KR20220020766A

KR20220020766A - 탄산탈수효소 복합체 및 이에 의한 이산화탄소 생물학적 고정화 및 지질 생산 강화 방법

Info

Publication number: KR20220020766A
Application number: KR1020210094366A
Authority: KR
Inventors: 한성옥; 유승규; 박현민
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2020-08-12
Filing date: 2021-07-19
Publication date: 2022-02-21
Also published as: KR102582851B1

Abstract

본 발명은 탄산탈수효소 및 도커린 모듈의 결합체;가 코헤신 모듈 및 셀룰로오스 결합 모듈(cellulose binding module, CBM)을 포함하는 소형 셀룰로오스 결합 단백질;에 결합된 탄산탈수효소 복합체와 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 복합체는 셀룰로오스 결합 모듈을 포함하여 녹조류의 표면에 고정화됨으로써 기질에 대한 접근성 및 효소의 활성을 높여 이산화탄소를 효율적으로 고정시키고, 다른 탄소원의 첨가 없이 녹조류의 생장 및 지질 생산을 증가시킬 수 있다. 본 발명은 이산화탄소 고정을 이용한 바이오 연료 등의 분야에서 활발하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

탄산탈수효소 복합체 및 이에 의한 이산화탄소 생물학적 고정화 및 지질 생산 강화 방법{Carbonic anhydrase complex and method for enhancing carbon dioxide biofixation and lipid production through the complex}

본 발명은 탄산탈수효소 복합체 등에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 탄산탈수효소 및 도커린 모듈의 결합체가 코헤신 모듈 및 셀룰로오스 결합 모듈(cellulose binding module, CBM)을 포함하는 소형 셀룰로오스 결합 단백질에 결합된 탄산탈수효소 복합체와 이의 제조방법 등에 관한 것이다.

석유는 한정된 재생 불가능한 에너지 자원이며, 이와 관련된 환경적 문제로 인해 재생가능한 에너지 자원의 필요성이 강조되고 있다. 화석연료의 연소는 이산화탄소(carbon dioxide, CO₂) 및 부산물로서 일산화탄소(carbon monoxide, CO), 산화질소(nitric oxide, NO), 및 황 산화물(sulfur oxide, SOx)을 생산한다. 이산화탄소는 주요 온실가스로서 지구 온난화의 주 원인으로 고려된다. 대기 중 CO₂를 감소시키기 위한 화학적 및 생물학적 접근에 관한 연구가 갈수록 증가하고 있다. 생물학적 CO₂는 주로 유기 화합물이 육상 식물(terrestrial plants) 또는 미세조류(microalgae)에 의한 광합성(photosynthesis)을 통해 CO₂로 변환되어 포집된다. 미세조류에 의한 CO₂의 생물학적 고정(fixation)은 육상 식물에 의한 고정과 비교하여 빠른 생장, 높은 광합성 효율 및 CO₂ 고정 조절 능력을 포함한 많은 장점이 있다.

클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)는 광합성을 통해 CO₂를 사용하는 녹조류로서, 가장 풍부하고, 널리 연구된 미세조류이다. C. vulgaris는 세포 내부에 지질을 생산하고 축적하는 능력이 있어 바이오디젤(biodiesel)의 잠재적 생산자로 연구되어 왔다. C. vulgaris의 생장 및 지질 생산에 대한 연구는 크게 하기의 두 카테고리로 구분된다. 기질로서 CO₂의 농도에 관한 연구와 다른 배양 조건(빛의 세기, pH, 폭기(aeration), 염도, 및 온도)의 효과에 대한 분석학적 연구이다. 특히, CO₂의 공급이 증가하면, 세포 내 아세틸-CoA 수준 및 지질 축적은 2.6% CO₂ 만큼 증가한다. 용존무기탄소(dissolved inorganic carbon, DIC) 자원에 따라, C. vulgaris의 생장 및 지질 축적에 최적화된 5% CO₂ 조건 하에서 바이오매스의 생산성은 27%, 바이오디젤의 생산성은 7.7% 증가할 수 있다.

탄산탈수효소(carbonic anhydrase, CA)는 동물, 식물, 및 미생물이 쉽게 CO₂를 중탄산염으로 전환하도록 하는 효소이다. 탄산탈수효소에 대한 대부분의 연구는 탄산탈수효소의 구조에 관한 것이며, 일부 탄산탈수효소는 효소 활성 또는 열적 안정성을 높이기 위해 이량체(dimer) 또는 사량체(tetramer)를 형성한다는 점이 보고된 바 있다. 탄산탈수효소를 산업적으로 활용함에 있어 주요 한계는 CO₂를 포집하는 장비가 열악한 환경에 놓인 경우 효소가 불안정하다는 점이다. 상기 한계를 극복하기 위해, 이황화 결합을 첨가하거나, 혹독한 환경에서의 직접적인 진화를 유도하거나, 탄산수소효소의 표면 잔기를 변형시키거나, 효소 고정화 기법(enzyme immobilzation techniques), 전체 세포 기법(whole cell strategies)을 사용하는 등 다양한 시도가 이루어졌다. 하지만 탄산수소효소를 직접적으로 이용하여 미세조류(microalgae)의 생장 및 지질 생산을 증가시키는 연구는 아직 보고되지 않았다.

