열번호 20의 정방향 프라이머(Forward primer)의 5'에는 제한효소 EcoRI, 서열번호 21의 역방향 프라이머(Reverse primer)의 5'에는 제한효소 Hind III 인식서열이 삽입되도록 프라이머를 디자인하여 합성하였다. PCR 반응을 수행하여 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자가 연결된 1382bp의 키메릭 무수갈락토시다아제 cAhgA 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 각각 확인할 수 있었다.
프라이머 서열번호 20: GCGCgaattcGATGAACAAATACTCCCAATTTTTAAT
프라이머 서열번호 21: GCGCaagcttTAAAAGCATTTTTTTAAGAACAGCTA
그 후, 키메릭 카파-카라기나아제 cCgkA, 키메릭 베타-아가레이즈 cAgaB와 키메릭 무수갈락토시다아제 cAhgA 유전자는 각각의 제한효소로 절단한 후 대장균 발현 벡터(E.coli expression vector)인 pET22b(+)에 라이게이션(ligation)시켜 에스세리시아 콜라이 (대장균, E.coli) DH5α에 형질전환을 하였다. 이어 재조합 미생물로부터 라이게이션(ligation)된 재조합 플라스미드 DNA를 분리하였다. 상기 재조합 벡터를 pET22(+)cCgkA, pET22(+)cAgaB와 pET22(+)cAhgA라 명명하였다(도 1). 그리고 상기 대장균 재조합 미생물을 DH5α/cCgkA, DH5α/cAgaB와 DH5α/cAhgA라 명명하였다.
대장균 재조합 미생물의 활성 측정
실시예 2에서 확보한 대장균 재조합 미생물을 IPTG로 발현 유도하여 cCgkA와 cAgaB 효소 단백질이 배양액으로 분비되도록 하는 조건을 조성하여 28℃에서 90분 동안 진탕배양 후 원심분리하여 세포내 단백질을 sonication을 통하여 분해하고 농축하여(Millipore, amicon 10kDa cut off) cCgkA, cAgaB 효소 단백질을 얻었다. 다만, cAhgA 효소 단백질이 배양액으로 분비되도록 하는 조건은 상기 cCgkA와 cAgaB 보다 낮은 온도인 16℃에서 240분 이상 진탕배양 후 원심분리하여 분리하고, 세포내 단백질을 sonication하여 단백질을 얻었다. 얻어진 재조합 미생물의 효소 단백질 발현을 확인하기 위하여, SDS-PAGE과 Western Blot을 실행하였으며 목적 단백질들의 크기별로 분리됨을 확인하였다(도 2).
효소단백질과
소형 골격 단백질의 효소복합체 형성
정제된 효소단백질 키메릭 카파-카라기나아제 cCgkA 및 키메릭 베타-아가레이즈 cAgaB 및 키메릭 무수갈락토시다아제 cAhgA와 소형 골격 단백질 mCbpA와의 효소 복합체 형성방법은 다음과 같다. 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 모듈이 연결된 조벨리아 갈락토니보란스로부터 유래한 키메릭 베타-아가레이즈 cAgaB와 소형 셀룰로즈 결합 단백질 mCbpA과의 결합으로 인한 복합체의 형성을 확인하기 위해 세 가지 단백질을 저온에서 100㎕의 결합완충액과 함께 일정 비율로 섞어 배양한 후 우선 셀룰로즈-결합 모듈(Cellulose binding module; CBM)과 셀룰로즈 사이의 상호작용을 이용한 단백질 정제 후에 Western-blotting을 통해 분석하였다.
결합완충액은 25mM Sodium acetate buffer와 15mM CaCl2 [pH 6.0]의 조성으로 제조하고, 1:1:1:1:6=cAgaB:cCgkA:cAhgA:miniCbpA:binding buffer 비율로 섞어 4℃에서 하룻밤 동안(18시간) 반응시켰다. 다음날 반응액을 이용하여 PAGE analysis를 하였으며, Western-blotting은 anti-His-tag primary antibody (ELPIS)와 goat anti-rabbit HRP conjugated(Santacruz) secondary antibody를 사용하였고 luminol reagent(Santacruz)로 효소 단백질의 발현을 확인하였다(도 3의 C).
