KR101919104B1 - 가야도모나스 주비니에게 G7 유래 신규 베타-아가레이즈 AgaJ9 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가야도모나스 주비니에게 G7 유래 신규 베타-아가레이즈 AgaJ9 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 가야도모나스 주비니에게 G7으로부터 동정되어 이종균주에서 과발현이 가능하며 아가로오스를 분해하여 네오아가로올리고당을 생성할 수 있고 낮은 온도에서도 효소활성을 나타내는 신규 베타-아가레이즈 AgaJ9 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 베타-아가레이즈는 아가로오스를 저분자로 분해하는데 매우 효과적일 뿐만 아니라 산업상 매우 유용한 네오아가로올리고당(네오아가로바이오스, 네오아가로테트라오스, 네오아가로헥사오스 등)으로 분해할 수 있으며, 특히 낮은 온도에서도 이러한 활성을 높게 유지할 수 있는 독특한 특성이 있다. 또한 이종숙주세포를 사용한 과발현 시스템을 통해 대량생산이 가능하기 때문에 다양한 산업 분야에서 매우 유용할 것이다.

Description

가야도모나스 주비니에게 G7 유래 신규 베타-아가레이즈 AgaJ9 및 이의 이용{A Novel beta-agarase AgaJ9 from Gayadomonas joobiniege G7 and use thereof}

본 발명은 가야도모나스 주비니에게 G7 유래 신규 베타-아가레이즈 AgaJ9 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 가야도모나스 주비니에게 G7으로부터 동정되어 이종균주에서 과발현이 가능하며 아가로오스를 분해하여 네오아가로올리고당을 생성할 수 있고 낮은 온도에서도 효소활성을 나타내는 신규 베타-아가레이즈 AgaJ9 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.

아가(agar)는 Gelidium, Gracilariais, 및 Gelidiella와 같은 홍조류(red algae)의 세포벽을 구성하는 주요성분이며, 아가로바이오스(agarobiose)와 포르피로바이오스(porphyrobiose)의 이성 다당류로 이루어진다(Chi et al., 2012; Duckworth and Yaphe, 1972). 아가로바이오스는 β-1, 4 연결 D-갈락토오스(D-galactose)와 α-1, 3 연결 3,6-무수-α-L-갈락토오스(3,6-anhydro-α-L-galactose)의 선형사슬인 반면(Chi et al., 2012), 포르피로바이오스는 β-1, 4 연결 D-갈락토오스와 α-1, 3 연결 L-갈락토오스-6-설페이트(L-galactose-6-sulfate)로 이루어진다(Hehemann et al., 2010; Morrice et al., 1983).

몇몇 아가-분해 박테리아가 해양, 토양, 식물뿌리와 같은 다양한 환경에서 동정된바 있으며(Chi et al., 2012; Hosoda and Sakai, 2006; Hosoda et al., 2003), 이들 박테리아의 아가레이즈(agarase)에 의해 아가가 특이적으로 가수분해될 수 있다(Chi et al., 2012). 아가레이즈는 작용기작을 기초로 α-아가레이즈(EC 3.2.1.158), β-아가레이즈(EC 3.2.1.81), β-포르피란네이즈(β-porphyrannase)(EC 3.2.1.-)의 3가지 그룹으로 나뉠 수 있다(Chi et al., 2012). α-아가레이즈는 3,6-무수-α-L-갈락토오스와 D-갈락토오스 사이의 α-1, 3 연결을 가수분해하여 환원말단으로 3,6-무수-α-L-갈락토오스를 갖는 아가로올리고당(agarooligosaccharide)을 생성하고, β-아가레이즈는 아가로오스(agarose)의 D-갈락토오스와 3,6-무수-α-L-갈락토오스의 β-1, 4 연결을 잘라 환원말단으로 D-갈락토오스를 갖는 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide)을 생성한다(Araki, 1959; Chi et al., 2012). β-포르피란네이즈는 D-갈락토오스와 L-갈락토오스-6-설페이트의 β-1, 4 연결을 잘라 환원말단으로 D-갈락토오스를 갖는 올리고당을 생성한다(Hehemann et al., 2010).

Carbohydrate-Active enZYmes(CAZY) 데이터베이스(http://www.cazy.org)의 글리코시드 가수분해효소(glycoside hydrolase, GH)의 기능적인 분류에 따르면, α-아가레이즈는 GH96 패밀리에 속한다(Chi et al., 2014). 오직 두 가지 α-아가레이즈 만이 Thalassomonas sp. JAMB-A33(Ohta et al., 2005)과 Alteromonas agalyticus GJ1B(Hassairi et al., 2001; Potin et al., 1993)의 두 종류의 해양 박테리아에서 동정되었다. 이와 유사하게 GH16 패밀리에 속하는 오직 두 가지 β-포르피란네이즈 만이 Zobella galactanivorans에서 동정되었다(Hehemann et al., 2010). 반면 β-아가레이즈는 Alteromonas(Chi et al., 2014), Pseudoalteromonas(Park et al., 2015), Vibrio(Liao et al., 2011), Agarivorans(Liu et al., 2014), Cohnella(Li et al., 2015a), Catenovulum(Cui et al., 2014), Stenotrophomonas(Zhu et al., 2016), Streptomyces(Temuujin et al., 2012; Temuujin et al., 2011)과 같은 몇몇 분류학적으로 다양한 속(genus)에서 동정되었고, 이들 효소는 GH16, GH50, GH86, GH118의 4가지 별개의 패밀리에 속한다(Chi et al., 2012).

