KR102644347B1 - 신규한 한천 분해 세균 유래의 ＧＨ１１７Ａ α네오아가로비오스 가수분해효소 및 이를 이용한 ＬＡＨＧ의 생산 방법 - Google Patents
신규한 한천 분해 세균 유래의 ＧＨ１１７Ａ α네오아가로비오스 가수분해효소 및 이를 이용한 ＬＡＨＧ의 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 기탁번호 KCTC 13629BP로 기탁된 신규한 한천 분해 세균 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 유래의 GH117A α-네오아가로비오스 가수분해효소(GH117A α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH) 및 상기 효소를 이용한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose, L-AHG)의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 한천 분해 세균 셀비브리오 종 KY-GH-1 유래의 지에이치117 에이 α-네오아가로비오스 가수분해효소는 네오아가로비오스를 기질로 하여 온도 범위와 pH 범위에 크게 제한됨이 없이 L-AHG를 고효율로 생산할 수 있으므로 발효 산업, 식품 산업, 의약품 산업 등에 광범위하게 활용될 수 있는 우수한 우수한 효과가 있다.
Description
본 발명은 기탁번호 KCTC 13629BP로 기탁된 신규한 한천 분해 세균 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 유래의 GH117A α-네오아가로비오스 가수분해효소(GH117A α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH) 및 상기 효소를 이용한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose, L-AHG)의 생산 방법에 관한 것이다.
한천은 해양 홍조류에서 발견되는 세포벽 다당류이며, 아가로오스와 아가로펙틴의 두 가지 성분의 혼합물이다. 아가로오스는 α-1,3-연결된 3,6-anhydro-L-galactose(L-AHG)와 β-1,4-연결된 D-galactose의 교차적인 잔기로 구성된다. 아가로펙틴은 동일한 반복 단위를 가지고 있지만, L-AHG 잔기 일부는 L-galactose sulfate로, 그리고 D-갈락토오스 잔기는 pyruvic acid acetal 4,6-O-(1-carboxyethylidene)-D-galactose로 일부 대체되어 있다 [Duckworth and Yaphe, 1971]. 한천은 미생물 분해에 강한 안정적인 겔 매트릭스를 형성하기 때문에, 식품 산업 및 미생물 배양 배지에서 겔화 소제로 널리 사용되고 있다.
약 15속의 해양성 세균들과 7속의 비해양성 세균들이 한천 분해 능력을 가지고 있으며 한천을 유일한 탄소원으로 사용할 수 있다 [Agbo and Moss, 1979; Bannikova et al., 2008; Rhee et al., 2010; Fu and Kim, 2010; Jahromi and Barzkar, 2018]. 한천을 탄소원으로 자화하기 위해, 한천 분해 세균은 다양한 한천 분해 효소들의 조합, 즉 아가레이즈들의 조합을 가지고 있으며 이를 통해 한천을 단당류인 L-AHG와 D-갈락토오스로 가수분해한다. 아가레이즈는 절단 방식에 따라 두 가지 유형으로 나눈다. α-아가레이즈 (EC 3.2.1.158)는 α-1,3-글리코시드 결합을 절단하는데 반해, β-아가레이즈 (EC 3.2.1.81)는 β-1,4-글리코시드 결합을 절단한다 [Fu and Kim, 2010; Jahromi and Barzkar, 2018].
현재까지 보고된 아가레이즈는 대부분 아가로오스를 가수분해하여 네오아가로올리고당 (neoagarooligosaccharides, NAOS)을 생산하는 엔도형 β-아가레이즈에 속한다. 이에 비해 아가로오스를 가수분해하여 아가로올리고당 (agarooligosaccharides, AOS)을 생성하는 α-아가레이즈들에 대한 보고는 거의 없다. 탄수화물 활성 효소(Carbohydrate-Active Enzymes, CAZyme) 데이터베이스에 수록된 세균성 아가레이즈들 간의 아미노산 서열의 유사성을 기준으로, 아가레이즈들을 서로 다른 글리코시드 가수분해효소(glycoside hydrolase, GH) 패밀리들로 분류할 수 있다. 즉 β-아가레이즈들은 GH16, GH50, GH86 및 GH118과 같은 다양한 GH 패밀리로 분류되며 [Michel et al., 2006; Cantarel et al., 2009; Chi et al., 2012], α-아가레이즈들은 GH96 및 GH117 패밀리 [Flament et al., 2007; Ha et al., 2011; Lee et al., 2019]로 분류된다. GH16, GH86 및 GH118 β-아가레이즈들은 각각 네오아가로테트라오스(NA4)/네오아가로헥사오스(NA6), NA6/네오아가로옥타오스(NA8) 및 NA8/네오아가로데카오스(NA10)를 생산하기 위해 아가로오스를 엔도형 가수분해 방식으로 절단한다. GH50 패밀리 β-아가레이즈들은 엔도형 또는 엑소형 아가로오스 분해활성을 통해 최종 생성물로 NA2, NA4 또는 NA2/NA4를 생산한다 [Fu and Kim, 2010; Li et al., 2015; Han et al., 2016; Liang et al., 2017; Chen et al., 2018]. GH96 α-아가레이즈들은 아가로오스를 주로 A4로 가수분해한다. GH117 α-네오아가로비오스 가수분해효소(α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH)는 NA2를 L-AHG 및 D-갈락토오스로 가수분해한다 [Flament et al., 2007; Ha et al., 2011; Lee et al., 2019].
항산화제 [Chen and Yan 2005], 항종양 [Enoki et al., 2012; Lee et al., 2017], 프리바이오틱 [Hu et al., 2006], 항염증제 [Wang et al., 2017], 항당뇨병 및 항비만 [Hong et al., 2017], 피부 보습 및 미백 [Kobayashi et al., 1997; Yun et al., 2013], 항우식 [Yun et al., 2017] 활성 등과 같은 아가로오스 분해산물의 다양한 생물학적 활성들은 아가로오스의 구성 단당류인 L-AHG의 존재와 관련이 있을 것으로 추정된다. 그러나, L-AHG 생물학적 활성에 대한 직접적인 증거를 제공할 수 있는 생체 내 연구에 이용할 수 있는 충분한 양의 L-AHG가 아직 상업적으로 공급되지 않기 때문에, L-AHG의 상용화를 가능하게 하는 대량생산 기술의 개발이 절실히 필요한 실정이다.
아가로오스로부터 L-AHG를 생산하기 위해 개발된 최근의 효소공정은, 아가로오스를 NA2로 분해한 후 이를 L-AHG 및 D-갈락토오스로 최종 분해하기 위한 목적으로, GH50 β-아가레이즈와 GH117 α-NABH를 공동처리하는 방법을 채택하고 있다 [Yun et al., 2013; Alkotaini et al., 2017; Wang et al., 2018]. 이때, 아가로오스를 당화시켜 L-AHG 및 D-갈락토오스를 생산하기 위해서는, 아가로오스를 NA2로 효율적으로 가수분해시키는 엑소형 GH50 β-아가레이즈 뿐만 아니라 NA2에 특이적으로 작용하여 단당류 L-AHG와 D-galactose로 가수분해시키는 GH117 α-NABH의 개발이 여전히 필요한 실정이다.
선행 연구에서 본 발명의 발명자들은 Cellvibrio sp. KY-GH-1 (KCTC13629BP) 균주의 전체 게놈 서열을 분석하여, 아가로오스를 L-AHG 및 D-갈락토오스로 가수분해하는 아가레이즈들을 암호화하는 유전 정보를 탐색하였다 [Kwon et al., 2019]. KY-GH-1 균주는 ~77kb 영역에 걸쳐 존재하는 아가레이즈 유전자 클러스터 내에 3개의 GH50 패밀리 β-아가레이즈 유전자 (GH50A, GH50B 및 GH50C)와 2개의 GH117 패밀리 α-NABH 유전자들 (GH117A 및 GH117B)을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 후속 연구를 통해 본 발명의 발명자들은 GH50A β-아가레이즈가 3개의 동종효소들(isozymes) 중에서 가장 높은 엑소형 β-아가레이즈 활성을 발휘함을 밝혔다 [Kwon et al., 2020]. 그러나, 2개의 GH117 α-NABH 동종효소들 중 어느 것이 NA2를 L-AHG 및 D-갈락토오스로 가수분해시키는 활성이 더 강한지에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 NA2로부터 L-AHG 생산에 필요한 효율적인 α-NABH를 개발하고, 이를 이용하여 L-AHG를 고효율로 생산하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 지에이치117 에이 α-네오아가로비오스 가수분해효소(GH117 A α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH)를 제공한다.
상기 지에이치117 에이 α-네오아가로비오스 가수분해효소(GH117 A α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH)는 기탁번호 KCTC 13629BP인 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 균주 기원인 것이 바람직하다.
상기 지에이치117 에이 α-네오아가로비오스 가수분해효소(GH117 A α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH)는 지에이치117 에이 α-네오아가로비오스 가수분해효소(GH117 A α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH) 유전자가 도입된 대장균 형질전환체로부터 수득되는 것이 바람직하다.
상기 지에이치117 에이 α-네오아가로비오스 가수분해효소(GH117 A α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH) 유전자는 발현 벡터(expression vector)에 클로닝(cloning)되어 대장균에 도입되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 지에이치117 에이 α-네오아가로비오스 가수분해효소(GH117 A α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH)를 네오아가로비오스(neoagarobiose, NA2)에 처리하여 효소적 분해시키는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose, L-AHG)의 생산 방법을 제공한다.
상기 처리는 25~45℃의 온도 범위에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 처리는 pH 6.0~10.0의 pH 범위에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 처리는 Mn2+를 더 첨가하여 수행되는 것이 바람직하다.
상기 Mn2+는 MnCl2, MnSO4 또는 이들의 혼합물의 형태인 것이 바람직하다.
상기 처리는 트리스(2-카복시에틸)-포스핀(Tris(2-carboxyethyl)-phosphine, TCEP)을 더 첨가하여 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 신규한 한천 분해 세균 셀비브리오 종 KY-GH-1 유래의 지에이치117 에이 α-네오아가로비오스 가수분해효소는 네오아가로비오스를 기질로 하여 온도 범위와 pH 범위에 크게 제한됨이 없이 L-AHG를 고효율로 생산할 수 있으므로 발효 산업, 식품 산업, 의약품 산업 등에 광범위하게 활용될 수 있는 우수한 우수한 효과가 있다.