“4세대 바이오연료(4th generation biofuels)”은 3세대 바이오연료의 탄소 포집 및 저장 기술(Carbon Capture & Storage, CCS)이 향상된 것으로서, “조류를 바이오연료로(algae to biofuels)”라는 키워드로 바이오기술을 접목시킨 것이다. 광합성 세균(photosynthetic bacteria) 또는 미세조류는 4세대 바이오연료 생산을 위한 전도유망한 미생물로 사용되었으며, 최근 연구는 영양 배지 조성, 배양 조건, 대사 공학, 유전 공학, 또는 효소 공학을 통해서 상기 세균의 탄소 포집 및 저장 기술(CCS) 능력을 향상시켰다.

이에, 본 발명자들은 녹조류에서 CO₂ 고정을 향상시켜 생장 및 지질 생산을 증가시키기 위하여 탄산탈수효소(CA)의 복합체를 형성하는 방법에 대해 연구함으로써 본 발명을 완성하였다.

Kang, D.H., You, S.K., Joo, Y.C., Shin, S.K., Hyeon, J.E., Han, S.O. (2018). Synergistic effect of the enzyme complexes comprising agarase, carrageenase and neoagarobiose hydrolase on degradation of the red algae. Bioresour Technol, 250, 666-672. Liu, X., Sadhukhan, S., Sun, S., Wagner, G.R., Hirschey, M.D., Qi, L., Lin, H., Locasale, J.W. (2015). High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol Cell Proteomics, 14(6), 1489-500. You, S.K., Joo, Y.C., Kang, D.H., Shin, S.K., Hyeon, J.E., Woo, H.M., Um, Y., Park, C., Han, S.O. (2017). Enhancing Fatty Acid Production of Saccharomyces cerevisiae as an Animal Feed Supplement. J Agric Food Chem, 65(50), 11029-11035.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 탄산탈수효소 복합체와 이를 포함하는 이산화탄소 고정화 반응 촉진용 조성물 및/또는 녹조류의 지질 생산 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 탄산탈수효소 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 탄산탈수효소 복합체를 이용한 이산화탄소 고정화 방법 및/또는 녹조류의 지질 생산성을 증가시키는 배양 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 탄산탈수효소 및 도커린 모듈의 결합체가 코헤신 모듈 및 셀룰로오스 결합 모듈(cellulose binding module, CBM)을 포함하는 소형 셀룰로오스 결합 단백질에 결합된 탄산탈수효소 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 탄산탈수효소 복합체를 포함하는 이산화탄소 고정화 반응 촉진용 조성물 및/또는 녹조류의 지질 생산 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 탄산탈수효소 복합체의 제조방법을 제공한다.

(1) 탄산탈수효소를 암호화하는 유전자 및 도커린 모듈을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 주입한 제1형질전환체 제조단계;

(2) 코헤신 모듈을 암호화하는 유전자 및 셀룰로오스 결합 모듈을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 주입한 제2형질전환체 제조단계; 및

(3) 상기 제1 및 제2 형질전환체를 배지에서 배양하는 단계.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 탄산탈수효소 복합체는 상기 제1형질전환체의 배양물과제2형질전환체의 배양물을 몰분율 2:1로 혼합하여 제조하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (1) 단계의 탄산탈수효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 유전자일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (1) 단계의 도커린 모듈을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 유전자일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (2) 단계의 코헤신 모듈을 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 유전자일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (2) 단계의 셀룰로오스 결합 모듈을 암호화하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 포함하거나, 이로 이루어진 유전자일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 제조방법에서 상기 벡터가 주입되어 숙주로 이용되는 형질전환체는 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (1) 및 (2) 단계의 벡터는 상기 숙주 세포에서 활발하게 발현되는 것이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 pColdⅡ플라스미드 벡터일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 이산화탄소 고정화 방법을 제공한다.

(1) 제1항의 탄산탈수효소 복합체를 제조하는 단계; 및

(2) 상기 제조된 탄산탈수효소 복합체에 이산화탄소를 공급하여 상기 이산화탄소를 중탄산염으로 전환시키는 단계.

또한, 본 발명은 녹조류에 제1항의 탄산탈수효소 복합체를 처리하는 단계를 포함하는, 녹조류의 지질 생산성을 증가시키는 배양 방법을 제공한다. 상기 지질은 바람직하게는 지방산, 더욱 바람직하게는 불포화 지방산일 수 있다.

