KR101618765B1 - 슈도알테로모나스 속 H9 유래의 신규한 철-의존적 GH16 베타-아가레이즈 AgaH92 - Google Patents

Abstract

본 발명은 슈도알테로모나스 속 H9 유래의 신규한 철-의존적 GH16 베타-아가레이즈 AgaH92에 관한 것으로, 구체적으로 슈도알테로모나스 속 H9 균주로부터 동정되어 이종균주에서 과발현이 가능하며 열안정성을 갖고 아가(agar)의 β-결합을 인식하여 네오아가로올리고당(neoagaro-oligosaccharide)을 생성할 수 있는 베타-아가레이즈에 관한 것이다.
본 발명의 베타-아가레이즈는 아가를 저분자로 분해하는데 매우 효과적일 뿐만 아니라 이종숙주세포를 사용한 과발현 시스템을 통해 대량생산이 가능하고, 열적으로도 매우 안정적이기 때문에 아가를 분해 또는 전환하여 다양한 화합물 또는 에너지를 생산하는 산업분야에서 다른 효소들과 함께 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 베타-아가레이즈를 사용하면 아가로부터 네오아가로테트라오스 또는 네오아가로헥사오스와 같은 유용한 네오아가로올리고당을 효율적으로 생산할 수 있다.

Description

슈도알테로모나스 속 H9 유래의 신규한 철-의존적 GH16 베타-아가레이즈 AgaH92{A novel iron-dependent GH16 β-agarase, AgaH92 from Pseudoalteromonas sp. H9}

본 발명은 슈도알테로모나스 속 H9 유래의 신규한 철-의존적 GH16 베타-아가레이즈 AgaH92에 관한 것으로, 구체적으로 슈도알테로모나스 속 H9 균주로부터 동정되어 이종균주에서 과발현이 가능하며 열안정성을 갖고 아가(agar)의 β-결합을 인식하여 네오아가로올리고당(neoagaro-oligosaccharide)을 생성할 수 있는 베타-아가레이즈에 관한 것이다.

적색 해초(red seaweed)에서 추출되는 갈락탄(galactan)은 풍부한 자연 자원이며, 중요한 상업적 용도로 사용된다. 갈락탄은 이종 다당류이며, 주로 갈락토오스(galactose)가 β-1,4 또는 α-1,3 글리코시드 결합(glycosidic linkage)되어 이루어진다. 갈락탄은 카라기난(carrageenan) 타입과 아가(agar) 타입의 두 가지 그룹으로 나뉘어진다. 카라기난 타입은 Chondrus 속(genera)과 Gigartina 속 같은 대서양의 조류에서 발견되며 α-D-갈락토오스 유닛을 갖는다. 아가 타입은 Gracilaria와 Porphyra 같은 Rhodophyceae 과(family)에 속하는 적색 조류에서 발견되며, α-L-갈락토오스 유닛을 갖는다(Craigie, 1990).

아가 자체 또한 이종 다당류로 아가로비오스(agarobiose)와 포피로비오스(porphyrobiose)로 이루어진다. 아가로비오스 유닛은 β-1,4 결합의 D-갈락토오스와 α-1,3 결합의 3,6,-anhydro-α-L-galactose로 이루어지는 반면(Duckworth & Yaphe, 1970), 포피로비오스 유닛은 3,6,-anhydro-α-L-galactose 대신 α-1,3 결합의 L-galactose-6-sulfate를 갖는다(Morrice et al ., 1983; Hehemann et al., 2010). 그 함유량은 조류 자원에 따라 다양하고, 적색 조류의 아가로오스는 아가로비오스의 비율이 높다.

아가레이즈(agarase)는 β와 α 두 가지로 분류된다. β-아가레이즈(EC 3.2.1.81)는 아가로오스의 β-1,4 결합을 잘라 환원 말단에 D-갈락토오스를 갖는 네오아가로올리고당(neoagaro-oligosaccharide) 시리즈를 만들며, Cytophaga (Duckworth & Turvey, 1969), Pseudomonas(Kang et al ., 2003), Pseudoalteromonas(Ivanova et al ., 2003), Thalassomonas(Ohta et al ., 2005), Bacillus(Suzuki et al ., 2003), Paenibacillus(Hosoda et al ., 2003) 및 Streptomyces(Temuujin et al ., 2012)와 같은 다양한 속에서 발견된다. 아미노산 서열 유사성에 근거하면, β-아가레이즈는 서로 다른 네 개의 글리코시드 가수분해효소(glycoside hydrolase, GH) 패밀리 GH16, GH50, GH86 및 GH118(CAZY 데이터베이스)에서 발견된다(Chi et al., 2012).

이와 같은 아가레이즈는 풍부한 자연자원인 아가를 저분자로 분해할 수 있으며, 이 과정에서 산업상 유용한 물질이 생성될 수 있기 때문에 많은 연구자들이 관심을 갖고 연구하고 있다.

이에 본 발명자는 다양한 미생물로부터 새로운 아가레이즈를 탐색하고 이를 보다 산업상 유용하게 사용할 수 있도록 하기 위해 노력하였으며, 특히 특이하고 새로운 다양한 종류의 미생물자원이 존재하는 해양 샘플로부터 이러한 아가레이즈를 탐색하고자 하였다. 이의 결과 아가-가수분해 박테리아인 Pseudoalteromonas 속에 속하는 H9 균주를 해안의 바닷물 샘플에서 분리할 수 있었으며, 이 균주로부터 열안정적이며 아가(agar)의 β-결합을 인식하여 유용한 네오아가로올리고당(neoagaro-oligosaccharide)을 생성할 수 있는 새로운 β-아가레이즈를 클로닝 및 이종균주 과발현시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

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따라서 본 발명의 주된 목적은 산업상 유용한 새로운 아가레이즈를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 아가레이즈를 보다 용이하게 대량으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 베타-아가레이즈(β-agarase)(AgaH92로 명명)를 제공한다.