도 1은 Cellvibrio sp. KY-GH-1의 GH117A α-NABH 및 GH117B β-NABH의 아미노산 서열을 비교한 것이다. 아미노산 서열은 Clustal X [Larkin et al. 2007]를 사용하여 동일성이 최대로 나타나도록 열린해독틀 (open reading frame)을 정렬하였으며, 이때 각 아미노산은 단일 문자 약어로 나타내었다. 두 서열 사이의 동일 잔기들은 배열 상단에 별표로 표시하였다. 각 아미노산 잔기들은 Clustal X 색 구성표를 사용하여 강조하였다. 결손은 대시로 표시하였다.
도 2는 E. coli 발현 시스템에서 발현된 재조합 His-tag된 GH117A 및 GH117B α-NABH의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 TLC 분석에 의한 NA2-가수분해 활성을 검정한 결과이다. (A) E. coli BL21 (DE3) 형질전환체를 0.125mM IPTG의 존재 하에 배양하여 재조합 His-tag된 GH117A 혹은 GH117B α-NABH 효소단백질의 합성을 유도한 후, 세포들을 회수하여 총 분획, 가용성 분획 및 불용성 분획으로 분획하였다. 이어서 동일양의 각 분획을 취하여 전기영동하였다. (B) 정제된 재조합 GH117A α-NABH 및 GH117B α-NABH의 SDS-PAGE. 전기영동 레인; SM, 미리 염색된 단백질 사이즈 마커; Crude GH117A α-NABH 및 Crude GH117A β-NABH, 각각 GH117A α-NABH 및 GH117B α-NABH를 발현하는 대장균 형질전환체로부터 얻은 가용성 분획; 정제된 GH117A α-NABH 및 정제된 GH117B α-NABH, Ni-NTA 정제 시스템으로 정제된 재조합 His-tag된 효소. (C-E) 재료 및 방법에 기재된 바와 같이, 각각의 정제된 재조합 효소 단백질로 0.4% NA2 또는 1.0% NAOS를 처리한 후, 각 효소 반응물을 TLC로 분석하였다. 도 2에는 대표적인 결과를 나타내었고 두 번의 추가 실험에서도 비슷한 결과가 나타났다.
도 3은 표준품 NA2, NA4 또는 NA6을 GH117A α-NABH 효소 처리하여 얻은 가수분해 산물의 TLC 분석 결과를 나타낸다. NA2 (0.4%), 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 및 정제된 GH117A α-NABH (10 μg/mL)를 혼합하여 반응시켰다. 동일한 양 각 개별 효소반응물을 취하여 TLC로 분석하였다. 표준품 D-갈락토오스는 Sigma-Aldrich 사에서, 그리고 표준품 NA2, NA4, NA6 등은 Carbosynth Ltd. (영국 버크셔 주)에서 구입하였다. L-AHG는 NA2를 GH117A β-NABH 효소로 처리하여 가수분해한 다음, 이로부터 정제하여 사용하였다. 도 3에는 대표적인 결과를 나타내었고, 두 번의 추가 실험에서도 유사한 결과가 나타났다.
도 4는 GH117A α-NABH에 의한 기질 NA2의 시간 별 처리에 따른 가수분해 생성물의 TLC 및 LC-MS/MS에 의한 분석 결과를 나타내었다. (A) NA2 (0.4%)와 50mM Tris-HCl (pH 7.5)에서 정제된 GH117A α-NABH (10μg/mL)와 함께 혼합한 후, 지정된 시간 동안 35℃에서 반응시켰다. 이어서 동일양의 각 효소 반응물을 TLC로 분석하였다. (B) 각 효소 반응물의 LC-MS/MS 분석은 재료 및 방법에 설명된 대로 수행하였다. 도 4에는 대표적인 결과를 나타내었고 두 번의 추가 실험에서도 비슷한 결과가 나타났다.
도 5는 Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH117A α-NABH의 아미노산 서열과 GenBank 데이터베이스에서 확보한 9개의 GH117 패밀리 α-NABH들의 다중 아미노산 서열을 비교한 것이다. (A) 아미노산은 Clustal X를 사용하여 최대한의 동일성이 나타나도록 열린해독틀(open reading frame)을 정렬하였으며, 이때 각 아미노산을 단일 문자 약어로 나타내었다 [Larkin et al. 2007]. 모든 서열 사이의 동일한 잔기는 배열 상단에 별표로 표시하였다. 보존적인 치환은 콜론으로, 반보존적인 치환은 점으로 표시하였으며, 각 잔기들은 Clustal X 색 구성표로 강조하였다. 결손은 대시로 표시하였다. (B) Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH117A α-NABH와 9개의 관련 GH117A α-NABH들 간의 계통학적 관계는 아미노산 서열 유사성에 기반하였다. 뿌리가 있는 계통수는 UPGMA 방법 [Sneath and Sokal 1973]으로 구성하였다. 노드의 숫자는 부트스트랩 발생 수준이다. 50% 이상의 값만 표시하였다. 눈금 막대는 50개 뉴클레오티드 당 하나의 치환을 나타낸다.
도 6은 정제된 GH117A α-NABH의 분자체 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸다. (A) 정제된 GH117A α-NABH의 분자체 크로마토그래피 프로파일은 150mM NaCl을 함유한 40mM Tris-HCl (pH 8.0)으로 평형화된 Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼을 사용하여 수행하였다. 이때, 500μg GH117A α-NABH를 함유하는 단백질 용액을 컬럼에 주입하였으며, 컬럼은 0.3mL/min의 유속으로 4℃에서 용출하였고 단백질 용출 프로파일은 280nm에서 흡광도를 측정하여 모니터링하였다. (B) 정제된 GH117A α-NABH의 분자량 측정을 위해서는, 동일한 컬럼 용출 조건에서 다음과 같은 분자량 사이즈 마커 단백질들을 사용하였다: 위치 a, 페리틴 (440kDa); 위치 b, 알 돌라제 (158kDa); 위치 c, 난알부민 (44kDa); 위치 d, 리보뉴클레아제 A (13.7kDa). GH117A α-NABH의 용출 피크 위치는 화살표로 표시하였다.
도 7은 GH117A α-NABH의 생화학적 특성을 나타낸다. (A, B) 효소 활성에 대한 온도 및 pH의 영향은 0.4% NA2 및 10μg/mL의 정제된 GH117A α-NABH를 사용하여 측정하였다. 각 값은 평균 ± SEM (n = 3, 각 실험 당 3반복)으로 표시하였다. (C, D) 정제된 GH117A α-NABH의 온도 및 pH 안정성은 개별 pH 또는 온도에서 효소를 4시간 처리한 후에 조사하였다. 각 값은 평균 ± SEM (n = 3, 각 실험 당 3반복)으로 표시하였다. (E) 정제된 GH117A α-NABH의 Km 및 Vmax 값에 대한 Lineweaver-Burk 플롯은 표시된 농도의 효소 및 기질 NA2를 사용하여 조사하였다. 도 7에는 대표적인 결과를 나타내었고 두 번의 추가 실험에서도 비슷한 결과가 나타났다.
도 8은 GH117A α-NABH 활성에 대한 금속 이온, 환원제 및 킬레이트제의 효과를 나타낸다. GH117A α-NABH 효소 활성에 미치는 금속 이온, SH 환원제 TCEP 및 킬레이터 EDTA의 5mM 농도에서의 개별 효과 (A) 및 5 mM MnSO4/5mM TCEP의 공동처리 효과 또는 5mM MnSO4/10mM TCEP의 공동처리 효과를 측정하기 위해, 정제된 효소 (10μg/mL)를 20mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5), 0.4% NA2와 혼합한 후 35℃에서 30분 동안 처리하였다. 이때, 여러 이온과 시약들을 처리하지 않고 측정한 효소활성을 100%로 정의하였다. 각 값은 평균 ± SD (n = 3, 각 실험 당 3반복으로 측정)로 표시하였다. * P <0.05 및 ** P <0.01.
도 9는 GH117A α-NABH 효소에 의해 촉매된 NA2의 L-AHG/D-갈락토오스로의 완전한 가수분해 및 가수분해 생성물로부터 Sephadex G-10 컬럼 크로마토그래피를 이용한 L-AHG의 정제를 나타낸다. (A) NA2 (2.0~5.0%)를 최적의 반응 조건 (5mM MnSO4 및 10mM TCEP, 35℃, pH 7.5)에서 GH117A α-NABH (40μg/ml)로 14시간 동안 처리한 후 NA2의 가수분해에 의한 L-AHG 및 D- 갈락토스로의 전환을 확인하기 위해 TLC 분석을 수행하였다. (B) GH117A α-NABH 효소에 의해 촉매된 NA2의 가수분해 생성물로부터 L-AHG를 회수하기 위해, 4.0% NA2 (10ml)를 GH117A α-NABH 효소 (20μg/ml)로 최적 조건에서 14시간 동안 처리한 다음 동결 건조하였다. 동결 건조된 시료를 3차 증류수에 녹인 후, 이를 Sephadex G-10 컬럼을 사용하여 분자체 크로마토그래피로 분획하였다. 각 분획 속의 L-AHG의 존재 유무는 TLC로 분석하였다. 도 9에는 대표적인 결과를 나타내었고, 두 번의 추가 실험에서도 비슷한 결과가 나타났다.