카보하이드레이트
바인딩 모듈을 이용한 효소복합체의 분리정제
카보하이드레이트 바인딩 모듈(이하 CBM)을 이용한 정제는 셀룰로즈 1㎎당 10ug의 재조합 미생물의 비율로 상온에서 1시간 동안 교반배양으로 인하여 결합 되었으며, 셀룰로즈와 결합된 CBM융합 단백질은 1,600 × g에서 10분간 원심분리 되었다. 20mM Tris(pH 8.0)에 1M NaCl이 함유된 버퍼와 20mM Tris(pH 7.5) 버퍼로 각각 세척을 한 다음 50mM Tris(pH 12.5) 버퍼로 용출하여 얻었으며, 이의 샘플을 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다(도 3의 A).
실시예
6 : 효소복합체를 이용한 다양한 기질에서의 환원당 측정
구축된 가수분해 효소복합체의 분해능을 시험하기 위하여 reducing sugar assay와 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay를 이용하여 분석하였다. 0.5㎖ agar solution과 0.5㎖ carrageenan solution을 동일 비율로 배합하고, 0.5㎖ (i) 키메릭 카파-카라기나아제와 키메릭 베타-아가레이즈와 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이가 결합된 효소복합체(CAM), (ii) 키메릭 카파-카라기나아제와 키메릭 무수갈락토시다아제와 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이가 결합된 효소복합체(CHM), (iii) 키메릭 베타-아가레이즈와 키메릭 무수갈락토시다아제와 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이가 결합된 효소복합체(AHM), (iv) 키메릭 카파-카라기나아제와 키메릭 베타-아가레이즈와 키메릭 무수갈락토시다아제와 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이가 결합된 효소복합체(CAHM)으로 구성된 군의 각각의 샘플들을 50℃에서 배양하였으며, 각각 2시간 간격으로 0.075㎖ 샘플링 하였다. 0.15㎖의 DNS solution을 첨가하여 PCR 기기에서 10분간 가열한 후, 상온에서 식힌 샘플을 550㎚ 파장에서 absorbance를 측정하였다(도 4의A).
또한, 구축된 가수분해 효소복합체의 분해능을 시험하기 위하여 reducing sugar assay와 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay를 이용하여 분석하였다. 1.0㎖ agar solution과 0.5㎖ (i) 키메릭 카파-카라기나아제와 키메릭 베타-아가레이즈와 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이가 결합된 효소복합체(CAM), (ii) 키메릭 카파-카라기나아제와 키메릭 무수갈락토시다아제와 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이가 결합된 효소복합체(CHM), (iii) 키메릭 베타-아가레이즈와 키메릭 무수갈락토시다아제와 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이가 결합된 효소복합체(AHM), (iv) 키메릭 카파-카라기나아제와 키메릭 베타-아가레이즈와 키메릭 무수갈락토시다아제와 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이가 결합된 효소복합체(CAHM)으로 구성된 군의 각각의 샘플들을 50℃에서 배양하였으며, 각각 2시간 간격으로 0.075㎖ 샘플링 하였다. 0.15㎖의 DNS 솔루션을 첨가하여 PCR 기기에서 10분간 가열한 후, 상온에서 식힌 샘플을 550㎚ 파장에서 absorbance를 측정하였다(도 4의B).
