KR102374210B1

KR102374210B1 - 카테노불룸 세디미니스 WS1-A 유래 신규 알파-아가레이즈 AgaWS5 및 이의 이용

Info

Publication number: KR102374210B1
Application number: KR1020200057011A
Authority: KR
Inventors: 이창로; 홍순광
Original assignee: 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2019-08-06
Filing date: 2020-05-13
Publication date: 2022-03-16
Also published as: KR20210018007A

Abstract

본 발명은 카테노불룸 세디미니스 WS1-A 유래 신규 알파-아가레이즈 AgaWS5 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 카테노불룸 세디미니스 WS1-A로부터 동정되어 이종균주에서 과발현이 가능하며 아가로오스를 분해하여 아가로테트라오스를 생산할 수 있고 저온에서도 효소활성을 안정적으로 나타내는 신규 알파-아가레이즈 AgaWS5 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 알파-아가레이즈는 아가로오스를 분해하거나 아가로테트라오스를 생산하는데 사용될 수 있으며, 이종균주 발현을 통해 용이하게 생산할 수 있어 산업적으로 유용하다. 특히 본 발명의 알파-아가레이즈는 저온에서도 우수한 효소활성을 나타낼 수 있어 저온 효소 공정이 필요한 분야에서 매우 유용하다.

Description

카테노불룸 세디미니스 WS1-A 유래 신규 알파-아가레이즈 AgaWS5 및 이의 이용{Novel alpha-agarase AgaWS5 from Catenovulum sediminis WS1-A and use thereof}

본 발명은 카테노불룸 세디미니스 WS1-A 유래 신규 알파-아가레이즈 AgaWS5 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 카테노불룸 세디미니스 WS1-A로부터 동정되어 이종균주에서 과발현이 가능하며 아가로오스를 분해하여 아가로테트라오스를 생산할 수 있고 저온에서도 효소활성을 안정적으로 나타내는 신규 알파-아가레이즈 AgaWS5 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.

아가(agar)는 3,6-anhydro-L-galatose와 D-galactose로 이루어진 적색조류(red algae)에서 발견되는 세포벽 구성 물질이다(Chi et al., 2012). 아가로오스는 아가를 구성하는 다당성분으로 베타-1,4 글리코시드 결합(glycosidic bond)으로 이루어진 갈락토오스(galactose, G)와 알파-1,3 결합으로 연결된 무수갈락토오스(anhydrogalactose, A)가 번갈아가며 연결된 긴 선형의 물질이다(Araki 1959; Chi et al. 2012).

아가를 분해하는 효소는 크게 알파-아가레이즈(alpha-agarase), 베타-아가레이즈(beta-agarase)로 나눠질 수 있다. 알파-아가레이즈는 아가로오스의 알파-1,3 결합을 잘라서 환원 말단(reducing end)에 무수갈락토오스를 가진 아가로올리고당(agarooligosaccharide)을 생성하는 효소이다(Jung et al. 2017). 베타-아가레이즈는 갈락토오스와 무수갈락토오스의 베타-1,4 결합을 분해하여 환원 말단에 갈락토오스를 가진 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide)을 생성하는 효소이다(Chi et al. 2012).

베타-아가레이즈에 의해 생성되는 네오아가로올리고당의 주요 성분은 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose, NA6), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, NA4), 네오아가로바이오스(neoagarobiose, NA2)이다(Chi et al. 2012). 네오아가로바이오스는 네오아가로바이오스 분해효소(neoagarobiose hydrolase)에 의해 무수갈락토오스(3,6-anhydro-L-galatose, A)와 갈락토오스(galactose, G)로 분해된다. 갈락토오스는 탄소원으로 바로 이용이 되고, 무수갈락토오스는 2-keto-3-deoxy-galactonate로 분해되어 탄소원으로 이용된다. 이런 대사에 대한 이해는 향후 한천을 이용한 바이오에탄올 생산에 이용될 수 있다. 네오아가로올리고당은 항균효과(Fu and Kim 2010), 미백효과(Kobayashi et al. 1997), 보습효과(Kobayashi et al. 1997), 항비만효과(Hong et al. 2017), 항당뇨효과(Hong et al. 2017) 등의 다양한 생리활성 효과를 가지고 있다는 사실이 알려져 있다.

베타-아가레이즈는 Alteromonas (Chi et al. 2014), Pseudomonas (Hsu et al. 2015), Gayadomonas (Jung et al. 2017), Vibrio (Dong et al. 2007; Liao et al. 2011), Pseudoalteromonas (Park da et al. 2015), Zobellia (Hehemann et al. 2012), Catenovulum (Cui et al. 2014), Agarivorans (Lee et al. 2012), Cohnella (Li et al. 2015), Bacillus (Li et al. 2014), Thalassomonas (Ohta et al. 2005), Streptomyces (Temuujin et al. 2011; Temuujin et al. 2012), Stenotrophomonas (Zhu et al. 2016), Simiduia (Tawara et al. 2015), Flammeovirga (Han et al. 2016) 등의 다양한 균주에서 발견이 되었다. 베타-아가레이즈는 글루코시드 분해효소(glycoside hydrolase, GH) CAZY 데이터베이스에 근거하였을 때, GH16 (Jung et al. 2017), GH39 (Jung et al. 2017), GH50 (Han et al. 2016), GH86 (Ariga et al. 2012), GH118 (Lee et al. 2012) 등 다양한 GH family에서 발견되었다.