도 2는 E. coli 발현 시스템에서 발현된 재조합 His-tag된 GH117A 및 GH117B α-NABH의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 TLC 분석에 의한 NA2-가수분해 활성을 검정한 결과이다. (A) E. coli BL21 (DE3) 형질전환체를 0.125mM IPTG의 존재 하에 배양하여 재조합 His-tag된 GH117A 혹은 GH117B α-NABH 효소단백질의 합성을 유도한 후, 세포들을 회수하여 총 분획, 가용성 분획 및 불용성 분획으로 분획하였다. 이어서 동일양의 각 분획을 취하여 전기영동하였다. (B) 정제된 재조합 GH117A α-NABH 및 GH117B α-NABH의 SDS-PAGE. 전기영동 레인; SM, 미리 염색된 단백질 사이즈 마커; Crude GH117A α-NABH 및 Crude GH117A β-NABH, 각각 GH117A α-NABH 및 GH117B α-NABH를 발현하는 대장균 형질전환체로부터 얻은 가용성 분획; 정제된 GH117A α-NABH 및 정제된 GH117B α-NABH, Ni-NTA 정제 시스템으로 정제된 재조합 His-tag된 효소. (C-E) 재료 및 방법에 기재된 바와 같이, 각각의 정제된 재조합 효소 단백질로 0.4% NA2 또는 1.0% NAOS를 처리한 후, 각 효소 반응물을 TLC로 분석하였다. 도 2에는 대표적인 결과를 나타내었고 두 번의 추가 실험에서도 비슷한 결과가 나타났다.
도 3은 표준품 NA2, NA4 또는 NA6을 GH117A α-NABH 효소 처리하여 얻은 가수분해 산물의 TLC 분석 결과를 나타낸다. NA2 (0.4%), 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 및 정제된 GH117A α-NABH (10 μg/mL)를 혼합하여 반응시켰다. 동일한 양 각 개별 효소반응물을 취하여 TLC로 분석하였다. 표준품 D-갈락토오스는 Sigma-Aldrich 사에서, 그리고 표준품 NA2, NA4, NA6 등은 Carbosynth Ltd. (영국 버크셔 주)에서 구입하였다. L-AHG는 NA2를 GH117A β-NABH 효소로 처리하여 가수분해한 다음, 이로부터 정제하여 사용하였다. 도 3에는 대표적인 결과를 나타내었고, 두 번의 추가 실험에서도 유사한 결과가 나타났다.
도 4는 GH117A α-NABH에 의한 기질 NA2의 시간 별 처리에 따른 가수분해 생성물의 TLC 및 LC-MS/MS에 의한 분석 결과를 나타내었다. (A) NA2 (0.4%)와 50mM Tris-HCl (pH 7.5)에서 정제된 GH117A α-NABH (10μg/mL)와 함께 혼합한 후, 지정된 시간 동안 35℃에서 반응시켰다. 이어서 동일양의 각 효소 반응물을 TLC로 분석하였다. (B) 각 효소 반응물의 LC-MS/MS 분석은 재료 및 방법에 설명된 대로 수행하였다. 도 4에는 대표적인 결과를 나타내었고 두 번의 추가 실험에서도 비슷한 결과가 나타났다.
도 5는 Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH117A α-NABH의 아미노산 서열과 GenBank 데이터베이스에서 확보한 9개의 GH117 패밀리 α-NABH들의 다중 아미노산 서열을 비교한 것이다. (A) 아미노산은 Clustal X를 사용하여 최대한의 동일성이 나타나도록 열린해독틀(open reading frame)을 정렬하였으며, 이때 각 아미노산을 단일 문자 약어로 나타내었다 [Larkin et al. 2007]. 모든 서열 사이의 동일한 잔기는 배열 상단에 별표로 표시하였다. 보존적인 치환은 콜론으로, 반보존적인 치환은 점으로 표시하였으며, 각 잔기들은 Clustal X 색 구성표로 강조하였다. 결손은 대시로 표시하였다. (B) Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH117A α-NABH와 9개의 관련 GH117A α-NABH들 간의 계통학적 관계는 아미노산 서열 유사성에 기반하였다. 뿌리가 있는 계통수는 UPGMA 방법 [Sneath and Sokal 1973]으로 구성하였다. 노드의 숫자는 부트스트랩 발생 수준이다. 50% 이상의 값만 표시하였다. 눈금 막대는 50개 뉴클레오티드 당 하나의 치환을 나타낸다.
도 6은 정제된 GH117A α-NABH의 분자체 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸다. (A) 정제된 GH117A α-NABH의 분자체 크로마토그래피 프로파일은 150mM NaCl을 함유한 40mM Tris-HCl (pH 8.0)으로 평형화된 Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼을 사용하여 수행하였다. 이때, 500μg GH117A α-NABH를 함유하는 단백질 용액을 컬럼에 주입하였으며, 컬럼은 0.3mL/min의 유속으로 4℃에서 용출하였고 단백질 용출 프로파일은 280nm에서 흡광도를 측정하여 모니터링하였다. (B) 정제된 GH117A α-NABH의 분자량 측정을 위해서는, 동일한 컬럼 용출 조건에서 다음과 같은 분자량 사이즈 마커 단백질들을 사용하였다: 위치 a, 페리틴 (440kDa); 위치 b, 알 돌라제 (158kDa); 위치 c, 난알부민 (44kDa); 위치 d, 리보뉴클레아제 A (13.7kDa). GH117A α-NABH의 용출 피크 위치는 화살표로 표시하였다.
도 7은 GH117A α-NABH의 생화학적 특성을 나타낸다. (A, B) 효소 활성에 대한 온도 및 pH의 영향은 0.4% NA2 및 10μg/mL의 정제된 GH117A α-NABH를 사용하여 측정하였다. 각 값은 평균 ± SEM (n = 3, 각 실험 당 3반복)으로 표시하였다. (C, D) 정제된 GH117A α-NABH의 온도 및 pH 안정성은 개별 pH 또는 온도에서 효소를 4시간 처리한 후에 조사하였다. 각 값은 평균 ± SEM (n = 3, 각 실험 당 3반복)으로 표시하였다. (E) 정제된 GH117A α-NABH의 Km 및 Vmax 값에 대한 Lineweaver-Burk 플롯은 표시된 농도의 효소 및 기질 NA2를 사용하여 조사하였다. 도 7에는 대표적인 결과를 나타내었고 두 번의 추가 실험에서도 비슷한 결과가 나타났다.
도 8은 GH117A α-NABH 활성에 대한 금속 이온, 환원제 및 킬레이트제의 효과를 나타낸다. GH117A α-NABH 효소 활성에 미치는 금속 이온, SH 환원제 TCEP 및 킬레이터 EDTA의 5mM 농도에서의 개별 효과 (A) 및 5 mM MnSO4/5mM TCEP의 공동처리 효과 또는 5mM MnSO4/10mM TCEP의 공동처리 효과를 측정하기 위해, 정제된 효소 (10μg/mL)를 20mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5), 0.4% NA2와 혼합한 후 35℃에서 30분 동안 처리하였다. 이때, 여러 이온과 시약들을 처리하지 않고 측정한 효소활성을 100%로 정의하였다. 각 값은 평균 ± SD (n = 3, 각 실험 당 3반복으로 측정)로 표시하였다. * P <0.05 및 ** P <0.01.
도 9는 GH117A α-NABH 효소에 의해 촉매된 NA2의 L-AHG/D-갈락토오스로의 완전한 가수분해 및 가수분해 생성물로부터 Sephadex G-10 컬럼 크로마토그래피를 이용한 L-AHG의 정제를 나타낸다. (A) NA2 (2.0~5.0%)를 최적의 반응 조건 (5mM MnSO4 및 10mM TCEP, 35℃, pH 7.5)에서 GH117A α-NABH (40μg/ml)로 14시간 동안 처리한 후 NA2의 가수분해에 의한 L-AHG 및 D- 갈락토스로의 전환을 확인하기 위해 TLC 분석을 수행하였다. (B) GH117A α-NABH 효소에 의해 촉매된 NA2의 가수분해 생성물로부터 L-AHG를 회수하기 위해, 4.0% NA2 (10ml)를 GH117A α-NABH 효소 (20μg/ml)로 최적 조건에서 14시간 동안 처리한 다음 동결 건조하였다. 동결 건조된 시료를 3차 증류수에 녹인 후, 이를 Sephadex G-10 컬럼을 사용하여 분자체 크로마토그래피로 분획하였다. 각 분획 속의 L-AHG의 존재 유무는 TLC로 분석하였다. 도 9에는 대표적인 결과를 나타내었고, 두 번의 추가 실험에서도 비슷한 결과가 나타났다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 E. coli 발현 시스템과 pET-30a 벡터 플라스미드를 이용하여 얻은 재조합 단백질 GH117A α-NABH와 GH117B α-NABH의 효소활성을 비교하였다. 그 결과로서, GH117B α-NABH에 비해 GH117A α-NABH가 이당류인 NA2를 단당류인 L-AHG 및 D-갈락토오스로 가수분해하는 효소 활성이 월등히 더 높음을 확인하였다. 또한, 최적의 반응조건에서 NA2 기질을 L-AHG와 D-갈락토오스 생성물로 전환시키는 GH117A α-NABH 효소(서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 아미노산서열 참조)의 효율성을 조사하였다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 지에이치117 에이 α-네오아가로비오스 가수분해효소(GH117 A α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH)를 제공한다.
상기 지에이치117 에이 α-네오아가로비오스 가수분해효소(GH117 A α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH)는 기탁번호 KCTC 13629BP인 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 균주 기원인 것이 바람직하다.
상기 지에이치117 에이 α-네오아가로비오스 가수분해효소(GH117 A α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH)는 지에이치117 에이 α-네오아가로비오스 가수분해효소(GH117 A α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH) 유전자가 도입된 대장균 형질전환체로부터 수득되는 것이 바람직하다.
상기 지에이치117 에이 α-네오아가로비오스 가수분해효소(GH117 A α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH) 유전자는 발현 벡터(expression vector)에 클로닝(cloning)되어 대장균에 도입되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 지에이치117 에이 α-네오아가로비오스 가수분해효소(GH117 A α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH)를 네오아가로비오스(neoagarobiose, NA2)에 처리하여 효소적 분해시키는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose, L-AHG)의 생산 방법을 제공한다.
상기 처리는 25~45℃의 온도 범위에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 처리는 pH 6.0~10.0의 pH 범위에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 처리는 Mn2+를 더 첨가하여 수행되는 것이 바람직하다.
상기 Mn2+는 MnCl2, MnSO4 또는 이들의 혼합물의 형태인 것이 바람직하다. 상기 MnCl2, MnSO4 또는 이들의 혼합물의 농도는 1~10mM, 바람직하게는 3~8mM, 보다 바람직하게는 4~6mM, 가장 바람직하게는 5mM일 수 있다.
