KR101944857B1 - 가야도모나스 주비니에게 G7 유래 베타-아가레이즈 AgaJ11 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가야도모나스 주비니에게 G7 유래 베타-아가레이즈 AgaJ11 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 가야도모나스 주비니에게 G7으로부터 동정되어 이종균주에서 과발현이 가능하며 아가로오스를 분해하여 네오아가로올리고당을 생성할 수 있고 낮은 pH에서도 효소활성을 안정적으로 나타내는 베타-아가레이즈 AgaJ11 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 가야도모나스 주비니에게 G7 유래 베타-아가레이즈 AgaJ11를 이용하여 아가로오스로부터 산업상 매우 유용한 네오아가로올리고당을 효율적으로 생산할 수 있으며, 아가로오스를 저분자로 분해하는 방법이 필요한 분야에서도 유용하게 이용할 수 있다. 특히 본 발명에 따르면 AgaJ11은 낮은 pH 조건에서 우수한 베타-아가레이즈 활성을 나타내기 때문에 본 발명에서 제공하는 방법, 조성물 및 키트는 다양한 조건이 요구되는 산업 분야에서 보다 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대되며, 또한 본 발명에서 제공하는 벡터, 형질전환체 및 베타-아가레이즈 대량생산방법을 이용하면 이종숙주세포를 사용한 과발현 시스템을 통해 베타-아가레이즈를 효율적으로 생산할 수 있다.

Description

가야도모나스 주비니에게 G7 유래 베타-아가레이즈 AgaJ11 및 이의 이용{A beta-agarase AgaJ11 from Gayadomonas joobiniege G7 and use thereof}

본 발명은 가야도모나스 주비니에게 G7 유래 베타-아가레이즈 AgaJ11 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 가야도모나스 주비니에게 G7으로부터 동정되어 이종균주에서 과발현이 가능하며 아가로오스를 분해하여 네오아가로올리고당을 생성할 수 있고 낮은 pH에서도 효소활성을 안정적으로 나타내는 베타-아가레이즈 AgaJ11 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.

아가(agar)는 Gelidium, Gracilaria 같은 적색조류(red algae)에서 발견되는 세포벽 구성 물질로 아가로오스(agarose)와 포피로오스(porphyrose)로 이루어진 다당류(polysaccharide)이다(Chi et al., 2012; Duckworth and Yaphe, 1972). 아가로오스는 베타-1,4 글리코시드 결합(glycosidic bond)으로 이루어진 갈락토오스(galactose)와 알파-1,3 결합으로 연결된 무수갈락토오스(anhydrogalactose)가 번갈아가며 연결된 긴 선형의 물질이다(Duckworth and Yaphe, 1972). 포피로오스는 베타-1,4 글리코시드 결합의 갈락토오스와 알파-1,3 글리코시드 결합의 갈락토오스-6-sulfate가 번갈아가며 연결된 물질이다(Hehemann et al., 2010; Morrice et al., 1983).

아가를 분해하는 다양한 미생물들이 발견이 되었다. Alteromonas (Chi et al., 2014), Pseudomonas (Hsu et al., 2015), Pseudoalteromonas (Park et al., 2015), Vibrio (Liao et al., 2011), Flammeovirga (Han et al., 2016), Zobellia (Hehamann et al., 2012), Agarivorans (Liu et al., 2014), Cohnella (Li et al., 2015), Bacillus (Li et al., 2014), Catenovulum (Cui et al., 2014), Thalassomonas (Ohta et al., 2005), Stenotrophomonas (Zhu et al., 2016), Simiduia (Tawara et al., 2015), Gayadomonas (Chi et al., 2013), Streptomyces (Temuujin et al., 2012; Temuujin et al., 2011) 등의 다양한 속에 속하는 미생물이 아가를 분해한다는 사실이 보고되었다. 아가를 분해하는 효소는 크게 알파-아가레이즈(agarase), 베타-아가레이즈, 베타-포피란네이즈(porphyrannase)로 나눠질 수 있다. 알파-아가레이즈는 아가로오스의 알파-1,3 결합을 잘라서 환원 말단(reducing end)에 무수갈락토오스를 가진 아가로올리고당(agarooligosaccharide)을 생성하는 효소이다. 지금까지 오직 두 종류의 알파-아가레이즈만 보고가 되었다(Ohta et al., 2005; Potin et al., 1993).

베타-아가레이즈는 갈락토오스와 무수갈락토오스의 베타-1,4 결합을 분해하여 환원 말단에 갈락토오스를 가진 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide)을 생성하는 효소이다(Araki, 1959). 베타-아가레이즈는 CAZY 데이터베이스에 근거하였을 때 GH16, GH50, GH86, GH118 등 다양한 GH(글루코사이드 분해효소, glycoside hydrolase) family에서 발견되었다(Chi et al., 2014 and Ohta et al., 2005). 갈락토오스의 세포내 대사는 대장균과 같은 세균에서 잘 알려져 있지만(Frey, 1996), 무수갈락토오스의 세포내 대사경로는 최근에야 Vibrio 속 EJY3 균주에서 밝혀졌다(Yun et al., 2015). 무수갈락토오스는 3,6-anhydro-α-L-galactose dehydrogenase 효소와 3,6-anhydrogalactonate cycloisomerase 효소에 의해 3,6-anhydrogalactonate와 2-keto-3-deoxy-galactonate로 변화되어 중심대사에 편입되어 분해된다. 그러므로 이런 아가를 분해하는 효소의 발견은 바이오에너지 분야를 포함한 다양한 산업 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명자는 해조류 유래 아가로올리고당을 보다 유용하게 이용할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였으며, 특히 이러한 아가로올리고당을 특이적으로 분해하여 유용한 형태의 당을 생산할 수 있는 미생물 및 관련 효소를 발굴하기 위하여 노력하였다. 또한 해양 미생물 자원으로부터 특이적인 성질의 새로운 아가로올리고당 분해효소를 발굴함으로써 산업적으로 유용하게 사용할 수 있도록 하고자 하였다. 이의 결과, 우리나라 가야섬의 연안 바닷물에서 분리된 가야도모나스 주비니에게 G7(Gayadomonas joobiniege G7) 균주로부터 신규한 β-아가레이즈 및 이의 유전자를 동정하고, 이의 재조합 효소를 대량생산할 수 있는 방법을 구축하였으며, 생산된 효소를 이용하여 유용한 네오아가로올리고당을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 낮은 pH에서도 효소활성을 갖는 특이적인 성질이 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

