KR20150028564A

KR20150028564A - 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 모듈이 연결된 ｊｍ109 균주로부터 유래한 키메릭 락케이즈가 삽입된 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시킨 대장균 형질전환체

Info

Publication number: KR20150028564A
Application number: KR1020130107358A
Authority: KR
Inventors: 유선화; 김명길; 이성숙; 한성옥; 현정은
Original assignee: 대한민국(산림청 국립산림과학원장)
Priority date: 2013-09-06
Filing date: 2013-09-06
Publication date: 2015-03-16

Abstract

본 발명은 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비(endo-β-1,4-glucanaseB, 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase, carboxymethylcellulase, CMCase; EC 3.2.1.4) 유전자의 도커린 모듈이 삽입된 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시킨 대장균 형질전환체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 모듈이 삽입되고 도 1의 A 개열지도로 나타내는 재조합 벡터(pET22(+)cCueO) 및 상기 재조합 벡터(pET22(+)cCueO)를 대장균 삽입시켜 형질전환시킨 대장균 형질전환체(BL21/cCueO)에 관한 것이다.

Description

엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 모듈이 연결된 ＪＭ109 균주로부터 유래한 키메릭 락케이즈가 삽입된 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시킨 대장균 형질전환체{A recombinant vector introduced with chimeric laccase gene which fused by dockerin module of endoglucanase B and a transformat Escherichia coli comprising the vector}

본 발명은 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비(endo-β-1,4-glucanaseB, 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase, carboxymethylcellulase, CMCase; EC 3.2.1.4) 유전자의 도커린 모듈이 삽입된 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시킨 대장균 형질전환체에 관한 것으로 보다 상세하게는 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 모듈이 삽입되고 도 1의 A 개열지도로 나타내는 재조합 벡터(pET22(+)cCueO) 및 상기 재조합 벡터(pET22(+)cCueO)를 대장균 삽입시켜 형질전환시킨 대장균 형질전환체(BL21/cCueO)에 관한 것이다.

최근, 화석연료의 과다 사용으로 인한 연료 고갈 및 지구 온난화와 기상 이변으로 대표되는 환경오염에 대한 우려로 인하여 재생 가능한 에너지에 대한 관심이 모아지고 있다. 이에 대체에너지중 하나인 바이오 에너지는 기존에 사용하지 않던 비식용 식물자원을 이용하여 바이오 에탄올, 부탄올, 디젤과 같은 바이오 연료를 만드는 것에 목표를 둔다. 식물자원 바이오매스는 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스, 리그닌 등으로 구성되어 각각 특이한 분해효소가 있어야만 분해가 가능하다.

다시 말해서, 식물 세포벽은 크리스탈린 구조를 지닌 셀룰로오스나 헤미셀룰로오스로 이루어진 리그닌에 의해 둘러싸여 있어서 분해하기 어렵다. 따라서 리그닌을 분해하는 효소를 형성할 수 있는 많은 미생물들에 대해 연구가 되고 있다. 그 연구는 혐기성 미생물에서 생성된 거대 엔자임 복합체인 셀룰로좀에 초점이 맞춰지고 있다 (Waeonukul et al., Bioresour Technol, 107:352-357, 2012). 셀룰로좀은 결정형 셀룰로우즈나 자일란, 만난, 펙틴과 같은 다양한기질에 대하여 작용하고 셀룰로좀 형성 효소들과 지지체 단백질로 이루어져 있다.

셀룰로좀의 형성은 하나의 셀룰로좀 형성 효소의 도커린 도메인과 지지체 단백질의 여러개의 코히신 도메인중 하나의 결합으로 이루어진다. 그 중 일부 코히신 도메인으로 이루어진 복합체를 미니셀룰로좀이라고 하며, 이를 구성하기 위해서는 도커린 도메인이 없는 효소들에 유전자 조작을 통하여 도커린 도메일을 연결한 키메릭 효소를 만드는 기술이 필요하다. 미니셀룰로좀 형성 효소들은 미니셀룰로좀을 형성하기 전에 비하여 향상된 효소 활성을 나타내게 된다.