상기 처리는 트리스(2-카복시에틸)-포스핀(Tris(2-carboxyethyl)-phosphine, TCEP)을 더 첨가하여 수행되는 것이 바람직하다. 상기 TCEP의 농도는 1~10mM, 바람직하게는 3~8mM, 보다 바람직하게는 4~6mM, 가장 바람직하게는 5mM일 수 있다.
이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예를 기재한 것이며, 하기 실시예에 기재된 사항에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되어 해석되는 것이 아님은 명백하다.
[실시예]
1. 재료 및 방법
1.1. 재료
제한 효소 (NedI 및 XhoI) 및 T4 리가아제는 Roche (바젤, 스위스)에서 구입하였다. Naphthoresorcinol, D-galactose, isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS), Coomassie brilliant blue (CBB) R-250, Kanamycin은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Micro-BCA 키트는 Pierce (미국 일리노이 주 록 포드)에서 구입했으며 형광 표시기 F254로 코팅된 Silica Gel 60 알루미늄 박층 크로마토그래피 (TLC) 플레이트는 Merck (다름슈타트, 독일)에서 구입하였다. Page Ruler Pre-stained Protein Ladder 및 Ni-NTA resin은 ThermoFisher Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다. C-말단 6x His-tagged 단백질의 발현을 위한 벡터 pET-30a는 EMD Millipore (Billerica, MA, USA)에서 구입하였으며, E. coli BL21 (DE3)은 Novagen (Madison, WI, USA)에서 구입하였다. Bio-Gel P-2는 Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA)에서 구입하였고 Sephadex G-10은 GE Healthcare Bio-Sciences AB (Uppsala, Sweden)에서 구입하였다. NA2~NA18을 포함하는 네오아가로올리고당 (NAOS) 혼합물은 신라대학교 이상현 박사로부터 제공받았다 [Lee et al., 2008]. 선행 연구에서 앞서 보고한 바와 같이, 네오아가로비오스 (neoagarobiose, NA2)는 재조합 GH50A β-아가레이즈로 처리하여 생성된 아가로오스 가수분해물로부터 정제하였다 [Kwon et al., 2020]. 즉, 가수분해물을 동결 건조시킨 후 3차 증류수에 녹이고 Bio-Gel P-2 컬럼을 사용하여 분자체 크로마토그래피를 수행하였다. 컬럼을 3차 증류수(DI)로 용출시킨 후 각 분획을 TLC로 분석하여 NA2만을 함유한 분획들만 회수하였으며, 이를 동결 건조하여 NA2 분말을 얻었다. 표준품 NA2, NA4 및 NA6는 Carbosynth Ltd. (Berkshire, UK)에서 구입하여 사용하였다.
1.2.
E. coli
발현 시스템을 이용한 GH117A 및 GH117B α-NABH 유전자의 클로닝 및 발현
Cellvibrio sp. KY-GH-1의 두 가지 GH117 패밀리 α-NABH 유전자들은 NdeI-포워드 프라이머 (GH117A의 경우, 5'-CGCATATGGGTGATCTTCCAGAAAA-3'(서열번호 3); GH117B의 경우, 5'-GACAT-ATGAGCGACCAAGATTCTG-3'(서열번호 4)) 및 XhoI-역방향 프라이머 (GH1117A의 경우, 5'-AACTCGAGGGAT-GCTACATTCTGAAAGG-3'(서열번호 5); GH117B의 경우, 5'-GGCTCGAGTGGATTGGATTTTCTAGCTT-3'(서열번호 6))를 사용하여 PCR 방법으로 유전체 DNA로부터 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 정제하고 NedI/XhoI으로 처리한 다음, T4 리가아제를 사용하여 pET-30a 발현 벡터에 연결하였다. 재조합 pET-30a 플라스미드를 대장균 BL21 (DE3)로 형질전환시켰다. 이때, GH117A α-NABH 유전자 또는 GH117B α-NABH 유전자를 함유한 형질전환체는 LB/Kanamycin (50μg/mL) 한천 플레이트에서 30℃에서 하룻밤 동안 배양한 후 선발하였다. 재조합 GH117A α-NABH 혹은 GH117B α-NABH 발현의 유도는 이전에 설명된 대로 수행하였다 [Studier et al., 1990]. 즉, 각 형질전환체는 25℃에서 LB/Kanamycin (50μg/mL) 배지에서 배양한 다음, OD600이 0.5~0.6에 도달되었을 때 0.15mM IPTG를 첨가하였으며, 이를 25℃에서 3시간 동안 추가로 배양하여 재조합 GH117 α-NABH 단백질의 합성을 유도하였다.
1.3. 시퀀스 분석 및 계통수 구성
9개의 GH117 패밀리 α-NABH의 아미노산 서열은 NCBI 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 사용한 BLAST 검색에 의해 획득하였다. 개별 오픈 리딩 프레임의 아미노산 서열은 Clustal X [Larkin et al., 2007]. 보존된 아미노산 잔기들은 Clustal X 색 구성표를 사용하여 강조 표시하였다. UPGMA를 사용하여 아미노산 서열 유사성을 기반으로 개별 GH117 패밀리 구성원을 포함하는 뿌리가 있는 계통수를 구성하였다 [Sneath and Sokal, 1973].
1.4. 세포 용해물, 단백질 정량 및 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)
형질전환체에 의해 생성된 재조합 효소단백질을 분리하고 확인하기 위해, 세포를 40mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 현탁하고 10초 동안 20번의 초음파 처리로 파쇄하고 4℃에서 30분 동안 추출한 후, 총 분획, 가용성 분획 및 불용성 분획의 세 분획으로 나누었다 [Jun et al., 1996]. 세포 용해물의 단백질 정량은 Micro BCA 키트 (Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 수행하였다. 동일량의 세포 용해물 (10μg)을 Laemmli 방법 [Laemmli, 1970]에 준하여 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다. 전기영동 후 겔을 CBB R-250으로 염색하여 단백질 밴드를 검출하였다. 전기영동 겔 상에서 특정 재조합 단백질의 농도를 정량하기 위해, 겔 상의 재조합 단백질 밴드의 밀도를 측정한 후 그 측정된 단위를, 동일 겔 상에서 검출되는 연속 희석된 소혈청알부민 (BSA)의 밴드의 밀도 측정 단위로써 확보한 표준곡선과 비교하였다 [Syrovy and Hodny, 1991]. 이때, 겔 상의 단백질 밴드의 밀도 측정은 ImageQuant TL 소프트웨어 (Amersham, Arlington Heights, IL, USA)를 사용하여 수행하였다.
1.5. 재조합 His-tagged α-NABH의 정제
재조합 His-tagged GH117A α-NABH 또는 His-tagged GH117B α-NABH를 정제하기 위해, 먼저 가용성 형태의 재조합 His-tagged GH117A α-NABH 또는 재조합 His-tagged GH117B α-NABH를 함유한 E. coli 형질전환체의 세포 용해물의 가용성 분획을 확보하였다. 이들 가용성 분획에 함유된 재조합 효소단백질은 Ni-NTA resin을 사용한 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피 방법으로 정제하였다 [Spriestersbach et al., 2015].
1.6. 분자체 크로마토그래피에 의한 GH117A α-NABH의 분자량 측정
분자체 크로마토그래피는 40mM Tris-HCl (pH 8.0) 및 150mM NaCl로 평형화시킨 Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 수행하였다. 정제된 GH117A α-NABH (0.5mg/0.5mL)를 컬럼에 주입하고, 분자체 크로마토그래피의 조건으로 4℃에서 0.3mL/min의 유속으로 수행되었고, 단백질 용출은 280nm 파장에서 측정하였다. 컬럼은 페리틴 (440kDa), 알돌라제 (158kDa), 난알부민 (44kDa) 및 리보뉴클레아제 A (13.7kDa)와 같은 크기 마커를 사용하여 단백질 분자량 대비 retention volume의 표준곡선을 확보하였고 이를 기준으로 정제된 GH117A α-NABH 분자량을 측정하였다.
1.7. GH117 α-NABH 활성 분석
GH117 α-NABH 활성은 DNS 방법 [Miller, 1959]을 사용하여 NA2에서 방출된 환원당을 검출함으로써 측정하였다. GH117 α-NABH 활성을 측정하기 위해 정제된 효소용액 (~2μg/100μl)을 20mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5)에 용해된 동일한 부피의 0.8% NA2와 혼합하였다. 35℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 반응 혼합물에서 형성된 환원당을 DNS 시약을 사용하여 발색하여 측정하였다. 효소 활성의 1 단위는 분당 1μmol D-갈락토오스에 해당하는 환원력을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. GH117A α-NABH의 효소반응속도 상수들은 NA2의 기질 용액 (1~10mg/ml, 20mM Tris-HCl, pH 7.5)에 정해진 양의 효소를 첨가하여 측정하였다. Km 및 Vmax 값은 GraphPad Prism 8 통계 패키지 (GraphPad Software, Inc, USA)를 사용하여 Lineweaver-Burk 방정식에서 계산하였다.
1.8. 박층 크로마토 그래피 (TLC)
GH117 α-NABH를 처리한 NA2 가수분해물의 TLC 분석은 Silica Gel 60 알루미늄 플레이트에서 수행되었으며, n-부탄올-에탄올-H2O [3:2:2 (v/v)] 용매를 사용하여 전개하였다. TLC 상의 당 물질의 확인을 위해, 에탄올에 0.2%(w/v) 나프토레소시놀 (Sigma-Aldrich)과 10% (v/v) H2SO4를 첨가한 발색용액을 TLC 판에 분사한 다음 80℃에서 가열하여 검출하였다.
1.9. 크기 배제 컬럼 크로마토 그래피에 의한 L-AHG 정제
NA2 가수분해산물로부터 L-AHG를 정제하기 위해, NA2를 GH117A α-NABH로 최적 반응조건 (5mM MnSO4, 10mM TCEP, 35℃, pH 7.5)에서 14시간 동안 처리한 후 효소 반응물을 동결 건조시켰다. 동결 건조된 시료를 3차 증류수 (DI)에 용해시키고 Sephadex G-10 컬럼 (I.D. 1.3x90cm)을 사용하여 분자체 크로마토그래피를 수행하였다. 컬럼을 DI로 용출하면서 2mL로 각 분획을 수집하였다. L-AHG를 함유하는 분획을 TLC로 측정하여 확인하여 회수하고 동결건조켰다.