서열번호 1은 본 발명 베타-아가레이즈의 전체 아미노산 서열로 여기에는 19개의 아미노산(1 ~ 19번 아미노산)으로 이루어진 시그널 펩티드(signal peptide)가 포함되어 있는 것으로 나타났다. 이 시그널 펩티드는 베타-아가레이즈가 3차 구조를 형성하고 본래의 활성을 나타내는데 영향을 미치지 않으므로, 제외될 수 있다. 이 시그널 펩티드가 제외된 것이 서열번호 2의 아미노산 서열이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 베타-아가레이즈 유전자를 제공한다. 슈도알테로모나스 속 H9 균주로부터 확인된 본래의 염기서열은 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열이지만, 발현을 위한 숙주의 종류에 따라 적합한 코돈 서열로 변형하여 적용할 수 있을 것이다.

서열번호 3에서 시그널 펩티드를 암호화하는 부분을 제외한 것이 서열번호 4의 염기서열이다. 또한 서열번호 3 및 4에는 stop codon이 제외되어 있다. 본래의 stop codon은 "TAA"이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 베타-아가레이즈 유전자를 함유하는 베타-아가레이즈 생산용 재조합 벡터를 제공한다. 이때 벡터는 숙주세포의 종류 또는 프로모터, 선별마커 등을 고려하여 기존에 알려진 다양한 종류의 벡터 중에서 선택하여 적용할 수 있다. 예를 들어 대장균(Escherichia coli)을 숙주로 이용할 경우 pET 시리즈의 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 베타-아가레이즈 생산용 재조합 벡터로 형질전환된 베타-아가레이즈 생산용 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하고 상기 베타-아가레이즈 유전자를 과발현시키는 것을 특징으로 하는 베타-아가레이즈 대량생산방법을 제공한다. 이때 배양배지의 종류, 배양온도, 배양시간 등의 조건은 숙주 및 벡터의 종류에 따라 선택적으로 적용할 수 있다. 예를 들어 숙주가 대장균이고 pET28 시리즈의 벡터를 이용하는 경우, LB(Luria Bertani) 배지에서 약 15 ~ 40℃로 12시간 ~ 5일간 배양하는 방법을 사용할 수 있다. 단, 본 발명에 따르면 대장균 발현 시스템을 이용할 경우 인크루전바디(inclusion body)를 형성하는 것으로 나타났으므로, 효소활성을 위해서는 이후 리폴딩(refolding)하는 과정을 수행할 필요가 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 베타-아가레이즈를 아가(agar)와 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당(neoagaro-oligosaccharide) 생산방법을 제공한다.

본 발명의 네오아가로올리고당 생산방법에 있어서, 상기 효소반응은 40 내지 45℃의 온도조건, pH 5 내지 7의 수소이온농도조건에서 이루어지는 것이 바람직하며, 반응액에 철(Fe) 이온이 존재하는 상태에서 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 이때 상기 철 이온의 농도는 1 내지 10mM인 것이 바람직하다. 이러한 조건은 본 발명의 베타-아가레이즈를 대상으로 한 다양한 최적화 실험의 결과를 바탕으로 한 것이다.

상기 본 발명의 네오아가로올리고당 생산방법은 네오아가로올리고당 중에서도 특히 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)(NA4) 또는 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)(NA6)를 효율적으로 생산할 수 있다.

본 발명자는 아가로오스를 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 가수분해하며 열안정성이 있고 철 이온에 의존적인 GH16 아가레이즈를 암호화하는 새로운 β-아가레이즈 유전자(agaH92)를 동정하였다. GH16은 가장 광범위한 β-아가레이즈 패밀리로 2,859가지 이상의 단백질로 구성되고, 기능적으로 이질적인 184가지(endo-1,3(4)-β-glucanase, licheninase, κ-carrageenase, xyloglucanase, endo-β-1,3-galactanase, β-porphyranase 등)가 여기에 포함된다. β-아가레이즈는 GH16 수퍼패밀리(cd02178) 중 하나의 서브패밀리를 담당한다(Marchler-Bauer et al., 2013).

in silico 분석에 따라, AgaH92가 두 개의 고도로 보존된 도메인, 즉 N-말단 부위에 GH16 수퍼패밀리 도메인(e-value; 1.03×10^-95), C-말단 부위에 RICIN 수퍼패밀리 도메인(e-value; 4.00×10^-15)을 갖는 것으로 나타났다. 이것은 carbohydrate binding domain 6(CBM6)를 갖는 다른 GH16의 단백질들과는 구분된다(Henshaw et al., 2006). GH16 β-아가레이즈의 보존된 도메인은 터널 형상의 활성부위 구멍과 함께 휘어진 β-샌드위치 구조(cd02178)를 갖는다(Allouch et al., 2003). 터널-모양의 활성부위 구멍을 형성하기 위해 필요한 아미노산은 AgaH92에 잘 보존되어 있었다(Asn⁶⁶, Trp⁶⁸, Trp¹³⁴, Asp¹⁴⁰, Glu¹⁴³, Asp¹⁴⁵, Glu¹⁴⁸, Phe¹⁶⁹, Arg¹⁷¹, Glu²⁶⁰ 및 His²⁶²). 또한 AgaH92는 두 개의 촉매잔기(Glu^148,153) 사이에 보존된 촉매도메인(catalytic domain)(EIDXXE, X; hydrophobic residues)을 갖고 있었다. 이는 GH16 패밀리의 글리코시드 가수분해효소의 일반적인 형태이다.