이에, 본 발명자들은 리그닌 분해효과가 뛰어난 효소 복합체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 클로스트리디움 셀룰로보란스가 가지는 엔도글루카나아제의 도커린 모듈을 연결한 키메릭 락케이즈를 설계 및 발현하고, 이를 소형 셀룰로오스 결합단백질 에이와 효소 복합체를 형성하게 하여, 결정성 셀룰로오스에 대한 분해 활성이 뛰어나다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

한편 본 발명의 대장균 형질전환체(BL21/cCueO)와 관련된 선행기술로서 한국공개특허 제2002-0092089호에 재조합 인간 훼리틴을 대량으로 생산할 수 있으며, pH 시프트(shift) 공정만으로도 활성형의 재조합 인간 훼리틴을 고농도 및 고효율로 분리할 수 있는 인간 훼리틴(ferritin) 유전자의 발현벡터, 이를 포함하는 대장균 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용한 훼리틴 단백질의 제조방법을 나타내고 있다.

또한 한국공개특허 제1997-0043048호에 사람 파필로마바이러스 18형 E7 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드에 의해 형질전환되어 가용성 18형 E7 재조합 단백질을 고효율로 생산할 수 있는 대장균 형질전환체, 대장균 형질전환체를 이용하여 비융합형이고 가용성인 18형 E7재조합 단백질을 제조하는 방법 및 상기 재조합 단백질에 대해 특이적인 폴리클로날 항체를 나타내고 있다.

그러나 본 발명과 상기 선행기술들은 발명의 기술적 특징이 서로 달라 발명의 구성이 서로 다른 발명이다.

본 발명의 목적은 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비(endo-β-1,4-glucanaseB, 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase, carboxymethylcellulase, CMCase; EC 3.2.1.4) 유전자의 도커린 모듈이 삽입된 재조합 벡터를 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시킨 대장균 형질전환체를 제공하고자 한다.

본 발명은 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비(endo-β-1,4-glucanaseB, 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase, carboxymethylcellulase, CMCase; EC 3.2.1.4) 유전자의 도커린 모듈이 삽입되고 도 1의 A 개열지도로 나타내는 재조합 벡터(pET22(+)cCueO)를 제공할 수 있다.

본 발명은 상기 재조합 벡터(pET22(+)cCueO)를 대장균 삽입시켜 형질전환시킨 대장균 형질전환체(BL21/cCueO)를 제공할 수 있다.

본 발명은 클로스트리디움 속 균주로부터 유래한 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자(endo-β-1,4-glucanase-B, 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase, carboxymethylcellulase, CMCase; EC 3.2.1.4)의 도커린 모듈이 삽입된 재조합 벡터(pET22(+)cCueO)를 대장균 삽입시켜 형질전환시킨 대장균 형질전환체(BL21/cCueO)로부터 키메릭 락케이즈 cCueO를 대량 생산할 수 있다.

본 발명에 따라 키메릭 락케이즈 cCueO를 대량 생산할 수 있으며, 또한 생산된 키메릭 락케이즈 cCueO를 다른 효소 및/또는 단백질과 결합시킨 복합체를 대량으로 생산할 수 있어 바이오매스의 생물학적 전처리에 있어 효과적으로 작용하여 경제적으로 저렴하고 생산적으로 효율적인 바이오 에탄올 공정에 유용한 발명인 것으로 기대된다. 또한 이는 양조, 제빵, 알코올 생산, 사료 생산 및 생균제 개발 등에 유용하게 사용될 수 있어 산업적으로 다양한 통합된 바이오프로세싱(Consolidated bioprocessing)에 매우 유용하다.

도 1은 본 발명에서 키메릭 락케이즈 유전자와 소형 골격 단백질 유전자의 설계를 통해 본 발명에서 제시된 키메릭 락케이즈 cCueO 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pET22(+)cAgaB의 모식도(도 1의 A)와 소형 골격 단백질 mCbpA 유전자가 pET22b(+)mCbpA의 모식도이다(도 1의 B).
도 2는 본 발명에서 제시된 재조합 벡터 pET22(+)cCueO가 삽입된 대장균의 배양 농축액의 정제를 통해 확보한 cCueO 단백질의 SDS-PAGE를 통하여 발현을 확인한 그림(도 2의 A) 및 ABTS를 기질로하였을 때의 cCueO와 조작 전의 CueO 단백질의 효소 활성을 분석한 그래프이다(도 2의 B).
도 3은 본 발명에서 제시된 pET22b(+)mCbpA가 삽입된 대장균의 배양액의 His-tag 이용과 CBM-based Recylcing Method 이용 정제 후에 SDS-PAGE을 통해 단백질을 확인하고, 발현한 단백질 소단위들의 결합을 CBM-based Recylcing Method 정제 방법과 SDS-PAGE을 통해 확인한 그림이다.
도 4는 본 발명에서 제시된 락케이스 효소 복합체의 활성을 확인하기 위하여 ABTS를 기질로 사용하여 cCueO와 mCbpA를 어셈블리 시킨 복합체의 활성 분석을 실행하여 효소 안정성을 확인하고 효소 활성의 증대를 증명한 그림이다.
도 5는 레인 2에서 보는 바와 같이, 217bp의 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 부분의 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 나타낸 것이다.
도 6은 레인 1에서 보는 바와 같이, 1563bp의 대장균으로부터 유래한 락케이즈 CueO 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 나타낸 것이다.
도 7은 레인 3에서 보는 바와 같이, 1659bp의 클로스트리디움 셀룰로보란스의 셀룰로오스-결합 단백질-에이 유전자의 일부인 mCbpA 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 나타낸 것이다.
도 8은 레인 4에서 보는 바와 같이, 1770bp의 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자가 연결된 대장균으로부터 유래한 키메릭 락케이즈 cCueO 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 나타낸 것이다.