1.10. 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)을 이용한 액체 크로마토그래피에 의한 효소 반응 생성물의 확인
LC-MS/MS 분석은 Acquity 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC) H-Class 코어시스템 (Waters Corporation, Milford, MA, USA)이 장착된 ESI (Electroprayization) 이온 소스와 접속한 Xevo TQ-S 마이크로 질량분석기를 사용하여 수행하였다 [Zeng et al., 2016; Koti et al., 2013]. 시료 용출은 용매 유속 200μL/min 및 40℃로 유지시킨 Waters Acquity UPLC Spherisorb amino 컬럼 (2mm×100mm, 3μm 입자 크기)을 사용하여 수행하였다. LC 시스템은 (A) 0.1% 포름산 수용액과 (B) 0.1% 아세토니트릴로 구성하였다. 기질 NA2의 효소 가수 분해물에서 D-갈락토오스와 L-AHG를 확인하기 위해, 먼저 크로마토그래피는 A:B를 95:5 비율로 혼합한 용매로서 시작하여 3분 동안 진행하였고, A:B의 구배를 점진적으로 변경시켜 크로마토그래피 개시 후 13분에는 75:25의 비율이 되도록 하였으며 15분에 이르기까지는 A:B의 75:25 비율을 유지하였다. 이어서 A:B의 비율을 크로마토그래피 개시 후 16분에는 다시 초기 상태인 95:5로 변경되도록 하여 크로마토그래피 개시 후 30분만에 크로마토그래피를 멈출 때까지 이 비율을 유지시켰다. 주입량은 5μL이고 샘플 매니저 온도는 5℃로 설정하였다. 질량 분석계 검출기 조건은 다음과 같이 설정하였다: 모세관 전압, 2.0kV; 콘 전압, 20V; 소스 온도, 150℃; 탈 용매 온도, 250℃; 탈 용매 가스 흐름, 550m/h; 콘 가스 흐름, 5L/h; 질량 범위, 100~800.
1.11. 통계분석
달리 명시되지 않는 한, 데이터는 최소 세 번의 독립적인 실험을 통해 나타내었다. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD, 각 그룹 n ≤ 3에 대해)로 표현하였다. 통계 분석은 Student's t-test를 사용하여 두 그룹 간의 차이와 일원 분산 분석의 유의성을 평가한 후, Dunnett의 다중비교 사후 테스트를 통해 세 개 이상의 그룹을 비교하였다. P 값 <0.05는 통계적 유의성을 나타낸다. 통계분석은 SPSS Statistics 버전 23 (IBM, Armonk, NY, USA)을 사용하여 수행하였다.
2. 결과
2.1.
Cellvibrio
sp. KY-GH-1 유래 GH117A α-NABHs 및 GH117B α-NABH 효소의
E. coli
및 pET-30a 벡터 시스템을 이용한 C-말단 His-tagged 재조합 단백질로서의 발현
본 발명의 발명자들은 선행 연구에서 Cellvibrio sp. KY-GH-1의 전체 게놈 서열 분석을 통해 2개의 GH117 α-NABH 유전자들 (α-CvNabh117A 및 α-CvNabh117B)의 존재를 확인하였다 [Kwon et al., 2019]. 도 1에서 보는 바와 같이, α-CvNabh117A는 40.9kDa 단백질 (GH117A α-NABH)을 구성하는 364개 아미노산을 암호화하는 해독틀 (open reading frame, ORF)을 가지고 있는 반면, α-CvNabh117B는 44.2kDa 단백질 (GH117B α-NABH)을 구성하는 392개 아미노산을 암호화하는 해독틀 (ORF)을 가지고 있는 것으로 나타났다. 이때, α-CvNabh117A의 ORF 염기서열은 α-CvNabh117B의 것과 53% 유사성을 보였고, 아미노산 서열은 서로 간에 35% 유사성을 보였다. 이는 Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주가 가진 2개의 GH117 α-NABHs 사이에는 상동성이 높지 않음을 나타낸다. 한편, GH117A α-NABH와 GH117B α-NABH 효소 단백질 모두에는 N-말단 신호 펩티드 서열이 존재하지 않았으므로, 이는 두 효소가 모두 Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주의 세포 내부, 즉 세포질에서 기능할 수 있음을 시사한다.
본 발명에서는, 이러한 데이터를 기반으로 하여 두 효소를 대장균 발현 시스템을 사용하여 재조합 His-tagged 효소 단백질로서 과발현시키고 정제하였으며, 이들 정제된 재조합 GH117A α-NABH 또는 재조합 GH117B α-NABH 중 어느 것이 NA2에 대해 더 높은 효소 활성을 또한 더 선택적인 효소 활성을 갖는지 조사하였다. 재조합 GH117A α-NABH 또는 GH117B α-NABH를 발현하는 각 E. coli 형질전환체의 효소 단백질 발현을 IPTG 처리로 유도한 후, 세포를 회수하고 초음파 파쇄하여 총 분획, 가용성 분획 및 불용성 분획을 얻었다. 각 분획의 동일양을 취하여 8% SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 후, 겔을 CBB로 염색하여 단백질 밴드를 확인함으로써 각 재조합 효소의 가용성/불용성 비율을 조사하였다. 도 2의 a에 나타낸 바와 같이, GH117A α-NABH 및 GH117B α-NABH는 모두 형질전환 세포의 가용성 분획에서 우세하게 검출되었고, 불용성 봉입체 (inclusion body) 분획에서 검출되는 각 재조합 효소의 양은 유의하지 않았다. Ni-NTA 정제 시스템을 사용하여 His-tagged GH117A 및 GH117B 효소를 세포 가용성 분획에서 정제했을 때, 8% SDS-PAGE에서 단일 단백질 밴드로 검출되었다 (도 2의 b). 정제된 재조합 GH117A 및 GH117B 효소 단백질의 분자량 (MW)을 전기영동 겔 상의 사이즈 마커들과 비교하였을 때, 재조합 GH117A 효소 단백질은 ~39.0kDa 그리고 GH117B 효소 단백질은 ~44.8kDa으로 확인되었다.
GH117A α-NABH와 GH117B α-NABH의 NA2 가수분해 활성을 TLC로 조사했을 때, GH117A α-NABH는 NA2를 L-AHG와 D-갈락토오스로 완전히 가수분해하는 반면, GH117B α-NABH는 NA2의 가수분해에 실패하였다 (도 2의 c). GH117A α-NABH와 GH117B α-NABH의 기질 특이성의 차이를 추가로 조사하기 위해, 기질 (NA2~NA18의 NAOS 혼합물)을 각 효소로 시간 별로 처리하면서 반응시간에 따른 분해 생성물을 TLC로 분석하였다. 그 결과, NA2~NA18의 NAOS 혼합물 중에서 NA2의 경우에만 GH117A α-NABH 처리에 의해 가수분해되어 L-AHG와 D-갈락토오스로 전환되었으며, NA2 가수분해는 효소 반응이 개시되는 시점에서부터 시작되어 L-AHG의 생성양이 60분의 반응 기간 동안 지속적으로 증가하였다 (도 2의 d). 그러나, 동일한 조건에서 NA4~NA18은 GH117A α-NABH에 의해 분해되지 않았다. 이는 NAOS (NA2~NA18) 중에서 NA2가 GH117A α-NABH 가수분해 작용에 특화된 유일한 기질임을 나타낸다. 한편, GH117B α-NABH는 NAOS (NA2~NA18) 혼합물들 중 어느 것도 가수분해하지 못하는 것으로 나타났다 (도 2의 e). NA2가 GH117A α-NABH 가수분해 작용의 유일한 기질임을 확인하기 위해, 표준품 NA2, NA4 또는 NA6를 각각 효소로 처리하고 개별 가수 분해물을 TLC로 분석하였다. 그 결과, NA2는 L-AHG와 D-galactose로 완전히 분해되었으나 NA4와 NA6는 분해되지 않는 것으로 나타나, NA2가 GH117A α-NABH 촉매작용의 유일한 기질임을 확정하였다 (도 3).
또한, TLC 분석의 결과, 0.4% NA2를 정제된 재조합 GH117 α-NABH (10μg/ml)로써 50mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5), 35℃에서 처리하였을 때 NA2의 가수분해가 반응시간에 정비례하여 증가하였으며, 반응시간 60분에는 단당류로 완전히 전환되는 것으로 확인되었다 (도 4의 a). 아울러 LC-MS/MS 분석을 통해, 효소의 가수분해 작용에 의해 시간 의존적으로 NA2가 L-AHG와 D-갈락토오스로 전환되는 것을 추가로 증명하였다 (도 4의 b). 이러한 결과들은 KY-GH-1 균주에서 GH117A α-NABH가 아가로오스 당화의 최종 효소 단계인 NA2의 L-AHG 및 D-갈락토오스로의 가수분해에 필수적인 효소임을 입증한다.
2.2. GH117A α-NABH의 아미노산 서열과 다른 균주 유래 관련 효소의 아미노산 서열과의 비교
GH117A α-NABH의 아미노산 서열을 Clustal X 프로그램을 사용하여 다른 한천 분해 세균 유래의 GH117A α-NABH의 아미노산 서열들과 비교 분석하였다 [Larkin et al., 2007]. 도 5의 a에 나타난 바와 같이, Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH117A α-NABH (GenBank 수탁번호 WP_151030319.1)는 Cellvibrio sp. KY-YJ-3 GH117A α-NABH (GenBank 수탁번호 WP_151057276.1)와 97.5% 유사성을 나타내었다. 또한, KY-GH-1 GH117A α-NABH는 Cellvibrio sp. pealriver (GenBank 수탁번호 WP_049629412.1) [Xie et al., 2017], Cellvibrio sp. BR (GenBank 수탁번호 WP_007640738.1) 및 Cellvibrio sp. OA-2007 (GenBank 수탁번호 WP_062065015.1) [Syazni et al., 2015]와 97.3%, 97.3%, 96.7%의 유사성을 나타내었다. 이는 Cellvibrio GH117A α-NABH들 사이에는 높은 수준의 상동성이 있음을 보여준다.