다양한 베타-아가레이즈가 발견이 되었지만, 알파-아가레이즈는 지금까지 3개만 특성이 규명되었다(Potin et al. 1993; Ohta et al. 2005; Zhang et al. 2018). 이들은 모두 GH96에 속하며 아가로테트라오스를 생산하고 Ca²⁺에 의해 효소 활성이 증가하는 특징을 공통적으로 가지고 있다.

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본 발명의 주된 목적은 새로운 알파-아가레이즈를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 알파-아가레이즈를 생산하는 방법과 이에 필요한 유전자, 재조합 벡터 및 형질전환체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 알파-아가레이즈를 산업적으로 이용하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 신규 알파-아가레이즈를 제공한다.

본 발명의 알파-아가레이즈는, 서열번호 1, 2 또는 3의 서열로 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 알파-아가레이즈를 코딩하는 알파-아가레이즈 유전자를 제공한다.

본 발명의 알파-아가레이즈 유전자는, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 유전자를 함유하는 알파-아가레이즈 생산용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 알파-아가레이즈 생산용 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하고 상기 알파-아가레이즈 유전자를 발현시키는 것을 특징으로 하는 알파-아가레이즈 생산방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 알파-아가레이즈를 유효성분으로 함유하는 효소 조성물을 제공한다.

본 발명의 효소 조성물은, 아가로오스 분해 용도 또는 아가로테트라오스 생산 용도로 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 알파-아가레이즈를 아가로오스와 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 아가로오스 분해방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 알파-아가레이즈를 아가로오스와 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 아가로테트라오스 생산방법을 제공한다.

본 발명의 알파-아가레이즈는 아가로오스를 분해하거나 아가로테트라오스를 생산하는데 사용될 수 있으며, 이종균주 발현을 통해 용이하게 생산할 수 있어 산업적으로 유용하다. 특히 본 발명의 알파-아가레이즈는 저온에서도 우수한 효소활성을 나타낼 수 있어 저온 효소 공정이 필요한 분야에서 매우 유용하다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 알파-아가레이즈(AgaWS5)를 SDS-PAGE 겔 상에서 분리한 것(a)과 자이모그램 분석한 결과(b)이다. Lane M, size marker; lane 1, pHis-AgaWS5 재조합 벡터로 형질전환된 E. coli ER2566의 인덕션(induction)하기 전 세포 추출물; lane 2, pHis-AgaWS5 재조합 벡터로 형질전환된 E. coli ER2566을 1mM IPTG로 인덕션한 이후의 세포 추출물; lane 3, 정제된 AgaWS5.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 알파-아가레이즈(AgaWS5)의 효소활성에 pH(a), 온도(b) 및 금속이온(c)이 미치는 영향을 조사한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 알파-아가레이즈(AgaWS5)의 동역학적 계수를 결정하기 위한 그래프이다. 모든 데이터는 적어도 2회의 반복실험을 통한 평균값으로 나타냄.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 알파-아가레이즈(AgaWS5)로 아가로오스를 효소반응시켜 생성된 반응산물을 분석한 결과이다. (a) 시간별 반응산물의 점성도 측정 결과, (b) 시간별 반응산물의 TLC 분석 결과, (c) 반응산물을 다양한 네오아가로올리고당 및 아가로올리고당과 함께 TLC 분석한 결과. NA2, 네오아가로바이오스(neoagarobiose); NA4, 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose); NA6, 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose); A2, 아가로바이오스(agarobiose); A4, 아가로테트라오스(agarotetraose); A6, 아가로헥사오스(agarohexaose).
도 5는 상기 도 4의 TLC 분석 결과로 생성된 반응산물 밴드를 메탄올로 추출하여 수득한 추출물의 MALDI-TOF 분석 결과이다.
도 6는 상기 도 5의 반응산물 밴드 메탄올 추출물(a의 lane 2)과 메탄올 추출 이전의 반응산물(a의 lane 1)의 TLC 분석 결과 및 반응산물을 glycine-NaOH 완충액(pH 10)에서 18시간(b의 lane 1) 또는 36시간(b의 lane 2) 반응시킨 것의 TLC 분석 결과이다. NA4, 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose); A2, 아가로바이오스(agarobiose); A4, 아가로테트라오스(agarotetraose); A6, 아가로헥사오스(agarohexaose).
도 7 및 8은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 알파-아가레이즈(AgaWS5)에 의한 아가로오스 분해산물의 ¹H-NMR 분석 결과이다.

본 발명의 알파-아가레이즈는 해양 박테리아인 카테노불룸 세디미니스(Catenovulum sediminis) WS1-A 균주(KCTC 42927) 유래의 알파-아가레이즈이다.

상기 WS1-A 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 KCTC 42927로 기탁되어 있다.

아미노산 서열 및 유전자의 염기서열 정보를 바탕으로 분석한 결과, 카테노불룸 세디미니스에서 본 발명의 알파-아가레이즈는 처음에 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 전구단백질(pre-mature protein)의 형태로 발현되고 이후 시그널 펩티드(signal peptide)가 잘려 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 성숙단백질(mature protein)이 되는 것으로 조사되었다. 따라서 시그널 펩티드가 제외된 서열번호 1의 아미노산 서열만으로 이루어지더라도 본래의 활성을 나타낼 수 있을 것이다.