본 발명은 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 모듈이 삽입된 재조합 벡터(pET22(+)cCueO)를 나타낸다.

본 발명은 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 모듈이 삽입되고 도 1의 A 개열지도로 나타내는 재조합 벡터(pET22(+)cCueO)를 나타낸다.

상기에서 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비(endo-β-1,4-glucanaseB, 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase, carboxymethylcellulase, CMCase; EC 3.2.1.4) 유전자는 클로스트리디움 속(Clostridium sp.)로부터 유래한 것을 사용할 수 있다.

상기에서 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자는 클로스트리디움 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans)로부터 유래한 것을 사용할 수 있다.

상기에서 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자는 클로스트리디움 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans)로부터 유래하며, 서열번호 1의 염기서열을 지니는 것을 사용할 수 있다.

상기의 재조합 벡터(pET22(+)cCueO) 내에서 도커린 모듈은 플렉서블 링커(flexible Linker)와 연결되며, 상기 플렉서블 링커는 CueO 촉매 모듈(CueO Catalytic Module))과 연결될 수 있다.

본 발명은 상기의 재조합 벡터(pET22(+)cCueO)를 대장균 삽입시켜 형질전환시킨 대장균 형질전환체(BL21/cCueO)(기탁번호: KCCM11409P)를 포함한다.

본 발명의 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 모듈이 삽입된 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시킨 대장균 형질전환체에 대해 다양한 조건으로 실시한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건에 의해 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 모듈이 삽입된 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시킨 대장균 형질전환체을 제공하는 것이 바람직하다.

이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자, 락케이즈 유전자의 증폭

락케이즈 효소 복합체 형성을 위한 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자를 클로닝하기 위하여 클로스트리디움 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans)의 지노믹디엔에이(genomic DNA)로부터 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린(dockerin) 부분의 염기서열(서열번호 2)을 참고로 하여 정방향 프라이머(forward primer)의 5’에는 대장균으로부터 유래한 락케이즈 CueO 유전자의 C-terminal 부분의 10bp 크기의 서열(서열번호 3)이, 역방향 프라이머(rverse primer)의 5’에는 제한효소 NotⅠ 인식서열(서열번호 4)이 삽입되도록 프라이머를 디자인하여 합성하였다.

이후 상기 합성된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 구체적으로는, Clostridium cellulovorans의 Genomic DNA를 Template로 하여, 합성된 한쌍의 프라이머와 함께, dNTP를 기질로 하여 DNA Polymerase의 효소 활성을 반응을 94도, 52도, 72도에서 35 Cycle 반응을 하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었는데, 레인 2에서 보는 바와 같이, 217bp의 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 부분의 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 확인할 수 있었다.

대장균으로부터 유래한 락케이즈 CueO 유전자(서열번호 5)를 클로닝하기 위하여 정방향 프라이머(forward primer)의 5’에는 제한효소 NcoI (서열번호 6), 역방향프라이머(reverse primer)의 5’에는 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 부분의 N-terminal 부분의 10bp 크기의 서열(서열번호 7)이 각각 삽입된 프라이머를 합성하였다. 이후, 상기 합성된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

구체적으로는, Escherichia coli JM109의 Genomic DNA를 주형으로 하여, 합성된 한쌍의 프라이머와 함께, dNTP를 기질로 하여 DNA Polymerase의 효소 활성을 반응을 94도, 52도, 72도에서 35 Cycle 반응을 하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었는데, 레인 1에서 보는 바와 같이, 1563bp의 대장균으로부터 유래한 락케이즈 CueO 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 확인할 수 있었다.