한편, GH117A α-NABH의 아미노산 서열은 Agrobacterium haliotis (GenBank 수탁번호 WP_096085215.1), Gilvimarinus polysaccharolyticus (GenBank 수탁번호 WP_049720980.1), Gilvimarinus chinensis (GenBank 수탁번호WP_020208680.1), Vibrio fluvialis (GenBank 수탁번호 WP_171934150.1) 및 Vibrio sp. EJY3 (GenBank 수탁번호 014232194.1)의 GH117A α-NABH의 아미노산 서열들과는 각각 77.5%, 77.4%, 77.2%, 76.8% 및 76.5% 유사성을 나타내었다,
개별 GH117A α-NABH의 뿌리가 있는 계통수에서 Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH117A α-NABH는, 해양성 Agrobacterium haliotis, Gilvimarinus polysaccharolyticus, Gilvimarinus chinensis, Vibrio fluvialis 및 Vibrio sp. EJY3 유래의 GH117A α-NABH에 비해 비해양성 환경에서 분리된 Cellvibrio sp. KY-YJ-3, Cellvibrio sp. pealriver, Cellvibrio sp. BR 및 Cellvibrio sp. OA-2007의 GH117A α-NABHs와 더 밀접하게 그룹화되었다 (도 5의 b).
GH117A α-NABHs의 동족체(homologs)가 높은 수준의 아미노산 서열의 상동성으로 모든 한천 분해 세균들에 존재한다는 보여주는 현재의 분석결과는, NA2 기질의α-1,3-결합을 가수분해하여 단당류인 L-AHG 및 D-갈락토오스를 생산하는 효소인 GH117A β-NABH가 한천 분해 세균들이 가진 아가로오스의 당화 공정에 있어서 필수적인 구성 효소임을 시사한다.
2.3. GH117A α-NABH의 효소학적 특성
몇몇 GH117 패밀리 α-네오아가로올리고당 가수분해 효소 (α-NAOSH)와 α-NABH가 세포질 내부에 존재하든 혹은 세포 외부에 존재하든 상관없이 이합체 형태로 존재하면서 효소기능을 수행하는 것으로 보고되었다 [Asghar et al., 2018]. 본 연구에서 E. coli expression system을 이용하여 생산한 재조합 GH117A α-NABH의 경우에도 이합체의 형태로 NA2를 L-AHG와 D-갈락토오스로 가수분해하는지를 확인하기 위해, 정제된 재조합 GH117A α-NABH의 분자량을 Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼을 사용한 분자체 크로마토그래피로 측정하였다.
그 결과, 측정된 GH117A α-NABH의 분자량은 92.1kDa로 나타났다 (도 6). 364개의 아미노산으로 구성된 GH117A α-NABH의 계산된 분자량은 40.9kDa이고, 이는 SDS-PAGE 분석에 의해 추정되는 GH117A α-NABH분자량 (~39.0kDa)과 일치하기 때문에, 분자체 크로마토그래피 데이터는 정제된 GH117A α-NABH가 이량체로 존재함을 보여준다.
NA2로부터 L-AHG를 대량생산하는데 있어서 재조합 GH117A α-NABH의 유효성을 구명하기 위해, 효소 특성을 조사하였다. GH117A α-NABH 효소 활성에 미치는 온도의 영향을 조사하였을 때, 35℃에서 가장 높은 활성이 나타내었다 (도 7의 a). 25~45℃ 범위를 벗어난 온도에서 최대 활성도의 50% 미만이 유지되었다. 효소는 6.0~10.0 (최적 pH 7.5)의 상당히 넓은 pH 범위에서 활성을 나타냈다 (도 7의 b). 효소는 35℃까지 안정적이었다. 그러나, 40℃에서 4시간 동안 처리 한 후 최대 활성의 40%만 유지되었으며, 45℃ 이상의 온도에서 4시간 동안 처리한 후에는 대부분의 효소 활성을 상실하였다 (도 7의 c). GH117A α-NABH는 7.0~7.5의 pH 범위에서 안정적이었지만 6.0 미만의 산성 pH에서는 빠르게 불활성이 되었고 pH 8.0~10.0에서는 4시간 처리 후 50~60%의 활성을 유지하였다. 이러한 관찰 결과는, GH117A α-NABH가 산성 pH 보다 알칼리성 pH에서 더 안정하다는 것을 보여준다 (도 7의 d). 기질 NA2에 대한 GH117A α-NABH의 효소반응속도 상수들인 Km, Vmax, Kcat 및 Kcat/Km 값은 각각 16.0mM, 20.8U/mg, 14.2s-1 및 8.9×102s-1·M-1이였다 (도 7의 e).
GH117A α-NABH 활성은 5mM MnCl2, 5mM MnSO4 및 5mM TCEP가 존재할 경우에 각각 1.4배, 1.5배 및 1.2배 향상되었지만, 5mM EDTA의 존재 하에서는 효소 활성의 85%를 억제했다 (도 8의 a). 효소 활성에 대한 Mn2+ 및 TCEP의 강화 효과는 용량 의존적 방식으로, 5mM MnSO4 및 10mM TCEP는 효소 활성을 각각 최대 수준인 1.5배 및 1.7배로 증가시켰다 (도 8의 b). 또한, 5mM MnSO4와 10mM TCEP가 동시에 존재할 경우에는, 효소 활성이 2.4배 정도까지 현저하게 상승하여서 GH117A α-NABH 활성에 대한 Mn2+ 및 TCEP의 시너지 효과를 확인하였다.
이러한 결과는 GH117A α-NABH가 적절한 효소 활성을 나타내기 위해서 망간 이온을 필요로 할 수 있지만 망간 이온과의 상호작용이 5mM EDTA의 킬레이트 작용에 저항할 수 있을 정도로는 강하지 않을 수 있음을 시사한다.
2.4. 최적 조건에서 GH117A α-NABH에 의한 NA2 처리로 생산할 수 있는 L-AHG 수율
GH117A α-NABH가 NA2로부터 L-AHG 생산에 효율적인 효소인지 알아보기 위해, GH117A α-NABH가 L-AHG와 D-갈락토오스로 완전히 가수분해시킬 수 있는 NA2의 최대 농도를 조사하였다. 다양한 농도 (2.0%, 3.0%, 4.0% 및 5.0%)의 NA2를 최적의 반응 조건 (5mM MnSO4 및 10mM TCEP, 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 35℃)에서 GH117A α-NABH (40μg/ml)와 14시간 동안 반응시킨 후, 각 가수분해 산물을 TLC로 분석하였다. 그 결과, 효소의 촉매작용에 의한 NA2 기질의 L-AHG 및 D-갈락토오스로의 완전한 가수분해는 2.0~5.0% 농도의 NA2에서 모두 관찰되었다 (도 9의 a). 그러나, 6.0% 이상의 NA2 농도에서는 불완전한 가수분해가 관찰되었다 (데이터 생략).
한편, 5% NA2 (8ml)를 GH117A α-NABH (40μg/mL)로 최적의 반응조건으로 14시간 동안 처리한 후, 효소 반응물을 동결 건조하였다. 건조된 시료를 3차 증류수에 용해시키고 Sephadex G-10 컬럼을 사용한 분자체 크로마토그래피로 분획하였다. 각 분획의 TLC 분석 결과, 30~31분획에서는 D-갈락토오스가 33~39분획에서는 L-AHG가 확인되었다 (도 9의 b). 분획 33~39를 회수하고 동결 건조하여 분말 상태의 L-AHG를 얻었다. 효소 처리로 확보한 400mg NA2의 가수분해물을 2회에 걸쳐 Sephadex G-10 컬럼 크로마토그래피로 분획한 결과, 이론적 최대 수율의 ~92%에 해당하는 총 ~192mg L-AHG를 회수하였다.
3. 논의
본 발명에서는 담수 유래 한천 분해 세균인 Cellvibrio sp. KY-GH-1에서 유래된 GH117A β-NABH 효소를 E. coli 발현 시스템을 사용하여 가용성의 His-tagged재조합 단백질로 생산하였고, 생산된 재조합 GH117A β-NABH 효소의 기질 특이성을 조사한 결과로서, 이당류인 NA2의 α-1,3-결합은 가수분해하여 단당류인 L-AHG와 D-갈락토스로 전환시키지만, NA4~NA18등의 다양한 DPs의 NAOS가 지닌 α-1,3-결합에 대해서는 가수분해능을 전혀 발휘하지 못함을 확인하였다. 또한, 5.0% NA2 기질을 재조합 GH117A β-NABH 효소로 최적의 반응조건에서 처리하여 완전히 L-AHG와 D-갈락토오스로 가수분해시킨 후 가수분해물로부터 L-AHG를 Sephadex G-10 컬럼을 이용한 분자체 크로마토그래피로 정제하였을 때, 400mg NA2로부터 생산할 수 있는 L-AHG의 이론상 최대 수율의 ~92%에 해당하는 ~192mg의 L-AHG를 회수하였다.