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따라서 본 발명의 주된 목적은 가야도모나스 주비니에게 G7(Gayadomonas joobiniege G7) 균주로부터 유래한 베타-아가레이즈의 특성을 이용하여 산업적으로 유용하게 적용할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 베타-아가레이즈를 생산하기 위한 재조합 벡터, 형질전환체 및 이들을 이용한 베타-아가레이즈의 대량생산 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 효소로 이용하여 아가로오스(agarose)를 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 생산방법을 제공한다.

본 발명의 네오아가로올리고당 생산방법에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 네오아가로올리고당 생산방법에 있어서, 상기 네오아가로올리고당은 네오아가로바이오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)로 이루어진 군 중에서 선택된 네오아가로올리고당일 수 있다.

본 발명의 네오아가로올리고당 생산방법에 있어서, 상기 효소반응이 pH 4 내지 5에서 이루어지도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 네오아가로올리고당 생산방법에 있어서, 상기 효소반응이 20 내지 30℃에서 이루어지도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 효소로 이용하여 아가로오스(agarose)를 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 아가로오스 분해방법을 제공한다.

본 발명의 아가로오스 분해방법에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 아가로오스 분해방법에 있어서, 상기 효소반응이 pH 4 내지 5에서 이루어지도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 아가로오스 분해방법에 있어서, 상기 효소반응이 20 내지 30℃에서 이루어지도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 함유하는 아가로오스(agarose)를 효소반응시켜 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide)을 생산하기 위한 네오아가로올리고당 생산용 효소 조성물을 제공한다.

본 발명의 효소 조성물에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 효소 조성물에 있어서, 상기 네오아가로올리고당은 네오아가로바이오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)로 이루어진 군 중에서 선택된 네오아가로올리고당일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 함유하는 DNA가 함유된 아가로오스 겔(agarose gel)로부터 DNA를 추출하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 함유하는 베타-아가레이즈(beta-agarase) 생산용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 베타-아가레이즈 생산용 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하고 서열번호 1의 아미노산을 암호화하는 유전자를 과발현시키는 것을 특징으로 하는 베타-아가레이즈 대량생산방법을 제공한다.

본 발명에 따르면 가야도모나스 주비니에게 G7 유래 베타-아가레이즈 AgaJ11를 이용하여 아가로오스로부터 산업상 매우 유용한 네오아가로올리고당을 효율적으로 생산할 수 있으며, 아가로오스를 저분자로 분해하는 방법이 필요한 분야에서도 유용하게 이용할 수 있다. 특히 본 발명에 따르면 AgaJ11은 낮은 pH 조건에서 우수한 베타-아가레이즈 활성을 나타내기 때문에 본 발명에서 제공하는 방법, 조성물 및 키트는 다양한 조건이 요구되는 산업 분야에서 보다 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대되며, 또한 본 발명에서 제공하는 벡터, 형질전환체 및 베타-아가레이즈 대량생산방법을 이용하면 이종숙주세포를 사용한 과발현 시스템을 통해 베타-아가레이즈를 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 재조합 AgaJ11를 SDS-PAGE 겔 상에서 분리한 것(a)과 자이모그램 분석한 결과(b)이다. Lane M, size marker; lane 1, pHis-AgaJ11 재조합 벡터로 형질전환된 ER2566의 인덕션(induction)하기 전 세포 추출물; lane 2, pHis-AgaJ11 재조합 벡터로 형질전환된 ER2566을 1mM IPTG로 인덕션한 이후의 세포 추출물; lane 3, metal affinity chromatography로 정제한 정제된 AgaJ11.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 재조합 AgaJ11의 효소활성에 pH(a), 온도(b) 및 금속이온(c)이 미치는 영향을 조사한 결과이다. (a)의 pH conditions : diamonds, 3 ~ 6 (10mM sodium citrate); squares, 6 ~ 7 (10mM MOPS); triangles, 7 ~ 9 (10mM Tris-HCl); circles, 9 ~ 10 (10mM Glycine-NaOH); (b) : diamonds, 10mM sodium citrate buffer(pH 4.5) 상에서의 온도별 활성; circles, 각 온도 상에서 1시간 도안 pre-incubation한 이후 최적 조건에서 측정한 활성(온도안정성).
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 재조합 AgaJ11의 동역학적 계수를 결정하기 위한 그래프이다. 모든 데이터는 적어도 2회의 반복실험을 통한 평균값으로 나타냄.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 재조합 AgaJ11의 반응산물을 분석한 결과이다. (a) 시간별 반응산물의 점성도 측정 결과, (b) 시간별 아가로오스 가수분해산물의 TLC 분석 결과, (c) 다양한 네오아가로올리고당을 기질로 이용한 반응산물의 TLC 분석 결과, NA2 : 네오아가로바이오스(neoagarobiose), NA4 : 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), NA6 : 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose).
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 재조합 AgaJ11에 의한 가수분해산물의 MALDI-TOF 분석 결과이다. (a) TLC 상 NA4 spot의 분석 결과, (b) TLC 상 NA6 spot의 분석 결과.