또한, 구축된 가수분해 효소복합체의 분해능을 시험하기 위하여 reducing sugar assay와 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay를 이용하여 분석하였다. 1.0㎖ carrageenan solution과 0.5㎖ (i) 키메릭 카파-카라기나아제와 키메릭 베타-아가레이즈와 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이가 결합된 효소복합체(CAM), (ii) 키메릭 카파-카라기나아제와 키메릭 무수갈락토시다아제와 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이가 결합된 효소복합체(CHM), (iii) 키메릭 베타-아가레이즈와 키메릭 무수갈락토시다아제와 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이가 결합된 효소복합체(AHM), (iv) 키메릭 카파-카라기나아제와 키메릭 베타-아가레이즈와 키메릭 무수갈락토시다아제와 소형 셀룰로즈-결합 단백질-에이가 결합된 효소복합체(CAHM)으로 구성된 군의 각각의 샘플들을 50℃에서 배양하였으며, 각각 2시간 간격으로 0.075㎖ 샘플링 하였다. 0.15㎖의 DNS 솔루션을 첨가하여 PCR 기기에서 10분간 가열한 후, 상온에서 식힌 샘플을 550㎚ 파장에서 absorbance를 측정하였다(도 4의C).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea University Research and Business Foundation
<120> Enzyme Complex Containing Beta agarase, Kappa carrageenase and
Anhydro-galactosidase and Use thereof
<130> P15-B230
<160> 15
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 406
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Beta agarase
<400> 1
Gly Asp Asn Ser Lys Phe Asp Ser Ala Thr Asp Leu Pro Val Glu Gln
1 5 10 15
Glu Gln Glu Gln Glu Thr Glu Gln Glu Gly Glu Pro Glu Glu Ser Ser
20 25 30
Glu Gln Asp Leu Val Glu Glu Val Asp Trp Lys Asp Ile Pro Val Pro
35 40 45
Ala Asp Ala Gly Pro Asn Met Lys Trp Glu Phe Gln Glu Ile Ser Asp
50 55 60
Asn Phe Glu Tyr Glu Ala Pro Ala Asp Asn Lys Gly Ser Glu Phe Leu
65 70 75 80
Glu Lys Trp Asp Asp Phe Tyr His Asn Ala Trp Ala Gly Pro Gly Leu
85 90 95
Thr Glu Trp Lys Arg Asp Arg Ser Tyr Val Ala Asp Gly Glu Leu Lys
100 105 110
Met Trp Ala Thr Arg Lys Pro Gly Ser Asp Lys Ile Asn Met Gly Cys
115 120 125
Ile Thr Ser Lys Thr Arg Val Val Tyr Pro Val Tyr Ile Glu Ala Arg
130 135 140
Ala Lys Val Met Asn Ser Thr Leu Ala Ser Asp Val Trp Leu Leu Ser
145 150 155 160
Ala Asp Asp Thr Gln Glu Ile Asp Ile Leu Glu Ala Tyr Gly Ala Asp
165 170 175
Tyr Ser Glu Ser Ala Gly Lys Asp His Ser Tyr Phe Ser Lys Lys Val
180 185 190
His Ile Ser His His Val Phe Ile Arg Asp Pro Phe Gln Asp Tyr Gln
195 200 205
Pro Lys Asp Ala Gly Ser Trp Phe Glu Asp Gly Thr Val Trp Asn Lys
210 215 220
Glu Phe His Arg Phe Gly Val Tyr Trp Arg Asp Pro Trp His Leu Glu
225 230 235 240
Tyr Tyr Ile Asp Gly Val Leu Val Arg Thr Val Ser Gly Lys Asp Ile
245 250 255
Ile Asp Pro Lys His Phe Thr Asn Thr Thr Asp Pro Gly Asn Thr Glu
260 265 270
Ile Asp Thr Arg Thr Gly Leu Asn Lys Glu Met Asp Ile Ile Ile Asn
275 280 285
Thr Glu Asp Gln Thr Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ser Gly Leu Gln Ser
290 295 300
Asn Thr Tyr Thr Pro Thr Asp Asn Glu Leu Ser Asn Ile Glu Asn Asn
305 310 315 320
Thr Phe Gly Val Asp Trp Ile Arg Ile Tyr Lys Pro Val Glu Lys Gly
325 330 335
Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe Asp Val Asn Lys Asp
340 345 350
Gly Lys Val Asn Ala Ile Asp Tyr Ala Val Leu Lys Ser Ile Leu Leu
355 360 365
Gly Thr Asn Thr Asn Val Asp Leu Ser Val Ser Asp Met Asn Lys Asp