그리고, 클로스트리디움 셀룰로보란스의 기본 골격 소단위체(primary scaffolding subunit)인 셀룰로오스-결합 단백질-에이(Cellulose-binding protein A) 중 셀룰로오스 결합 모듈(Cellulose binding module; CBM)과 코히즌1 모듈(Cohesin1 module, Coh1) 및 코히즌2 모듈(Cohesin2 module, Coh2)의 두 개의 코히즌 모듈(Cohesin module)을 가진 소형 셀룰로오스-결합 단백질-에이(Mini-Cellulose-binding protein A, MiniCbpA) 유전자를 클로닝하기 위해 서열번호 8의 염기서열을 참고로 하여 정방향 프라이머(forward primer)의 5‘에는 제한효소 BamHI (서열번호 9), 역방향 프라이머(reverse primer)에는 제한효소 XhoI 인식서열 (서열번호 10)이 각각 삽입된 프라이머를 합성하였다.

그 결과를 도 7에 나타내었는데, 레인 3에서 보는 바와 같이, 1659bp의 클로스트리디움 셀룰로보란스의 셀룰로오스-결합 단백질-에이 유전자의 일부인 mCbpA 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 확인할 수 있었다.

<실시예 2> 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자와 베타-아가레이즈 유전자의 연결 및 클로닝

상기 실시예 1에서 얻은 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자와 CueO 증폭산물을 0.8％ 아가로스 겔 상에서 전기영동하였고 아가로스 겔 상의 DNA 절편은 Gel extraction kit(입수처:GeneAll)를 사용하여 회수하였다.

그 후, 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자와 락케이즈 유전자의 연결하기 위해 회수한 DNA 절편을 이용하여 오버렙(Overlap) PCR 반응을 수행하였다. 이전에 확보한 두 DNA 절편을 프라이머 없이 Annealing Time을 25min으로 늘려 DNA Polymerase 반응을 10 Cycle 수행하였다.

정방향 프라이머(forward primer)의 5’에는 제한효소 NcoI(서열번호 11), 역방향 프라이머(reverse primer)의 5’에는 제한효소 NotⅠ 인식서열(서열번호 12)이 삽입되도록 프라이머를 디자인하여 합성하였다.

오버랩된 PCR 결과물을 주형으로 하여 합성된 DNA 절편과 합성한 양 말단의 두 프라이머를 이용하여, dNTP를 기질로 하여 DNA Polymerase의 효소 활성을 반응을 94도, 52도, 72도에서 35 Cycle 반응을 하였다.

PCR 반응을 수행한 결과를 도 8에 나타내었는데, 레인 4에서 보는 바와 같이, 1770bp의 섬유소 분해효소의 도커린 도메인의 유전자가 연결된 대장균으로부터 유래한 키메릭 락케이즈 cCueO 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 확인할 수 있었다.

그 후, 키메릭 락케이즈 cCueO 유전자는 절단한 후 대장균 발현 벡터(E. coli expression vector)인 pET22b(+)에 라이게이션(ligation)시켜 NcoⅠ과 NotⅠ으로 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli, E. coli) BL21에 형질전환을 하여 형질전환체를 얻었다. 이어서 형질전환체로부터 라이게이션(ligation)된 재조합 플라스미드 DNA를 분리하였다.

상기 재조합 벡터를 pET22(+)cCueO라 명명하였고, 도 1의 A에 도시하였다. 그리고, 상기 대장균 형질전환체를 BL21/cCueO라 명명하고, 이를 2013년 4월 9일, 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM11409P로 기탁하였다.

또한, 도 1의 B에 나타나 있는 것처럼, 소형 셀룰로오스-결합 단백질 유전자 또한 절단 후 대장균 발현 벡터(E. coli expression vector)인 pET22b(+)에 라이게이션(ligation)시켜 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli , E. coli) BL21에 형질전환을 하여 형질전환체를 얻였다.

이어 형질전환체로부터 라이게이션(ligation)된 재조합 플라스미드 DNA를 분리하였다. 상기 재조합 벡터를 pET22(+)mCbpA라 명명하였고, 도 1의 A에 도시하였다. 그리고, 상기 대장균 형질전환체를 BL21/mCbpA라 명명하였다.