선행 연구에서 본 발명의 발명자들은 한천 분해 세균인 Cellvibrio sp. KY-GH-1균주의 전체 유전체 염기서열 분석한 결과, GH117A α-NABH (364개 아미노산, 40.9kDa) 및 GH117B α-NABH (392개 아미노산, 44.2kDa)를 암호화하는 2개의 잠정적인 GH117 α-NABH 유전자들 (α-CvNabh117A 및 α-CvNabh117B)를 함유하고 있음을 추정하였는데, GH117 α-NABH 효소는 이당류 NA2를 단당류인 L-AHG와 D-갈락토오스로 가수분해시키는 기능을 통해 아가로오스의 효소적 당화의 마지막 단계에 기여하는 것으로 알려졌다 [Kwon et al., 2019]. 비록 두 가지의 재조합 His-tagged GH117 α-NABH 효소들이 모두 E. coli 형질전환체 내에서 가용성 형태로 발현되었지만, GH117A α-NABH만이 NA2를 단당류로 가수분해하는 기능을 보였다. 이는 GH117A α-NABH가 Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주에서의 아가로오스 분해의 최종 효소 단계에 필수 효소임을 나타낸다. 여러 연구 문헌에서, α-NABH를 포함한 GH117 패밀리 α-NAOSH는 NA2를 기질로 인식하고 이를 L-AHG 및 D-갈락토오스로 가수분해하는 것으로 보고된 바 있지만 [Ha et al., 2011; Ariga et al., 2007; Watanabe et al., 2017], 이러한 α-NAOSH는 NA2 기질에만 특이적인 것이 아니라 NA4에도 작용하여 L-AHG 생성과 함께 아가로트리오스 (A3)를 생성하여 잔존시키며 또한 NA6에도 작용하여 L-AHG 생성과 함께 아가로펜타오스 (A5)를 생성하여 잔존시키는 것으로 보고되었다. 특히, 최근에 연구된 Streptomyces coelicolor A3의 α-NAOSH는 2~14의 다양한 중합도 (DPs)의 NAOS에 작용하여서 이들의 비환원성 말단에서 첫 번째 α-1,3-글리코시드 결합만을 가수분해하는 것으로 보고되었다 [Jiang et al., 2020]. 본 발명에서 재조합 GH117A α-NABH 효소 단백질을 E. coli 발현 시스템으로 생산하고 정제하여 확보한 후 다양한 DPs의 NA2~NA18를 함유한 NAOS 혼합물을 기질로 사용하여 그 기질 특이성을 조사한 결과, NA2는 L-AHG와 D-갈락토오스로 가수분해되는데 반해, 나머지 NA4~NA18 등은 GH117A α-NABH의 효소활성에 의해 전혀 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다. 뿐만 아니라 표준품 NA2, NA4 또는 NA6을 사용한 GH117A α-NABH의 기질 특이성에 대한 추가 조사에서도, NA2가 GH117A α-NAB의 유일한 기질이며 L-AHG 및 D-갈락토오스로 완전히 가수분해됨이 밝혀졌다. 이러한 결과는 GH117A α-NABH가 NA2 가수분해에 특화된 효소이며, 이와 같은 NA2 기질 특이성을 가진 면에서는 기존의 보고된 바 있는 효소들과 뚜렷이 구별된다는 것을 보여준다. 한편, GH117B α-NABH의 아미노산 서열이 GH117A α-NABH의 아미노산 서열과 35% 유사성을 공유하지만, NA2~NA18 중 어느 것도 가수분해하지 못하여 GH117B α-NABH의 효소 기능이 NAOS (NA2~NA18)로부터의 L-AHG 생산에는 기여하지 않음을 확인하였다. Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주에서 GH117B α-NABH의 역할은 아직 밝혀지지 않은 상태로 남아있다.
GH117A α-NABH의 아미노산 서열을 NCBI GenBank 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 발견한 상위 9개 동족체들과 함께 Clustal X 프로그램 [Larkin et al., 2007]을 사용하여 정렬하였을 때, GH117A α-NABH 동족체는 해양성 및 비해양성의 모든 한천 분해 세균에 존재하며 높은 수준의 서열 상동성 (76.5~97.5 %)을 지니고 있는 것으로 확인되었다. 이는 GH117A α-NABH가 세균성 한천 분해 효소계의 필수적인 구성원임을 시사한다. 또한, 이러한 9개의 GH117 α-NABHs 중에서, Vibrio sp. EJY3 균주의 GH117A α-NABH는 유일하게 효소 특성이 조사되어 NA2 및 NA4를 기질로 분해하는 것으로 보고되었다 [Yu et al., 2000]. 따라서, 본 발명에서 보고하는 GH117A α-NABH에 대한 현재 데이터는 GH117A α-NABH와 상당한 상동성을 나타내는 GH117 패밀리 α-NABHs에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
또한, 이러한 9개의 GH117 α-NABH 중 어느 것도 지금까지 효소 특성에 대해 조사되지 않았기 때문에, 본 연구에서 보고된 GH117A α-NABH에 대한 현재 데이터는 GH117A α-NABH와 상당한 상동성을 나타내는 GH117 패밀리 α-NABHs에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
NA2에 대한 GH117A α-NABH의 효소 반응속도 상수들인 Km 및 Vmax 값 (16.0mM 및 20.8U/mg)은 Vibrio sp. JT0107 [Sugano et al., 1994]의 α-NAOSH (5.37mM 및 92U/mg)를 포함하여 다른 보고된 바 있는 α-NABHs, 즉 Cellvibrio sp. OA-2007 [Ariga et al., 2014]의 α-NAOSH (6 mM 및 19 U/mg), Cellvibrio sp. WU-0601 [Watanabe et al., 2017]의 α-NAOSH (5.8 mM 및 60 U/mg), Agarovorans gilvus WH0801 [Liu et al., 2016]의 α-NABH (6.45mM 및 6.98U/mg), Gayadomonas joobiniege G7 [Asghar et al., 2018]의 α-NABH (4.5mM 및 1.33U/mg) 및 Streptomyces coelicolor A3 [Jiang et al., 2020]의 α-NAOSH (11.57mM 및 데이터 부재) 등과 비교할 만하였다. 또한, GH117A α-NABH는 NA2에 대한 Vmax 및 Kcat 값 (20.8U/mg 및 14.2s-1)과 관련하여서는 다른 비교되는 효소들 보다 더 촉매적인 것으로 나타났다. 또한, 현재까지 보고된 α-NAOSH 중 어느 것도, NA2의 α-1,3-글리코시드 결합만을 가수분해하는 GH117A α-NABH의 NA2에 특화된 효소작용과는 대조적으로, NA2에 대한 기질 특이성을 나타내지 않았다는 점이 주목할 만하다.
일반적으로 Mg2+ 및 Na+의 존재에 의존하는 것으로 보고된 해양성 β-아가레이즈들 [An et al., 2018; Han et al., 2016; Xie et al., 2013]과는 달리, Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주 유래의 GH117A α-NABH 효소활성은 MgCl2 또는 NaCl에 의해 크게 영향을 받지 않았다. 대신에, GH117A α-NABH 효소활성은 Mn2+ 또는 환원제 TCEP의 존재 하에 농도 의존적으로 현저하게 향상되었다. GH117A α-NABH 효소활성에 대한 Mn2+ 및 TCEP의 시너지 효과가 관찰되어, 5mM MnSO4 및 10mM TCEP의 공존할 경우에는 효소활성이 2.4배까지 향상되는 것으로 나타났다. 동시에 NA2기질에 대한 GH117A α-NABH의 효소 반응속도 상수들인 Km, Vmax, Kcat 및 Kcat/Km 값은 각각 5.8mM, 33.7U/mg, 23.0s-1 및 4.0×103s-1·M-1인 것으로 나타났다 (데이터 생략). 이러한 연구결과는, GH117A α-NABH 효소 활성이 Mn2+/TCEP의 존재에 의해 농도 의존적으로 증진되는 것이 본 효소의 독특한 효소학적 특성임을 보여준다.
최적의 반응 조건 (5mM MnSO4, 10mM TCEP, 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 35℃)에서 GH117A α-NABH (40μg/ml) 효소는 최대 5.0% NA2를 단당류인 L-AHG와 D-갈락토오스로 완전히 가수분해할 수 있었다. GH117A α-NABH 효소 처리에 의해 NA2 기질로부터 생성된 L-AHG는, 효소반응물을 Sephadex G-10 컬럼을 이용하여 분자체 크로마토그래피를 수행하여 분획하였을 때, 쉽게 정제할 수 있었다. 이와 같은 방법으로 GH117A 효소 처리에 의해 얻을 수 있는 5% NA2의 가수분해물로부터 L-AHG를 정제하였을 때, L-AHG의 회수율은 이론적 최대 수율의 ~92%로 나타났다.
최근 다당류인 아가로오스로부터 구성 단당류인 L-AHG의 대량생산과 관련하여, 엑소형 β-아가레이즈에 의한 아가로오스 분해를 통한 NA2 생산 단계 및 뒤이은 GH117 α-NABH에 의한 NA2의 L-AHG 및 D-갈락토오스로의 가수분해 단계를 진행시키는 2단계 효소 공정이 제안된 바 있다 [Yun et al., 2013; Alkotaini et al., 2017]. 또한, β-아가레이즈와 α-NABH 효소를 공동-고정화한 후, 아가로오스를 L-AHG로 가수분해하는 데 활용하는 방법에 관해서도 보고된 바 있다 [Wang et al., 2018]. 그러나, 이러한 선행 연구에서 제안된 효소 처리 공정은, 사용된 효소들의 효소학적 특성으로 인해 개선되어야 할 비효율적인 면이 있는 것으로 보인다. 즉, 사용된 엑소형 β-아가레이즈는 아가로오스로 부터 NA2 외에도 여러 DPs의 NAOS를 생성했으며, 또한 사용된 GH117 α-NABH는 NA2에 특화된 효소가 아니라 NA4와 NA6에도 작용하여 각각 L-AHG/아가로트리오스 (A3) 및 L-AHG/아가로펜타오스 (A5)를 생성할 수 있어서 다당류인 아가로오스가 단당류인 L-AHG와 D-갈락토오스로 분해되는 효율이 저하되는 단점이 가진 효소였다.
따라서, 아가로오스로부터 NA2를 주된 생성물로 생산할 수 있는 효과적인 엑소형 GH50 β-아가레이즈 뿐만 아니라 NA2 기질에 대해서만 특이적으로 α-1,3-글리코시드 결합을 가수분해할 수 있는 NA2에 특화된 GH117 α-NABH의 개발이, 아가로오스의 효소적 당화를 통해 단당류를 생산하는 효율적인 효소 공정을 위해 절실하게 요구되는 실정이라 할 수 있다.
본 발명에서 개시된 GH117A β-NABH 효소 특성을 기반으로, NA2의 가수분해에 특화된 GH117A β-NABH를 사용한다면 NA2에서 L-AHG를 생성하는 1단계 효소 공정이 L-AHG 양산의 표준이 될 것이며, 또한 L-AHG 양산의 가속화에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다. 아울러 아가로오스를 NA2로 효율적으로 전환시킬 수 있는 강력한 엑소형 GH50A β-아가레이즈 [Kwon et al. 2020]와 GH117A α-NABH를 복합처리하는 방법 또한 L-AHG 생산을 위해 아가로오스를 당화시키는 공정으로 유용할 것으로 믿어진다.