본 발명자는 해조류 유래 아가로올리고당을 보다 유용하게 이용할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였으며, 특히 이러한 아가로올리고당을 특이적으로 분해하여 유용한 형태의 당을 생산할 수 있는 미생물 및 관련 효소를 발굴하기 위하여 노력하였다. 또한 해양 미생물 자원으로부터 특이적인 성질의 새로운 아가로올리고당 분해효소를 발굴함으로써 산업적으로 유용하게 사용할 수 있도록 하고자 하였다. 이의 결과, 우리나라 가야섬의 연안 바닷물에서 분리된 가야도모나스 주비니에게 G7(Gayadomonas joobiniege G7) 균주로부터 신규한 β-아가레이즈 및 이의 유전자를 동정하고, 이의 재조합 효소를 대량생산할 수 있는 방법을 구축하였으며, 생산된 효소를 이용하여 유용한 네오아가로올리고당을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 낮은 온도에서도 효소활성을 갖는 특이적인 성질이 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

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따라서 본 발명의 주된 목적은 가야도모나스 주비니에게 G7(Gayadomonas joobiniege G7) 균주로부터 유래한 신규한 베타-아가레이즈를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 베타-아가레이즈를 암호화하는 유전자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 베타-아가레이즈를 생산하기 위한 재조합 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 베타-아가레이즈를 생산하기 위한 형질전환체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 베타-아가레이즈를 대량생산하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 베타-아가레이즈를 이용한 네오아가로올리고당 생산방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 베타-아가레이즈를 이용한 아가로오스 분해방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 베타-아가레이즈(beta-agarase)를 제공한다.

본 발명의 베타-아가레이즈는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 베타-아가레이즈를 암호화하는 베타-아가레이즈(beta-agarase) 유전자를 제공한다.

본 발명의 베타-아가레이즈 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 베타-아가레이즈 유전자를 함유하는 베타-아가레이즈(beta-agarase) 생산용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 베타-아가레이즈 생산용 재조합 벡터로 형질전환된 베타-아가레이즈(beta-agarase) 생산용 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하고 상기 베타-아가레이즈 유전자를 과발현시키는 것을 특징으로 하는 베타-아가레이즈(beta-agarase) 대량생산방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 베타-아가레이즈를 아가로오스(agarose)와 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 생산방법을 제공한다.

본 발명의 네오아가로올리고당 생산방법에 있어서, 상기 네오아가로올리고당은 네오아가로바이오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)로 이루어진 군 중에서 선택된 네오아가로올리고당일 수 있다.

본 발명의 네오아가로올리고당 생산방법에 있어서, 상기 효소반응이 pH 4 내지 8에서 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 네오아가로올리고당 생산방법에 있어서, 상기 효소반응이 5 내지 30℃에서 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 베타-아가레이즈를 아가로오스(agarose)와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 아가로오스 분해방법을 제공한다.