본 발명의 알파-아가레이즈는 알파-아가레이즈 활성을 나타낼 수 있는 한도 내에서 서열번호 1 또는 서열번호 2의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열이 부가된 형태일 수 있다. 부가되는 서열에 특별한 제한은 없으나 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩티드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열 등을 부가하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 정제의 용이성을 위해 다수개의 히스티딘(Histidine)을 N-말단 또는 C-말단에 부가한 형태일 수 있다(서열번호 3 참조).

본 발명의 알파-아가레이즈 유전자는 상기와 같은 본 발명의 알파-아가레이즈를 코딩하는 것으로, 염기서열에 특별한 제한은 없으나 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것이 바람직하다. 서열번호 4의 염기서열은 카테노불룸 세디미니스 WS1-A 균주의 게놈 상에 존재하는 알파-아가레이즈 코딩 서열이다.

본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 알파-아가레이즈 유전자를 함유함으로써 알파-아가레이즈를 생산하기 위해 이용될 수 있는데, 이때 본 발명의 알파-아가레이즈 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 다양한 염기서열이 부가될 수 있다. 부가되는 서열로는 위에서 언급한 본 발명의 알파-아가레이즈 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 아미노산 서열을 코딩하는 서열일 수 있으며, 여기에는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩티드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열 등을 코딩하는 서열이 포함된다. 예를 들어, 정제의 용이성을 위해 다수개의 히스티딘(Histidine)을 코딩하는 서열을 5'-말단 또는 3'-말단에 부가한 형태일 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 알파-아가레이즈 유전자가 용이하게 발현될 수 있도록 숙주에 따라 적합한 프로모터(promoter) 및 터미네이터(terminator)가 포함되는 것이 바람직하며, 이 프로모터 및 터미네이터로는 카테노불룸 세디미니스에 존재하는 고유의 프로모터 및 터미네이터를 이용할 수도 있다. 이러한 프로모터 및 터미네이터가 포함되어 있으며 외래 유전자의 도입이 용이하게 설계된 다양한 벡터들이 개발되어 있어 이들을 이용할 수 있다. 예를 들어 대장균(Escherichia coli)을 숙주로 이용할 경우 pET 시리즈의 벡터를 이용할 수 있다.

본 발명의 형질전환체는 상기와 같은 재조합 벡터를 숙주생물체에 도입하여 제조될 수 있다. 이때 숙주로는 다양한 생물체를 이용할 수 있을 것으로 판단되며, 알파-아가레이즈의 안정적인 발현 또는 생산 효율을 위해 미생물을 이용하는 것이 보다 바람직할 것이다. 본 발명의 연구결과에 따르면 본 발명의 알파-아가레이즈 유전자가 대장균의 발현시스템에서도 매우 원활하게 발현될 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서 대장균을 숙주로 이용하여 형질전환체를 제조하면 알파-아가레이즈를 매우 용이하게 생산할 수 있다. 숙주생물체의 형질전환은 각 숙주생물체에 이용되고 있는 통상의 형질전환방법을 적용하여 상기 재조합 벡터를 숙주생물체에 도입하는 방법으로 달성할 수 있다.

본 발명의 알파-아가레이즈 대량생산은 상기 형질전환체를 배양하고 알파-아가레이즈 유전자를 발현시키는 방법으로 달성할 수 있다. 이때 배양배지의 종류, 배양온도, 배양시간 등의 조건은 숙주 및 벡터의 종류에 따라 선택적으로 적용할 수 있다. 예를 들어 숙주가 대장균이고 pET28 시리즈의 벡터를 이용하는 경우, LB(Luria Bertani) 배지에서 30 ~ 40℃로 OD₆₀₀값이 0.4 ~ 0.6이 될 때까지 배양한 다음 IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 연구결과에 따르면, 본 발명의 알파-아가레이즈는 엔도-작용(endo-acting) 알파-아가레이즈이며, 아가로오스를 분해하여 아가로테트라오스(agarotetraose)를 생성할 수 있다.

본 발명의 연구결과에 따르면, 본 발명의 알파-아가레이즈는 pH 7 내지 9의 조건 및 30 내지 50℃의 조건에서 보다 우수한 알파-아가레이즈 활성을 나타낼 수 있다. 따라서 보다 효율적인 효소반응을 위해서는 상기와 같은 pH 및 온도 조건을 적용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 pH 7.5 내지 8.5, 35 내지 45℃의 조건을 적용하는 것이 바람직하다. 특히 본 발명의 알파-아가레이즈는 10℃의 낮은 온도에서도 40% 이상의 효소 활성을 유지하는 저온내성이 있어, 저온에서 알파-아가레이즈 효소 활성이 필요한 분야에 매우 유용할 것이다.