AgaH92의 C-말단 부위(~Gln³¹⁶-Leu³⁴⁸, ~Glu³⁵⁵-Asn³⁹⁷, ~Glu⁴⁰⁵-Phe⁴⁴¹)에서 발견된 Ricin-type beta-trefoil 도메인(cd00161)은 유전자 3중화로 추정되는 현상으로부터 형성되는 CBM13이고, 밀집된 도메인 구조 표면 상에 고도로 특이적인 리간드 결합력을 갖는다(Rutenber et al., 1987). 또한 세 개의 Q-X-W 모티프(Q333QW335, Q392RF394, Q439RF441)가 AgaH92의 beta-trefoil 서브도메인에 고도로 보전되어 있었다. 비록 Ricin-타입 도메인이 75가지 이상의 단백질 패밀리에 광범위하게 분포하고 있지만, YM01-3 Catenovulum agarivorans YM01T(Cui et al., 2014)를 포함하는 7개의 아가레이즈만이 이 도메인을 갖는 것으로 조사된바 있다.

GH16 아가레이즈는 Ca²⁺ 이온-결합 부위(Alloush et al. 2003)의 존재여부로 특정할 수 있으며, 세 개의 보존된 아미노산(Asp²¹, Asn⁴⁸, Asp²⁸⁸)이 AgaH92에서 발견되었다. 한편 rAgaH92의 활성이 CaCl₂ 대신 FeCl₂에 의존적이라는 것이 확인되었다. 이것은 철-결합 아가레이즈의 첫 번째 케이스이다. 대부분의 아가레이즈는 보존된 Ca²⁺ 이온-결합 부위를 갖으나, 킬레이팅 화합물(EDTA, EGTA)에 내성이 있고, 특정한 금속 이온 cofactor를 필요로 하지 않는다. 대신에 이들의 효소활성은 금속의 종류에 따라 양성적으로나 음성적인 방법으로 금속이온에 의해 약간의 영향을 받는다(Fu et al., 2009, Chi et al., 2014). 몇 가지의 아가레이즈만이 칼슘과 같은 금속이온에 의해 효소활성에 영향을 받는다(Potin et al., 1993, Jang et al., 2010). Thermoanaerobacter wiegelii(Bannikova et al., 2008)와 Paenibacillus sp. SSG-1(Song et al., 2014)의 β-아가레이즈는 5mM Mg²⁺의 조건에서 활성이 증가한다. 제한된 연구에도 불구하고 본 발명에서는 몇몇 금속이온이 특정 범위에서 아가레이즈의 활성을 증가시킨다고 결론지을 수 있다. 이러한 관점에서 AgaH92는 효소활성을 위해 Fe²⁺ 이온을 필요로하기 때문에 독특하다.

최근 바다의 생물자원은 화석연료의 대체자원으로써 부각되고 있다. 따라서 산업적으로 적용하기 위해서는 혹독한 조건과 높은 온도(아가 용액이 고체화하지 않는)에서 조류의 생물자원을 효과적으로 분해하는 효소 시스템이 개발될 필요가 있다. 덧붙여, 아가가 부분적으로 소화되어 나타나는 네오아가로올리고당은 매우 값진 기능식품으로 사용할 수 있다. 이들은 음식의 품질을 개선할 수 있고(Xiao & Kim, 2010), 피부의 촉촉한 효과와 melanoma 세포 상에서 미백효과(Ohta et al.,2005)를 나타낼 수 있으며, 항산화 효과도 갖는다(Oh et al., 2010). 본 발명에서 제공하는 열안정적인 AgaH92는 산업적인 규모로 NA4와 NA6를 만들고 다른 아가레이즈와 함께 아가를 완전히 분해하는데 매우 유용할 것이다.

본 발명의 베타-아가레이즈는 아가를 저분자로 분해하는데 매우 효과적일 뿐만 아니라 이종숙주세포를 사용한 과발현 시스템을 통해 대량생산이 가능하고, 열적으로도 매우 안정적이기 때문에 아가를 분해 또는 전환하여 다양한 화합물 또는 에너지를 생산하는 산업분야에서 다른 효소들과 함께 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 베타-아가레이즈를 사용하면 아가로부터 네오아가로테트라오스 또는 네오아가로헥사오스와 같은 유용한 네오아가로올리고당을 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명의 베타-아가레이즈를 생산하는 해양 박테리아인 Pseudoalteromonas sp. H9 KCTC23887 균주의 아가분해활성을 나타낸 고체배지 사진(A), 균주를 투과전자현미경(Transmission electron microscopy)으로 촬영한 사진(B) 및 배양시간과 세포농도에 따른 아가레이즈 활성을 나타낸 그래프(C)이다.
도 2는 Pseudoalteromonas sp. H9 KCTC23887 균주 및 이와 연관된 균주들의 16S rRNA 유전자 서열의 계통수(phylogenetic tree)이다.
도 3은 H9-1 클론의 유전자 구조와 AgaH92의 보존영역 분포를 나타낸 것이다.
도 4는 정제된 rAgaH92의 SDS-PAGE 및 자이모그래피 분석결과를 나타낸 것이다.
도 5는 정제된 rAgaH92의 생화학특성 분석결과를 나타낸 그래프이다. (A) 온도에 따른 아가레이즈 활성, (B) pH에 따른 아가레이즈 활성, (C) 금속이온에 따른 아가레이즈 활성, (D) Lineweaver-Burk plots.
도 6은 정제된 rAgaH92에 의한 가수분해물을 분석한 결과이다. (A) 기질의 종류(α-, β-form)에 따른 활성, (B) Thin-layer chromatography 분석결과, (C) 반응시간에 따른 점도.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 베타-아가레이즈 생산

1-1. 균주

아가레이즈를 생산하는 해양 박테리아인 Pseudoalteromonas sp. H9 KCTC23887는 Marine Agar(MA) 2216(Difco, USA) 플레이트 또는 Marine Broth(MB) 2216(Difco, USA) 배지를 사용하여 28℃에서 배양하였다.