본 발명의 아가로오스 분해방법에 있어서, 상기 효소반응이 pH 4 내지 8에서 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 아가로오스 분해방법에 있어서, 상기 접촉이 5 내지 30℃에서 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 베타-아가레이즈를 포함하여 이루어지는 DNA가 함유된 아가로오스 겔(agarose gel)로부터 DNA를 추출하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 베타-아가레이즈는 아가로오스를 저분자로 분해하는데 매우 효과적일 뿐만 아니라 산업상 매우 유용한 네오아가로올리고당(네오아가로바이오스, 네오아가로테트라오스, 네오아가로헥사오스 등)으로 분해할 수 있으며, 특히 낮은 온도에서도 이러한 활성을 높게 유지할 수 있는 독특한 특성이 있다. 또한 이종숙주세포를 사용한 과발현 시스템을 통해 대량생산이 가능하기 때문에 다양한 산업 분야에서 매우 유용할 것이다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 베타-아가레이즈(AgaJ9)를 SDS-PAGE 겔 상에서 분리한 것과 자이모그램 분석 결과이다. (a) 재조합 벡터인 pHis-AgaJ9를 함유하는 E. coli ER2566에서 AgaJ9을 과발현하고, metal affinity 및 gel filtration chromatography를 사용하여 정제한 다음 5분간 끓이고 SDS-PAGE 겔 상에서 분리한 것이다. Lane M, size marker; lane 1, 1mM IPTG를 사용한 발현유도 이전 pHis-AgaJ9를 함유하는 E. coli ER2566의 cell extract; lane 2, 발현유도 이후 pHis-AgaJ9를 함유하는 E. coli ER2566의 cell extract; lane 3, metal affinity chromatography로 정제한 AgaJ9; lane 4, gel filtration chromatography로 정제한 AgaJ9. (b) 정제된 AgaJ9의 SDS-PAGE 및 자이모그램 분석결과이다. 정제된 AgaJ9를 0.3% agarose 함유 10% polyacrylamide gel 상에 로딩하고, 전기영동 및 효소반응 이후 겔을 Coomassie brilliant blue 용액(lane 1) 또는 Lugol's iodine 용액(lane 2)으로 염색한 것이다.
도 2는 gel filtration chromatography를 통해 AgaJ9의 분자량을 결정한 실험결과이다. (a) 정제된 AgaJ9의 gel filtration chromatography이다. AgaJ9 단백질 400㎍ 함유 샘플을 Superose 12 10/300 GL column 상에 주입하였고, gel filtration은 0.5㎖/min의 유속으로 수행하였고, 용출 프로파일을 흡광도 280nm에서 모니터하였다. 1번 피크, AgaJ9의 이합체 형태; 2번 피크, AgaJ9의 단량체 형태. (b) Superose 12 10/300 GL column 상에서 수행한 AgaJ9와 size marker 단백질의 gel filtration chromatography이다. a, β-amylase(200kDa); b, yeast alcohol dehydrogenase(150kDa); c, bovine serum albumin(66kDa); c, bovine carbonic anhydrase(29kDa). 비교를 위해 AgaJ9의 이합체 및 단량체 용출 피크의 위치를 각각 1, 2 화살표로 표시하였다.
도 3은 AgaJ9의 활성 상에서 pH, 온도 및 금속 이온이 미치는 영향을 실험한 결과이다. (a) 37℃ 및 다양한 pH 조건에서 효소활성을 실험한 것이다. 다이아몬드, 3 ~ 6(10mM sodium citrate); 사각형, 6 ~ 7(10mM MOPS); 삼각형, 7 ~ 9(10mM Tris-HCl); 원형, 9 ~ 10(10mM Glycine-NaOH). (b) 10mM sodium citrate buffer(pH 5) 및 5 ~ 60℃ 온도 범위에서 AgaJ9의 아가레이즈 활성을 실험한 것(다이아몬드) 및 5 ~ 60℃의 온도 범위에서 30분간 전처리한 다음 확인된 최적 조건(25℃, pH 5)에서 온도 안정성을 실험한 결과이다(사각형). (c) 최종농도 5mM로 다양한 금속 이온(KCl₂, ZnCl₂, CuCl₂, CaCl₂, MnCl₂, NiCl₂, NaCl₂, KCl₂, CoCl₂ 및 FeCl₂) 또는 EDTA가 함유된 10mM sodium citrate buffer(pH 5) 및 25℃에서 AgaJ9의 활성을 실험한 결과이다.
도 4는 AgaJ9의 이합체(흰색 막대그래프) 및 단량체(검은색 막대그래프)의 생화학적 특성을 비교한 실험결과이다. AgaJ9의 이합체 및 단량체 형태의 아가레이즈 활성에서 pH(a), 온도(b), 및 금속 이온(c)에 따른 효과를 DNS 방법을 사용하여 실험한 것이다.
도 5는 동역학적 계수를 결정한 실험결과이다. Reciprocal Lineweaver-Burk plot을 사용하여 아가로오스에 작용하는 AgaJ9의 이합체(a) 또는 단량체(b) 형태의 동역학적 계수를 결정하였다. 모든 데이터는 적어도 2회 반복 실험의 평균값으로 나타냈다.
도 6은 AgaJ9에 의한 가수분해산물의 분석 실험결과이다. (a) AgaJ9의 효소반응은 30℃, 0.5% 아가로오스를 함유하는 20mM sodium citrate buffer(pH 5)에서 수행하였고, 점성도는 0 ~ 60분의 다양한 반응시간 범위에서 DV2T viscometer를 사용하여 측정하였다. (b) 반응시간에 따른 아가로오스 가수분해산물의 TLC 분석 결과이다. 효소반응은 25℃, 24시간, 0.1% 아가로오스를 함유하는 10mM sodium citrate buffer(pH 5)에서 수행하였다. 가수분해산물은 silica gel 60 TLC plate 상에서 분석하였다. (c) 기질로 다양한 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide)을 사용하여 AgaJ9의 효소반응을 실험한 결과이다. 25℃, 24시간 동안 다양한 네오아가로올리고당과 반응시킨 후 반응산물을 silica gel 60 TLC plate 상에서 분리하였다. NA2, 네오아가로바이오스(neoagarobiose); NA4, 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose); NA6, 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose).
도 7은 AgaJ9에 의해 아가로오스 겔로부터 DNA를 회수한 결과이다. (a) AgaJ9에 의한 DNA 회수를 테스트하기 위해 1.3kb의 선형의 DNA 산물(대장균에 존재하는 특정 유전자 PCR 산물)을 이용하였다. 0.5% 아가로오스 겔에 삽입된 DNA를 AgaJ9(lane 1) 또는 증류수(lane 2)와 상온에서 밤새 반응시켰다. 에탄올 침전 이후, 추출된 DNA를 0.5% 아가로오스 겔 상에서 전기영동하여 분석하였다. (b) 1% 아가로오스 겔에 삽입된 800ng의 pET24a plasmid DNA를 AgaJ9(lane 1) 또는 증류수(lane 2)와 상온에서 1시간 반응시켰다. 에탄올 침전 이후, 추출된 DNA를 전기영동하여 분석하였다.

