KR102017247B1

KR102017247B1 - 가야도모나스 주비니에게 g7 유래 네오아가로바이오스 하이드로레이즈-2의 이용

Info

Publication number: KR102017247B1
Application number: KR1020170132304A
Authority: KR
Inventors: 이제현; 박재선
Original assignee: 다인바이오 주식회사
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2017-10-12
Publication date: 2019-09-02
Also published as: KR20190041167A

Abstract

본 발명은 가야도모나스 주비니에게 G7 유래 네오아가로바이오스 하이드로레이즈-2의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 효소로 반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당의 분해 방법 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 효소와 네오아가로올리고당을 반응시키는 것을 특징으로 하는 무수갈락토오스, 갈락토오스 또는 비환원성말단의 무수갈락토오스가 제거된 네오아가로올리고당 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 네오아가로올리고당을 분해하여 무수갈락토오스, 갈락토오스 또는 비환원성말단의 무수갈락토오스가 제거된 네오아가로올리고당을 매우 효과적으로 생산할 수 있다. 이에 따라 본 발명은 바이오매스로부터 당화를 통해 바이오연료 및 의약품 원료를 생산하는 산업분야 등에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

가야도모나스 주비니에게 G7 유래 네오아가로바이오스 하이드로레이즈-2의 이용{Use of neoagarobiose hydrolase-2 from Gayadomonas joobiniege G7}

본 발명은 가야도모나스 주비니에게 G7 유래 네오아가로바이오스 하이드로레이즈-2의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 효소로 반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당의 분해 방법 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 효소와 네오아가로올리고당을 반응시키는 것을 특징으로 하는 무수갈락토오스, 갈락토오스 또는 비환원성말단의 무수갈락토오스가 제거된 네오아가로올리고당 생산방법에 관한 것이다.

해조류는 일반적으로 이용되는 에너지 곡물에 비해 연료 생산량이 월등히 높으며, 지구온난화의 주범인 이산화탄소 흡수능이 뛰어나고, 태양광 및 비식용수 만을 이용하며 매우 빠른 속도의 성장이 이루어지는 장점을 가진다. 해조류를 구성하고 있는 주요성분은 다당류로, 최근에는 건강에 대한 관심이 증대되면서 생체조절기능을 갖는 다기능성 올리고당의 소재로 많이 사용되고 있다. 특히 해조류 유래 기능성 소재는 항종양성, 항바이러스성, 항혈액응고 및 면역력 증강 등 다양한 생리활성 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 해조류 중에서도 홍조류는 바다 속에 다량 존재하고 있으나 이용률이 높지 않은 농수산자원으로 셀룰로오스(cellulose) 20%, 아가(agar) 60%, 단백질 10%, 기타 10%로 구성되어 있으며, 주로 식용 및 화장품에 사용하거나, 정제하여 연구용 아가 또는 아가로오스(agarose)로 사용하여 왔다.

해조류는 일년에 4 ~ 6회 정도 원료 수확이 가능하여 원료 확보가 유리하며, 또한 바다에 무한하게 존재하므로 생산 및 수확비용이 아주 저렴하다는 장점이 있다. 홍조류 우뭇가사리는 국내의 경우 매년 수확량이 4,000톤에 이르는 풍부한 농수산자원이지만, 전체 생산량의 10% 이하만이 단순가공 처리되어 공업용 또는 식용 등의 값싼 원료로 사용되고 있다. 따라서 우뭇가사리의 새로운 용도개발과 부가가치 향상에 대한 연구가 필요하며, 이에 다양한 분자생물학적 대사공학방법을 적용하여 방대한 농수산자원인 홍조류로부터 고부가가치 산물인 기능성 아가로올리고당을 생산할 수 있는 기술을 개발할 필요성이 있다. 또한 인체에 안전하게 적용하기 위해서는 염산과 같은 유해하지 않고 환경 오염원을 사용하지 않는 친환경적인 새로운 생물전환 방법으로 네오아가로올리고당을 제조하는 방법이 필요하며, 이를 응용하여 기존에 사용되어 왔던 다른 원료에 비해 경제성과 효능이 우수한 네오아가로올리고당 제품으로 개발할 필요가 있다. 이와 같은 기술개발은 국내에서 채취하는 천연농수산자원의 이용률을 높이고, 농수산 자원을 이용한 고부가가치 상품을 창출하며, 국민 건강에 기여할 수 있고, 세계의 생체 촉매 시장에서도 독자적 기술로 자생력을 갖출 수 있는 차세대 녹색 성장을 위하여 절대적으로 필요한 기술이라고 판단된다.