<시험예 1> 대장균 형질전환체의 아가레이즈 활성 측정

상기 실시예 2에서 확보한 형질전환체의 효소 단백질 발현을 확인하기 위하여, ABTS(2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)를 기질로 하는 효소 활성 측정, SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 를 수행하였다.

대장균 형질전환체(BL21/cCueO)를 IPTG(isopropyl 1-thio-β-Dgalactoside)로 발현 유도하여 키메릭 CueO 효소 단백질이 배양액으로 분비되도록 하는 조건(30도 Shaking Incubator, 200 rpm)을 조성하여 30℃에서 5시간 동안 진탕배양 후, 원심분리(4000xg 10min)하여 상등액을 준비하고 농축하여(Millipore, amicon 10kDa cut off) cCueO 효소 단백질을 얻었다.

SDS-PAGE는 10％ 폴리-아크릴아미드 겔(poly-acrylamide gel)을 사용하여 효소 단백질을 전기영동하였다. cCueO 단백질의 C-terminal에 연결되어 있는 His-tag을 이용하여 Ni-NTA Resin을 이용하여 정제한 후 로딩하였다.

그 결과 예상한 cCueO 단백질 사이즈와 동일한 위치에서 나타남을 확인할 수 있었으며, 이의 결과를 도 2의 A에 나타내었는데, 상기 도 2의 B 그래프는 시간에 따른 효소 활성의 변화를 측정한 것이며, 15분 간격으로 120분 동안 효소 활성을 측정한 결과이다.

상기 cCueO 효소 단백질의 효소 활성을 확인하기 위해 ABTS를 효소반응의 기질로 사용하였다. 형질전환된 대장균의 콜로니를 LB 배지(Luria Bertani media broth)에 접종하여 24시간 동안 37℃에서 배양하고, IPTG를 함유한 LB 액상배지에서 5시간 동안 37℃에서 배양한 배양액을 농축하여 얻은 효소 단백질을 Sodium acetate Buffer에 1mmol/L ABTS를 혼합한 반응액에 첨가하여 반응을 유도하였다.

그 후 락케이즈 효소에 의한 ABTS의 산화를 파장 420nm에서의 흡광도를 측정하여 정량 분석하였고 그 결과를 각각 도 2의 B에 도시하였다.

<시험예 2> 형질전환체의 소형 셀룰로오스-결합 단백질 발현

도커린 모듈이 연결된 키메릭-락케이즈의 복합체 형성을 확인하기 위하여, 소형 셀룰로오스-결합 단백질이 가진 셀룰로스-결합 모듈(Cellulse binding module; CBM)과 셀룰로오스 사이의 상호작용을 이용한 단백질 정제를 실행하였다.

도 1의 B 재조합 벡터(pET22b(+)mCbpA)를 대장균에 삽입시킨 형질전환체의 발현 유도하여 mCbpA 단백질이 배양액으로 분비되도록 하는 조건 (30도 Shaking Incubator, 200 rpm)을 조성하여 LB 배지에 접종하여 24시간 동안 37℃에서 배양하고, IPTG를 함유한 LB 액상배지에서 5시간 동안 37℃에서 배양한 상등액을 준비하고 농축하여(Millipore, amicon 10kDa cut off) mCbpA 소형 셀룰로오스-결합 단백질을 얻었다.

셀룰로오스-결합 모듈(Cellulse binding module; CBM)과 셀룰로오스 사이의 상호작용을 이용한 단백질 정제를 위해 셀룰로오스(Sigmacell Type 50, SIGMA)를 mCbpA 소형 셀룰로오스-결합 단백질에 첨가하여 1시간 동안 실온(25℃)에서 반응시켰다.

반응 후 1몰 소듐 클로라이드(sodium chloride) 0.02mol 트리스 버퍼(tris buffer, pH 8.0)로 세 번 헹구어낸 후 0.05mol 트리스 버퍼(pH 12.5)로 용리하였다. 이의 SDS-PAGE는 10％ poly-acrylamide gel을 사용하여 효소 단백질을 전기영동하였다. 그 결과 58kDa 위치에 단백질 밴드를 확인하였으며, 이의 결과를 도 3에 도시하였다.