Escherichia coli 균주는 Luria Bertani(LB) 배지에서 배양하였다.

1-2. 시약

아가와 아가로오스는 Amresco Inc.(USA)에서 구입하였으며, 다른 시약들은 Sigma-Aldrich Co.(USA)에서 구입하였다.

1-3. 아가레이즈 암호화 유전자의 클로닝

H9 균주의 게놈 DNA를 소니케이션(sonication)하여 부분절단하고, 0.8% 아가로오스겔 상에서 분리하였다. 약 5 ~ 13kb 크기의 DNA 단편들을 아가로오스겔로부터 추출한 다음 HincII로 절단한 pUC118에 접합하고, 이 접합체로 E. coli DH5αF′를 형질전환하였다. 약 21,000개의 흰색 콜로니를 LB 아가 플레이트로 옮겨 37℃에서 24시간 배양하였다. 이들 중 루골 아이오다인 용액(Lugol's iodine solution) 염색에서 클리어존을 형성하는 두 개의 아가레이즈-양성 콜로니를 선별하였다. 제한효소지도작성 및 염기서열분석을 위해 두 형질전환체에서 플라스미드 DNA를 분리하였다. 염기서열을 기초로 ORF Finder tool을 사용하여 ORF(open reading frame)를 확인하고, National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 제공하는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 분석하였다.

두 개의 아가레이즈-양성 콜로니 중 하나(H9-1)가 세포외 아가레이즈 활성을 나타내어 이 콜로니를 Pseudoalteromonas sp. H9의 mini-expression library로부터 선택하였다. H9-1 클론은 13,684bp의 insert를 갖으며, 여기에는 12개의 완전한 Orf(Orf1 ~ Orf12)가 포함되어 있고, 이중 2개가 아가레이즈로 추정되었다(Orf1 및 Orf2). H9-1 클론의 유전자 구성을 도 3에 나타내었다.

Orf1은 세포내 β-아가레이즈로 추정되는 단백질을 암호화하고 있었으며, 이 단백질은 P. arctica의 β-아가레이즈 C(GenBank accession no. WP010554479)와 70%, Glaciecola agarilytica의 β-아가레이즈 A(GenBank accession no. WP008301661)와 62%의 상동성을 갖는 773개의 아미노산(이론상 pI/Mw: 6.10/87.9 kDa)으로 이루어져있었다(도 3 참조).

Orf2는 445개의 아미노산(이론상 pI/Mw: 4.81/50.1 kDa)으로 구성된 미상의 단백질을 암호화하고 있었으며, N-말단 부위에 GH16의 멤버에 속하는 β-아가레이즈 도메인(cd02178)을 갖고 있었다. Orf2는 Janthinobacterium sp. SY12(ABO93616)와 Gayadomonas joobiniege(WP017445420)의 세포외 아가레이즈로 추정되는 단백질과 각각 98%, 69%의 상동성을 갖는 것으로 나타났다. 이 Orf2가 암호화하는 단백질은 19개의 아미노산을 포함하는 유력한 시그널 펩티드(SignalP 프로그램에 의해 분비되기 위해 필요한 펩티드)가 전구단백질에 포함되어 있는 것으로 예측되었으며, 이 전구단백질은 Ala¹⁹와 Asn²⁰ 사이가 시그널 펩티다제에 의해 잘려 426개의 아미노산으로 이루어지는 성숙단백질(이론상 pI/Mw: 4.76/48.1 kDa)을 형성할 것이라 예상되었다.

1-4. 아가레이즈 유전자 agaH92 의 발현벡터 제작

다른 아가레이즈-양성 클론(H9-25)은 4,474bp의 insert를 갖고, 여기에는 H9-1 클론에서 동정된 Orf2의 온전한 서열과 Orf3의 일부 서열이 포함되어 있었다. 따라서 Orf2가 두 개의 형질전환체에서 세포외 아가레이즈 활성을 나타내는데 필요한 유전자일 것이라 판단하였다. 이 유전자를 agaH92라고 명명하였다.

PCR을 통해 Orf-2(agaH92)의 전체 암호화부위를 포함하는 약 1.3kb의 단편을 증폭하였다(Forward primer: 5′-GCCATATGAAAAATAACCTTTTGTTG-3′, 밑줄친 부분은 NdeI 인식부위이다, Reverse primer: 5′-TCGAATTCTCCTCAATCAGCTGAAAACG-3′, 밑줄친 부분은 EcoRI 인식부위이다). NdeI-EcoRI으로 이중절단하고 NdeI-EcoRI으로 이중절단한 pET28a(+)에 접합하여 아가레이즈의 C-말단에 His-tag가 포함되어 발현되는 pET28a-H92를 제작하였다. 형질전환체(E. coli Rosetta-gami/pET28a-H92)를 500㎖ LBBS 배지(1M betaine과 2.5M sorbitol이 함유된 LB 배지)에서 OD₆₀₀ 값이 0.6이 될 때까지 37℃로 배양하였다. isopropylβ-d-1-thiogalactopyranoside(IPTG)를 최종농도 1mM로 처리하여 단백질 발현을 유도하고, 16℃에서 12시간 더 배양하였다. 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 균체를 회수하고, 20㎖의 PBS 완충액(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 2mM KH₂PO₄)에 현탁한 다음, 소니케이션하여 파쇄하고 다음 분석을 위해 14,000rpm으로 10분간 원심분리하였다.

1-5. 재조합 AgaH92의 생산, 리폴딩 및 정제

온도나 IPTG 농도와 같은 배양 조건을 다양하게 조합해보았지만, 발현된 단백질은 항상 인크루전바디(inclusion body)를 형성하였다. 따라서 비활성의 단백질을 활성화된 상태로 리폴딩하였다.