한편 홍조류에 함유된 아가의 약 70%는 아가로오스(agarose)이며, 이 아가로오스는 갈락토오스(D-galactose)와 무수갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)가 β-1, 4 결합한 단위체인 아가로바이오스(agarobiose)가 반복하여 α-1, 3 결합으로 연결된 직쇄구조로 구성되어 있다. 아가로오스는 베타-아가레이즈(beta-agarase)에 의해 β-1, 4 결합이 가수분해되어 최소 단위체인 네오아가로바이오스로 되고 알파-네오아가로바이오스 하이드로레이즈에 의해 갈락토오스와 무수갈락토오스로 분해된다(도 1 참조). 네오아가로바이오스를 구성하는 무수갈락토오스의 경우 신 물질로 새로운 생리활성의 연구대상이 되고 있으며, 그 효용 가치가 매우 높다. 그리고 갈락토오스는 감미료 타가토스(Tagatose)의 원료로 사용하는 고가의 화합물이며, 무수갈락토오스와 함께 바이오에탄올을 생산에 활용될 수 있다.

본 발명자는 상기와 같은 해조류 유래 아가로올리고당을 보다 유용하게 이용할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였으며, 특히 이러한 아가로올리고당 또는 네오아가로올리고당을 특이적으로 분해하여 유용한 당분해 산물을 생산할 수 있는 미생물 및 관련 효소를 발굴하기 위하여 노력하였다. 이의 결과, 가야도모나스 주비니에게 G7(Gayadomonas jubiniege G7) 균주로부터 유래된 네오아가로바이오스 하이드로레이즈-2(NABH-2)가 네오아가로올리고당을 분해할 수 있으며, 이를 통해 무수갈락토오스, 갈락토오스 또는 비환원성말단의 무수갈락토오스가 제거된 네오아가로올리고당을 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-1618765호 대한민국 등록특허 제10-1615141호

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따라서 본 발명의 주된 목적은 네오아가로올리고당을 특이적으로 분해하여 유용한 당분해 산물을 생산할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 효소로 반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당(neoagaro-oligosaccharide)의 분해 방법을 제공한다.

본 발명의 네오아가로올리고당의 분해 방법에 있어서, 상기 네오아가로올리고당은 네오아가로바이오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 또는 둘 이상인 것이 바람직하다.

본 발명의 네오아가로올리고당의 분해 방법에 있어서, 상기 반응이 pH 6 내지 8에서 이루어지도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 네오아가로올리고당의 분해 방법에 있어서, 상기 반응이 0 내지 30℃에서 이루어지도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 효소와 네오아가로올리고당을 반응시키는 것을 특징으로 하는 무수갈락토오스, 갈락토오스 또는 비환원성말단의 무수갈락토오스가 제거된 네오아가로올리고당 생산방법을 제공한다.

본 발명의 무수갈락토오스, 갈락토오스 또는 비환원성말단의 무수갈락토오스가 제거된 네오아가로올리고당 생산방법에 있어서, 상기 네오아가로올리고당은 네오아가로바이오스, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 또는 둘 이상인 것이 바람직하다.

본 발명의 무수갈락토오스, 갈락토오스 또는 비환원성말단의 무수갈락토오스가 제거된 네오아가로올리고당 생산방법에 있어서, 상기 반응이 pH 6 내지 8에서 이루어지도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 무수갈락토오스, 갈락토오스 또는 비환원성말단의 무수갈락토오스가 제거된 네오아가로올리고당 생산방법에 있어서, 상기 반응이 0 내지 30℃에서 이루어지도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 네오아가로올리고당을 분해하여 무수갈락토오스, 갈락토오스 또는 비환원성말단의 무수갈락토오스가 제거된 네오아가로올리고당을 매우 효과적으로 생산할 수 있다. 이에 따라 본 발명은 바이오매스로부터 당화를 통해 바이오연료 및 의약품 원료를 생산하는 산업분야 등에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 가야도모나스 주비니에게 G7 균주의 게놈 DNA를 이용하여 PCR을 통해 수득한 네오아가로바이오스 하이드로레이즈-2(이하, 'NABH-2'라 한다) 유전자 DNA 단편의 아가로스젤 전기영동 결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 NABH-2 유전자 형질전환체(E. coli Rosetta-gami/pET28a-NABH2)를 이용하여 정제한 NABH-2의 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 본 발명의 NABH-2와 네오아가로올리고당의 반응산물을 TLC(thin-layer chromatography)를 이용하여 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 NABH-2와 네오아가로바이오스의 반응산물을 MS(mass spectrometry)를 이용하여 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 NABH-2와 네오아가로테트라오스의 반응산물을 MS(mass spectrometry)를 이용하여 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 NABH-2와 네오아가로헥사오스의 반응산물을 MS(mass spectrometry)를 이용하여 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명 NABH-2의 반응 적정 pH를 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명 NABH-2의 반응 적정 온도를 분석한 결과이다.
도 9는 본 발명 NABH-2의 열안정성을 분석한 결과이다.
도 10 및 11은 본 발명 NABH-2의 효소활성에 영향을 미치는 금속이온을 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명 NABH-2의 동력학적 계수를 분석한 결과이다.