본 발명의 베타-아가레이즈는 가야도모나스 주비니에게 G7(Gayadomonas joobiniege G7)으로부터 유래된 효소로 서열번호 1의 1182개 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본래 가야도모나스 주비니에게 G7에서는 서열번호 2와 같이 시그널 펩티드(signal peptide)(서열번호 2의 1 ~ 23번 아미노산)가 포함되어 있는 형태로 발현되며, 세포 외부로 분비될 때 이 시그널 펩티드가 잘려 서열번호 1과 같은 성숙한 형태가 되는 것으로 판단된다. 이 시그널 펩티드는 베타-아가레이즈가 3차 구조를 형성하고 본래의 활성을 나타내는데 영향을 미치지 않으므로, 포함될 수도 있고 제외될 수도 있다.

본 발명의 베타-아가레이즈는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열이 부가된 모든 펩타이드를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 정제의 용이성을 위해 다수개의 히스티딘(Histidine)을 N-말단 또는 C-말단에 부가한 형태일 수 있다(서열번호 3 참조).

본 발명의 베타-아가레이즈의 근원인 가야도모나스 주비니에게 G7은 우리나라 가야섬의 연안 바닷물에서 분리된 균주로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 KCTC23721로, 미국균주은행(American Type Culture Collection, ATCC)에 ATCC BAA-2321로, 독일균주은행(Deutsche Sammlung von Microorganismund Zellkulturen Gmb H, DSM)에 DSM25250로 기탁되어 있다.

본 발명의 베타-아가레이즈 유전자의 염기서열은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 서열번호 4의 염기서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 4의 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있다.

가야도모나스 주비니에게 G7 균주로부터 확인된 본래의 염기서열은 서열번호 4의 염기서열이지만, 발현을 위한 숙주의 종류에 따라 적합한 코돈 서열로 변형하여 적용할 수 있다.

본 발명의 베타-아가레이즈 생산용 재조합 벡터는 상기와 같은 베타-아가레이즈 유전자를 함유하여 이루어진다. 이때 벡터는 숙주세포의 종류 또는 프로모터, 선별마커 등을 고려하여 기존에 알려진 다양한 종류의 벡터 중에서 선택하여 적용할 수 있다. 예를 들어 대장균(Escherichia coli)을 숙주로 이용할 경우 pET 시리즈의 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명의 베타-아가레이즈 생산용 형질전환체는 상기와 같은 재조합 벡터를 숙주생물체에 도입하여 제조될 수 있다. 이때 숙주로는 다양한 생물체를 이용할 수 있을 것으로 판단되며, 베타-아가레이즈의 안정적인 발현 또는 생산 효율을 위해 미생물을 이용하는 것이 보다 바람직할 것이다. 본 발명에 따르면 본 발명의 베타-아가레이즈 유전자가 대장균의 발현시스템에서도 매우 원활하게 발현될 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서 대장균을 숙주로 이용하여 형질전환체를 제조하면 베타-아가레이즈을 매우 용이하게 생산할 수 있다. 숙주생물체의 형질전환은 각 숙주생물체에 이용되고 있는 통상의 형질전환방법을 적용하여 상기 재조합 벡터를 숙주생물체에 도입하는 방법으로 달성할 수 있다.

본 발명의 베타-아가레이즈 대량생산은 상기 형질전환체를 배양하고 상기 베타-아가레이즈 유전자를 과발현시키는 방법으로 달성할 수 있다. 이때 배양배지의 종류, 배양온도, 배양시간 등의 조건은 숙주 및 벡터의 종류에 따라 선택적으로 적용할 수 있다. 예를 들어 숙주가 대장균이고 pET28 시리즈의 벡터를 이용하는 경우, LB(Luria Bertani) 배지에서 약 15 ~ 40℃로 12시간 ~ 5일간 배양하는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 베타-아가레이즈는 endo-작용성 β-아가레이즈 활성이 있어, 아가로오스와 효소반응하여 네오아가로올리고당을 생성할 수 있다. 반응 초기에는 아가로오스를 네오아가로바이오스(neoagarobiose; NA2), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose; NA4), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose; NA6) 및 미량의 NA6보다 큰 네오아가로올리고당(neooligosaccharide)으로 분해할 수 있으며, 오랜 시간 반응시키면 아가로오스를 최종적으로 NA2 및 NA4로 분해할 수 있다. 따라서 반응시간의 조절을 통해 상기와 같은 다양한 네오아가로올리고당을 생산할 수 있다.

본 발명의 베타-아가레이즈는 pH 3 내지 10에 걸쳐서, 그리고 5 내지 45℃에 걸쳐 효소활성을 나타낼 수 있다. 따라서 이러한 pH 범위와 온도 범위에서 상기와 같은 효소반응을 수행할 수 있으나, 효소활성을 높여 반응생성물의 생산효율을 높이기 위해서는 pH 4 내지 8 및 5 내지 30℃에서 효소반응이 이루어지도록 하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 pH 5 내지 7, 5 내지 30℃가 좋을 것이다.