모든 실험은 4℃에서 수행하였다. 첫째, 원심분리 후에 얻은 인크루전바디를 0.3M n-부탄올 및 2M 우레아(urea)가 함유된 100mM Tris-HCl 완충액(pH8.5) 10㎖에 용해하고, 하룻밤동안 천천히 교반하였다. 현탁액을 1시간 동안 상온에 놓아둔 다음 12,000rpm으로 10분간 원심분리하였다(Surinder et al., 2012). 용해된 상층액(10㎖)을 1M 우레아가 함유된 TEDG 완충액(20mM Tris HCl, 0.1mM EDTA, 0.1mM DTT, 5% glycerol, pH 7.5)으로 4시간 동안 투석한 다음 0.5M 우레아가 함유된 TEDG로 4시간 투석하였다. 마지막으로 샘플을 10mM 이미다졸(imidazole)이 함유된 완충액 A(20mM Tris HCl, 0.5M NaCl, 5% glycerol, pH 7.9)로 하루밤 동안 투석하고, 10㎖ Ni²⁺-NTA 컬럼(column)(ClonTech, Japan)에 로딩하였다. 컬럼을 결합완충액 100㎖로 세척하고 세척완충액(buffer A + 60mM imidazole) 80㎖로 세척하였다. 결합된 단백질을 100mM 및 250mM 이미다졸이 함유된 완충액A로 용출하였다.

실시예 2. 베타-아가레이즈 분석

상기 실시예 1에서 생산한 베타-아가레이즈의 특성을 분석하였다.

2-1. 단백질 분석

단백질 농도는 Bradford(1976) 방법에 따라 결정하였고, bovine serum albumin을 표준으로 사용하였다. Laemmli(1970)의 방법에 따라 단백질 샘플을 0.1%-sodium dodecyl sulfate-10% polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 분석하였다. 겔은 Coomassie Brilliant Blue로 염색하였다.

2-2. 아가레이즈 활성을 위한 자이모그램 분석

단백질 샘플을 끓이지 않고 0.5% 아가로오스가 함유된 SDS-polyacrylamide gel에 로드하였다. 전기영동을 실시한 다음 겔을 1% Triton X-100가 함유된 20mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)에 담가 상온에서 1시간 동안 적시고, 10mM MOPS 완충액(pH 6.0)에 담가 45℃에서 2시간 동안 놓아두었다. 이후 Lugol's iodine solution으로 염색하였다.

2-3. 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS) 방법을 사용한 아가레이즈 활성 분석

3,5-dinitrosalicylic acid(DNS) 방법(Miller, 1959)에 따라 아가레이즈 활성을 측정하였다. 효소용액 10㎕를 0.2% 아가로오스(기질)를 함유하는 10mM MOPS(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid) 완충액(pH 6.0) 490㎕와 천천히 혼합하였다. 45℃에서 10분간 반응한 다음 DNS 반응용액(증류수 1ℓ당 DNS 6.5g, 2M NaOH 325㎖, glycerol 45㎖ 함유) 500㎕와 혼합하고, 10분간 중탕하였다. 튜브를 ice water bath에서 식힌 다음 OD₅₄₀을 측정하였다. 분석 조건에서 1분당 갈락토오스 1μmol을 생산하는 효소의 양을 아가레이즈 1유닛(U)으로 정의하였다. D-갈락토오스를 표준곡선 작성을 위한 기준 환원당으로 사용하였다.

2-4. 기질 특이성 결정

p-nitrophenyl-α-d-galactopyranoside와 p-nitrophenyl-β-d-galactopyranoside 인공색소기질을 사용하여 기질 특이성을 측정하였다. 0.25㎍의 아가레이즈를 함유하는 효소용액 500㎕를 1mM KCl 및 1mM MgSO₄·7H₂O를 함유하는 100mM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 500㎕에 첨가하고, 45℃에서 2분간 전처리하였다. 이후 색소기질용액(2㎎/㎖) 200㎕를 첨가하고 45℃에서 3시간 반응시켰다. 1 M Na₂CO₃ 500㎕를 첨가하여 반응을 멈추었다. 인공색소기질의 가수분해에 따라 발생하는 p-nitrophenol을 420㎚에서 분광측정함으로써 활성을 측정하였다.

2-5. 효소 특성 결정

아가레이즈 활성을 DNS 방법에 따라 측정하였다. 20 ~ 60℃의 온도범위 내에서 10mM MOPS 완충액(pH 6.0) 상 아가레이즈 활성 최적 온도를 측정하였다. 최적 pH 조건은 다음 완충액 및 pH 조건에 따라 45℃에서 결정하였다: 10mM citrate buffer(pH 4.0 ~ 6.0), 10mM MOPS buffer(pH 6.0 ~ 8.0), 10mM Tris-Cl buffer(pH 8.0 ~ 9.0) 및 10mM glycine-NaOH(pH 9.0 ~ 11). 1 ~ 5mM의 다양한 금속염이 함유된 완충액에서 효소활성 상 금속이온의 효과를 분석하였다. 효소는 효소분석 전 30분간 화합물들과 함께 전처리하였다.

2-6. 동역학적 계수 결정

0.5 ~ 10㎎/㎖ 범위의 다양한 양의 아가로오스를 함유하는 10mM MOPS buffer (pH 6)에서 효소(0.25㎍)의 Km 및 Vmax 동역학적 계수를 결정하였다. Km 및 Vmax 값은 표준조건에서 얻은 개시속도의 Lineweaver-Burk double-reciprocal plots의 선형회귀분석으로 계산하였다.