본 발명은 가야도모나스 주비니에게 G7(Gayadomonas joobiniege G7)이 생산하는 NABH-2가 네오아가로올리고당(neoagaro-oligosaccharide)을 분해할 수 있고, 이를 통해 무수갈락토오스, 갈락토오스 또는 비환원성말단의 무수갈락토오스가 제거된 네오아가로올리고당을 생성할 수 있다는 새로운 발견으로부터 안출되었다.

본 발명의 NABH-2는 본래 가야도모나스 주비니에게 G7(Gayadomonas joobiniege G7)이 생산하는 효소로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 전구단백질(pre-mature protein)로 발현되고 이후 시그널 펩티드(signal peptide)(서열번호 2의 1 ~ 25번 아미노산)가 잘려 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 성숙단백질(mature protein)이 되는 것으로 확인되었다.

미생물 유래 아가레이즈 중에는 시그널 펩타이드가 포함된 형태의 전구단백질로 발현된 다음 시그널 펩타이드 프로그램에 의해 세포 외부로 분비될 때 이 시그널 펩타이드가 잘려 성숙한 형태의 단백질로 되는 경우들이 다수 존재하는데, 이때 시그널 펩티드는 단백질이 세포 외부로 분비되는 과정에 관여하는 것으로 효소 활성에는 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서 시그널 펩티드가 제외된 서열번호 1의 아미노산 서열만으로 이루어지더라도 본래의 활성을 나타낼 수 있을 것이다.

또한, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열을 부가하는 것도 가능할 것이다. 부가되는 서열에 특별한 제한은 없으나 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열 등을 부가하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 정제의 용이성을 위해 다수개의 히스티딘(Histidine)을 N-말단 또는 C-말단에 부가한 형태일 수 있다.

본 발명의 NABH-2의 근원인 가야도모나스 주비니에게 G7은 우리나라 가야섬의 연안 바닷물에서 분리된 균주로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 KCTC23721로, 미국균주은행(American Type Culture Collection, ATCC)에 ATCC BAA-2321로, 독일균주은행(Deutsche Sammlung von Microorganismund Zellkulturen Gmb H, DSM)에 DSM25250로 기탁되어 있다.

본 발명의 NABH-2는 NABH-2 유전자로 형질전환된 형질전환체로부터 정제하는 방법으로 수득할 수 있다.

이때 NABH-2 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 것으로, 가야도모나스 주비니에게 G7 균주로부터 확인된 본래의 염기서열은 서열번호 3의 염기서열이지만, 여기서 시그널 펩티드를 암호화하는 부분을 제거하거나 또는 발현을 위한 숙주의 종류에 따라 적합한 코돈 서열로 변형하여 적용할 수 있을 것이다.

상기 NABH-2 유전자는 재조합 벡터의 형태로 제조하여 형질전환에 이용할 수 있다. 이때 벡터는 숙주세포의 종류 또는 프로모터, 선별마커 등을 고려하여 기존에 알려진 다양한 종류의 벡터 중에서 선택하여 적용할 수 있다. 예를 들어 대장균(Escherichia coli)을 숙주로 이용할 경우 pET 시리즈의 벡터를 사용할 수 있다.