370 375 380
Gly Lys Val Asn Ala Leu Asp Leu Ala Val Leu Lys Lys Met Leu Leu
385 390 395 400
His His His His His His
405
<210> 2
<211> 443
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kappa carrageenase
<400> 2
Ala Ser Met Gln Pro Pro Ile Ala Lys Pro Gly Glu Thr Trp Ile Leu
1 5 10 15
Gln Ala Lys Arg Ser Asp Glu Phe Asn Val Lys Asp Ala Thr Lys Trp
20 25 30
Asn Phe Gln Thr Glu Asn Tyr Gly Val Trp Ser Trp Lys Asn Glu Asn
35 40 45
Ala Thr Val Ser Asn Gly Lys Leu Lys Leu Thr Thr Lys Arg Glu Ser
50 55 60
His Gln Arg Thr Phe Trp Asp Gly Cys Asn Gln Gln Gln Val Ala Asn
65 70 75 80
Tyr Pro Leu Tyr Tyr Thr Ser Gly Val Ala Lys Ser Arg Ala Thr Gly
85 90 95
Asn Tyr Gly Tyr Tyr Glu Ala Arg Ile Lys Gly Ala Ser Thr Phe Pro
100 105 110
Gly Val Ser Pro Ala Phe Trp Met Tyr Ser Thr Ile Asp Arg Ser Leu
115 120 125
Thr Lys Glu Gly Asp Val Gln Tyr Ser Glu Ile Asp Val Val Glu Leu
130 135 140
Thr Gln Lys Ser Ala Val Arg Glu Ser Asp His Asp Leu His Asn Ile
145 150 155 160
Val Val Lys Asn Gly Lys Pro Thr Trp Met Arg Pro Gly Ser Phe Pro
165 170 175
Gln Thr Asn His Asn Gly Tyr His Leu Pro Phe Asp Pro Arg Asn Asp
180 185 190
Phe His Thr Tyr Gly Val Asn Val Thr Lys Asp Lys Ile Thr Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Glu Ile Val Gly Glu Lys Asp Asn Leu Tyr Trp His Arg
210 215 220
Gln Met Asn Leu Thr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Ala Pro His Thr Gln
225 230 235 240
Trp Lys Cys Asn Gln Phe Tyr Pro Ser Ala Asn Lys Ser Ala Glu Gly
245 250 255
Phe Pro Thr Ser Met Glu Val Asp Tyr Val Arg Thr Trp Val Lys Val
260 265 270
Gly Asn Asn Asn Ser Ala Pro Gly Glu Gly Gln Ser Cys Pro Asn Thr
275 280 285
Phe Val Ala Val Asn Ser Val Gln Leu Ser Ala Ala Lys Gln Thr Leu
290 295 300
Arg Lys Gly Gln Ser Thr Thr Leu Glu Ser Thr Val Leu Pro Asn Cys
305 310 315 320
Ala Thr Asn Lys Lys Val Ile Tyr Ser Ser Ser Asn Lys Asn Val Ala
325 330 335
Thr Val Asn Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Lys Asn Lys Gly Thr Ala
340 345 350
Thr Ile Thr Val Lys Thr Lys Asn Lys Gly Lys Ile Asp Lys Leu Thr
355 360 365
Ile Ala Val Asn Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
370 375 380
Asp Val Asn Lys Asp Gly Lys Val Asn Ala Ile Asp Tyr Ala Val Leu
385 390 395 400
Lys Ser Ile Leu Leu Gly Thr Asn Thr Asn Val Asp Leu Ser Val Ser
405 410 415
Asp Met Asn Lys Asp Gly Lys Val Asn Ala Leu Asp Leu Ala Val Leu
420 425 430
Lys Lys Met Leu Leu His His His His His His
435 440
<210> 3
<211> 461
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anhydro-galactosidase
<400> 3
Met Asn Lys Tyr Ser Gln Phe Leu Ile Phe Ala Ala Val Leu Val Ser
1 5 10 15
Ala Cys Asn Ser Pro Lys Thr Thr Lys Glu Met Lys Ser Thr Asp Asp
20 25 30
Cys Pro Glu Lys Val Thr Phe Thr Pro Glu Gln Ile Asp His Leu Gly
35 40 45
Ile Thr Asp Thr Asn His Leu Ser Ala Ala Ser Lys Arg Ala Leu Lys
50 55 60
Trp Pro Thr Asp Leu Gly Asn Glu Trp Phe Ile Gln Phe Gly Pro Leu
65 70 75 80