본 발명의 네오아가로올리고당 생산방법, 아가로오스 분해방법, 효소 조성물 및 키트는 AgaJ11의 특성을 이용하는 것을 특징으로 한다.

AgaJ11은 가야도모나스 주비니에게 G7(Gayadomonas joobiniege G7)의 게놈 염기서열 분석과정에서 나타난 가상의 단백질(hypothetical protein)로 지금까지 그 기능이 밝혀져지지 않았었으나, 본 발명을 통해 이 단백질이 베타-아가레이즈임이 밝혀졌다.

AgaJ11 생산균주인 가야도모나스 주비니에게 G7은 우리나라 가야섬의 연안 바닷물에서 분리된 균주로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 KCTC23721로, 미국균주은행(American Type Culture Collection, ATCC)에 ATCC BAA-2321로, 독일균주은행(Deutsche Sammlung von Microorganismund Zellkulturen Gmb H, DSM)에 DSM25250로 기탁되어 있다.

AgaJ11은 처음에는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 전구단백질(pre-mature protein)로 발현되고 이후 시그널 펩티드(signal peptide)(서열번호 2의 1 ~ 26번 아미노산)가 잘려 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 성숙단백질(mature protein)이 될 것으로 예상되었다. 따라서 시그널 펩티드가 제외된 서열번호 1의 아미노산 서열만으로 이루어지더라도 본래의 활성을 나타낼 수 있을 것으로 예상되었으며, 본 발명에서 실험을 통해 이를 입증하였다. 본 발명에서는 서열번호 1의 아미노산 서열의 N 말단 부위에 다수의 히스티딘(Histidine)이 연결된 형태(서열번호 3)로 제조되었지만, 이 부위는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 부분으로 본래 단백질의 활성에는 영향을 미치지 않는다. 따라서 AgaJ11의 베타-아가레이즈 활성을 이용하기 위해서는 서열번호 1의 아미노산 서열만으로 이루어지더라도 가능하며, 이 밖에 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열을 부가하는 것도 가능할 것이다. 부가되는 서열에 특별한 제한은 없으나 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열 등을 부가하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 정제의 용이성을 위해 다수개의 히스티딘(Histidine)을 N-말단 또는 C-말단에 부가한 형태일 수 있다(서열번호 3 참조). 또한 전구단백질과 같이 시그널 펩티드가 포함된 형태로도 이용할 수 있을 것이다.

본 발명에 따르면, AgaJ11은 endo-작용성 베타-아가레이즈이며, 아가로오스와 효소반응하여 네오아가로바이오스(neoagarobiose; NA2), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose; NA4), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose; NA6) 및 이들보다 분자량이 큰 네오아가로올리고당을 생성하는 것으로 나타났다. 따라서 이 AgaJ11을 네오아가로올리고당의 생산에 매우 유용하게 이용할 수 있다. 반응 초기에는 주로 분자량이 큰 네오아가로올리고당이 생성되며, 오랜 시간 반응시키면 보다 작은 분자량을 갖는 NA2 및 NA4의 생성이 증가하므로, 반응시간의 조절을 통해 상기와 같은 다양한 네오아가로올리고당을 생산할 수 있다.

본 발명에 따르면, AgaJ11은 pH 4 내지 5의 pH 조건 및 20 내지 30℃의 온도조건에서 보다 우수한 베타-아가레이즈 활성을 나타낼 수 있다. 따라서 보다 효율적으로 네오아가로올리고당을 생산하기 위해서는 상기와 같은 pH 및 온도 조건을 적용하는 것이 바람직하다. 활성의 측면만으로 본다면 40℃의 온도조건에서도 우수한 활성을 나타내지만 이 온도에서는 안정성이 낮아질 수 있다.

상기와 같이 AgaJ11은 고분자의 아가로오스를 상대적으로 저분자 형태인 네오아가로올리고당으로 효과적으로 분해할 수 있다. 따라서 아가로오스를 분해하기 위한 용도로도 유용하게 활용될 수 있다. 이때의 바람직한 조건은 상기 네오아가로올리고당의 생산을 위한 조건과 동일할 것이다.

상기와 같은 AgaJ11의 특성을 이용한 본 발명의 네오아가로올리고당 생산용 효소 조성물은 AgaJ11 또는 이의 재조합 단백질 이외에도 단백질의 효소활성을 안정적으로 유지할 수 있도록 하기 위한 완충제, 또는 부형제 등의 첨가제를 포함할 수 있으며, 동일 또는 유사한 효소활성을 갖는 다른 효소도 추가로 포함될 수 있을 것이다.

아가로오스를 분해하는 활성은 아가로오스를 이용한 DNA 또는 RNA와 같은 분자의 전기영동 이후 아가로오스 겔로부터 이들 분자를 회수하는데 유용하게 활용될 수 있다. 따라서 AgaJ11 또는 이의 재조합 단백질을 아가로오스 겔로부터 DNA를 추출하기 위한 키트, 예를 들어 DNA gel extraction kit 등에 이용할 수 있다. 이때 키트에는 AgaJ11 또는 이의 재조합 단백질 이외에도 DNA 추출 시 필요한 시약 또는 기구 등이 추가로 포함될 수 있을 것이다.