본 발명은 탄산탈수효소 및 도커린 모듈의 결합체가 코헤신 모듈 및 셀룰로오스 결합 모듈(cellulose binding module, CBM)을 포함하는 소형 셀룰로오스 결합 단백질에 결합된 탄산탈수효소 복합체와 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 복합체는 셀룰로오스 결합 모듈을 포함하여 녹조류의 표면에 고정화됨으로써 기질에 대한 접근성 및 효소의 활성을 높여 이산화탄소를 효율적으로 고정시키고, 다른 탄소원의 첨가 없이 녹조류의 생장 및 지질 생산을 증가시킬 수 있다. 본 발명은 이산화탄소 고정을 이용한 바이오 연료 등의 분야에서 활발하게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 CA 복합체를 녹조류(C. vulgaris) 표면에 고정화하는 방법 및 이를 통한 녹조류(C. vulgaris)의 생장 및 지질 생산을 증가시키는 전략을 개략적으로 나타낸 것이다. (CBM: 셀룰로오스 결합 모듈(cellulose binding module), mCbpA: 소형 셀룰로오스 결합 단백질 에이, Coh: 코헤신(cohesin), Doc: 도커린(dockerin), CA: 탄산탈수효소)
도 2는 상기 CA 복합체의 표면 고정화를 확인하기 위한 공초점 형광 현미경 사진으로, (A) GFP-doc를 처리한 대조군과 (B) GFP-doc-mCbpA를 처리한 실험군을 비교한 것이다. 왼쪽은 CBM을 포함하는 mCbpA에서 세포 이미지이고, 오른쪽은 동일한 세포의 표면에 나타난 녹색 형광 프로브 이미지로, 위상차(pahse contrast)에 의해 탐지되었다.
도 3은 CA 복합체의 형성이 탄산탈수효소 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A)는 CA 복합체와 단일 효소(cCA)의 상대적인 효소 활성 수준을, (B)는 CA 복합체와 단일 효소(cCA)의 안정성을 비교한 것이다.
도 4는 CA 복합체가 세포 생장에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 세포 밀도(cell density)를 위해 흡광도(optical density, OD)는 540 nm 파장에서 측정되었다.
도 5는 C. vulgaris에서 CA 복합체가 말로닐-CoA의 세포 내 농도에 미치는 영향을 HPLC로 분석한 것이다.
도 6은 C. vulgaris의 지질 함량 분석 결과를 나타낸 것으로서, 지질은 클로로포름을 이용하여 추출하고, 건중량법(dry weight method)으로 분석하였다.
도 7은 지방산 생산량 및 함량을 가스 크로마토그래피(GC)로 분석한 결과를 나타낸 것으로서, (A)는 총 지방산 생산량, (B)는 총 지방산 함량을 나타낸 것이다.

본 발명자들은 안정적이고 효율적으로 녹조류에서 이산화탄소를 고정하는 기술에 대해 연구하여, 탄산탈수효소를 복합체화하여 녹조류의 표면에 고정하는 경우 탄산탈수효소의 활성 및 안정성이 증가하고, 기질에 대한 접근성이 높아져, 이산화탄소의 고정량이 증가할 뿐만 아니라 녹조류의 세포 생장과 지질 생산이 증가함을 구체적인 실험으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 탄산탈수효소 및 도커린 모듈의 결합체가 코헤신 모듈 및 셀룰로오스 결합 모듈(CBM)을 포함하는 소형 셀룰로오스 결합 단백질(mCbpA)에 결합된 탄산탈수효소 복합체를 제공한다.

본 발명에서 “탄산탈수효소(carbonic anhydrase, CA)”는 탄산무수화효소라고도 하며, 이산화탄소의 수화반응을 촉매하는 금속 효소로서, 상기 수화반응의 결과 중탄산염(HCO₃ ^-) 을 생성한다. 본 발명에서 탄산탈수효소 유전자는 알파-탄산탈수효소(α-carbonic anhydrase)를 암호화하는 하이드로제노비브리오 마리너스(Hydrogenovibrio marinus) 균주 유래의 hmCA 유전자(서열번호 1)을 이용하였으나, DNA 서열 또는 유전 코드의 디제너러시(degeneracy)를 고려하여 상기 유전자의 염기서열과 80% 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자를 이용할 수 있다.

본 발명에서 용어 “중탄산염”은 중탄산염 그룹(HCO₃ ^-)을 함유하는 무기물 성분을 의미하며, 상기 용어는 중탄산염, 중탄산염 이온, 또는 중탄산염과 탄산염의 혼합물을 포함할 수 있다. “탄산염”은 탄산염 그룹(CO₃ ^2-)을 함유하는 무기물 성분을 의미하며, 상기 용어는 탄산염, 탄산염 이온, 또는 중탄산염과 탄산염의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명에서 “도커린(Dokerin)”은 탄산탈수효소가 복합체화 하는데 핵심적인 단백질이며, 클로스트리듐(Clostridium), 보다 구체적으로 클로스트리디움 셀룰로보란스 (C. cellulovorans) 균주 유래의 도커린 유전자(서열번호 2)를 이용하였으나, DNA 서열 또는 유전 코드의 디제너러시(degeneracy)를 고려하여 상기 유전자의 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자를 이용할 수 있다.