본 발명의 효소 조성물은 본 발명의 알파-아가레이즈 이외에도 알파-아가레이즈의 효소활성을 안정적으로 유지할 수 있도록 하기 위한 완충제, 또는 부형제 등의 첨가제를 포함할 수 있으며, 동일 또는 유사한 효소활성을 갖는 다른 효소도 추가로 포함될 수 있을 것이다. 또한 상기와 같은 본 발명 알파-아가레이즈의 특성에 따라 본 발명의 효소 조성물은 아가레이즈 분해 용도 또는 아가로테트라오스 생산 용도로 사용되는 것이 바람직할 것이다.

본 발명 알파-아가레이즈는 고분자의 아가로오스를 상대적으로 저분자 형태인 아가로테트라오스로 효과적으로 분해할 수 있고, 이에 따라 아가로오스를 분해하기 위한 용도로도 유용하게 활용될 수 있다. 아가로오스를 분해하는 활성은 아가로오스를 이용한 DNA 또는 RNA와 같은 분자의 전기영동 이후 아가로오스 겔로부터 이들 분자를 회수하는데 유용하게 활용될 수 있다. 따라서 본 발명 알파-아가레이즈는 아가로오스 겔로부터 DNA를 추출하기 위한 용도의 효소 조성물 또는 키트에 이용할 수 있다. 예를 들어 DNA gel extraction kit 등에 이용할 수 있다. 이때 키트에는 본 발명의 알파-아가레이즈 이외에도 DNA 추출 시 필요한 시약 또는 기구 등이 추가로 포함될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[실시예]

1. 알파-아가레이즈 생산

1-1. 균주

해양 박테리아인 카테노불룸 세디미니스(Catenovulum sediminis) WS1-A 균주(KCTC 42927)를 Marine Broth(MB) 2216(Difco, USA) 배지를 사용하여 30℃에서 배양하였다. Escherichia coli ER2566 균주는 Luria Bertani(LB) 배지에서 배양하였다.

1-2. 재조합 발현벡터 제작

WS1-A 균주의 게놈 서열 분석을 통해 유전자들 중 아가레이즈 활성이 있을 것으로 추정되는 유전자를 찾을 수 있었고, 이 유전자를 'agaWS5'로 명명하였다. 또한 이 유전자가 암호화하는 단백질을 'AgaWS5'로 명명하였다.

WS1-A 균주의 게놈 DNA로부터 agaWS5가 암호화하는 DNA 부위(3,888 bp)(서열번호 4)의 단편을 증폭(forward primer: 5'-CGCGCGGCAGCCATATGTTTAAAACTAAACGTTC-3', 밑줄친 부분은 pNdeI 절단 부위이다; reverse primer: 5'-GCTCGAATTCGGATCCGCGATTTAAAATTAGTGCGC-3', 밑줄친 부분은 BamHI 절단 부위이다)하고, NdeI-BamHI으로 절단한 pET28a 단편에 상기 증폭된 DNA 단편을 삽입하여 AgaWS5의 N-말단에 His-tag이 포함되어 발현되도록 설계된 pHis-AgaWS5 재조합 벡터를 제작하였다.

1-3. 형질전환체 제작 및 알파-아가레이즈 유전자 발현

상기 pHis-AgaWS5 벡터로 E. coli ER2566를 형질전환시켜 형질전환체(E. coli ER2566/pHis-AgaWS5)를 제작하였다.

이 형질전환체를 100㎖ LB 배지에서 OD₆₀₀값이 0.5가 될 때까지 37℃에서 배양한 다음, IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 1mM의 농도로 처리하여 agaWS5의 발현을 유도하면서 16℃에서 12시간 더 배양하였다. 배양액을 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 회수하고, 10㎖ 바인딩 버퍼(binding buffer)(50mM Tris-HCl, 250mM NaCl, pH 8)로 씻어준 후, 프렌치 프레스(French pressure cell)를 이용하여 10,000p.s.i.에서 세포를 2번 파쇄한 후 12,000rpm에서 35분간 원심분리하여 상층액만을 수거하고 이를 AgaWS5의 순수분리에 이용하였다.

1-4. 알파-아가레이즈 정제

상기 1-3의 상층액을 0.4㎖ BD TALON^TM metal affinity resin과 함께 20분간 섞어준 후 바인딩 버퍼(50mM Tris-HCl, 250mM NaCl, pH 8) 20㎖로 씻어주고 200mM 이미다졸(imidazole)을 포함하는 용출 버퍼(elution buffer)로 AgaWS5를 용출하였다. 이미다졸을 제거하기 위해 50mM NaCl을 가진 50mM Tris-HCl(pH 8) 버퍼를 이용하여 투석(dialysis)하였다. 단백질의 순수도는 SDS-PAGE(0.1% sodium dodecyl sulfate-10% polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석한 후 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색하여 확인하였다.

2. 알파-아가레이즈 분석

상기 실시예 1에서 생산한 AgaWS5의 특성을 분석하였다.

2-1. 방법

2-1-1. 자이모그램 방법을 사용한 아가레이즈 활성 조사

끓이지 않은 AgaWS5 샘플(상기 실시예 1-4에서 투석하여 수득한 샘플)을 0.1% 아가로오스가 포함된 10% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에 로딩하여 전기영동을 수행한 다음 2% 트리톤(triton) X-100으로 씻어준 후, 50mM Tris-HCl(pH 8.0) 버퍼로 두 번 더 씻어 주었다. 겔을 50mM Tris-HCl(pH 8.0) 버퍼에 담아 40℃에서 12시간 반응시켰다. 12시간 후 루골 아이오다인(lugol's iodine) 용액으로 염색하여 아가레이즈 활성을 측정하였다.