상기와 같은 재조합 벡터를 숙주생물체에 도입하여 NABH-2를 생산하는 형질전환체를 제조할 수 있다. 이때 숙주로는 다양한 생물체를 이용할 수 있을 것으로 판단되며, NABH-2의 안정적인 발현 또는 생산 효율을 위해 미생물을 이용하는 것이 보다 바람직할 것이다. 본 발명에 따르면 NABH-2 유전자가 대장균의 발현시스템에서도 매우 원활하게 발현될 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서 대장균을 숙주로 이용하여 형질전환체를 제조하면 NABH-2을 매우 용이하게 생산할 수 있다. 숙주생물체의 형질전환은 각 숙주생물체에 이용되고 있는 통상의 형질전환방법을 적용하여 상기 재조합 벡터를 숙주생물체에 도입하는 방법으로 달성할 수 있다.

상기와 같은 형질전환체를 배양하고 NABH-2 유전자를 과발현시키는 방법으로 NABH-2를 생산할 수 있다. 이때 배양배지의 종류, 배양온도, 배양시간 등의 조건은 숙주 및 벡터의 종류에 따라 선택적으로 적용할 수 있다. 예를 들어 숙주가 대장균이고 pET28 시리즈의 벡터를 이용하는 경우, LB(Luria Bertani) 배지에서 약 15 ~ 40℃로 12시간 ~ 5일간 배양하는 방법을 사용할 수 있다. 또한 유전자의 과발현은 벡터에 포함된 발현 조절 기능을 이용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, pET28a 벡터는 IPTG(isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside)를 이용하여 표적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 기능이 있어 이를 이용할 수 있다.

상기와 같은 방법으로 형질전환체를 배양하고 유전자의 과발현을 유도한 다음 형질전환체의 파쇄물 또는 배양액으로부터 정제하는 방법을 통해 NABH-2를 수득할 수 있다. 이때 정제는 이종 생물체에서 생산한 표적단백질을 정제하기 위한 통상의 방법을 이용하여 달성할 수 있다.

본 발명의 NABH-2는 네오아가로올리고당의 비환원성 말단의 무수갈락토오스와 갈락토오스 분자 사이의 α1-3 결합을 잘라 무수갈락토오스(3,6-anhydro-α-L-galactose)와 비환원성말단의 무수갈락토오스가 제거된 네오아가로올리고당을 생산할 수 있다.

이때 상기 네오아가로올리고당이 네오아가로바이오스(neoagarobiose)인 경우에는 무수갈락토오스와 갈락토오스(β-D-galactose)가 생성되며, 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 또는 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)인 경우 무수갈락토오스와 홀수개의 당분자로 이루어지며 분자의 양끝단이 갈락토오스 분자로 이루어진 특이적인 구조의 올리고당을 생산할 수 있다.

본 발명의 NABH-2는 pH 4 내지 8에 걸쳐서, 그리고 0 내지 30℃에 걸쳐 20% 이상(최고 활성 기준)의 효소활성을 나타낼 수 있다. 따라서 이러한 pH 범위와 온도 범위에서 상기와 같은 효소반응을 수행할 수 있으나, 효소활성을 높여 반응생성물의 생산효율을 높이기 위해서는 pH 6 내지 8 및 4 내지 25℃에서 효소반응이 이루어지도록 하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.5 및 10 내지 20℃가 좋다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. NABH-2 암호화 유전자 발현벡터 및 형질전환체 제작

가야도모나스 주비니에게 G7(Gayadomonas joobiniege G7)(KCTC23721) 게놈 DNA를 추출하고 Forward primer (5'-ACAGATAGCTAGCATGAAATCACTCAAACA-3', 밑줄친 부분은 NheI 인식부위)(서열번호 4)와 Reverse primer (5'-GTCTTGGATCCGTTAGATTCGTTTTTTCTG-3′, 밑줄친 부분은 BamHI 인식부위)(서열번호 5)를 이용하여 PCR을 통해 400개의 아미노산으로 구성되는 네오아가로바이오스 하이드로레이즈(NABH-2)의 암호화부위(1,203bp)를 포함하는 DNA단편(서열번호 6)을 증폭하였다(도 1 참조). 증폭된 DNA단편을 NheI-BamHI 제한효소로 이중절단하고 pET28a(+)의 NheI-BamHI 제한효소부위에 접합하여 네오아가로바이오스 하이드로레이즈 C-말단에 His-tag가 포함되어 발현되는 pET28a-NABH2(NABH-2 암호화 유전자 발현벡터)를 제작하였다.