본 발명에서 “코헤신(Cohesin)”은 도커린과 상호작용하여 탄산탈수효소가 복합체를 형성하도록 하는 골격단백질(scaffoldin)의 핵심 단백질이며, 셀룰로오스 결합 단백질과 결합할 수 있도록 하는 기능을 수행하는 것으로서, 클로스트리듐(Clostridium), 보다 구체적으로 클로스트리디움 셀룰로보란스 (C. cellulovorans) 균주 유래의 코헤신 유전자(서열번호 3)를 이용하였으나, DNA 서열 또는 유전 코드의 디제너러시(degeneracy)를 고려하여 상기 유전자의 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자를 이용할 수 있다.

한편, 본 발명은 효율적이고 안정적으로 이산화탄소를 고정하기 위해 셀룰로좀을 모방하여 소형의 기능적인 복합체를 제공하며, 상기 복합체는 셀룰로오스 결합 모듈(CBM)을 포함하는바, 녹조류의 세포벽 표면에 고정화한 상태로 발현되어 탄산탈수효소의 활성 및 안정성을 높일 수 있다. 상기 셀룰로오스 결합 모듈은 클로스트리듐(Clostridium), 보다 구체적으로 클로스트리디움 셀룰로보란스 (C. cellulovorans) 균주 유래의 유전자(서열번호 4)를 이용하였으나, DNA 서열 또는 유전 코드의 디제너러시(degeneracy)를 고려하여 상기 유전자의 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자를 이용할 수 있다.

본 발명에서 "벡터(vector)"는 pColdⅡ플라스미드를 이용하고 있으나, 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물이라면 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이고, 본 발명의 구체적인 실시예에서 이용하고 있는 형태이므로, 본 발명에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.

본 발명에서 "재조합 발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하 게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

상기 벡터는 클로닝되는 유전자와 작동가능하게 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함할 수 있으며, 본 발명에서 “프로모터”는 형질주입하고자 하는 유전자의 발현을 촉진시키는 것으로서 상기 프로모터에는 전사에 필요한 기본인자(basal element)뿐만 아니라, 발현의 촉진 및 조절에 사용될 수 있는 인핸서(enhancer)가 더 포함될 수 있다.

또한, 본 명세서에서 "형질전환" 또는 “형질주입”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

실시예 1. 탄산탈수효소 복합체(CA complex)의 형성

DNA를 조작하기 위한 숙주 세포로는 Escherichia coli DH5a(Invitrogen, USA)를 사용하고 발현 벡터로는 pColdⅡ (Takara, Japan) 및 pET-22b (+) (Novagen, USA)를 사용하였다. E. coli BL21 (DE3) 균주(Invitrogen, USA)를 효소 단백질 생산에 사용하였다. 광합성 미생물로는 C. vulgaris UTEX 265를 사용하였다.

본 발명에서는, 효율적이고 안정적으로 CO₂를 고정하기 위한 셀룰로좀(cellulosome)를 모방한 기능적인 복합체를 형성하기 위해 하이드로제노비브리오 마리너스(Hydrogenovibrio marinus)의 hmCA 유전자(서열번호 1)를 사용하였다. 효소 복합체 서브유닛을 형성하기 위해, hmCA 유전자를 클로스트리디움 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans) 효소복합체의 셀룰라아제(cellulosomal cellulase) EngB의 도커링 도메인(dockering domain), docB(서열번호 2)와 융합하여 중복 PCR 방법으로 단일 효소(cCA)를 형성하였다. 상기 유전자는 제한 효소와 T4 DNA ligase(NEB, 영국)를 사용하여 발현 벡터에 삽입되었다.

한편, 세포벽의 셀룰로오스 양은 미세조류 종에 따라 달라지며, 해조류의 셀룰로오스 양은 1~20%로 알려져 있는 반면, 섬질의 녹조류의 셀룰로오스 양은 20~45%이다. 특히, C. vulgaris의 세포벽은 대부분 70~80%의 셀룰로오스로 구성되어 있다. 본 발명은 C. cellulovorans의 소형 셀룰로오스 결합 단백질(mCbpA)을 발현하기 위해 이전 연구(Kang et al., 2018)에서 개발된 mCbpA pET22b (+) 플라스미드를 사용하였다. 상기 단백질은 셀룰로오스 결합 모듈(CBM) 및 두 개의 코헤신을 포함하며, 상기 CBM은 CA 복합체가 C. vulgaris 표면에 고정화한 형태로 발현할 수 있도록 한다.