2-1-2. DNS 방법을 사용한 아가레이즈 활성 측정

DNS(3,5-dinitrosalicylic acid) 방법은 환원당의 양을 측정하는 방법이다. 0.1% 아가로오스를 포함한 50mM Tris-HCl(pH 8.0) 버퍼 480㎕에 AgaWS5 샘플(상기 실시예 1-4에서 투석하여 수득한 샘플) 20㎕를 넣은 후 40℃에서 20분간 반응시키고, DNS 반응용액(증류수 1ℓ에 DNS 6.5g, 2M NaOH 325㎖, glycerol 45㎖ 함유) 500㎕와 혼합한 후 10분간 중탕하였다. 반응액을 얼음물에 식힌 다음 10,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액 만을 수득하고, OD₅₄₀에서 흡광도를 측정하였다. 1유닛(U)은 상기 반응 조건에서 1분당 갈락토오스 1μmol을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다. D-갈락토오스를 이용하여 표준곡선을 작성한 후 반응에서 생성되는 갈락토오스의 양을 측정하였다.

2-1-3. 효소 특성 결정

효소활성의 최적온도를 조사하기 위해 상기 실시예 2-1-2에서 설명한 DNS 방법을 이용하였고, 이때 반응온도를 10 ~ 60℃로 각각 다르게 설정하였다. 최적 pH는 상기 DNS 방법에서 반응온도를 40℃로 고정하고 버퍼를 다르게 적용하는 방법으로 조사하였다 : pH 3-6(10mM sodium citrate), pH 6-7(10mM MOPS), pH 7-9(10mM Tris-HCl), pH 9-10(10mM Glycine-NaOH). 금속염의 효과는 각각의 금속염이 1 또는 5mM의 농도로 포함된 버퍼에서 반응하는 방법으로 조사하였다.

2-1-4. 동역학적 계수 결정

다양한 농도의 아가로오스(0.1~2.4㎎/㎖)가 존재하는 조건에서 50mM Tris-HCl(pH 8.0) 버퍼에 AgaWS5 샘플을 넣고 40℃에서 2분간 반응하여 효소의 Km과 Vmax의 동역학적 계수를 결정하였다. 표준조건에서 얻은 개시속도의 라인위버-버크 이중 역수 플롯(Lineweaver-Burk double-reciprocal plots)의 선형회귀분석으로 Km과 Vmax의 값을 계산하였다.

2-1-5. TLC(thin-layer chromatography) 분석

0.1% 아가로오스 기질이 함유된 150mM Tris-HCl(pH 8.0) 버퍼에 AgaWS5 샘플을 넣고 40℃에서 시간대별로 다양하게 반응시킨 후 반응액(10㎕)을 실리카겔 60 플레이트(silica gel 60 plate)에 로드하였다. n-부탄올 : 아세트산 : 물이 2 : 1 : 1의 비율로 첨가된 용액을 이용한 크로마토그래피 전개 방법으로 물질들을 분리하였다. 이후 플레이트를 완전히 말린 후 30%(w/v) 황산이 함유된 에탄올 용액을 스프레이하고 120℃의 오븐에서 가열하여 분리된 물질들을 가시화 하였다.

2-1-6. 점성도 측정

0.5% 아가로오스를 포함한 50mM Tris-HCl(pH 8.0) 버퍼에 AgaWS5 샘플을 넣고 40℃에서 50분간 반응을 진행한 다음 이 반응물의 점성도를 DV2T 점도계(viscometer)(Brookfield AMETEK, USA)를 이용하여 측정하였다.

2-1-7. 질량 분석

아가로오스를 AgaWS5로 반응시켜 생성된 반응산물 중 TLC 상에서 아가로테트라오스(agarotetraose, A4)로 예상되는 실리카겔 부위를 긁어서 수집하고, 수집된 실리카겔의 반응산물을 100% 메탄올로 추출하였다.

추출물에서 메탄올을 제거하고 HABA(2-(4'-hydroxybenzeneazo)benzoic acid) MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight) 분광기(Autoflex III, Germany)를 사용하여 반응산물의 질량을 분석하였다.

2-1-8. ¹ H-NMR 분석

AgaWS5 반응산물의 알칼리(alkaline) 처리를 통해 생성된 네오아가로트리오스(neoagarotriose, NA3)로 예상되는 TLC 밴드를 TLC 플레이트에서 긁어내어 메탄올 추출을 수행한 후 D20에 녹여 Bruker Avance 500MHz 분광기(spectrometer)(Bruker, USA)를 이용하여 ¹H-NMR을 수행하였다.

2-2. 결과

상기 실시예 1에서 His-tag이 연결된 형태의 AgaWS5를 E. coli에서 발현하여 순수분리하였다(도 1의 a 참조). 순수분리된 AgaWS5의 분자량은 약 150kDa이었으며, 이는 His-tag이 포함된 단백질 분자량의 계산된 값과 거의 일치하였다. SDS-PAGE 후 자이모그램을 수행하여 AgaWS5의 아가레이즈 효소 활성을 확인하였다(도 1의 b 참조).