가야도모나스 주비니에게 G7의 게놈 상에는 전구단백질 형태의 AgaJ11이 서열번호 5의 염기서열로 암호화되어 있다. 하지만 위에서 설명한 바와 같이 베타-아가레이즈 활성은 시그널 펩티드가 잘린 형태에서도 발휘되므로, 서열번호 5의 염기서열에서 시그널 펩티드를 암호화하는 부위가 제거된 서열번호 4의 염기서열이 발현되더라도 발현된 단백질은 베타-아가레이즈 활성을 나타낼 수 있다. 또한 반드시 서열번호 4와 같은 염기서열이 아니더라도 같은 아미노산 서열을 암호화하도록 변경된 서열이 발현되면 발현된 단백질은 베타-아가레이즈 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 서열번호 4에서 코돈 서열을 변형하는 방법이 여기에 해당될 수 있다. 즉, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자가 발현되면 발현된 단백질은 베타-아가레이즈 활성을 나타낼 수 있을 것이다.

본 발명의 재조합 벡터는 상기와 같은 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 함유함으로써 베타-아가레이즈를 생산하기 위해 이용될 수 있는데, 이때 이 유전자에는 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 다양한 염기서열이 부가될 수 있다. 부가되는 서열로는 위에서 언급한 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열일 수 있으며, 여기에는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열 등을 암호화하는 서열이 포함된다. 예를 들어, 정제의 용이성을 위해 다수개의 히스티딘(Histidine)을 암호화하는 서열을 5'-말단 또는 3'-말단에 부가한 형태일 수 있다(서열번호 6 참조). 또한 상기 유전자로는 본래 AgaJ11을 암호화하는 유전자(서열번호 5 참조)를 이용할 수도 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 상기와 같은 유전자가 용이하게 발현될 수 있도록 숙주에 따라 적합한 프로모터(promoter) 및 터미네이터(terminator)가 포함되는 것이 바람직하며, 이 프로모터 및 터미네이터로는 agaJ11 고유의 프로모터 및 터미네이터를 이용할 수도 있다. 이러한 프로모터 및 터미네이터가 포함되어 있으며 외래 유전자의 도입이 용이하게 설계된 다양한 벡터들이 개발되어 있어 이들을 이용할 수 있다. 예를 들어 대장균(Escherichia coli)을 숙주로 이용할 경우 pET 시리즈의 벡터를 이용할 수 있다.

본 발명의 형질전환체는 상기와 같은 재조합 벡터를 숙주생물체에 도입하여 제조될 수 있다. 이때 숙주로는 다양한 생물체를 이용할 수 있을 것으로 판단되며, 베타-아가레이즈의 안정적인 발현 또는 생산 효율을 위해 미생물을 이용하는 것이 보다 바람직할 것이다. 본 발명에 따르면 agaJ11이 대장균의 발현시스템에서도 매우 원활하게 발현될 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서 대장균을 숙주로 이용하여 형질전환체를 제조하면 베타-아가레이즈을 매우 용이하게 생산할 수 있다. 숙주생물체의 형질전환은 각 숙주생물체에 이용되고 있는 통상의 형질전환방법을 적용하여 상기 재조합 벡터를 숙주생물체에 도입하는 방법으로 달성할 수 있다.

본 발명의 베타-아가레이즈 대량생산은 상기 형질전환체를 배양하고 베타-아가레이즈 유전자를 과발현시키는 방법으로 달성할 수 있다. 이때 배양배지의 종류, 배양온도, 배양시간 등의 조건은 숙주 및 벡터의 종류에 따라 선택적으로 적용할 수 있다. 예를 들어 숙주가 대장균이고 pET28 시리즈의 벡터를 이용하는 경우, LB(Luria Bertani) 배지에서 약 15 ~ 40℃로 12시간 ~ 5일간 배양하는 방법을 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 베타-아가레이즈 생산

1-1. 방법

1-1-1. 균주

아가레이즈를 생산하는 해양 박테리아인 가야도모나스 주비니에게 G7(Gayadomonas joobiniege G7)(KCTC23721)은 Marine Broth(MB) 2216(Difco, USA) 배지를 사용하여 30℃에서 배양하였다. Escherichia coli ER2566 균주는 Luria Bertani(LB) 배지에서 배양하였다.

1-1-2. 아가레이즈 암호화 유전자 agaJ11 의 발현벡터 제작

가야도모나스 주비니에게 G7 균주의 유전자 중 아가레이즈 활성이 있을 것으로 추정되는 agaJ11을 찾을 수 있었다. 이 agaJ11이 암호화하는 단백질은 26개의 시그널 펩티드가 전구단백질에 포함되어 있는 것으로 예측되었으며(SignalP 프로그램 이용), 이 전구단백질의 Asp²⁶과 Leu²⁷사이가 시그널 펩티다제에 의해 잘려 291개의 아미노산으로 이루어지는 성숙단백질(이론상 pI: 8.76, Mw: 33.96 kDa)을 형성할 것으로 예상이 되었다. 이에 agaJ11의 발현벡터를 제작하기 위해 예측된 시그널 펩티드를 제외한 291개의 아미노산을 암호화하는 DNA 부위(876 bp)의 단편을 증폭하였다(forward primer: 5'-CGCGCGGCAGCCATATGCTAAATCATGAGCGTTTGGC-3', 밑줄친 부분은 NdeI 인식부위이다; reverse primer: 5'-GCTCGAATTCGGATCCGTTTTACGCATTATCTAGTT-3', 밑줄친 부분은 BamHI 인식부위이다). NdeI-BamHI으로 절단한 후 같은 제한효소로 절단한 pET28a에 접합하여 아가레이즈의 N-말단에 His-tag이 포함되어 발현되는 재조합 벡터 pHis-AgaJ11을 제작하였다. 이 재조합 벡터로 E. coli ER2566을 형질전환하여 형질전환체(E. coli ER2566/pHis-AgaJ11)를 수득하고, 이 형질전환체를 500㎖ LB 배지에서 OD₆₀₀값이 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양하였다. Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)를 1mM로 처리하여 단백질 발현을 유도하면서 30℃에서 4시간 더 배양하였다. 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 회수하고, 10㎖ PBS buffer(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 2mM KH₂PO₄)로 회수한 세포를 씻어준 후, French pressure cell을 이용하여 10,000p.s.i.에서 세포를 2번 파쇄한 후 10,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액만을 취하여 단백질 순수분리에 이용하였다.