상기 재조합된 cCA 및 mCbpA를 Ni-NTA 레진 컬럼으로 정제하고 몰분율 2:1로 혼합하였다. 염화 칼슘 결합 버퍼에서 코헤신-도커린 상호작용을 통해 CA 복합체를 형성하였다(도 1).

실시예 2. 녹조류( C. vulgaris ) 배양

500 mL 플라스크에서 100 mL 부피의 bold basal medium (BBM)를 사용하여 C. vulgaris를 배양했으며, 배양은 OD 540 = 0.1로 시작하였다. 최대 7 일 동안 28 ℃에서 120 rpm으로 C. vulgaris를 배양하였고, C. vulgaris의 생장을 매일 측정하였다. CO₂는 5%의 합성 가스로 사용되었고 배양 중에 플라스크의 헤드 스페이스(headspace)에 공급되었다.

실시예 3. CA 복합체의 표면 고정화 확인

CBM에 의한 복합체의 표면 고정화(surface immobilization)를 확인하기 위해, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)를 이용하여 공초점 형광 현미경 분석을 수행하였다. 코헤신-도커린 상호작용을 통해 복합체를 형성하기 위해 해파리(Aequorea victoria)의 GFP를 도커린과 융합(GFP-doc)하였다. C. vulgaris 샘플을 28 ℃에서 7 일 동안 배양하였으며, mCbpA 및 GFP-doc를 E. coli에서 발현하고 His tag로 정제한 후, 상기 형성된 복합체를 배양된 C. vulgaris와 혼합하고 1 시간동안 배양하였다. 세척 후, 공초점 레이저 스캐닝 현미경(confocal laser-scanning microscope), LSM 5 Exciter (Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany)을 통해 표면 고정화를 분석하였다.

그 결과, mCbpA가 없는 대조군에서는 세척 후에 C. vulgaris의 표면에 효소 고정화를 관찰할 수 없었다. 그러나, GFP mCbpA를 결합한 복합체 그룹에서는 CBM에 의해 C. vulgaris 표면에 효소 고정화가 성공적으로 관찰되었다(도 2).

실시예 4. 탄산탈수효소 복합체의 활성 및 안정성

CA 복합체 형성이 탄산탈수효소의 활성 및 안정성에 미치는 영향을 분석하기 위해 p-니트로페닐 아세테이트(p-NPA)를 이용하여 에스테라제 활성을 시험하였다.

먼저, 30 μL의 30 mM pNPA, 240 μL의 20 mM Tris-sulfate 버퍼 (pH 7.5) 및 제조된 효소 30 μL를 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 에스테라제 활성은 분광 광도계로 25 ℃에서 측정되었다. 405 nm 파장에서 3 분간 흡광도를 분석하였다.

동일한 조건에서, p-NPA 에스테라제 활성 분석 결과, 탄산탈수효소 복합체의 활성이 단일 효소의 활성에 비해 약 1.4배 높았다(도 3A).

효소의 안정성은 코헤신-도커린 상호작용을 통해 성공적으로 CA 복합체를 형성한 후에 분석하였다. 효소 활성은 7 일간 측정하였으며, 단일 효소(cCA)의 활성은 기준치와 비교하여 2 일차에 50% 보다 낮았고, 7 일차에 약 11% 정도였다. 그러나, CA 복합체의 경우, 2 일차에 기준치의 약 82%였고, 7 일차에 기준치의 약 52%였다(도 3B). 상기 결과는 CA 복합체 구조에 의해 탄산탈수효소의 활성이 안정적으로 유지된다는 점을 보여준다. 한편, 탄산탈수효소를 이량체나 사량체로 형성하는 경우, 분자 내 이황화결합 및 비공유결합 상호작용 등에 의해 효소 활성, 안정성 또는 열적 안정성이 증가할 수 있다.

실시예 5. 탄산탈수효소 복합체 처리에 따른 C. vulgaris 의 생장

용존무기탄소(dissolved inorganic carbon, DIC)와 미세조류의 생장 간 상관관계를 이해하는 것은 CO₂ 고정의 효율성을 증가시키는데 중요한 부분이다. 탄소원은 미세조류의 바이오매스의 주요 구성성분이며, 공급된 CO₂에 의해 생산된 DIC는 미세조류의 유일한 탄소원이다. 본 발명자들은 CA 복합체가 CO₂를 빠르게 중탄산염(HCO₃ ^-)으로 변환함으로써 DIC 농도를 높이고, C. vulgaris의 급속한 생장을 이끌어낼 것으로 기대하였다. C. vulgaris를 7 일 이상 배양한 후, 540 nm에서 흡광도(optical density, O.D.)를 측정하였다.