2-7. Thin-layer 크로마토그래피

10mM MOPS buffer(pH 6.0)에 0.2% 아가로오스 기질이 함유된 용액 190㎕와 아가레이즈 효소액 10㎕를 혼합하여 반응액을 준비하였다. 반응은 45℃에서 24시간 수행하였다. 반응액(10㎕)을 Silica Gel 60 plate(EMD Merck AG, Darmstadt, Germany)에 로드하고 n-butanol, acetic acid 및 물(2:1:1,v/v/v)의 용매시스템 상에서 이중으로 분리하였다. 30%(w/v) sulfuric acid가 함유된 에탄올 용액을 스프레이하여 분리된 산물을 가시화하고 플레이트를 120℃로 가열하였다.

2-8. 점성도 측정

Cannon-Ubbelohde Viscometer(Cannon Instrument, USA)를 사용하여 아가레이즈의 동적 점성도를 결정하였다. 효소 반응은 최적조건(10mM MOPS buffer pH 6에 0.6% 아가로오스 함유, 45℃)에서 60분간 수행하였다.

2-9. 염기서열 수납번호

Pseudoalteromonas sp. H9의 agaH92 서열은 GenBank database에 수납번호(accession number) KM289083로 기탁되어 있다.

2-10. 결과

상기 실시예 1에서 C-말단에 His-tag를 연결하여 전체 agaH92를 E. coli에서 과발현시켰으나, 인크루전 바디를 형성하였다. 이에 따라 n-butanol과 urea를 사용하여 리폴딩하였으며, affinity column을 사용하여 정제에 성공하였다. SDS-PAGE 후 zymography를 수행하여 리폴딩된 단백질(rAgaH92)의 효소 활성을 확인하였다. rAgaH92의 분자량은 약 51kDa이었으며, 이는 His-tag가 포함된 단백질의 분자량을 계산한 것과 일치하였다(도 4 참조).

25 ~ 60℃의 다양한 온도범위에서 rAgaH92의 아가레이즈 활성을 측정하였다. rAgaH92는 40 ~ 45℃에서 효율적으로 작용하였으며, 최대활성은 45℃인 것으로 나타났다. 또한 60℃에서도 40%의 아가레이즈 활성을 유지하였다(도 5A 참조). 다른 온도로 1시간 동안 열처리한 효소샘플의 잔여활성을 측정함으로써 온도안정성을 결정하였다(도 5A 참조). rAgaH92는 45℃까지 안정(99%)하였으며, 50℃에서 개시활성이 85% 이상 유지되었지만, 55℃에서는 비활성화(18% 잔여활성)되었다.

또한, rAgaH92의 활성에서 pH의 효과를 결정하였다. pH 6.0에서 최대 아가레이즈 활성을 나타내었으며, 5.0 ~ 9.0의 넓은 pH 범위에서 활성을 나타내었다. 하지만 pH가 9.0 이상일 경우와 4.0 이하일 경우에는 아가레이즈 활성의 60% 이상을 잃었다(도 5B 참조).

rAgaH92의 아가레이즈 활성에서 금속이온의 효과를 조사하였다(도 5C 참조). CuCl₂, MnCl₂ 및 ZnCl₂는 1mM과 5mM에서 아가레이즈 활성에 유의적인 영향을 미치지 않았다. 반면, NiCl₂와 MgCl₂는 5mM에서 아가레이즈 활성을 각각 40%, 50% 저해하였다. 추가로 EDTA 또한 1mM과 5mM에서 아가레이즈 활성을 각각 49%, 63% 저해하였다. 이는 효소가 cofactor로 금속이온을 필요로한다는 것을 암시한다. 흥미롭게도 FeCl₂가 5mM에서 아가레이즈 활성을 170%로 증가시켰고, EDTA의 저해효과를 상쇄하였다. 게다가 1mM EDTA 상태에 5mM FeCl₂를 첨가한 후에는 효소활성이 230%로 증가하였다(도 5C 참조). 이러한 결과는 rAgaH92 아가레이즈가 cofactor로 FeCl₂를 필요로 한다는 것을 나타낸다. 아가로오스에 대한 rAgaH92의 Km 값은 59㎎/㎖, Vmax는 156U/㎎이었다(도 5D 참조).

두 가지 타입의 색소기질, p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside와 p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside를 사용하여 rAgaH92의 기질 특이성을 조사하였다(도 6A 참조). rAgaH92는 p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside에는 강한 가수분해 활성(OD₅₄₀=1.656)을 나타낸 반면, p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside에는 활성(OD₅₄₀=0.05)이 거의 없는 것으로 나타내었다. 이는 β-연결은 인식하지만 α-연결은 인식하지 못한다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 rAgaH92가 아가를 기질로하여 네오아가로올리고당을 생산하는 β-아가레이즈라는 것을 의미한다.

thin-layer chromatography (TLC)를 사용하여 rAgaH92의 작용기작을 조사하였다(도 6B 참조). 아가로오스를 빠르게 가수분해하여 주요산물로 neoagarotetraose(NA4)와 neoagarohexaose(NA6)를 생성하였다. 반응이 진행되는 동안, NA6보다 긴 길이의 네오아가로올리고당이 연속적으로 가수분해되어 NA4와 NA6가 점차 축적되었으나, neoagarobiose(NA2)와 다른 단당류(d-galactose와 3,6-anhydro-α-l-galactose 등)는 가수분해가 끝날 때까지 발견되지 않았다.

TLC 데이터에서와 같이, rAgaH92를 처리한 후 아가로오스 용액의 점도가 처음 30분 동안 유의적으로 감소하였고, 반응이 끝날 때까지 점차 감소하였다(도 6C 참조). 이러한 가순분해 패턴은 rAgaH92가 endo-acting 아가레이즈라는 것을 나타낸다(Temuujin et al., 2011). 이들 모든 결과는 rAgaH92가 아가로오스로부터 neoagarotetraose를 생산하는 endo-acting 타입의 β-아가레이즈라는 것을 나타낸다.