1-1-3. 재조합 AgaJ11의 정제

재조합 단백질을 포함하는 상층액을 1㎖ BD TALON^TM metal affinity resin과 함께 20분간 섞어준 후 washing buffer(50mM Tris-HCl, 300mM NaCl, pH 8.0) 20㎖로 씻어주고 200mM imidazole을 포함하는 washing buffer로 재조합 AgaJ11을 용출하였다. Imidazole을 제거하여 보다 고순도의 단백질을 순수분리하기 위해서 HiLoad 16/600 Superdex 200pg column을 이용한 gel filtration 크로마토그래피를 수행하였다. 재조합 AgaJ11 단백질이 포함된 검출되어 나온 fraction을 농축한 후 단백질의 농도는 Bradford assay방법을 통해 결정하였다. 단백질의 순수도는 0.1%-sodium dodecyl sulfate-10% polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 분석한 후 Coomassie Brilliant Blue로 염색하여 확인하였다.

1-2. 결과

26개의 시그널 펩티드가 제외된 N-말단에 His-tag이 연결된 AgaJ11을 E. coli에서 발현하여 순수분리하였다(도 1의 a 참조). 재조합 AgaJ11의 분자량은 약 34.5kDa이었으며 이는 His-tag이 포함된 단백질의 분자량을 계산하여 예측한 값과 거의 일치하였다. SDS-PAGE 후 zymogram을 수행하여 재조합 AgaJ11 단백질의 아가레이즈 효소 활성을 확인하였다(도 1의 b 참조).

실시예 2. 베타-아가레이즈 분석

상기 실시예 1에서 생산한 베타-아가레이즈의 특성을 분석하였다.

2-1. 방법

2-1-1. 아가레이즈 활성을 위한 자이모그램 분석

끓이지 않은 단백질 샘플을 0.3% 아가로오스가 포함된 SDS-polyacrylamide gel에 loading하여 전기영동을 수행한 다음 1% triton X-100이 함유된 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충액에 1시간동안 담가두었다. Gel을 물로 씻어준 후 20mM sodium citrate(pH 4.5) 완충액에 담아 40℃에서 12시간 반응시켰다. 12시간 후 lugol's iodine solution으로 염색하여 아가레이즈 활성을 측정하였다.

2-1-2. 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS) 방법을 사용한 아가레이즈의 효소활성 측정

3,5-dinitrosalicylic acid(DNS) 방법은 환원당의 양을 측정하는 방법이다. 0.2% 아가로오스를 포함한 20mM sodium citrate(pH 4.5) 완충액 480㎕에 상기 실시예 1에서 정제된 AgaJ11 단백질 20㎕를 넣고 40℃에서 30분간 반응한 후 DNS 반응용액(증류수 1ℓ에 DNS 6.5g, 2M NaOH 325㎖, glycerol 45㎖ 함유) 500㎕와 혼합한 후 10분간 중탕하였다. 반응액을 얼음물에 식힌 다음 10,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액만을 취하여 OD₅₄₀에서 흡광도를 측정하였다. 1유닛(U)은 위 반응 조건에서 1분당 갈락토오스 1μmol을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다. D-갈락토오스를 이용하여 표준곡선을 작성한 후 반응에서 생성되는 갈락토오스의 양을 측정하였다.

2-1-3. 효소 특성 결정

효소활성의 최적온도는 앞에서 설명한 DNS 방법을 이용하여 20 ~ 60℃의 온도범위 및 10mM sodium citrate(pH 4.5) 완충액 상에서 아가레이즈의 활성을 측정하는 방법으로 확인하였다. 최적 pH는 40℃ 및 다양한 pH 조건에서 실험을 진행하여 확인하였다. pH 3 ~ 6 (10mM sodium citrate), pH 6 ~ 7 (10mM MOPS), pH 7 ~ 9 (10mM Tris-HCl), pH 9 ~ 10 (10mM Glycine-NaOH). 금속염에 따른 효과는 각각의 금속염 5mM이 포함된 완충액에서 효소활성을 조사하는 방법으로 확인하였다.

2-1-4. 동역학적 계수 결정

다양한 농도의 아가로오스(0.1 ~ 8㎎/㎖)가 존재하는 조건에서 10mM sodium citrate(pH 4.5) 완충액에 효소(1.4㎍)를 넣고 40℃에서 10분간 반응하여 효소의 Km과 Vmax의 동역학적 계수를 결정하였다. 표준조건에서 얻은 개시속도의 Lineweaver-Burk double-reciprocal plots의 선형회귀분석으로 Km과 Vmax의 값을 계산하였다.

2-1-5. Thin layer 크로마토그래피(TLC) 분석

0.2% 아가로오스 기질이 함유된 20mM sodium citrate(pH 4.5) 완충액에 효소(1.4㎍)를 넣고 40℃에서 시간대별로 다양하게 반응시킨 후 반응액(10㎕)을 silica gel 60 plate에 로드하였다. n-butanol : acetic acid : 물이 2 : 1 : 1로 첨가된 용액을 이용한 크로마토그래피 전개 방법으로 물질들을 분리하였다. 이후 plate를 완전히 말린 후 30%(w/v) sulfuric acid가 함유된 에탄올 용액을 스프레이하고, plate를 120℃의 오븐에서 가열하여 분리된 물질들을 가시화하였다.