3 ~ 10 사이의 다양한 pH조건에서 AgaWS5의 아가레이즈 활성을 측정하였다. 그 결과 pH 8에서 아가레이즈 활성이 가장 좋았다. 주로 염기성 pH 범위에서 아가레이즈 활성이 좋게 나타났다(도 2의 a 참조).

10 ~ 60℃의 다양한 온도범위에서 AgaWS5의 아가레이즈 활성을 측정한 결과 40℃에서 효소활성이 가장 좋았다. 특히, 10℃의 낮은 온도에서도 40% 이상의 효소 활성을 유지하는 저온내성 특성을 보였다(도 2의 b 참조).

AgaWS5의 아가레이즈 활성에 금속이온이 미치는 영향을 살펴본 결과, FeCl₂, ZnCl₂, CoCl₂, CuCl₂는 아가레이즈 활성을 90% 이상 저해하였고, CaCl₂은 아가레이즈의 활성을 약간 증진시켰다(도 2의 c 참조). AgaWS5의 단백질 BLAST 분석을 통해 AgaWS5에 칼슘 결합 부위(calcium binding site)가 여러 개 존재한다고 예측되기에 이런 결과는 예측이 가능한 결과이다. 그리고 예상대로 EDTA는 효소활성을 강하게 저해하였다(도 2의 c 참조). 그러므로 이는 최적 효소 활성에 Ca²⁺ 이온을 요구한다는 것을 암시한다. AgaWS5의 Km값은 10.6㎍/㎖, Vmax는 714.3U/㎎로 상당히 높은 Vmax값을 나타내었다(도 3 참조).

AgaWS5 처리 후 아가로오스 용액의 점도변화를 살펴본 결과, 처음 5분 동안 점도가 유의하게 감소했지만, 그 이후로는 천천히 감소하였다(도 4의 a 참조). 이러한 가수분해 패턴은 AgaWS5가 엔도-작용(endo-acting) 아가레이즈임을 나타낸다(Temuujin et al., 2011).

AgaWS5의 작용기작을 TLC 분석으로 살펴보았다. AgaWS5는 아가로오스를 분해하여 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, NA4)보다 조금 빠른 이동성을 보이는 올리고당을 생성하였다(도 4의 b 참조). 아가로바이오스(agarobiose, A2), 아가로테트라오스(agarotetraose, A4), 아가로헥사오스(agarohexaose, A6)가 존재하는 상황에서 TLC를 수행하였을 때, 상기 올리고당은 A4와 정확히 일치하는 이동성을 보였다(도 4의 c 참조).

이 올리고당이 A4인지 확인하기 위해 MALDI-TOF 분석을 수행한 결과, A4에 대응되는 결과가 확인되었다(도 5 참조).

좀 더 명확한 확인을 위해 ¹H-NMR 분석을 수행하려고 하였으나, 메탄올 추출 과정에서 이 올리고당이 일부 분해되어 네오아가로트리오스(neoagarotriose, NA3)로 추정되는 물질이 생성이 되는 것을 발견하였다(도 6의 a 참조). 즉, 메탄올 추출 샘플에는 A4로 예상되는 반응산물과 이 반응산물이 메탄올 추출과정에서 분해되어 생성된 NA3로 예상되는 반응산물 2가지의 물질이 함유되어 있기 때문에, 이대로는 ¹H-NMR을 수행하는 것이 의미가 없다고 판단하였다.

기존 연구결과에 따르면, A4는 염기성 용액에서 환원말단(reducing end) 위치의 무수갈락토오스(A)가 분해되어 NA3를 형성한다고 알려져 있는데(Zhang et al. 2018), 이러한 이유로 상기와 같이 추출물에 NA3가 형성된 것으로 판단하였다.

이에 A4로 예상되는 반응산물을 염기성 용액으로 처리하여 완전히 분해되도록 유도한 다음(도 6의 b 참조), 이의 ¹H-NMR 분석을 수행하는 방법으로 반응산물을 확인하였다. 만약 ¹H-NMR 분석 결과가 NA3로 확인된다면 이는 AgaWS5의 반응산물이 A4라는 것을 의미하는 것이다.

¹H-NMR 분석 결과, 환원말단 위치의 갈락토오스(Gr), 비환원말단 위치의 갈락토오스(Gnr), 환원말단 위치의 무수갈락토오스(Ar) 만 측정이 되었다(도 7 및 8 참조). 이는 ¹H-NMR 분석한 물질이 NA3(G-A-G)임을 의미하며, 따라서 AgaWS5의 반응산물이 A4임을 알 수 있다.

상기 결과들을 종합해보면, AgaWS5는 아가로오스로부터 아가로테트라오즈(A4)를 생산할 수 있는 저온내성의 엔도-작용 알파-아가레이즈라는 것을 알 수 있다.