제작된 pET28a-NABH2로 E. coli Rosetta-gami를 형질전환하여 NABH-2를 생산하기 위한 형질전환체(E. coli Rosetta-gami/pET28a-NABH2)를 제작하였다.

실시예 2. NABH-2 생산 및 정제

상기 실시예 1의 형질전환체(E. coli Rosetta-gami/pET28a-NABH2)를 최종농도 50㎍/㎖의 카나마이신이 첨가된 50㎖ LB 배지에서 OD600 값이 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양한 뒤, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 최종농도 0.5 mM로 첨가하여 단백질 발현을 유도하고, 16℃에 12시간 더 배양하였다. 5,000rpm으로 10분간 원심리하여 균체를 회수하고, 5㎖ PBS완충액(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 2mM KH₂PO₄)에 현탁한 다음, 소니케이션하여 파쇄하고 5,000rpm에서 30분간 원심분리한 다음 상등액을 취하여 정제를 위해 사용하였다.

단백질 정제를 위해 1.5 ㎖ Ni²⁺-NTA 레진(ClonTech, Japan)을 컬럼에 채운 뒤 5㎖ PBS 완충액으로 세척하고 상등액을 로딩하였다. 컬럼을 10㎖ PBS 완충액으로 세척하고 200mM 이미다졸이 함유된 1㎖ PBS 완충액을 단계적으로 총 5㎖ 이용하여 레진에 결합된 단백질을 용출하였다.

회수된 단백질은 SDS-PAGE를 이용하여 400개의 아미노산으로 구성된 분자량 45.18kDa의 NABH-2의 분자량을 가지는 단백질임을 확인하였다(도 2 참조).

실시예 3. NABH-2의 기질 분해산물 분석

상기 실시예 2에서 수득한 NABH-2를 이용하여 각각의 네오아가로올리고당(네오아가로바이오스, 네오아가로테트라오스, 네오아가로헥사오스)과 반응시킨 뒤, 분해산물을 분석하였다.

기질 분해산물은 TLC와 MS (mass spectrometry)를 이용하여 분석하였다.

TLC를 이용한 기질 분해산물의 분석을 위하여 PBS 완충액(pH 7) 20㎕에 각각의 네오아가로올리고당(네오아가로바이오스, 네오아가로테트라오스, 네오아가로헥사오스) 0.8% 기질과 NABH-2(3㎍)를 함유한 반응액을 준비하였다. 반응은 40℃에 16시간 동안 수행한 후 분해 산물을 TLC (thin-layer chromatography)를 이용하여 분석하였다. 반응액(2㎕)을 Silica Gel 60 plate (EMD Merck AG, Darmstadt, Germany)에 로드하고 n-butanol, ethanol 및 물(3:1:1, v/v/v)의 용매시스템 상에서 이중으로 분리하였다. 20%(w/v) sulfuric acid가 함유된 메탄올 용액을 스프레이하여 분리된 산물을 가시화하고 플레이트를 120℃로 가열하였다.

반응 후 TLC 분석에서 각각의 네오아가로올리고당(네오아가로바이오스, 네오아가로테트라오스, 네오아가로헥사오스)를 함유한 반응액들은 두 종류의 분해산물을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

MS(mass spectrometry)를 이용한 기질 분해산물의 분석을 위하여 PBS 완충액(pH 7) 20㎕에 각각의 0.8% 네오아가로올리고당 기질(네오아가로바이오스, 네오아가로테트라오스, 네오아가로헥사오스)과 NABH-2(3㎍)를 함유한 반응액을 준비하였다. 40℃에 16시간 동안 반응을 수행한 후, 분해된 네오아가로올리고당을 30배의 메탄올을 첨가하여 침전시키고 14,000rpm에서 10분간 원심분리하여 회수하였다. 침전물을 진공 건조하여 MS(mass spectrometry)로 분석하였다. 분석 결과, 기질로 네오아가로바이오스를 이용한 분해물로부터 무수갈락토오스(185m/z)와 갈락토오스(203m/z)의 분자량과 같은 위치에서 피크가 보였다(도 4 참조). 네오아가로테트라오스를 이용한 분해물로부터는 무수갈락토오스(185m/z)와 네오아가로트리오스(509m/z)의 분자량과 같은 위치에서 피크가 보였다(도 5 참조). 네오아가로헥사오스를 이용한 분해물로부터는 무수갈락토오스(185m/z)와 네오아가로펜타오스(815m/z)의 분자량과 같은 위치에서 피크가 보였다(도 6 참조).