2-1-6. 점성도 측정

아가레이즈의 점성도는 DV2T viscometer(Brookfield AMETEK, USA)를 이용하여 측정하였다. 0.5% 아가로오스를 포함한 20mM sodium citrate(pH 4.5) 완충액에 아가레이즈를 넣고 40℃에서 60분간 반응을 진행한 다음 점성도를 측정하였다.

2-1-7. 질량분석법

TLC 반응을 통해 생성된 생성물의 분자량을 측정하기 위하여 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight) 분석을 수행하였다. TLC 상에서 NA4(네오아가로테트라오스, neoagarotetraose)와 NA6(네오아가로헥사오스, neoagarohexaose)에 해당하는 위치를 칼로 긁어낸 후 100% methanol을 이용하여 올리고당을 녹여내었다. Methanol을 증발시킨 후 MALDI-TOF mass spectrometer(Autoflex III, 독일)를 이용하여 HABA(2-(4'-hydroxybenzeneazo) benzoic acid) matrix 상에서 올리고당의 분자량을 분석하였다.

2-2. 결과

3 ~ 10 사이의 다양한 pH 조건에서 재조합 AgaJ11의 아가레이즈 활성을 측정하였다. 이의 결과 pH 4 ~ 5 사이에서 우수한 아가레이즈 활성이 나타났으며, pH 4.5에서 활성이 가장 좋았다. 특히, pH 4.0에서도 80%에 가까운 효소활성을 유지하였다. 하지만 이 범위를 벗어난 pH에서는 아가레이즈 활성의 70% 이상을 잃는 것으로 나타났다(도 2의 a 참조).

20 ~ 60℃의 다양한 온도범위에서 재조합 AgaJ11의 아가레이즈 활성을 측정한 결과, 20℃부터 활성이 증가하여 40℃에서 효소활성이 가장 좋았으며, 40℃ 이상의 온도에서는 효소활성이 급격히 감소하였다(도 2의 b에서 각 값이 다이아몬드로 표시된 그래프 참조). 온도안정성 측정에서도 30℃까지는 안정적으로(95% 이상) 활성을 가지고 있었지만, 40℃ 이후에는 안정성이 낮아져 약 20%의 잔여활성이 남는 것으로 나타났다(도 2의 b에서 각 값이 원형점으로 표시된 그래프 참조).

아가레이즈 활성에 금속이온이 미치는 영향을 살펴본 결과, FeCl₂, CuCl₂, MnCl₂, ZnCl₂는 아가레이즈 활성을 80% 이상 저해하였다. CaCl₂와 CoCl₂도 아가레이즈의 활성을 각각 60% 이상 저해하였다. EDTA는 효소활성에 거의 영향이 없었다(도 2의 c 참조). 이는 효소활성에 특별한 금속이온을 요구하지 않음을 암시한다.

재조합 AgaJ11의 Km값은 21.42㎍/㎖, Vmax는 25U/㎎이었다(도 3 참조).

재조합 AgaJ11 효소 처리 후 아가로오스 용액의 점도변화를 살펴본 결과, 처음 6분 동안 점도가 유의미적으로 감소했지만, 그 이후로는 점도 변화가 크지 않았다(도 4의 a 참조). 이러한 가수분해 패턴은 재조합 AgaJ11 효소가 endo-acting 아가레이즈임을 나타낸다(Temuujin et al., 2011).

재조합 AgaJ11 효소의 작용기작을 thin layer 크로마토그래피(TLC) 분석으로 살펴본 결과, 재조합 AgaJ11 효소는 아가로오스를 빠른 시간에 분해하여 네오아가로바이오스(neoagarobiose, NA2), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, NA4) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose, NA6)를 주요산물로 생성하였다(도 4의 b 참조). 이 외에도 NA6보다 크기가 큰 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide)들이 미량 생성이 되었다(도 4의 b 참조). NA2, NA4, NA6을 반응산물로 아가레이즈 활성을 분석해 본 결과, 재조합 AgaJ11 효소는 NA2와 NA4는 분해할 수 없었지만, NA6는 NA2와 NA4로 완전히 분해하였다(도 4의 c 참조). NA6은 베타-아가레이즈를 이용하여 만든 산물이기에 NA6가 NA2와 NA4로 분해된다는 사실은 재조합 AgaJ11효소가 베타-아가레이즈임을 나타낸다. 재조합 AgaJ11이 생성한 생성물은 MALDI-TOF 분석을 통해 (M+Na)⁺ 값으로 653과 959를 얻을 수 있었다(도 5 참조). 이는 NA4와 NA6에 해당하는 값으로, 생성된 생성물이 NA4와 NA6임을 나타낸다. 그러므로 이들 모든 결과는 재조합 AgaJ11이 아가로오스로부터 NA2, NA4, NA6를 생산할 수 있는 endo-acting 베타-아가레이즈임을 나타낸다.