CA 복합체의 존재 시, C. vulgaris는 대조군에 비해 더욱 급속한 생장을 나타냈다. 성장기(log phase)의 중간에 해당하는 3 일 내지 5 일동안, CA 복합체를 처리한 C. vulgaris의 O.D.는 대조군에 비해 대략 1.6 배 높았으며, 이는 급격한 생장을 나타낸다. 배양 7 일째에, O.D.의 차이는 약 1.3 배였으며, 이는 정지 단계(stationary phase)가 임박했기 때문으로 생각된다(도 4). 공급된 CO₂는 매질에서 용해되어 CO₂(aq), 중탄산염, 및 탄산염과 같은 DIC로 전환되었다. DIC는 용해된 수용액의 온도, pH, 및 다른 염의 농도의 영향을 직접적으로 받는다. C. vulgaris는 DIC를 탄소원으로 사용하기 위해 세포 내 수송하며, 공급된 CO₂의 농도에 따라 생장율이 상이하다. 한편, 본 발명에 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate, NaHCO₃)를 추가하는 것은 C. vulgaris의 이른 생장을 저해할 수 있다. 더욱이, pH가 증가함에 따라 DIC가 변화하고 생장을 억제하기 때문에, 추가적인 탄소원의 첨가에는 한계가 존재할 수 있다.

실시예 6. 탄산탈수효소 복합체 처리에 따른 지질 생산 및 지방산 함량

CA 복합체가 DIC를 증가시킨다는 점을 확인하기 위해, 말로닐-CoA의 농도를 HPLC를 이용하여 분석하였다. 말로닐-CoA는 지방산 생합성 경로(fatty acid biosynthetic pathways)의 시작에 해당하는 중요한 대사체로서, 지방산 생합성의 속도결정단계(rate-limiting step)에서 아세틸-CoA와 중탄산염을 아세틸-CoA 카르복실라아제에 의해 반응시킴으로써 생성된다.

말로닐-CoA의 농도는 바이너리 HPLC 펌프(Waters 1525), 자동 시료 주입기(Waters 717) 및 이중 λ흡광도 검출기(Waters 2487)로 구성된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템 (Waters Corporation USA)을 사용하여 측정되었다. SUPELCOSIL LC-18-DB HPLC 컬럼 L × I.D. 250 × 4.6 mm, 5 μm 입자 크기(Supelco Inc., USA)는 이동상 A: 5 mM 아세트산 암모늄 (pH 6.8)이 포함된 물 및 이동상 B: 메탄올과 함께 사용되었다. 이전 연구를 참조하여 상세한 선형 구배를 수행하였다(Liu et al., 2015).

대조군과 비교하여, CA 복합체 처리군에서 말로닐-CoA가 2.0 배 높게 나타났다. 결과적으로, 본 발명자들은 CA 복합체의 영향 하에 지질 생합성이 활성화된다는 점을 확인하였다(도 5).

증가된 말로닐-CoA는 전체 지질 대사를 촉진한다. 중탄산염 수치의 증가에 따른 지질 함량의 변화를 비교하기 위해, 클로로포름을 이용하여 지질을 추출하고, 건중량법(dry weight method)으로 분석하고, 측정값을 매일 비교하였다. 보다 구체적으로, 세포를 12000 rpm에서 1 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하고 상청액을 제거하였다. 원심 분리된 세포를 55 ℃의 건조 오븐에서 완전히 건조하고 저울로 칭량하였다. 지질은 클로로포름 메탄올 (2:1, v/v) 용매 혼합물을 사용하여 Folch의 방법으로 추출하였다. 상기 추출된 지질을 건조하고 무게를 측정하고, 무게 차이를 사용하여 지질 함량을 계산하였다.

7 일째에, CA 복합체의 가장 높은 지질 함량은 23.3% 였으며, 대조군의 지질 함량 13.6%에 비해 1.7배 높은 수치였다(도 6). C. vulgaris의 생장 및 지질 생산은 얼마나 효율적으로 CO₂가 세포 내에 공급되는지에 따라 결정되었다. 공급된 CO₂의 양이 증가하는 경우, 생장 및 지질 생산이 모두 증가한 것을 확인하였다. 그러나, CO₂의 공급이 지속적으로 높다면, pH는 감소하고, 생장은 저해되었다. 고농도의 CO₂에 의해 pH가 감소하는 것을 방지하고, 세포 내 공급되는 탄소를 증가시키기 위해 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate, NaHCO₃)을 첨가하여 실험을 진행하였다.

지방산 함량에 대하여 CA 복합체에 의해 증가된 DIC의 효과를 확인하기 위해, 7 일째 지방산의 함량을 가스 크로마토그래피(GC)로 분석하였다. 샘플을 Folch의 방법으로 분쇄하고, FAME으로 유도체화하였다. 상기 유도체화된 FAME을 FID가 포함되는 Agilent의 GC 7890을 사용하여 분석하였고, HP-5MS 컬럼(30 m, 2.5 mm 내경, 0.25 mm 필름)을 사용하였다. GC-FID의 조건은 이전 연구를 참조하여 수행하였다(You et al., 2017).