상기와 같이 본 발명의 베타-아가레이즈는 고분자의 아가로오스를 상대적으로 저분자 형태인 네오아가로올리고당으로 효과적으로 분해할 수 있다. 따라서 아가로오스를 분해하기 위한 용도로도 유용하게 활용될 수 있다. 이때의 바람직한 조건은 상기 네오아가로올리고당의 생산을 위한 조건과 동일할 것이다.

아가로오스를 분해하는 활성은 아가로오스를 이용한 DNA 또는 RNA와 같은 분자의 전기영동 이후 아가로오스 겔로부터 이들 분자를 회수하는데 유용하게 활용될 수 있다. 따라서 본 발명의 베타-아가레이즈를 아가로오스 겔로부터 DNA를 추출하기 위한 키트, 예를 들어 DNA gel extraction kit 등에 이용할 수 있다. 이때 키트에는 본 발명의 베타-아가레이즈 이외에도 DNA 추출 시 필요한 시약 또는 기구 등이 추가로 포함될 수 있을 것이다.

기존에 GH39 패밀리에 속하는 몇몇 β-xylosidase가 보고된 바 있으나, 이 패밀리에 속하는 아가레이즈는 아직까지 보고된 바 없다. 그러므로 본 발명의 베타-아가레이즈가 처음으로 보고되는 GH39 패밀리 베타-아가레이즈라 할 수 있다. 또한 본 발명의 베타-아가레이즈는 기존의 다른 베타-아가레이즈에 비해 낮은 온도에서도 우수한 효소활성을 갖는다는 점에서 특이성이 있다. 5℃에서 조차 약 80%나 되는 효소활성이 있을 정도이다. 그리고 pH 4 ~ 3에서도 70 ~ 30%의 효소활성이 있어 산성 조건 하에서도 작용할 수 있다.

이러한 독특한 특성은 낮은 온도에서 endo-작용성 β-아가레이즈 활성이 요구되는 공정에 매우 유용할 것이며, 아가로오스의 저분자화가 필요하거나 네오아가로올리고당이 요구되는 다양한 산업분야에서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1.

1-1. 재료 및 방법

1-1-1. 균주 및 배양 조건

pET-28a 플라스미드를 클로닝 및 E. coli strain ER2566에서의 발현을 위해 사용하였다. E. coli는 LB 배지에서 37℃로 배양하였고, 필요시 Kanamycin(50㎍/㎖)을 첨가하였다.

1-1-2. 아가레이즈 유전자 agaJ9 의 클로닝

가야도모나스 주비니에게 G7(Gayadomonas joobiniege G7)(KCTC23721) 게놈 DNA로부터 Forward primer(5′- AACTGCCATATGGGTGACAGAAACCGAAATTAA -3′, 밑줄친 부분은 NdeI 인식부위)(서열번호 5)와 Reverse primer(5′-AACTGCCTCGAGGCGGCTTGCGCCGCTTGAGCT-3′, 밑줄친 부분은 XhoI 인식부위)(서열번호 6)를 이용하여 PCR을 통해 분비 시그널 펩타이드(서열번호 2의 1 ~ 23번 아미노산)로 여겨지는 부위가 결핍된 AgaJ9을 암호화하는 3618bp의 유전자 단편을 증폭하였다. 증폭 반응은 Q-Cycler(Quanta Biotech, England)를 사용하여 95℃에서 5분 이후 95℃ 20초, 55℃ 20초, 72℃ 1분/kb을 40사이클 반복하고, 72℃ 5분 최종 연장하는 방법으로 수행하였다.

증폭된 DNA단편을 NdeI-XhoI 제한효소로 이중절단하고 pET-28a의 NdeI-XhoI 제한효소부위에 접합하여 아가레이즈 N-말단에 His-tag가 포함되어 발현되는 pHis-AgaJ9(AgaJ9 암호화 유전자 발현벡터)를 제작하였다.

1-1-3. 재조합 AgaJ9의 발현 및 정제

제작된 pHis-AgaJ9으로 E. coli ER2566을 형질전환하여 AgaJ9을 생산하기 위한 형질전환체를 제작하였다.

이 형질전환체를 배양액의 OD₆₀₀이 0.5가 될 때까지 LB 배지에서 37℃로 배양한 뒤, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside(IPTG)를 최종농도 0.1mM로 첨가하여 단백질 발현을 유도하고, 30℃에서 3시간 더 배양하였다. 배양된 균체를 회수하고 binding buffer(50mM Tris-HCl (pH8.0), 300mM NaCl)에 재현탁한 다음, French pressure cell에 10,000 p.s.i.로 2회 통과시켰다. 15,000rpm으로 4℃ 15분간 원심리하여 남아있는 세포 및 세포 파쇄물을 제거하였다. 용해성 부분인 상등액을 BD TALON^TM metal affinity resin 상에 로딩한 다음 200mM imidazole을 함유하는 binding buffer로 resin에 결합한 단백질을 용출하였다. HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column을 사용한 gel filtration chromatography로 용출된 단백질을 정제(Lee et al., 2013)하여 imidazole이 제거된 균질한 단백질을 수득하였다.