<110> Myongji University Industry and Academia Cooperation Foundation National Institute of Biological Resources <120> A beta-agarase AgaJ11 from Gayadomonas joobiniege G7 and use thereof <130> PA-D17090 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 291 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Gayadomonas joobiniege G7 <400> 1 Leu Asn His Glu Arg Leu Ala Ser Glu Leu Ser Phe Ala Asn Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Thr Tyr Gly Asn Trp Gln Leu Asn Pro 20 25 30 Ala Ile Ser Asp Asp Phe Asn Tyr Ser Glu Lys Asn Gln Gln Phe Phe 35 40 45 Lys Lys Trp His Asp Asn His Ile Arg Gly Trp Lys Gly Pro Gly Ala 50 55 60 Thr Tyr Phe Ser Ala Glu His Ser Phe Ile Lys Ala Gly Gln Leu Val 65 70 75 80 Leu Thr Ala Ala Pro Val Pro Ala Asp Lys Gln Gly Lys Thr Val Asp 85 90 95 Tyr Gly Asn Phe Glu Thr Lys Lys Thr Ile Tyr Thr Gly Phe Val Thr 100 105 110 Ala Lys Gln Val Leu Ser Tyr Pro Ala Tyr Val Glu Val Asn Met Lys 115 120 125 Val Ser Asp Leu Ala Leu Ala Asn Asn Phe Trp Leu Leu Ser Asp Asp 130 135 140 Asp Arg Asn Glu Ile Asp Val Thr Glu Thr Tyr Gly Asp Asp Glu Arg 145 150 155 160 Lys Val Arg Leu Met Ala Thr Asn Tyr His Ile Phe Lys Arg Asp Pro 165 170 175 Lys Thr Asn Ala Met Leu Asp Asp Tyr Gly His Lys Gln Lys His Phe 180 185 190 Lys Thr Pro Lys Gln Asp Lys Leu Asn Ser Ser Phe His Arg Phe Gly 195 200 205 Phe Leu Trp Leu Ser Pro Thr Lys Met Gln Phe Phe Leu Asp Gly Lys 210 215 220 Ala Val Arg Glu Leu Ser Leu Arg Thr Asp Leu Thr Asp Pro Glu Gly 225 230 235 240 His Tyr Phe Asp Arg Pro Met Arg Ile Ile Phe Asp Met Glu Asp His 245 250 255 Val Trp Arg Ala Arg Lys Gly Ile Ser Pro Ser Lys Ser Asp Leu Met 260 265 270 Asp Val Ser Arg Asn Lys Met Tyr Ile Asp Trp Ile Arg Thr Tyr Gln 275 280 285 Leu Thr Arg 290 <210> 2 <211> 317 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Gayadomonas joobiniege G7 <400> 2 Met Thr Met Leu Gln Lys Ile Leu Ile Val Cys Ala Ala Thr Cys Leu 1 5 10 15 Leu Ser Cys Ala Gly Lys Ser Thr Asp Asp Leu Asn His Glu Arg Leu 20 25 30 Ala Ser Glu Leu Ser Phe Ala Asn Lys Val Pro Leu Pro Glu Ala Val 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Phe Val Thr Ala Lys Gln Val Leu Ser Tyr Pro Ala Tyr Val 130 135 140 Glu Val Asn Met Lys Val Ser Asp Leu Ala Leu Ala Asn Asn Phe Trp 145 150 155 160 Leu Leu Ser Asp Asp Asp Arg Asn Glu Ile Asp Val Thr Glu Thr Tyr 165 170 175 Gly Asp Asp Glu Arg Lys Val Arg Leu Met Ala Thr Asn Tyr His Ile 180 185 190 Phe Lys Arg Asp Pro Lys Thr Asn Ala Met Leu Asp Asp Tyr Gly His 195 200 205 Lys Gln Lys His Phe Lys Thr Pro Lys Gln Asp Lys Leu Asn Ser Ser 210 215 220 Phe His Arg Phe Gly Phe Leu Trp Leu Ser Pro Thr Lys Met Gln Phe 225 230 235 240 Phe Leu Asp Gly Lys Ala Val Arg Glu Leu Ser Leu Arg Thr Asp Leu 245 250 255 Thr Asp Pro Glu Gly His Tyr Phe Asp Arg Pro Met Arg Ile Ile Phe 260 265 270 Asp Met Glu Asp His Val Trp Arg Ala Arg Lys Gly Ile Ser Pro Ser 275 280 285 Lys Ser Asp Leu Met Asp Val Ser Arg Asn Lys Met Tyr Ile Asp Trp 290 295 300 Ile Arg Thr Tyr Gln Leu Thr Arg 305 310 <210> 4 <211> 876 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gayadomonas joobiniege G7 <400> 4 ctaaatcatg agcgtttggc aagcgagttg tcgtttgcca acaaagtgcc actgccagaa 60 gccgttttga cttatggcaa ttggcaatta aatccagcca tttcagatga ttttaattat 120 agcgaaaaga accagcagtt ttttaaaaaa tggcacgata atcatattcg tggttggaaa 180 ggtcctggcg caacttattt tagtgcagag cacagcttta tcaaagcagg ccagttggtg 240 ctaacagctg ccccagtacc agccgacaaa caaggaaaaa cggttgatta tggtaacttc 300 gaaaccaaaa agacaattta tacagggttt gttactgcga aacaggtctt aagctatcca 360 gcttatgttg aagttaacat gaaagtatca gatctcgcgt tagccaataa cttttggtta 420 ttaagtgatg atgatagaaa tgaaattgac gttacagaaa catacggaga tgatgagcgt 480 aaagttcgtt taatggctac taattaccat atttttaagc gagatcctaa aacgaatgcc 540 atgctggatg attatggcca taaacaaaag cattttaaaa cgcccaaaca ggataaacta 600 aactcaagtt ttcaccgctt tggcttttta tggttaagtc cgaccaaaat gcagtttttt 660 ttagatggga aagcggttcg cgagttgagt ttgcgtacag atcttactga tcccgaaggt 720 cattattttg accgcccaat gcggattatt tttgatatgg aagatcacgt ttggcgtgct 780 cgtaagggga tctctccttc taaaagtgat ctaatggatg tcagccgaaa taagatgtat 840 attgactgga tccggactta ccaactaact agataa 876 <210> 5 <211> 954 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gayadomonas joobiniege G7 <400> 5 atgaccatgt tgcagaaaat tttgattgtt tgcgccgcga cttgtttgct gagctgcgca 60 ggaaaaagta cagatgatct aaatcatgag cgtttggcaa gcgagttgtc gtttgccaac 120 aaagtgccac tgccagaagc cgttttgact tatggcaatt ggcaattaaa tccagccatt 180 tcagatgatt ttaattatag cgaaaagaac cagcagtttt ttaaaaaatg gcacgataat 240 catattcgtg gttggaaagg tcctggcgca acttatttta gtgcagagca cagctttatc 300 aaagcaggcc agttggtgct aacagctgcc ccagtaccag ccgacaaaca aggaaaaacg 360 gttgattatg gtaacttcga aaccaaaaag acaatttata cagggtttgt tactgcgaaa 420 caggtcttaa gctatccagc ttatgttgaa gttaacatga aagtatcaga tctcgcgtta 480 gccaataact tttggttatt aagtgatgat gatagaaatg aaattgacgt tacagaaaca 540 tacggagatg atgagcgtaa agttcgttta atggctacta attaccatat ttttaagcga 600 gatcctaaaa cgaatgccat gctggatgat tatggccata aacaaaagca ttttaaaacg 660 cccaaacagg ataaactaaa ctcaagtttt caccgctttg gctttttatg gttaagtccg 720 accaaaatgc agtttttttt agatgggaaa gcggttcgcg agttgagttt gcgtacagat 780 cttactgatc ccgaaggtca ttattttgac cgcccaatgc ggattatttt tgatatggaa 840 gatcacgttt ggcgtgctcg taaggggatc tctccttcta aaagtgatct aatggatgtc 900 agccgaaata agatgtatat tgactggatc cggacttacc aactaactag ataa 954 <210> 6 <211> 939 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant DNA of agaJ11 <400> 6 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atgctaaatc atgagcgttt ggcaagcgag ttgtcgtttg ccaacaaagt gccactgcca 120 gaagccgttt tgacttatgg caattggcaa ttaaatccag ccatttcaga tgattttaat 180 tatagcgaaa agaaccagca gttttttaaa aaatggcacg ataatcatat tcgtggttgg 240 aaaggtcctg gcgcaactta ttttagtgca gagcacagct ttatcaaagc aggccagttg 300 gtgctaacag ctgccccagt accagccgac aaacaaggaa aaacggttga ttatggtaac 360 ttcgaaacca aaaagacaat ttatacaggg tttgttactg cgaaacaggt cttaagctat 420 ccagcttatg ttgaagttaa catgaaagta tcagatctcg cgttagccaa taacttttgg 480 ttattaagtg atgatgatag aaatgaaatt gacgttacag aaacatacgg agatgatgag 540 cgtaaagttc gtttaatggc tactaattac catattttta agcgagatcc taaaacgaat 600 gccatgctgg atgattatgg ccataaacaa aagcatttta aaacgcccaa acaggataaa 660 ctaaactcaa gttttcaccg ctttggcttt ttatggttaa gtccgaccaa aatgcagttt 720 tttttagatg ggaaagcggt tcgcgagttg agtttgcgta cagatcttac tgatcccgaa 780 ggtcattatt ttgaccgccc aatgcggatt atttttgata tggaagatca cgtttggcgt 840 gctcgtaagg ggatctctcc ttctaaaagt gatctaatgg atgtcagccg aaataagatg 900 tatattgact ggatccggac ttaccaacta actagataa 939 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mature protein region of agaJ11 <400> 7 cgcgcggcag ccatatgcta aatcatgagc gtttggc 37 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mature protein region of agaJ11 <400> 8 gctcgaattc ggatccgttt tacgcattat ctagtt 36