CA 복합체 처리군에서 총 지방산의 양은 989.4 mg/L였으며, 이는 대조군(총 지방산 485.4 mg/L 함유)에 비해 2 배 높은 수치였다(도 7A). 지방산 함량은 C16:0 부터 C18:2로 분석되었다. 흥미롭게도, CA 복합체의 영향으로 포화 지방산의 함량은 35.8%에서 15.6%로 감소했고, 불포화 지방산의 함량은 64.2%에서 84.4%로 증가하였다(도 7B).

한편, 지방산의 함량은 C. vulgaris의 배양 배지에 존재하는 탄소원의 종류에 따라 달라질 수 있다. 탄산수소암모늄(NaHCO₃)을 첨가하거나 질소 부족 상태에서 광합성하는 경우, 포화 지방산의 함량은 증가하였다. 상기 결과는 CA 복합체와 함께 C. vulgaris를 배양하는 경우 CO₂를 더욱 효율적으로 고정하며, 이를 통해 생산된 다양한 불포화 지방산이 추후 활용될 수 있다는 점을 시사한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Carbonic anhydrase complex and method for enhancing carbon dioxide biofixation and lipid production through the complex <130> DP-2020-0515P1, DHP20-559 <150> KR 10-2020-0101363 <151> 2020-08-12 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 918 <212> DNA <213> Hydrogenovibrio marinus <400> 1 catatgcaac atagcaatgc cccattgatt gacttgggcg cggaaatgaa aaaacagcac 60 aaggaggcag ctcccgaagg cgctgcgccg gctcaaggta aggcacctgc cgcggaagcc 120 aaaaaagaag aagcacctaa accaaaaccc gttgtgcata acccacattg gtcttattcg 180 ggagaagaag gccccgacca ttggggagac ttgtcgcctg attatgcaac ctgtaaaacc 240 ggcaaaaatc agtcaccaat taacttgatg gcagatgatg ccgttggcac cacttcacta 300 ccgggctttg atgtgcacta ccgtgatacg gttcttaaag tcatcaacaa cggccacacg 360 ctgcaagcca acgtgccttt gggtagctat atcaaaatca aaaatcagcg ttatgagctg 420 ttgcagtatc attttcatac cccctcagaa catcagttga acggtttcaa ttatccgatg 480 gagttgcatt tggttcaccg agatggtcgt gggcattatc tggtaattgg tattttgttc 540 agagagggta aagagaacga tgcgttgcaa actatcctga accacttgcc taaaaaagtc 600 ggtaaacagg aaatttttaa tggcattgaa tttaatccaa atgtcttttt ccctgaaagt 660 aaaaaattct ttaaatacag cggctcttta accacaccgc cttgtacgga aggggtttat 720 tggatggtgt tcaaacaacc aatcgaagcg tcggcggagc aacttgaaaa gatgaacgaa 780 ttaatggggg cgaatgctcg tcctgttcag gatttggaag ctcgctcgtt gttgaaatct 840 tggagcaatc ctaaaaacga tagtcaggat caccgttact atcaatatta cctcgagcac 900 caccaccacc accactga 918 <210> 2 <211> 159 <212> DNA <213> Clostridium cellulovorans <400> 2 gatgttaaca aagatggaaa ggtaaatgct atcgattatg cagtgcttaa atcaattctt 60 ttaggtacaa atactaacgt tgatttatca gtatcagaca tgaataagga tggtaaagta 120 aatgctttgg atttagctgt tcttaaaaaa atgctttta 159 <210> 3 <211> 407 <212> DNA <213> Clostridium cellulovorans <400> 3 gtaacagcta caattggaaa agtacaagta aatgctggag aaacggtagc agtaccagtt 60 aacttaacaa aagttccagc agctggttta gcaacaattg aattaccatt aacttttgat 120 tctgcatcat tagaagtagt atcaataact gctggagata tcgtattaaa tccatcagta 180 aacttctctt ctacagtaag tggaagcaca ataaaattat tattcttaga tgatacatta 240 ggaagccaat taatcataag gatggagttt ttgcaacaat aacatttaaa gcaaaagcta 300 taactggaac aactgcaaaa gtaacttcag ttaaattagc tggaacacca gtagttggtg 360 atgcgcaatt acaagaaaaa ccttgtgcag ttaacccagg aacagta 407 <210> 4 <211> 1647 <212> DNA <213> Clostridium cellulovorans <400> 4 gcagcgacat catcaatgtc agttgaattt tacaactcta acaaatcagc acaaacaaac 60 tcaattacac caataatcaa aattactaac acatctgaca gtgatttaaa tttaaatgac 120 gtaaaagtta gatattatta cacaagtgat ggtacacaag gacaaacttt ctggtgtgac 180 catgctggtg cattattagg aaatagctat gttgataaca ctagcaaagt gacagcaaac 240 ttcgttaaag aaacagcaag cccaacatca acctatgata catatgttga atttggattt 300 gcaagcggag cagctactct taaaaaagga caatttataa ctattcaagg aagaataaca 360 aaatcagact ggtcaaacta cactcaaaca aatgactatt catttgatgc aagtagttca 420 acaccagttg taaatccaaa agttacagga tatataggtg gagctaaagt acttggtaca 480 gcaccaggtc cagatgtacc atcttcaata attaatccta cttctgcaac atttgataaa 540 aatgtaacta aacaagcaga tgttaaaact actatgactt taaatggtaa cacatttaaa 600 acaattacag atgcaaacgg tacagctcta aatgcaagca ctgattatag tgtttctgga 660 aatgatgtaa caataagcaa agcttattta gcaaaacaat cagtaggaac aactacatta 720 aactttaact ttagtgcagg aaatcctcaa aaattagtaa ttacagtagt tgacacacca 780 gttgaagctg taacagctac aattggaaaa gtacaagtaa atgctggaga aacggtagca 840 gtaccagtta acttaacaaa agttccagca gctggtttag caacaattga attaccatta 900 acttttgatt ctgcatcatt agaagtagta tcaataactg ctggagatat cgtattaaat 960 ccatcagtaa acttctcttc tacagtaagt ggaagcacaa taaaattatt attcttagat 1020 gatacattag gaagccaatt aatcactaag gatggagttt ttgcaacaat aacatttaaa 1080 gcaaaagcta taactggaac aactgcaaaa gtaacttcag ttaaattagc tggaacacca 1140 gtagttggtg atgcgcaatt acaagaaaaa ccttgtgcag ttaacccagg aacagtaact 1200 atcaatccaa tcgataatag aatgcaaatt tcagttggaa cagcaacagt aaaagctgga 1260 gaaatagcag cagtgccagt aacattaaca agtgttccat caactggaat agcaactgct 1320 gaagcacaag taagttttga tgcaacatta ttagaagtag catcagtaac tgctggagat 1380 atcgtattaa atccaacagt aaacttctct tatacagtaa acggaaatgt aataaaatta 1440 ttattcctag atgatacatt aggaagccaa ttaattagta aagatggagt ttttgtaaca 1500 ataaacttca aagcaaaagc tgtaacaagc acagtaacaa caccagttac agtatcagga 1560 acacctgtat ttgcagatgg tacattagca gaagtacaat ctaaaacagc agcaggtagc 1620 gttacaataa atattggaga tcctata 1647