Gln Pro Leu Lys Gly Asp Leu Ala Tyr Glu Glu Gly Val Val Arg Arg
85 90 95
Asp Pro Ser Ala Ile Ile Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Tyr Val Trp Tyr
100 105 110
Ser Lys Ser Thr Gly Pro Thr Gln Gly Phe Gly Gly Asp Ile Glu Lys
115 120 125
Asp Lys Val Phe Pro Trp Asp Arg Cys Asp Ile Trp Tyr Ala Thr Ser
130 135 140
Glu Asp Gly Trp Thr Trp Lys Glu Glu Gly Pro Ala Val Thr Arg Gly
145 150 155 160
Glu Lys Gly Ala Tyr Asp Asp Arg Ser Val Phe Thr Val Glu Ile Met
165 170 175
Lys Trp Glu Asp Lys Tyr Tyr Leu Cys Tyr Gln Thr Val Lys Ser Pro
180 185 190
Tyr Asn Val Arg Val Lys Asn Gln Val Gly Leu Ala Trp Ala Asp Ser
195 200 205
Pro Asp Gly Pro Trp Thr Lys Ser Glu Glu Pro Ile Leu Ser Pro Ala
210 215 220
Asp Asn Gly Val Trp Lys Gly Glu Glu Gln Asp Arg Phe Ala Val Ile
225 230 235 240
Lys Lys Gly Asp Phe Asp Ser His Lys Val His Asp Pro Cys Ile Ile
245 250 255
Pro Tyr Lys Gly Lys Phe Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Glu Gln Met Gly
260 265 270
Glu Ala Ile Thr Phe Gly Gly Arg Gln Ile Arg His Gly Val Ala Ile
275 280 285
Ala Asp Asn Pro Lys Gly Pro Tyr Val Lys Ser Pro Tyr Asn Pro Ile
290 295 300
Ser Asn Ser Gly His Glu Ile Cys Val Trp Pro Tyr Asn Gly Gly Ile
305 310 315 320
Ala Ser Leu Ile Thr Thr Asp Gly Pro Glu Lys Asn Thr Ile Gln Trp
325 330 335
Ala Pro Asp Gly Ile Asn Phe Glu Ile Lys Ser Val Ile Pro Gly Val
340 345 350
Asn Ala His Ala Ile Gly Leu Asn Arg Thr Ala Asp Val Glu Lys Glu
355 360 365
Pro Thr Glu Ile Leu Arg Trp Gly Leu Thr His Ile Tyr Asn Asn Gly
370 375 380
Asp Tyr Gln Ser Ile Met Arg Phe Ser Ser Glu Arg Lys Thr Arg His
385 390 395 400
Val Ala Lys Gly Val Lys Lys Gln Asp Val Asn Lys Asp Gly Lys Val
405 410 415
Asn Ala Ile Asp Tyr Ala Val Leu Lys Ser Ile Leu Leu Gly Thr Asn
420 425 430
Thr Asn Val Asp Leu Ser Val Ser Asp Met Asn Lys Asp Gly Lys Val
435 440 445
Asn Ala Leu Asp Leu Ala Val Leu Lys Lys Met Leu Leu
450 455 460
<210> 4
<211> 441
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> endo-beta-1, 4-glucanase
<400> 4
Met Asn Lys Arg Leu Ser Arg Gly Lys Ile Ser Leu Leu Ala Ser Val
1 5 10 15
Phe Val Thr Thr Thr Phe Met Gly Gly Val Asn Val Leu Ala Ser Thr
20 25 30
Ala Lys Thr Gly Ile Arg Asp Ile Thr Ser Gln Gln Val Val Lys Glu
35 40 45
Met Lys Val Gly Trp Asn Leu Gly Asn Thr Met Asp Ala Thr Gly Gly
50 55 60
Glu Thr Asn Trp Gly Asn Pro Leu Thr Thr His Ala Met Ile Asp Lys
65 70 75 80
Val Lys Ala Ala Gly Phe Asn Thr Leu Arg Leu Pro Ile Thr Trp Asp
85 90 95
Gly His Ile Gly Ala Ala Pro Asp Tyr Ala Ile Asp Ala Thr Trp Met
100 105 110
Asn Arg Val Glu Glu Ile Ala Asn Tyr Ala Phe Asp Asn Asn Met Tyr
115 120 125
Val Ile Ile Asn Leu His His Glu Asp Gly Trp Leu Lys Pro Tyr Tyr
130 135 140
Ala Asn Glu Ala Glu Val Lys Ala Lys Ile Thr Lys Val Trp Thr Gln
145 150 155 160
Ile Ala Asn Arg Phe Lys Asp Tyr Gly Asp Tyr Leu Ile Phe Glu Thr
165 170 175
Met Asn Glu Pro Arg Pro Val Gly Ala Ala Asp Glu Trp Ser Gly Gly
180 185 190