<시험예 3> 락케이즈 효소 복합체 형성의 확인

엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 모듈이 연결된 대장균으로부터 유래한 키메릭 락케이즈 cCueO의 cCueO 효소 단백질과 소형 셀룰로오스-결합 단백질 mCbpA의 결합으로 인한 복합체의 형성을 확인하기 위해 상기 두 단백질을 4℃에서 2:1의 부피 비율로 섞어 4℃에서 24시간 동안 배양한 후 두 단백질의 복합체 형성 여부를 확인하기 위해 우선 셀룰로오스-결합 모듈(Cellulse binding module; CBM)과 셀룰로오스 사이의 상호작용을 이용한 단백질 정제 후에 SDS-PAGE를 통해 분석하고 이 결과를 도 3에 도시하였다.

엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 모듈이 연결된 대장균으로부터 유래한 키메릭 락케이즈 cCueO 효소 단백질과 소형 셀룰로오스-결합 단백질 mCbpA의 결합으로 인한 복합체의 활성을 확인하기 위해 ABTS를 기질로 하는 활성 분석을 수행하였다. 상기 방법대로 실행결과 락케이즈 효소 복합체가 형성된 경우 단일 락케이즈 효소보다 활성이 높게 측정되었고 이 결과를 도 4의 A에 나타내었다.

도 4의 A는 락케이스 효소의 활성을 ABTS를 기질로 하여 측정하였으며, 각각 [1]은 mCbpA만 있을 경우, [2] 락케이즈만 있을 경우, [3] 락케이즈 효소 복합체의 활성을 나타낸다. 이를 보아 복합체를 형성할 경우 효소 활성이 증대되었음을 볼 수 있다.

또한, 도 4의 B의 경우는 시간에 따를 효소 활성의 변화를 나타내는 것으로, 락케이즈 효소만의 활성을 나타내는 아래의 그래프에 비하여 락케이즈 복합체의 활성을 나타내는 위의 그래프가 더 높은 효소 활성을 가지는 것을 볼 수 있으며, 15분 간격으로 120분 동안 효소 활성을 측정하였다.

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예 및 시험예를 참조하여 설명하였지만 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

또한 본 발명에 따라 키메릭 락케이즈 cCueO를 대량 생산할 수 있으며, 또한 생산된 키메릭 락케이즈 cCueO를 다른 효소 및/또는 단백질과 결합시킨 복합체를 대량으로 생산할 수 있어 바이오매스의 생물학적 전처리에 있어 효과적으로 작용하여 경제적으로 저렴하고 생산적으로 효율적인 바이오 에탄올 공정에 유용한 발명인 것으로 기대된다. 또한 이는 양조, 제빵, 알코올 생산, 사료 생산 및 생균제 개발 등에 유용하게 사용될 수 있어 산업적으로 다양한 통합된 바이오프로세싱(Consolidated bioprocessing)에 매우 유용하므로 산업상 이용가능성이 있다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11409P