MS 분석과 TLC 분석에서 확인된 각각의 네오아가로올리고당(네오아가로바이오스, 네오아가로테트라오스, 네오아가로헥사오스)으로부터의 두 종류의 분해산물은 기질의 비환원성 말단의 무수갈락토오스와 그 잔여물인 각각 갈락토오스, 네오아가로트리오스, 네오아가로펜타오스로 구성됨을 확인하였다.

실시예 4. NABH-2의 활성 분석

NABH-2의 효소반응 적정 pH, 효소반응 적정온도 및 효소의 열안정성을 측정하여 생화학적 특성을 분석하였다.

NABH-2의 효소반응 적정 pH 측정을 위해 각각의 pH에서 완충작용을 하는 완충액을 이용하였다. pH 4 ~ 6에서의 측정에는 50mM Sodium Citrate 완충액을 이용하였다. pH 7 ~ 8에서의 측정에는 50mM Sodium Phosphate 완충액을 이용하였다. pH 9 ~ 11에서의 측정에는 50mM Glycine-NaOH 완충액을 이용하였다. 각각의 pH에서의 반응액 500㎕는 네오아가로바이오스 100㎍과 NABH-2 50㎍이 포함되도록 구성하였다. 반응은 15℃에 30분 동안 수행한 후, 500㎕ DNS 용액과 혼합하고 10분간 수조에서 끓인 뒤, 얼음물에서 5분간 식혔다. 반응액의 흡광도를 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 O.D. 540nm에서 측정하여 효소활성을 측정하였다. 측정결과로부터 NABH-2의 효소반응 적정 pH가 pH 7임이 확인되었다(도 7 참조).

NABH-2의 효소반응 적정온도 측정을 위해 50mM Sodium Phosphate 완충액(pH 7.0) 500㎕에 네오아가로바이오스 100㎍과 NABH-2 50㎍이 함유된 반응액을 준비하였다. 반응은 0 ~ 80℃ 사이의 온도에서 10분 동안 수행한 후, 500㎕ DNS 용액과 혼합하고 10분간 수조에서 끓인 뒤, 얼음물에서 5분간 식혔다. 반응액의 흡광도를 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 O.D. 540nm에서 측정하여 효소활성을 측정하였다. 측정결과로부터 NABH-2의 효소반응 적정온도가 15℃임이 확인되었다(도 8 참조).

NABH-2의 열안정성 측정을 위해 NABH-2 50㎍이 함유된 효소액을 열안정성 측정을 위한 온도(0, 4, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80℃)에서 1시간 동안 유지한 후 네오아가로바이오스 100㎍을 함유한 50mM Sodium Phosphate 완충액(pH 7.0)과 혼합하여 500㎕의 반응액을 준비하였다. 15℃에 30분 동안 반응시킨 후, 500㎕ DNS 용액과 혼합하고 10분간 수조에서 끓인 뒤, 얼음물에서 5분간 식혔다. 반응액의 흡광도를 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 O.D. 540nm에서 측정하여 효소활성을 측정하였다. 측정결과 0 ~ 20℃ 사이의 온도에서 1시간 동안 효소액을 유지해도 활성은 80% 이상 보존됨이 확인되었다(도 9 참조).

실시예 5. NABH-2의 효소활성에 영향을 미치는 금속이온 분석

NABH-2의 효소활성에 영향을 미치는 금속이온을 분석하기 위하여 CaCl₂, CoCl₂, CuCl₂, FeCl₂, MnCl₂, MgCl₂, NaCl, NiCl₂, ZnCl₂와 EDTA의 각각 최종농도 0.5mM과 5mM의 존재 하에서 효소 활성 변화를 측정하였다. 각 농도의 금속이온, NABH-2 50㎍, 네오아가로바이오스 100㎍을 함유한 50mM Sodium Phosphate 완충액(pH 7.0)으로 구성된 500㎕의 반응액을 15℃에 30분 동안 반응시킨 후, 500㎕ DNS 용액과 혼합하고 10분간 수조에서 끓인 뒤, 얼음물에서 5분간 식혔다. 반응액의 흡광도를 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 O.D. 540nm에서 측정하여 효소 활성 변화를 측정하였다. 또한, 금속이온의 효소활성에 미치는 영향을 추가 검토하기 위해 FeCl₂와 MnCl₂를 선택하여 각각의 최종농도 0.5mM과 1mM의 용액과 최종농도 0.5mM EDTA를 혼합하여 효소 활성 변화를 측정하였다. 측정결과, 각 금속이온의 존재에 따라 효소 활성에 차이가 있음이 확인되었다(도 10 및 11 참조).