Coomassie brilliant blue 염색을 사용한 SDS-PAGE를 통해 준비된 단백질의 순도를 확인하고, Bradford assay(Zor and Selinger, 1996)를 통해 최종 농도를 결정하였다.

1-1-4. Gel filtration chromatography를 통한 AgaJ9의 분자량 결정

Gel filtration chromatography를 이용하여 정제된 AgaJ9의 분자량을 결정하였다. Gel filtration chromatography는 AKTA-FPLC system(GE Healthcare Life Sciences, USA)에서 100mM NaCl을 함유하는 50mM Tris-HCl(pH 8.0)로 평형화한 Superose 12 10/300 GL column을 사용하여 수행하였다. Gel filtration은 상온에서 0.5㎖/min의 유속으로 수행하였고, 단백질 용출을 280nm에서 모니터하였다. Column은 size marker(Sigma-Aldrich, USA)(beta-amylase(200kDa), yeast alcohol dehydrogenase(150kDa), bovine serum albumin(66kDa) 및 bovine carbonic anhydrase(29kDa))를 사용하여 검정하였다.

1-1-5. Dinitrosalicylic acid 방법을 통한 아가레이즈 분석 및 AgaJ9의 생화학적 특성 분석

3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) 방법(Park et al., 2015)을 사용하여 생성되는 환원당 당량을 측정하는 방법으로 아가레이즈 활성을 표준분석하였다.

20㎖의 효소용액(정제된 AgaJ9)에 0.2% 아가로오스(agarose)가 함유된 10mM sodium citrate buffer(pH 5) 500㎖을 혼합하고 30℃에서 30분간 반응시킨 다음 반응샘플에 DNS reagent solution(DNS 6.5g, 2N NaOH 325㎖, glycerol 45㎖ / 1ℓ 증류수)을 첨가하고, 100℃에서 10분간 끓인 후 얼음물에서 2분간 식혔다. 환원당의 양을 대조군(효소용액 대신 증류수를 대조군으로 사용)에 대한 540nm OD값으로 측정하였다.

37℃에서 다양한 pH 조건으로 아가레이즈 활성을 측정하여 최적 pH 조건을 조사하였다. pH 3 ~ 6의 조건은 10mM sodium citrate 완충액, pH 6 ~ 7의 조건은 10mM MOPS 완충액, pH 7 ~ 9는 10mM Tris-HCl 완충액, pH 9 ~ 10의 조건은 10mM Glycine-NaOH 완충액을 이용하였다.

10mM sodium citrate buffer(pH 5)에서 5 ~ 60℃의 온도 범위로 아가레이즈 활성을 측정하여 최적 온도 조건을 조사하였다.

온도 안정성은 5 ~ 60℃의 온도 범위에서 30분간 전-반응시킨 다음 결정된 최적 조건(25ㅀC pH 5) 하에서 조사하였다.

AgaJ9 활성에 대한 금속이온의 효과는 10mM sodium citrate buffer(pH 5)에 최종농도 5mM로 다양한 금속이온(KCl₂, ZnCl₂, CuCl₂, CaCl₂, MnCl₂, NiCl₂, NaCl₂, KCl₂, CoCl₂ 및 FeCl₂) 또는 EDTA를 함유시켜 30℃에서 측정하였다.

1-1-6. 동역학적 계수 결정

결정된 최적 조건(25℃ pH 5)에서 아가로오스의 양을 0.1 ~ 8㎎/㎖ 범위로 다양하게 하여 정제된 AgaJ9의 Km 및 Vmax 동역학적 계수를 결정하였다. 10mM sodium citrate buffer(pH 5) 중의 샘플을 5% 이하로 기질 이용효율을 제한하기에 적합한 조건인 25℃에서 10분간 반응시켰다(Segel, 1976). Km 및 Vmax 값은 Lineweaver-Burk plot으로부터 계산하였다.

1-1-7. SDS-PAGE 상에서 AgaJ9의 활성 분석을 위한 자이모그램 분석

끓이지 않은 AgaJ9 단백질 샘플을 0.3% 아가로오스를 함유하는 10% polyacrylamide gel 상에 로딩하고 전기영동한 다음 gel을 2% Triton X-100에 30분간 담그고 20mM Tris-HCl(pH 8)로 2번 세척하였다. 20mM sodium citrate buffer(pH 5) 및 25℃에서 밤새 반응시키고, gel을 Lugol's iodine solution으로 염색하였다.

1-1-8. 점성도 측정

AgaJ9의 유동성 점도를 DV2T viscometer(Brookfield AMETEK, USA)를 사용하여 조사하였다. 효소반응은 0.5% 아가로오스가 함유된 20mM sodium citrate buffer(pH 5) 및 30℃에서 수행하였다. 0 ~ 60분 범위의 다양한 반응 시간 범위에서 측정하였다.

1-1-9. 반응산물의 Thin-layer chromatography(TLC) 분석

정제된 AgaJ9를 10mM sodium citrate buffer(pH 5) 및 25℃에서 0.1% 아가로오스 또는 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharides)과 반응시켰다. 끓는 물에 5분간 담그는 방법으로 효소반응을 멈추고 얼음에서 5분간 식힌 다음 반응샘플을 Silica Gel 60 plate(Merck, USA)에 로딩하였다. n-butanol, acetic acid 및 물의 혼합액(2:1:1, v/v/v)으로 전개시킨 다음 20% H₂SO₄ 메탄올 용액을 스프레이하고 120℃로 2분간 열처리하여 분리된 산물을 가시화하였다.