<110> Myongji University Industry and Academia Cooperation Foundation <120> A novel iron-dependent GH16 beta-agarase, AgaH92 from Pseudoalteromonas sp. H9 <130> PA141022-C01 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 445 <212> PRT <213> Pseudoalteromonas sp. H9 KCTC23887 <400> 1 Met Lys Asn Asn Leu Leu Leu Ile Gly Cys Val Leu Thr Ser Thr Asn 11 15 20 25 Leu Leu Ala Asn Asp Trp Asp Ala Ile Pro Leu Pro Val Thr Pro Asp 30 35 40 Asn Gly Lys Val Trp Gln Leu Gln Glu Ala Tyr Ser Asp Ser Phe Asn 45 50 55 Tyr Thr Gly Lys Pro Ala Ala Phe Thr Ser Lys Trp Asn Asp Thr Tyr 60 65 70 Phe Asn Ser Trp Thr Gly Pro Gly Leu Thr Tyr Trp Gln Gln Asp Glu 75 80 85 90 Ser Trp Val Ser Asp Gly Asn Leu Ile Ile Ser Ala Ser Arg Arg Ala 95 100 105 Gly Thr Ala Gln Val Asn Ala Gly Val Ile Thr Ser Lys Thr Lys Val 110 115 120 Thr Phe Pro Ile Phe Leu Glu Ala Ser Ile Lys Val Ser Asn Leu Glu 125 130 135 Leu Ser Ser Asn Phe Trp Leu Leu Ser Asp Asn Asp Glu Arg Glu Ile 140 145 150 Asp Val Leu Glu Val Tyr Gly Gly Ala Arg Asp Glu Trp Phe Ala Lys 155 160 165 170 Asn Met Ser Thr Asn Phe His Val Phe Ile Arg Asp Gln Gln Thr Asn 175 180 185 Gln Ile Ile Ser Asp Tyr Asn Asp Gln Thr His Asn Thr Pro Ser Trp 190 195 200 Gly Thr Tyr Trp Arg Glu Gly Phe His Arg Phe Gly Val Tyr Trp Lys 205 210 215 Ser Pro Thr Asp Val Thr Phe Tyr Ile Asp Gly Gln Gln Thr Pro Asp 220 225 230 Gly Ser Trp Ala Gln Val Ile Met Lys Asp Lys Asp Tyr Thr Gly Ala 235 240 245 250 Thr Leu Asn Lys Asn Thr His Asn Met Asp Gln Ser Ala Tyr Ile Ile 255 260 265 Ile Asp Thr Glu Asp His Asp Trp Arg Ser Glu Ala Gly Asn Ile Ala 270 275 280 Thr Asp Ala Asp Leu Ala Asp Asp Ser Lys Asn Lys Met Tyr Val Asp 285 290 295 Trp Val Arg Val Tyr Lys Pro Val Asn Ala Ala Asn Thr Asn Ser Val 300 305 310 Thr Ser Gly Ala Gln Ile Lys Ala Lys His Ser Gln Lys Cys Ile Asp 315 320 325 330 Ile Lys Asn Gly Ala Met Asn Asn Gly Ser Ile Tyr Gln Gln Trp Asn 335 340 345 Cys Asn Ser Asn Asn Glu Asn Gln Ala Phe Glu Leu Val Glu Leu Thr 350 355 360 Asn Asn Glu Tyr Ala Ile Ser Ser Gln Leu Thr Gly Leu Cys Met Gln 365 370 375 Ile Ala Asn Ser Ser Thr Ser Asn Gly Ala Gly Val Glu Gln Trp Val 380 385 390 Cys Asp His Thr Lys Ala Asn Gln Arg Phe Thr Leu Asn Asn Thr Gly 395 400 405 410 Asp Gly Tyr Phe Glu Leu Arg Ser Ser Leu Ser Asn Lys Cys Ile Asp 415 420 425 Ile Ala Gly Lys Leu Gln Thr Asn Gly Ala Ser Val Val Gln Trp Gln 430 435 440 Cys Tyr Asn Gly Asp Asn Gln Arg Phe Gln Leu Ile Glu 445 450 455 <210> 2 <211> 426 <212> PRT <213> Pseudoalteromonas sp. H9 KCTC23887 <400> 2 Asn Asp Trp Asp Ala Ile Pro Leu Pro Val Thr Pro Asp Asn Gly Lys 1 5 10 15 Val Trp Gln Leu Gln Glu Ala Tyr Ser Asp Ser Phe Asn Tyr Thr Gly 20 25 30 Lys Pro Ala Ala Phe Thr Ser Lys Trp Asn Asp Thr Tyr Phe Asn Ser 35 40 45 Trp Thr Gly Pro Gly Leu Thr Tyr Trp Gln Gln Asp Glu Ser Trp Val 50 55 60 Ser Asp Gly Asn Leu Ile Ile Ser Ala Ser Arg Arg Ala Gly Thr Ala 65 70 75 80 Gln Val Asn Ala Gly Val Ile Thr Ser Lys Thr Lys Val Thr Phe Pro 85 90 95 Ile Phe Leu Glu Ala Ser Ile Lys Val Ser Asn Leu Glu Leu Ser Ser 100 105 110 Asn Phe Trp Leu Leu Ser Asp Asn Asp Glu Arg Glu Ile Asp Val Leu 115 120 125 Glu Val Tyr Gly Gly Ala Arg Asp Glu Trp Phe Ala Lys Asn Met Ser 130 135 140 Thr Asn Phe His Val Phe Ile Arg Asp Gln Gln Thr Asn Gln Ile Ile 145 150 155 160 Ser Asp Tyr Asn Asp Gln Thr His Asn Thr Pro Ser Trp Gly Thr Tyr 165 170 175 Trp Arg Glu Gly Phe His Arg Phe Gly Val Tyr Trp Lys Ser Pro Thr 180 185 190 Asp Val Thr Phe Tyr Ile Asp Gly Gln Gln Thr Pro Asp Gly Ser Trp 195 200 205 Ala Gln Val Ile Met Lys Asp Lys Asp Tyr Thr Gly Ala Thr Leu Asn 210 215 220 Lys Asn Thr His Asn Met Asp Gln Ser Ala Tyr Ile Ile Ile Asp Thr 225 230 235 240 Glu Asp His Asp Trp Arg Ser Glu Ala Gly Asn Ile Ala Thr Asp Ala 245 250 255 Asp Leu Ala Asp Asp Ser Lys Asn Lys Met Tyr Val Asp Trp Val Arg 260 265 270 Val Tyr Lys Pro Val Asn Ala Ala Asn Thr Asn Ser Val Thr Ser Gly 275 280 285 Ala Gln Ile Lys Ala Lys His Ser Gln Lys Cys Ile Asp Ile Lys Asn 290 295 300 Gly Ala Met Asn Asn Gly Ser Ile Tyr Gln Gln Trp Asn Cys Asn Ser 305 310 315 320 Asn Asn Glu Asn Gln Ala Phe Glu Leu Val Glu Leu Thr Asn Asn Glu 325 330 335 Tyr Ala Ile Ser Ser Gln Leu Thr Gly Leu Cys Met Gln Ile Ala Asn 340 345 350 Ser Ser Thr Ser Asn Gly Ala Gly Val Glu Gln Trp Val Cys Asp His 355 360 365 Thr Lys Ala Asn Gln Arg Phe Thr Leu Asn Asn Thr Gly Asp Gly Tyr 370 375 380 Phe Glu Leu Arg Ser Ser Leu Ser Asn Lys Cys Ile Asp Ile Ala Gly 385 390 395 400 Lys Leu Gln Thr Asn Gly Ala Ser Val Val Gln Trp Gln Cys Tyr Asn 405 410 415 Gly Asp Asn Gln Arg Phe Gln Leu Ile Glu 420 425 <210> 3 <211> 1335 <212> DNA <213> Pseudoalteromonas sp. 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H9 KCTC23887 <400> 4 aacgactggg atgcaatacc actgccagtc acgcctgaca atggtaaagt ttggcaacta 60 caagaagcat actcggattc ttttaattac acgggtaagc ctgctgcatt taccagtaaa 120 tggaatgata catattttaa tagttggaca ggtccaggct tgacctattg gcaacaagat 180 gaatcttggg tctcagatgg gaatctcata attagtgctt cacgtcgtgc aggtactgct 240 caagtcaatg caggggtgat cacttcaaaa actaaagtca cgttcccaat atttttagaa 300 gctagtatta aggtgagtaa cctagagtta tcttcaaatt tttggttgct tagcgataat 360 gatgaacgag aaattgatgt actagaagta tacggtggtg cgcgtgatga atggtttgct 420 aaaaatatgt cgacgaactt ccatgttttt attcgcgatc aacaaacaaa tcaaataatc 480 agtgattaca atgaccaaac ccataatacg ccaagctggg gaacatactg gcgagaaggc 540 tttcatcgct ttggtgtgta ttggaaaagt ccaacagatg tcacatttta tattgatggc 600 cagcaaacgc cagatggttc ttgggcacaa gtgatcatga aagacaaaga ctacactggg 660 gctacgttaa ataagaacac acataatatg gatcaatctg cttatattat tattgatact 720 gaagatcatg attggcgctc agaagcgggt aatattgcaa ctgatgcaga cctagccgat 780 gacagtaaaa ataaaatgta cgttgattgg gtgcgcgtgt ataaacccgt taatgcagca 840 aatacaaact ctgttactag tggcgcgcaa attaaagcaa aacacagtca aaagtgtatc 900 gatattaaaa acggtgcaat gaataacggc agtatttatc agcaatggaa ttgtaattct 960 aataacgaga accaagcatt tgagctcgtt gaactcacaa ataacgaata tgctatcagc 1020 tcacaattaa ctggcttgtg tatgcaaatt gcaaattcaa gtacctcaaa tggcgcaggg 1080 gttgaacagt gggtgtgtga tcacacaaaa gccaatcaac gttttacact gaacaataca 1140 ggagatggct actttgaact tagatcaagc ttaagtaata aatgtattga tatagcaggt 1200 aaattacaaa ccaatggcgc gtcagttgtg cagtggcagt gttataacgg cgataatcag 1260 cgttttcagc tgattgag 1278