실시예 6. NABH-2의 동력학적 계수 분석

NABH-2의 동력학적 계수인 Vmax, Km의 측정을 위해 네오아가로바이오스의 최종농도가 0.2㎎/㎖씩 차이나는 반응액을 0.2㎎/㎖ ~ 2㎎/㎖ 범위에서 이용하였다. 각각의 500㎕ 반응액을 50mM Sodium Phosphate 완충액(pH 7.0)과 50㎍의 NABH-2로 구성하였고 반응을 15℃에 20분 동안 수행한 후, 500㎕ DNS 용액과 혼합하고 10분간 수조에서 끓인 뒤, 얼음물에서 5분간 식혔다. 반응액의 흡광도를 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 O.D. 540nm에서 측정하여 효소활성을 측정하였다. 측정결과, Lineweaver-Burk Plot을 이용하여 NABH-2의 Vmax와 Km값이 각각 133.3uM/min과 1.466㎎/㎖로 확인되었다(도 12 참조).

<110> DyneBio Inc. <120> Use of neoagarobiose hydrolase-2 from Gayadomonas joobiniege G7 <130> PA-D17353 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 375 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Gayadomonas joobiniege G7 <400> 1 Thr Asp Tyr Ser Glu Tyr Ser Gln Asp Thr Leu Asp Tyr Leu Gly Ile 1 5 10 15 Lys Asp Val Asn Tyr Leu Ser Ala Ala Ser Lys Arg Ala Leu Glu Arg 20 25 30 Gly Tyr Tyr Lys Asn Ala Glu Trp Phe Gly Arg Phe Ser Val Glu Asn 35 40 45 Leu Thr Gly Asp Phe Ala Tyr Glu Lys Gly Val Ile Arg Arg Asp Pro 50 55 60 Ser Lys Val Leu Lys Ile Asp Gly Arg Tyr Tyr Thr Trp Tyr Thr Lys 65 70 75 80 Ser Ile Gly Pro Gly His Gly Phe Glu Thr Gly Asp Pro Asp Lys Lys 85 90 95 Val Phe Pro Trp Asp Lys Ser Glu Val Trp Tyr Ala Ser Ser Ala Asp 100 105 110 Gly Tyr His Trp Lys Glu Glu Gly Leu Ala Val Gly Leu Gly Pro Thr 115 120 125 Gly Ser Tyr Asp Asp Arg Ser Val Phe Thr Pro Glu Val Met Ala His 130 135 140 Asp Gly Lys Tyr Tyr Leu Val Tyr Gln Thr Val Lys Ala Pro Tyr Leu 145 150 155 160 Leu Arg Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Met Ala Val Ala Asp Asn Pro His 165 170 175 Gly Pro Trp Thr Lys Leu Ala Lys Pro Ile Leu Ser Pro Ser Ser Glu 180 185 190 Thr Gly Glu Trp Lys Gly Glu Lys Asp Asp Arg Phe Ala Val Val Ser 195 200 205 Gln Gly Glu Trp Asp Ser His Lys Val His Asp Pro Thr Leu Met Tyr 210 215 220 Tyr Lys Asp Lys Phe Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Glu Arg Lys Gly Glu 225 230 235 240 Lys Ile Thr Met Gly Gly Arg Glu Ile Arg Trp Gly Val Ala Ile Ala 245 250 255 Asp Asn Ile Glu Gly Pro Tyr Val Lys Ser Lys Tyr Asn Pro Ile Thr 260 265 270 Gln Ser Gly His Glu Leu Ala Ile Trp His Tyr Asp Gly Gly Ile Ala 275 280 285 Met Val Ser Gly His Asp Gly Pro Glu Lys Glu Thr Ile Gln Trp Ala 290 295 300 Lys Asp Gly Ile Asn Phe Glu Ile Met Ala Val Val Asn Glu Val Pro 305 310 315 320 Pro Ala Leu Gly Leu Val Glu Ser Leu Asp Thr Glu Lys His Pro Thr 325 330 335 Glu Ala Leu Arg Trp Gly Leu Ser His Lys Tyr Val Arg Thr Pro Gly 340 345 350 Lys Ser Trp Leu Glu Ser Asp Asn Tyr Ile Thr Arg Phe Thr Phe Ser 355 360 365 Pro Ile Gln Lys Lys Arg Ile 370 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Met Ala Val Ala Asp Asn Pro His Gly