Ser Tyr Glu Asn Arg Asp Met Val Asn Arg Tyr Asn Leu Thr Ala Val
195 200 205
Asn Thr Ile Arg Ala Thr Gly Gly Asn Asn Ala Leu Arg His Ile Met
210 215 220
Val Pro Thr Leu Ala Ala Ala Ala Leu Ser Thr Thr Met Asn Asp Tyr
225 230 235 240
Ile Val Pro Asn Asn Asp Ser Arg Val Ile Val Ser Leu His Met Tyr
245 250 255
Ser Pro Tyr Phe Phe Ser Ala Asp Leu Thr Ser Gln Trp Thr Thr Ala
260 265 270
Thr Trp Gly Ser Asp Ala Asp Lys Ala Ala Leu Ser Ala Asp Phe Asp
275 280 285
Ala Val Tyr Asn Lys Phe Val Lys Asn Gly Arg Ala Val Val Ile Gly
290 295 300
Glu Met Gly Thr Ile Asn Lys Asn Asn Leu Asp Ser Arg Val Lys His
305 310 315 320
Ala Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Ala Thr Val Arg Gly Ile Thr Pro Ile
325 330 335
Trp Trp Asp Asn Gly Tyr Cys Val Ala Gly Lys Glu Gln Thr Phe Gly
340 345 350
Ile Phe Asn Arg Lys Asn Leu Thr Trp Cys Cys Pro Glu Val Met Gln
355 360 365
Ala Phe Ile Arg Gly Ala Gly Ala Thr Gln Thr Gln Thr Ser Tyr Ser
370 375 380
Leu Gly Asp Val Asn Lys Asp Gly Lys Val Asn Ala Ile Asp Tyr Ala
385 390 395 400
Val Leu Lys Ser Ile Leu Leu Gly Thr Asn Thr Asn Val Asp Leu Ser
405 410 415
Val Ser Asp Met Asn Lys Asp Gly Lys Val Asn Ala Leu Asp Leu Ala
420 425 430
Val Leu Lys Lys Met Leu Leu Ser Leu
435 440
<210> 5
<211> 549
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cellulose binding protein A
<400> 5
Ala Ala Thr Ser Ser Met Ser Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Lys Ser
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Ile Thr Pro Ile Ile Lys Ile Thr Asn Thr Ser
20 25 30
Asp Ser Asp Leu Asn Leu Asn Asp Val Lys Val Arg Tyr Tyr Tyr Thr
35 40 45
Ser Asp Gly Thr Gln Gly Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Gly Ala
50 55 60
Leu Leu Gly Asn Ser Tyr Val Asp Asn Thr Ser Lys Val Thr Ala Asn
65 70 75 80
Phe Val Lys Glu Thr Ala Ser Pro Thr Ser Thr Tyr Asp Thr Tyr Val
85 90 95
Glu Phe Gly Phe Ala Ser Gly Ala Ala Thr Leu Lys Lys Gly Gln Phe
100 105 110
Ile Thr Ile Gln Gly Arg Ile Thr Lys Ser Asp Trp Ser Asn Tyr Thr
115 120 125
Gln Thr Asn Asp Tyr Ser Phe Asp Ala Ser Ser Ser Thr Pro Val Val
130 135 140
Asn Pro Lys Val Thr Gly Tyr Ile Gly Gly Ala Lys Val Leu Gly Thr
145 150 155 160
Ala Pro Gly Pro Asp Val Pro Ser Ser Ile Ile Asn Pro Thr Ser Ala
165 170 175
Thr Phe Asp Lys Asn Val Thr Lys Gln Ala Asp Val Lys Thr Thr Met
180 185 190
Thr Leu Asn Gly Asn Thr Phe Lys Thr Ile Thr Asp Ala Asn Gly Thr
195 200 205
Ala Leu Asn Ala Ser Thr Asp Tyr Ser Val Ser Gly Asn Asp Val Thr
210 215 220
Ile Ser Lys Ala Tyr Leu Ala Lys Gln Ser Val Gly Thr Thr Thr Leu
225 230 235 240
Asn Phe Asn Phe Ser Ala Gly Asn Pro Gln Lys Leu Val Ile Thr Val
245 250 255
Val Asp Thr Pro Val Glu Ala Val Thr Ala Thr Ile Gly Lys Val Gln
260 265 270
Val Asn Ala Gly Glu Thr Val Ala Val Pro Val Asn Leu Thr Lys Val
275 280 285
Pro Ala Ala Gly Leu Ala Thr Ile Glu Leu Pro Leu Thr Phe Asp Ser
290 295 300
Ala Ser Leu Glu Val Val Ser Ile Thr Ala Gly Asp Ile Val Leu Asn