20130409

<110> Korea Forest Research Institute <120> A recombinant vector introduced with chimeric laccse gene which fused by dockerin module of endoglucanse B and a transformant Escherichia coli comprising the vector <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1323 <212> DNA <213> Clostridium cellulovorans <220> <221> gene <222> (1) <223> endo-beta-1,4-glucanase B <400> 1 atgaataaaa gattatcacg gggaaagata tctcttttag catcagtttt cgttaccaca 60 acttttatgg ggggagtaaa tgttctcgca tctacagcta agacaggtat tcgtgacata 120 acttctcaac aagttgttaa ggaaatgaag gttggttgga acttaggaaa tacaatggat 180 gctacaggag gagaaacaaa ttgggggaat ccattaacaa cacatgccat gattgacaaa 240 gtaaaagcag caggctttaa tactttaagg cttccaataa cttgggatgg tcatattgga 300 gcagcaccag attatgctat tgatgcaaca tggatgaata gagtcgaaga aatagcaaat 360 tatgcttttg ataataatat gtatgttata ataaatcttc atcacgaaga tggatggctt 420 aagccttatt atgccaatga ggctgaagta aaagctaaaa tcacaaaagt atggacacaa 480 attgcaaatc gctttaaaga ttatggggat tatctaattt ttgaaacaat gaatgaacct 540 cgtccagtag gcgcagctga tgaatggtct ggtggctcct atgaaaatcg agatatggtt 600 aatagatata atttaacagc ggtaaacact attagagcta ctggtggaaa taatgcatta 660 aggcacatta tggttccaac tcttgcagca gcagcactta gcacaacaat gaatgattac 720 atagtaccaa ataatgatag cagagttata gtatccttac atatgtattc accatatttc 780 ttctctgcag atcttactag tcaatggact acagcaactt ggggaagtga tgctgataag 840 gctgcactaa gtgctgactt tgatgcagtt tataataagt ttgttaagaa tggaagagct 900 gtagttattg gcgaaatggg aacaatcaat aagaataatt tagattctag agtgaaacat 960 gcagaatatt atgctaaaga agcaacagtt agagggataa ctcctatatg gtgggataat 1020 ggatattgtg ttgctggaaa agagcaaacc ttcggaatat ttaatagaaa gaatcttact 1080 tggtgttgtc cagaagttat gcaagctttc ataagaggag caggtgccac acaaactcaa 1140 acttcttatt cactaggtga tgttaacaaa gatggaaagg taaatgctat cgattatgca 1200 gtgcttaaat caattctttt aggtacaaat actaacgttg atttatcagt atcagacatg 1260 aataaggatg gtaaagtaaa tgctttggat ttagctgttc ttaaaaaaat gcttttaagc 1320 taa 1323 <210> 2 <211> 159 <212> DNA <213> Clostridium cellulovorans <220> <221> gene <222> (1) <223> dockerin of endo-beta-1,4-glucanase B <400> 2 gatgttaaca aagatggaaa ggtaaatgct atcgattatg cagtgcttaa atcaattctt 60 ttaggtacaa atactaacgt tgatttatca gtatcagaca tgaataagga tggtaaagta 120 aatgctttgg atttagctgt tcttaaaaaa atgctttta 159 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 tggggaattc 10 <210> 4 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 gcggccgc 8 <210> 5 <211> 1545 <212> DNA <213> E. coli <220> <221> gene <222> (1) <223> laccase CueO gene <400> 5 caacgtcgtg atttcttaaa atattccgtc gcgctgggtg tggcttcggc tttgccgctg 60 tggagccgcg cagtatttgc ggcagaacgc ccaacgttac cgatccctga tttgctcacg 120 accgatgccc gtaatcgcat tcagttaact attggcgcag gccagtccac ctttggcggg 180 aaaactgcaa ctacctgggg ctataacggc aatctgctgg ggccggcggt gaaattacag 240 cgcggcaaag cggtaacggt tgatatctac aaccaactga cggaagagac aacgttgcac 300 tggcacgggc tggaagtacc gggtgaagtc gacggcggcc cgcagggaat tattccgcca 360 ggtggcaagc gctcggtgac gttgaacgtt gatcaacctg ccgctacctg ctggttccat 420 ccgcatcagc acggcaaaac cgggcgacag gtggcgatgg ggctggctgg gctggtggtg 480 attgaagatg acgagatcct gaaattaatg ctgccaaaac agtggggtat cgatgatgtt 540 ccggtgatcg ttcaggataa gaaatttagc gccgacgggc agattgatta tcaactggat 600 gtgatgaccg ccgccgtggg ctggtttggc gatacgttgc tgaccaacgg tgcaatctac 660 ccgcaacacg ctgccccgcg tggttggctg cgcctgcgtt tgctcaatgg ctgtaatgcc 720 cgttcgctca atttcgccac cagcgacaat cgcccgctgt atgtgattgc cagcgacggt 780 ggtctgctac ctgaaccagt gaaggtgagc gaactgccgg tgctgatggg cgagcgtttt 840 gaagtgctgg tggaggttaa cgataacaaa ccctttgacc tggtgacgct gccggtcagc 900 cagatgggga tggcgattgc gccgtttgat aagcctcatc cggtaatgcg gattcagccg 960 attgctatta gtgcctccgg tgctttgcca gacacattaa gtagcctgcc tgcgttacct 1020 tcgctggaag ggctgacggt acgcaagctg