Pro Trp Thr Lys Leu Ala 195 200 205 Lys Pro Ile Leu Ser Pro Ser Ser Glu Thr Gly Glu Trp Lys Gly Glu 210 215 220 Lys Asp Asp Arg Phe Ala Val Val Ser Gln Gly Glu Trp Asp Ser His 225 230 235 240 Lys Val His Asp Pro Thr Leu Met Tyr Tyr Lys Asp Lys Phe Tyr Leu 245 250 255 Tyr Tyr Lys Gly Glu Arg Lys Gly Glu Lys Ile Thr Met Gly Gly Arg 260 265 270 Glu Ile Arg Trp Gly Val Ala Ile Ala Asp Asn Ile Glu Gly Pro Tyr 275 280 285 Val Lys Ser Lys Tyr Asn Pro Ile Thr Gln Ser Gly His Glu Leu Ala 290 295 300 Ile Trp His Tyr Asp Gly Gly Ile Ala Met Val Ser Gly His Asp Gly 305 310 315 320 Pro Glu Lys Glu Thr Ile Gln Trp Ala Lys Asp Gly Ile Asn Phe Glu 325 330 335 Ile Met Ala Val Val Asn Glu Val Pro Pro Ala Leu Gly Leu Val Glu 340 345 350 Ser Leu Asp Thr Glu Lys His Pro Thr Glu Ala Leu Arg Trp Gly Leu 355 360 365 Ser His Lys Tyr Val Arg Thr Pro Gly Lys Ser Trp Leu Glu Ser Asp 370 375 380 Asn Tyr Ile Thr Arg Phe Thr Phe Ser Pro Ile Gln Lys Lys Arg Ile 385 390 395 400 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gagcgtaaag gcgaaaagat cactatgggt ggccgtgaaa tccgctgggg tgtcgctatt 840 gcggataata ttgaaggccc atatgttaaa tcaaaatata accctattac gcaaagtggg 900 catgagttag ccatttggca ctacgatggc ggcattgcta tggtgtctgg ccatgatggt 960 cccgaaaaag aaaccattca atgggcaaaa gacggtatta actttgaaat tatggccgtt 1020 gttaacgagg tgccaccagc tttaggttta gttgagtcat tagacacaga aaaacatcca 1080 acagaagctt tgcgctgggg tttgtcacat aaatatgtgc gcacgccggg caaaagctgg 1140 ctcgagagtg acaactatat cacgcgtttt actttctctc cgattcagaa aaaacgaatc 1200 taa 1203 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NABH-2 <400> 4 acagatagct agcatgaaat cactcaaaca 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NABH-2 <400> 5 gtcttggatc cgttagattc gttttttctg 30 <210> 6 <211> 1228 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR product for cloning of NABH-2 gene <400> 6 acagatagct agcatgaaat cactcaaaca cctattgagc tgtgtggcac tggctgcttt 60 agccagtgca tgcggcacta aacaagcaac tgactatagc 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Claims

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서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 효소와 비환원성 말단에 무수갈락토오스를 갖는 네오아가로올리고당(neoagaro-oligosaccharide)을 반응시키는 것을 특징으로 하는 무수갈락토오스; 또는 상기 네오아가로올리고당의 비환원성 말단의 무수갈락토오스가 제거된 분자;의 생산방법.
제 5항에 있어서,
상기 네오아가로올리고당은 네오아가로바이오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 무수갈락토오스; 또는 상기 네오아가로올리고당의 비환원성 말단의 무수갈락토오스가 제거된 분자;의 생산방법.
제 5항에 있어서,
상기 반응이 pH 6 내지 8에서 이루어지도록 하는 것을 특징으로 하는 무수갈락토오스; 또는 상기 네오아가로올리고당의 비환원성 말단의 무수갈락토오스가 제거된 분자;의 생산방법.
제 5항에 있어서,
상기 반응이 0 내지 30℃에서 이루어지도록 하는 것을 특징으로 하는 무수갈락토오스; 또는 상기 네오아가로올리고당의 비환원성 말단의 무수갈락토오스가 제거된 분자;의 생산방법.