<110> Myongji University Industry and Academia Cooperation Foundation <120> Novel alpha-agarase AgaWS5 from Catenovulum sediminis WS1-A and use thereof <130> PA-D19116 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1269 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Catenovulum sediminis WS1-A <400> 1 Glu Thr Ile Val Leu Gln Ala Glu Ser Phe Asp Asn Ser Gly Gly Thr 1 5 10 15 Tyr Asp Asp Gly Gln Pro Thr Pro Val Thr Ile Tyr Ser Val Asn Gly 20 25 30 Gln Asn Ala Ile Asn Phe Val Asn Ala Gly Asp Phe Val Asp Phe Asn 35 40 45 Ile Asn Ala Glu Gly Gly Glu Tyr Asp Ile Glu Tyr Leu Val Gly Thr 50 55 60 Ser Val Gln Ser Gly Pro Gly Ile Glu Val Leu Val Asn Thr Asn Gly 65 70 75 80 Thr Trp Asp Ser Gln Gly Thr Val Ala Val Pro Leu Thr Ser Trp Asp 85 90 95 Asp Phe Gln Pro Leu Lys Pro Ser His Ser Val Thr Leu Pro Ala Gly 100 105 110 Ala Ser Thr Ile Arg Leu His Ala Ile Gly Ser Thr Trp Gln Trp Asn 115 120 125 Met Glu Ser Phe Ser Leu Thr Gln Val Val Pro Leu Glu Pro Glu Thr 130 135 140 Pro Val Asp Val Asp Asp Ile Val Ile Asn 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Gly Gln Ala Ser Leu Arg Val Glu Ala Ile Gly Gly Ser 660 665 670 Asp Trp Gln Trp Ser Gly Asp Lys Leu Arg Ile Thr Arg Val Gly Asp 675 680 685 Val Ser Tyr Val Pro Glu Arg His Tyr Asn Pro Asn Asp His Tyr Val 690 695 700 Ala Glu Val Glu Gly Pro Lys Thr Gln Ile Thr His Leu Lys Lys Pro 705 710 715 720 Val Ala Ile Pro Gln His Lys Lys Val Leu Lys Ser Asp Val Trp Tyr 725 730 735 Thr Tyr Pro Gln Asn Arg Glu Leu Glu Gly Phe Asp Asp Phe Gly Ala 740 745 750 Thr Gly Ala Phe Trp Gly His Pro Pro Glu His Asp Phe Tyr Asp Glu 755 760 765 Thr Val Ile Met Asp Trp Ala Val Asn Val Val Asp Thr Phe Gln Ser 770 775 780 Glu Gly Phe Glu Tyr Thr Ala Arg Gly Glu Phe Asp Trp Gly Tyr Gly 785 790 795 800 Trp Phe Thr Glu Tyr Val Thr Asn Pro Gln Pro His Tyr Val Gln Thr 805 810 815 Leu Asp Asp Arg Asn Val Arg Met Thr Phe Met Gly Tyr Leu Ser His 820 825 830 Asn Gly Tyr Asn Asn His Trp Leu Ser Asn His Ser Pro Ala Phe Val 835 840 845 Pro Phe Met Lys Ser Gln Val Asp Gln Ile Leu Lys Ala Asp Pro Asp 850 855 860 Lys Leu Met Phe Asp Thr Gln Thr Asn Ser Thr Arg Ser Thr Asp Met 865 870 875 880 Arg Thr Phe Gly Gly Asp Phe Ser Pro Tyr Ala Met Glu Asn Phe Arg 885 890 895 Ile Trp Leu Asp Lys Lys Tyr Ser Ser Asn Glu Leu Ala Asn Met Gly 900 905 910 Ile Asn Asn Ile Gln Thr Phe Asp Tyr Lys Gln His Leu Leu Asn Ala 915 920 925 Ser Val Thr His Gln Ser Phe Met Asn Ala Ala Asp Thr Leu Ser Gly 930 935 940 Asn Val Pro Leu Leu Glu Asp Phe Ile Tyr Phe Asn Arg Asp Val Trp 945 950 955 960 Asn Gln Lys Phe Gly Glu Val Leu Asp Tyr Ile Arg Gln Gln Arg Pro 965 970 975 Asp Ile Glu Ile Gly Ala Ser Thr His Leu Phe Glu Ser Arg Gly Tyr 980 985 990 Ile Phe Asn Glu Asn Ile Thr Phe Leu Ser Gly Glu Leu Asn Leu Gly 995 1000 1005 Ala Arg Thr Thr Ile Ser Glu Leu Pro Thr Asn Ile Leu Val His Leu 1010 1015 1020 Lys Gly Ala Gln Ala Val Asp Lys Thr Leu Ala Tyr Phe Pro Tyr Pro 1025 1030 1035 1040 Trp Glu Phe Asp Glu Leu Arg Leu Gln Asp Ala Pro Arg Phe Gly Arg 1045 1050 1055 Gly Trp Val Ala Gln Ala Tyr Ala Tyr Gly Gly Leu Phe Ser Ile Pro 1060 1065 1070 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Ser Ala Thr Leu His Leu 1265 1270 1275 1280 Pro Asp Gly Thr Ser Thr Asn Leu Ser Val Ser Thr Asn Ala Glu Gly 1285 1290 1295 Asp Ala Val Val Thr Val Asn Asn Leu Glu Val Trp Gly Ile Leu Glu 1300 1305 1310 Leu Ala His 1315 <210> 4 <211> 3888 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Catenovulum sediminis WS1-A <400> 4 atgtttaaaa ctaaacgttc tctgctgagc tctagtattg