1-2. 결과

1-2-1. 아가레이즈 암호화 유전자의 동정

가야도모나스 주비니에게 G7이 높은 아가 분해 활성을 나타내었기 때문에, 게놈 상에서 베타-아가레이즈를 암호화하는 것으로 예상되는 유전자를 탐색하였다. 1205개의 아미노산으로 구성되는 가야도모나스 주비니에게 G7의 yjdB 유전자가 4.97 × e^-4의 E-value를 나타내어 GH39 패밀리에 속하는 베타-아가레이즈로 예상되었다. BLAST를 사용한 서열비교분석 결과, 이 단백질은 비-해양 아가분해 미생물인 Cellvibrio sp. OA-2007의 동정된 베타-아가레이즈(GenBank accession No. BAG48880)(Ariga et al., 2012)와 42% 상동성(60% 유사성)을 나타내고, Catenovulum agarivorans DS-2의 베타-아가레이즈로 추정되는 단백질(GenBank accession No. EWH10720)(Shan et al., 2014)과 47% 상동성(66% 유사성)을 나타내었다. SignalP 프로그램(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)을 기초로 YjdB가 N-말단 시그널 펩타이드(1 ~ 23번 아미노산)를 갖는 것으로 예측되었다. 이 YjdB를 동정하기 위해, 분비 시그널 펩타이드가 결핍된 성숙형(mature form) 단백질을 암호화하는 yjdB 유전자 단편을 pET28a 벡터에 클로닝하여 His-태그 결합 재조합 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터를 제작하였다. 132603Da의 분자량을 갖는 이 재조합 단백질을 E. coli ER2566에서 발현시키고 TALON^TM metal affinity chromatography를 사용하여 정제하였다(도 1a 참조). Imidazole이 제거된 균일한 단백질을 수득하기 위해, HiLoad 16/600 Superdex 200 prepgrade column을 사용하여 용출된 단백질의 chromatography를 수행하였다(도 1a 참조). SDS-PAGE 상에서 정제된 단백질의 분자량은 약 132kDa으로 추정되었다.

자이모그램 분석에서 YjdB의 아가레이즈 활성을 확인하고(도 1b 참조), 이 아가레이즈 단백질을 AgaJ9으로 명명하였다. 특이하게도 자이모그램 분석을 위해 끓이지 않은 단백질 샘플이 두 개의 단백질 밴드로 나뉘어졌다(도 1b 참조). SDS-PAGE 상에 로딩하기 전에 샘플을 끓이면 단백질 이합체화 상태(dimerization)가 파괴되기 때문에(Bayer et al., 1996), 이 두 개의 밴드가 AgaJ9의 단량체(monomer) 또는 이합체(dimer)라고 추정하였다. 이를 증명하기 위해 Superose 12 gel filtration column(10×300mm)으로부터 AgaJ9의 용출 프로파일을 단백질 size marker들의 프로파일과 비교한 결과, AgaJ9이 각각 이합체 형태(264kDa)와 단량체 형태(132kDa)에 해당하는 10.15 및 11.23㎖에서 두 개의 대칭성 피크로 용출된 것으로 나타났다(도 2 참조). 이러한 결과는 AgaJ9이 단량체와 이량체로 존재한다는 것을 의미한다.

1-2-2. 효소특성

pH 3 ~ 10의 범위에서 활성을 측정하여 AgaJ9 활성에 미치는 pH의 영향을 조사하였다(도 3a 참조). AgaJ9은 10mM sodium citrate buffer 상의 pH 5에서 최대 아가레이즈 활성을 나타냈다. pH 4 ~ 8의 넓은 범위에서 활성을 나타냈으며, pH 3에서도 30%의 효소활성이 남아 있었다. 이러한 결과는 AgaJ9이 호산성 아가레이즈라는 것을 의미한다.

AgaJ9의 아가레이즈 활성 상에서 온도의 영향을 조사한 결과, 25℃에서 최대 활성을 나타냈다(도 3b 참조). 특이하게도 AgaJ9은 30℃ 이상의 온도에서 효소활성이 급격하게 감소하는 반면, 10℃의 낮은 온도에서는 80% 이상의 활성이 남아있었다(도 3b 참조). 대부분의 아가레이즈가 15℃ 이하의 온도에서 매우 낮은 효소활성을 보이기 때문에(Chi et al., 2014; Hosoda and Sakai, 2006; Hosoda et al., 2003; Li et al., 2015a; Liao et al., 2011; Liu et al., 2014), 이러한 결과는 AgaJ9가 저온 적합성 아가레이즈라는 것을 의미한다.

다양한 금속 이온의 존재 하에서 효소활성을 측정하여 AgaJ9 활성에서 금속 이온의 영향을 조사하였다(도 3c 참조). 아가레이즈 활성은 FeCl₂(40% 잔류) 및 MnCl₂(70% 잔류)에 의해 보통의 수준으로 저해되는 반면, CuCl₂에 의해서는 강하게 저해되었다(10% 잔류). EDTA도 보통의 저해 효과를 나타냈는데, 이는 AgaJ9의 효소활성에 금속 이온 보조인자(cofactor)가 필요하지 않다는 것을 의미한다.