4. 결론
본 발명의 결과는 한천 분해 Cellvibrio sp. KY-GH-1균주에서 유래한 재조합 GH117A α-NABH는 최대 5%의 NA2를 단당류인 L-AHG 및 D-갈락토오스로 완전히 가수분해할 수 있음을 보여준다. 기질인 NA2를 제외하고는 NA4~NA18들 중에서 어느 것도 GH117A α-NABH의 가수분해작용을 받지 않음을 확인하였으므로, 이를 통해 GH117A α-NABH효소작용은 NA2에 특화되어 있음을 밝혔다. 기질 NA2에 대한 GH117A α-NABH 효소의 가수분해작용의 최적 온도와 pH는 각각 35℃와 7.5였다. GH117A α-NABH 효소는 35℃까지, 그리고 pH 7.0~7.5범위에서는 안정한 반면, 35℃ 이상 및 pH 7.0~7.5 범위를 넘어서는 불안정한 것으로 나타났다. GH117A α-NABH 효소 활성은 5mM MnSO4 및 10mM TCEP의 존재 하에서 2.4배 향상되었다. NA2에 대한 GH117A α-NABH 효소의 반응속도 상수들, 즉 Km, Vmax, Kcat 및 Kcat/Km 값은 각각 16.0mM, 20.8U/mg, 14.2s-1 및 8.9×102s-1·M-1이었다. 특히, 5mM MnSO4 및 10mM TCEP의 공존할 경우에는, NA2 기질에 대한 GH117A α-NABH의 Km, Vmax, Kcat 및 Kcat/Km 값이 각각 5.8mM, 33.7U/mg, 23.0s-1 및 4.0×103s-1·M-1인 것으로 나타났다. 이러한 재조합 α-NABH의 효소학적 특성은 이당류인 NA2를 단당류인 L-AHG 및 D-갈락토오스로 분해시키는 1단계 효소공정을 통한 L-AHG의 대량 생산에 유용할 수 있음을 시사한다. 대안으로는 이러한 당화 과정을, 엑소형 가수분해 방식으로 아가로오스를 NA2로 효율적으로 분해할 수 있는 강력한 GH50 패밀리 β-아가레이즈와 병합하는 공정도 유용할 수 있음을 시사한다.
끝으로, GH117A α-NABH와 아미노산 서열에 있어서 76.5~97.5% 유사성을 공유하는 9개의 α-NABH들 중에서 76.8%의 유사성을 지닌 Vibrio sp. EJY3 균주 유래 GH117A α-NABH의 효소 특성 외에는 현재까지 조사된 바가 없으므로, 본 발명에서 개시하는 한천 분해 세균 Cellvibrio sp. KY-GH-1의 GH117A α-NABH 효소에 대한 연구결과들은, 다른 한천 분해 세균 유래이지만 GH117A α-NABH와 유사성을 지닌 α-NABH 효소들에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
<110> KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> GH117A ALPHA-NEOAGAROBIOSE HYDROLASE DERIVED FROM A NOVEL
AGAR-DEGRADING BACTERIUM AND PRODUCING METHOD OF L-AHG USING THE
SAME
<130> YP210009
<160> 6
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<210> 1
<211> 1092
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH117A alpha-NABH
<400> 1
atgggtgatc ttccagaaaa aaaattaagc aaagccagtc ttcgtgcaat tgagcgcggt 60
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aatgtagcat cc 1092
<210> 2
<211> 364
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH117A alpha-NABH
<400> 2
Met Gly Asp Leu Pro Glu Lys Lys Leu Ser Lys Ala Ser Leu Arg Ala
1 5 10 15
Ile Glu Arg Gly Tyr Asp Gln Lys Asn Ala Asp Trp Val Phe Glu Phe
20 25 30
Asp Val Lys Pro Leu Gly Gly Asp Phe Ala Tyr Gln Glu Gly Val Ile
35 40 45
Arg Arg Asp Pro Ser Ala Val Ile Phe Val Asp Gly Leu Tyr His Val
50 55 60
Trp Tyr Thr Lys Gly Glu Gly Glu Thr Val Gly Phe Gly Ser Ala Asn
65 70 75 80
Pro Glu Asp Lys Val Phe Pro Trp Asp Lys Thr Glu Val Trp His Ala
85 90 95
Thr Ser Ser Asp Gly Trp Asp Trp Lys Glu Gln Gly Ala Ala Ile Val
100 105 110
Ala Gly Ala Pro Gly Ser Tyr Asp Asp Arg Ala Val Phe Thr Pro Glu
115 120 125
Val Leu Ala His Glu Gly Arg Tyr Tyr Leu Val Tyr Gln Thr Val Lys
130 135 140
Ala Pro Tyr Leu Asn Arg Thr Lys Glu Cys Ile Ala Leu Ala Ser Ala
145 150 155 160
Asp Ser Pro Tyr Gly Pro Trp Val Lys Ser Pro Ala Pro Ile Leu Thr
165 170 175
Pro Ala Asp Asn Gly Val Trp Asp Gly Asp Glu Asp Asn Arg Phe Asn
180 185 190
Cys Lys Ile Arg Gly Asp Phe Asp Ser His Lys Val His Asp Pro Cys
195 200 205
Leu Met Phe Tyr Gln Asn Lys Phe Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Glu Ile
210 215 220
Met Gly Glu Arg Met Asn Phe Gly Gly Arg Glu Ile Lys His Gly Val
225 230 235 240
Ala Ile Ala Asp Lys Ile Glu Gly Pro Tyr Val Lys Ser Glu Phe Asn
245 250 255
Pro Ile Thr Asn Ser Gly His Glu Val Val Val Trp His Val Asn Gly
260 265 270
Gly Ile Ala Ser Leu Leu Thr Thr Asp Gly Pro Glu Lys Asn Thr Cys
275 280 285
Gln Trp Ser Pro Asp Gly Ile Asn Phe Asp Ile Met Ala His Ile Lys
290 295 300
Gly Ala Pro Glu Ala Leu Gly Leu Tyr Arg Asp Pro Ala Ala Asp Ile
305 310 315 320
Gln Asp Pro Met Ala Gly Leu Ala Trp Gly Leu Cys His Lys Tyr Asp
325 330 335
Ser Ser Trp Asn Trp Asn Tyr Ile Cys Arg Phe Lys Thr Arg Arg Gln
340 345 350
Ile Leu Asp Pro Gly Thr Phe Gln Asn Val Ala Ser
355 360
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH117A alpha-NABH Nde1 forward primer
<400> 3
cgcatatggg tgatcttcca gaaaa 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH117B alpha-NABH Nde1 forward primer
<400> 4
gacatatgag cgaccaagat tctg 24
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH117A alpha-NABH Xho1 reverse primer
<400> 5
aactcgaggg atgctacatt ctgaaagg 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH117B alpha-NABH Xho1 reverse primer
<400> 6
ggctcgagtg gattggattt tctagctt 28
Claims (10)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 1을 포함하는 지에이치117 에이 α-네오아가로비오스 가수분해효소(GH117 A α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH)를 Mn2+의 존재 하에 네오아가로비오스(neoagarobiose, NA2)에 처리하여 효소적 분해시키는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose, L-AHG)의 생산 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 처리는 25~45℃의 온도 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose, L-AHG)의 생산 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 처리는 pH 6.0~10.0의 pH 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose, L-AHG)의 생산 방법.
- 삭제
- 제 5항에 있어서, 상기 Mn2+는 MnCl2, MnSO4 또는 이들의 혼합물의 형태인 것을 특징으로 하는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose, L-AHG)의 생산 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 처리는 트리스(2-카복시에틸)-포스핀(Tris(2-carboxyethyl)-phosphine, TCEP)을 더 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose, L-AHG)의 생산 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210148524A KR102644347B1 (ko) | 2021-11-02 | 2021-11-02 | 신규한 한천 분해 세균 유래의 ＧＨ１１７Ａ α네오아가로비오스 가수분해효소 및 이를 이용한 ＬＡＨＧ의 생산 방법 |
| PCT/KR2022/004631 WO2023080357A1 (ko) | 2021-11-02 | 2022-03-31 | 신규한 한천 분해 세균 유래의 GH117A α-네오아가로비오스 가수분해효소 및 이를 이용한 L-AHG의 생산 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210148524A KR102644347B1 (ko) | 2021-11-02 | 2021-11-02 | 신규한 한천 분해 세균 유래의 ＧＨ１１７Ａ α네오아가로비오스 가수분해효소 및 이를 이용한 ＬＡＨＧ의 생산 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230063443A KR20230063443A (ko) | 2023-05-09 |
| KR102644347B1 true KR102644347B1 (ko) | 2024-03-07 |
Family
ID=86241188
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210148524A KR102644347B1 (ko) | 2021-11-02 | 2021-11-02 | 신규한 한천 분해 세균 유래의 ＧＨ１１７Ａ α네오아가로비오스 가수분해효소 및 이를 이용한 ＬＡＨＧ의 생산 방법 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102644347B1 (ko) |
| WO (1) | WO2023080357A1 (ko) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6074788B2 (ja) * | 2012-05-30 | 2017-02-08 | 株式会社コーセー | ３，６−アンヒドロ−ｌ−ガラクトース生成酵素 |
-
2021
- 2021-11-02 KR KR1020210148524A patent/KR102644347B1/ko active IP Right Grant
-
2022
- 2022-03-31 WO PCT/KR2022/004631 patent/WO2023080357A1/ko unknown
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JANG, W. Y. et al, 'A Novel Neoagarobiose-Specific GH117A α-NABH from a Freshwater Agar-Degrading Bacterium Cellvibrio sp. KY-GH-1', KMB 2020 47th Annual Meeting & International Symposidum, p470-486 (* |
| NCBI Reference sequence : WP_151030819(2019.12.29.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023080357A1 (ko) | 2023-05-11 |
| KR20230063443A (ko) | 2023-05-09 |
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