Claims (19)

1. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 효소로 이용하여 아가로오스(agarose)를 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 생산방법.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서,
   상기 네오아가로올리고당은 네오아가로바이오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)로 이루어진 군 중에서 선택된 네오아가로올리고당인 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당 생산방법.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 효소반응이 pH 4 내지 5에서 이루어지도록 하는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당 생산방법.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 효소반응이 20 내지 30℃에서 이루어지도록 하는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당 생산방법.
6. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 효소로 이용하여 아가로오스(agarose)를 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 아가로오스 분해방법.
7. 삭제
8. 제 6항에 있어서,
   상기 효소반응이 pH 4 내지 5에서 이루어지도록 하는 것을 특징으로 하는 아가로오스 분해방법.
9. 제 6항에 있어서,
   상기 효소반응이 20 내지 30℃에서 이루어지도록 하는 것을 특징으로 하는 아가로오스 분해방법.
10. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 함유하는 아가로오스(agarose)를 효소반응시켜 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide)을 생산하기 위한 네오아가로올리고당 생산용 효소 조성물.
11. 삭제
12. 제 10항에 있어서,
    상기 네오아가로올리고당은 네오아가로바이오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)로 이루어진 군 중에서 선택된 네오아가로올리고당인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
13. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 함유하는 DNA가 함유된 아가로오스 겔(agarose gel)로부터 DNA를 추출하기 위한 키트.
14. 삭제
15. 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 함유하는 베타-아가레이즈(beta-agarase) 생산용 재조합 벡터.
16. 제 15항에 있어서,
    상기 유전자는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
17. 삭제
18. 제 15항의 베타-아가레이즈 생산용 재조합 벡터로 형질전환된 베타-아가레이즈 생산용 형질전환체.
19. 제 18항의 형질전환체를 배양하고 서열번호 1의 아미노산을 암호화하는 유전자를 과발현시키는 것을 특징으로 하는 베타-아가레이즈 대량생산방법.
    

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