caactctcta tggacccgat gctcgatatg 1080 atggggatgc agatgctaat ggagaaatat ggcgatcagg cgatggccgg gatggatcac 1140 agccagatga tgggccatat ggggcacggc aatatgaatc atatgaacca cggcgggaag 1200 ttcgatttcc accatgccaa caaaatcaac ggtcaggcgt ttgatatgaa caagccgatg 1260 tttgcggcgg cgaaagggca atacgaacgt tgggttatct ctggcgtggg cgacatgatg 1320 ctgcatccgt tccatatcca cggcacgcag ttccgtatct tgtcagaaaa tggcaaaccg 1380 ccagcggctc atcgcgcggg ctggaaagat accgttaagg tagaaggtaa tgtcagcgaa 1440 gtgctggtga agtttaatca cgatgcaccg aaagaacatg cttatatggc gcactgccat 1500 ctgctggagc atgaagatac ggggatgatg ttagggttta cggta 1545 <210> 6 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 6 ccatgg 6 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 7 tcggatccga 10 <210> 8 <211> 1647 <212> DNA <213> Clostridium cellulovorans <220> <221> gene <222> (1) <223> cellulose-binding protein A <400> 8 gcagcgacat catcaatgtc agttgaattt tacaactcta acaaatcagc acaaacaaac 60 tcaattacac caataatcaa aattactaac acatctgaca gtgatttaaa tttaaatgac 120 gtaaaagtta gatattatta cacaagtgat ggtacacaag gacaaacttt ctggtgtgac 180 catgctggtg cattattagg aaatagctat gttgataaca ctagcaaagt gacagcaaac 240 ttcgttaaag aaacagcaag cccaacatca acctatgata catatgttga atttggattt 300 gcaagcggag cagctactct taaaaaagga caatttataa ctattcaagg aagaataaca 360 aaatcagact ggtcaaacta cactcaaaca aatgactatt catttgatgc aagtagttca 420 acaccagttg taaatccaaa agttacagga tatataggtg gagctaaagt acttggtaca 480 gcaccaggtc cagatgtacc atcttcaata attaatccta cttctgcaac atttgataaa 540 aatgtaacta aacaagcaga tgttaaaact actatgactt taaatggtaa cacatttaaa 600 acaattacag atgcaaacgg tacagctcta aatgcaagca ctgattatag tgtttctgga 660 aatgatgtaa caataagcaa agcttattta gcaaaacaat cagtaggaac aactacatta 720 aactttaact ttagtgcagg aaatcctcaa aaattagtaa ttacagtagt tgacacacca 780 gttgaagctg taacagctac aattggaaaa gtacaagtaa atgctggaga aacggtagca 840 gtaccagtta acttaacaaa agttccagca gctggtttag caacaattga attaccatta 900 acttttgatt ctgcatcatt agaagtagta tcaataactg ctggagatat cgtattaaat 960 ccatcagtaa acttctcttc tacagtaagt ggaagcacaa taaaattatt attcttagat 1020 gatacattag gaagccaatt aatcactaag gatggagttt ttgcaacaat aacatttaaa 1080 gcaaaagcta taactggaac aactgcaaaa gtaacttcag ttaaattagc tggaacacca 1140 gtagttggtg atgcgcaatt acaagaaaaa ccttgtgcag ttaacccagg aacagtaact 1200 atcaatccaa tcgataatag aatgcaaatt tcagttggaa cagcaacagt aaaagctgga 1260 gaaatagcag cagtgccagt aacattaaca agtgttccat caactggaat agcaactgct 1320 gaagcacaag taagttttga tgcaacatta ttagaagtag catcagtaac tgctggagat 1380 atcgtattaa atccaacagt aaacttctct tatacagtaa acggaaatgt aataaaatta 1440 ttattcctag atgatacatt aggaagccaa ttaattagta aagatggagt ttttgtaaca 1500 ataaacttca aagcaaaagc tgtaacaagc acagtaacaa caccagttac agtatcagga 1560 acacctgtat ttgcagatgg tacattagca gaagtacaat ctaaaacagc agcaggtagc 1620 gttacaataa atattggaga tcctata 1647 <210> 9 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 9 ggatcc 6 <210> 10 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 10 ctcgag 6 <210> 11 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 11 ccatgg 6 <210> 12 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 12 gcggccgc 8

Claims

엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 유전자의 도커린 모듈이 삽입되고 도 1의 A 개열지도로 나타내는 재조합 벡터(pET22(+)cCueO).
제1항에 있어서,
엔도-베타-1,4-글루칸아제-비(endo-β-1,4-glucanaseB, 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase, carboxymethylcellulase, CMCase; EC 3.2.1.4) 유전자는 클로스트리디움 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans)로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 재조합 벡터(pET22(+)cCueO).
제1항에 있어서,
도커린 모듈은 플렉서블 링커(flexible Linker)와 연결되며, 상기 플렉서블 링커는 CueO 촉매 모듈(CueO Catalytic Module))과 연결된 것임을 특징으로 하는 재조합 벡터(pET22(+)cCueO).
제1항의 재조합 벡터(pET22(+)cCueO)를 대장균 삽입시켜 형질전환시킨 대장균 형질전환체 BL21/cCueO (KCCM11409P).