Claims (12)

1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 베타-아가레이즈(β-agarase).
2. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 베타-아가레이즈 유전자.
3. 제 2항에 있어서,
   서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 베타-아가레이즈 유전자.
4. 제 2항 또는 제 3항의 베타-아가레이즈 유전자를 함유하는 베타-아가레이즈 생산용 재조합 벡터.
5. 제 4항의 베타-아가레이즈 생산용 재조합 벡터로 형질전환된 베타-아가레이즈 생산용 형질전환체.
6. 제 5항의 형질전환체를 배양하고 상기 베타-아가레이즈 유전자를 과발현시키는 것을 특징으로 하는 베타-아가레이즈 대량생산방법.
7. 제 1항의 베타-아가레이즈를 아가(agar)와 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당(neoagaro-oligosaccharide) 생산방법.
8. 제 7항에 있어서,
   상기 효소반응이 40 내지 45℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당 생산방법.
9. 제 7항에 있어서,
   상기 효소반응이 pH 5 내지 7에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당 생산방법.
10. 제 7항에 있어서,
    상기 효소반응이 철(Fe) 이온의 존재 하에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당 생산방법.
11. 제 10항에 있어서,
    상기 철 이온의 농도가 1 내지 10mM인 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당 생산방법.
12. 제 7항에 있어서,
    상기 네오아가로올리고당은 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 또는 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)인 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당(neoagaro-oligosaccharide) 생산방법.
    

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