Claims

탄산탈수효소 및 도커린 모듈의 결합체;가
코헤신 모듈 및 셀룰로오스 결합 모듈(cellulose binding module, CBM)을 포함하는 소형 셀룰로오스 결합 단백질;에 결합된 탄산탈수효소 복합체.
제1항의 탄산탈수효소 복합체를 포함하는 이산화탄소 고정화 반응 촉진용 조성물.
제1항의 탄산탈수효소 복합체를 포함하는 녹조류의 지질 생산 촉진용 조성물.
하기 단계를 포함하는 탄산탈수효소 복합체의 제조방법:
(1) 탄산탈수효소를 암호화하는 유전자 및 도커린 모듈을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 주입한 제1형질전환체 제조단계;
(2) 코헤신 모듈을 암호화하는 유전자 및 셀룰로오스 결합 모듈을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 주입한 제2형질전환체 제조단계; 및
(3) 상기 제1 및 제2 형질전환체를 각각의 배지에서 배양하는 단계.
제4항에 있어서,
상기 탄산탈수효소 복합체는 상기 제1형질전환체의 배양물과 제2형질전환체의 배양물을 몰분율 2:1로 혼합하여 제조하는 것을 특징으로 하는, 탄산탈수효소 복합체의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 (1) 단계의 탄산탈수효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 탄산탈수효소 복합체의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 (1) 단계의 도커린 모듈을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 탄산탈수효소 복합체의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 (2) 단계의 코헤신 모듈을 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 탄산탈수효소 복합체의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 (2) 단계의 셀룰로오스 결합 모듈을 암호화하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 탄산탈수효소 복합체의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 (1) 및 (2) 단계의 형질전환체는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는, 탄산탈수효소 복합체의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 (1) 및 (2) 단계의 벡터는 pColdⅡ플라스미드 벡터인 것을 특징으로 하는, 탄산탈수효소 복합체의 제조방법.
하기 단계를 포함하는 이산화탄소 고정화 방법:
(1) 제1항의 탄산탈수효소 복합체를 제조하는 단계; 및
(2) 상기 제조된 탄산탈수효소 복합체에 이산화탄소를 공급하여 상기 이산화탄소를 중탄산염으로 전환시키는 단계.
녹조류에 제1항의 탄산탈수효소 복합체를 처리하는 단계를 포함하는, 녹조류의 지질 생산성을 증가시키는 배양 방법.