305 310 315 320
Pro Ser Val Asn Phe Ser Ser Thr Val Ser Gly Ser Thr Ile Lys Leu
325 330 335
Leu Phe Leu Asp Asp Thr Leu Gly Ser Gln Leu Ile Thr Lys Asp Gly
340 345 350
Val Phe Ala Thr Ile Thr Phe Lys Ala Lys Ala Ile Thr Gly Thr Thr
355 360 365
Ala Lys Val Thr Ser Val Lys Leu Ala Gly Thr Pro Val Val Gly Asp
370 375 380
Ala Gln Leu Gln Glu Lys Pro Cys Ala Val Asn Pro Gly Thr Val Thr
385 390 395 400
Ile Asn Pro Ile Asp Asn Arg Met Gln Ile Ser Val Gly Thr Ala Thr
405 410 415
Val Lys Ala Gly Glu Ile Ala Ala Val Pro Val Thr Leu Thr Ser Val
420 425 430
Pro Ser Thr Gly Ile Ala Thr Ala Glu Ala Gln Val Ser Phe Asp Ala
435 440 445
Thr Leu Leu Glu Val Ala Ser Val Thr Ala Gly Asp Ile Val Leu Asn
450 455 460
Pro Thr Val Asn Phe Ser Tyr Thr Val Asn Gly Asn Val Ile Lys Leu
465 470 475 480
Leu Phe Leu Asp Asp Thr Leu Gly Ser Gln Leu Ile Ser Lys Asp Gly
485 490 495
Val Phe Val Thr Ile Asn Phe Lys Ala Lys Ala Val Thr Ser Thr Val
500 505 510
Thr Thr Pro Val Thr Val Ser Gly Thr Pro Val Phe Ala Asp Gly Thr
515 520 525
Leu Ala Glu Val Gln Ser Lys Thr Ala Ala Gly Ser Val Thr Ile Asn
530 535 540
Ile Gly Asp Pro Ile
545
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
gcgcggatcc attcaccgca at 22
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
atatccatgg atgcatctat gcaacc 26
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
ccatggattc tcaatcggct attaaaagta 30
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
ggatccacga acactatgac gtgaattttc t 31
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
gcgcgagctc cggcgacaat tcaaaatttg ata 33
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
cagcggatcc tttctctaca ggtttataga tc 32
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
gcgcgaattc gatgaacaaa tactcccaat ttttaat 37
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
tgttaacatc ttgttttttt actcctttag cta 33
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
ggatccgcag cgacatcatc aat 23
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
gcgcggtacc gctataggat ctccaatatt tatt 34
Claims (17)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 베타-아가레이즈와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 베타-아가레이즈; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 카파-카라기나아제와 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 카파-카라기나아제; 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 무수갈락토시다아제와 엔도-β-1,4-글루카나아제-B의 도커린 모듈이 융합된 키메릭 무수갈락토시다아제; 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 소형 셀룰로즈-결합 단백질 A가 결합 되어 있는 홍조류 유래 다당을 단당류로 분해하는 분해능을 가지는 효소 복합체.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 효소 복합체를 이용하여 홍조류 바이오매스를 분해하는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150184782A KR101864350B1 (ko) | 2015-12-23 | 2015-12-23 | 베타-아가레이즈, 카파-카라기나아제 및 무수갈락토시다아제를 함유하는 효소 복합체 및 그 용도 |
Publications (2)
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|---|---|
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