cgctttcact ggctttactt 60 ggcacaaaag cacatgcaga gactatagtc ttgcaagctg aatcatttga taactctggc 120 ggtacgtatg acgacggcca acccactcca gtcacgatat acagcgtaaa tggacaaaac 180 gcgattaact ttgttaacgc gggtgatttt gtcgatttta atattaacgc tgaagggggc 240 gaatatgaca ttgagtattt agtcggtacc agtgttcagt ctggtcctgg tattgaagtg 300 cttgttaata ctaatggtac ttgggacagt caaggtacag tcgccgttcc gttaaccagt 360 tgggatgatt tccagcctct caaacccagc cactctgtaa ccttaccagc aggtgcttca 420 acgattcgct tacatgcaat tggttcgact tggcaatgga acatggagtc tttttcttta 480 acacaagtcg tacctcttga gcctgaaacg ccagttgatg tagacgatat tgttattaac 540 ctagaaaact ttatctttac agacaaagaa ggagcagctg tttcaggaga 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1440 aatgcagatg gtggcagtgg tgccgttgat ggcattggtt ttgggatcga cattaatggc 1500 ggaacaaact ttgttcatcc atcgcaatta agcgaaaaca tttttacatc cgaaggtgaa 1560 gtaacaggca atccaagtcc accacaagaa ggtgatttga ttgttgaact agaagacttc 1620 gttaatacag gtacaaccgg ccgcgttggt ggcgatagtg ttgaagggtt tggcgtaaca 1680 gcaactggcg tgaactgggt cactaatggt gattatggtg actacaacat aacctttgca 1740 gagcccggta cctaccgagc gtttttcacc tactcagcgg ctagtgcagg tagttacggt 1800 gcacgtgtag atgtaaatgg tgaacccgtc gcatggggct attttgccga aacaggcagt 1860 tgggatattg cgtcggaagt tgagctttat ggtggatact ttgtagttga ccaatcaggc 1920 caagcgagtt tacgcgtaga agcaattggt ggatctgatt ggcagtggag cggtgataaa 1980 ctacggataa cccgtgtagg tgatgtttca tatgtccctg aacgtcacta taatccgaac 2040 gatcactatg tagctgaagt cgaaggacct aaaacgcaaa taacgcatct taaaaagcca 2100 gttgcaatac cacaacataa aaaggtatta aaatcagatg tttggtatac gtatccacaa 2160 aaccgtgaac tagaaggttt tgacgacttt ggggcaacgg gtgcgttttg gggacatccg 2220 ccagagcatg acttttatga cgaaaccgtt attatggatt gggcagttaa tgttgtagat 2280 acattccaaa gtgaaggttt tgaatacaca gctcgcggcg aattcgattg ggggtatggc 2340 tggtttacag aatatgtgac aaatcctcag ccacattatg tacaaacact ggatgatcgt 2400 aatgttcgca tgacctttat gggttactta tcgcacaatg gttataacaa tcactggtta 2460 agtaatcata gtccagcatt tgtaccattt atgaaatccc aagttgatca aatattaaaa 2520 gcagatccgg acaagctgat gtttgataca caaaccaact caacccgttc gaccgacatg 2580 cgtacctttg gtggtgattt ctcgccatat gccatggaaa acttccgcat ttggttagat 2640 aaaaaataca gtagtaacga gttggccaat atgggtatta ataatattca aacgtttgat 2700 tacaaacagc acttgttaaa tgccagtgtg acacatcaat cattcatgaa tgccgcagat 2760 acattatctg gcaacgtacc attacttgaa gatttcattt attttaatcg tgatgtatgg 2820 aatcaaaaat ttggtgaagt attagattat attcgccagc aacgtccaga catagaaatt 2880 ggtgcgagca cacatttgtt tgaatctcgt ggttatatat ttaacgagaa tatcaccttt 2940 ttgtcaggcg agctcaactt aggtgcgaga accactatct ctgaactacc aaccaatatc 3000 cttgtacact taaaaggtgc acaggcagta gataaaacgt tagcatattt cccgtatcct 3060 tgggagtttg acgaacttcg tttgcaagac gcaccgcgtt ttggccgtgg ttgggtcgcg 3120 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Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 알파-아가레이즈.
제 1항에 있어서,
상기 알파-아가레이즈는 서열번호 1, 2 또는 3의 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 알파-아가레이즈.
제 1항의 알파-아가레이즈를 코딩하는 알파-아가레이즈 유전자.
제 3항에 있어서,
상기 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 알파-아가레이즈 유전자.
제 3항의 유전자를 함유하는 알파-아가레이즈 생산용 재조합 벡터.
제 5항의 재조합 벡터로 형질전환된 알파-아가레이즈 생산용 형질전환체.
제 6항의 형질전환체를 배양하고 상기 알파-아가레이즈 유전자를 발현시키는 것을 특징으로 하는 알파-아가레이즈 생산방법.
제 1항의 알파-아가레이즈를 유효성분으로 함유하는 효소 조성물.
제 8항에 있어서,
상기 효소 조성물은 아가로오스 분해 용도 또는 아가로테트라오스 생산 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는, 효소 조성물.
제 1항의 알파-아가레이즈를 아가로오스와 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 아가로오스 분해방법.
제 1항의 알파-아가레이즈를 아가로오스와 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 아가로테트라오스 생산방법.