1-2-3. AgaJ9의 단량체 및 이량체 형태의 생화학적 특성

효소 활성 상에서 AgaJ9 이량체화의 영향을 조사하기 위해, AgaJ9의 단량체와 이량체 사이의 효소 특성을 비교하였다. 도 2에서와 같이, gel filtration chromatography를 통해 두 가지 형태의 AgaJ9을 분리하였고, 각 단백질의 효소 활성을 조사하였다. 이의 결과, 도 4에서와 같이 이량체와 단량체는 모든 실험조건 하에서 유사한 효소 특성을 나타냈지만, 동력학적 계수(kinetic parameter)에서 유의적인 차이를 나타냈다(도 5 참조). AgaJ9의 단량체 형태의 Km값이 이량체 형태의 값보다 높은 것으로 나타났다. 아가로오스에 대한 AgaJ9 단량체 형태의 Km은 1.43㎎/㎖, Vmax는 10.7U/㎎으로 나타난 반면, 이량체 형태의 Km 및 Vmax는 각각 0.68㎎/㎖, 17.2U/㎎으로 나타났다.

1-2-4. AgaJ9 가수분해 산물의 동정

AgaJ9이 α(alpha)-아가레이즈인지 또는 β(beta)-아가레이즈인지 조사하기 위하여, p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside 및 p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside의 두 가지 발색성 기질을 사용하여 AgaJ9의 기질 특이성을 실험하였다. 기대한 것과는 달리 AgaJ9은 두 기질 모두에 어떠한 활성도 나타내지 않았다. AgaJ9이 endo-형 아가레이즈인지 또는 exo-형 아가레이즈인지 조사하기 위하여, 아가로오스 가수분해반응 중 아가로오스 용액의 점도 변화 시간을 측정하였다. 아가로오스 용액의 점도는 처음 8분간 빠르게 감소하였고 반응의 끝까지 천천히 낮아졌다(도 6a 참조). 이러한 결과는 AgaJ9이 endo-작용성 아가레이즈라는 것을 의미한다.

AgaJ9에 의해 생성된 가수분해산물을 TLC로 동정하였다(도 6b 참조). TLC 결과 아가로오스는 반응 초기동안 네오아가로바이오스(neoagarobiose; NA2), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose; NA4), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose; NA6) 및 미량의 NA6보다 큰 네오아가로올리고당(neooligosaccharide)으로 빠르게 분해되는 것으로 나타났다. 반면, 밤새 반응시킨 후에는 NA2와 NA4만 검출되었다. 이러한 결과는 아가로오스의 초기 가수분해산물인 NA6와 이보다 큰 네오아가로올리고당이 AgaJ9에 의해 NA2 및 NA4로 더 가수분해되었다는 것을 의미한다. 이러한 가설은 기질로 NA2, NA4 및 NA6를 이용한 TLC 분석에 의해 추가로 확인되었다(도 6c 참조). NA6는 AgaJ9에 의한 β-1,4 글리코시드 결합(glycosidic bond)의 절단에 의해 NA4 및 NA2로 완전히 가수분해되는 반면, NA2 및 NA4는 가수분해되지 않았다. 따라서 AgaJ9은 아가로오스로부터 NA2 및 NA4를 생성하는 endo-형 β-아가레이즈라고 할 수 있다.

1-2-5. 아가로오스 겔로부터 DNA를 추출하기 위한 AgaJ9의 적용

아가레이즈는 아가로오스 겔로부터 DNA를 추출하는데 이용될 수 있다(Fu and Kim, 2010). AgaJ9은 낮은 온도에서도 강력한 효소활성을 나타내는 저온-적합성 아가레이즈이므로, AgaJ9이 상온에서 아가로오스 겔로부터 DNA를 추출하는데 도움이 될 수 있는지 조사하였다.

먼저 겔을 녹인 다음 DNA 추출 과정에서 AgaJ9의 효과를 조사하였다. 0.5% 아가로오스에 삽입되어 있는 DNA 샘플을 AgaJ9과 상온에서 밤새 반응시켰다. 물을 처리한 대조군 샘플로부터의 DNA 추출수율이 1% 이하 반면, AgaJ9를 처리한 샘플의 수율은 거의 100%에 달했다(도 7a 참조). 추가로 1% 아가로오스에 pET24a 플라스미드가 삽입된 DNA 샘플에 AgaJ9을 2시간 동안 상온에서 처리하였을 때, 비록 10%의 낮은 수율이기는 하지만 DNA가 추출되었다(도 7b 참조). 이러한 결과는 AgaJ9의 특이적인 성질로 인해 아가로오스 겔로부터 DNA를 수득하는데 뿐만 아니라 낮은 온도에서 이루어지는 다른 모든 아가로오스의 효소처리공정에도 폭넓게 사용될 수 있다는 것을 의미한다.

<110> Myongji University Industry and Academia Cooperation Foundation National Institute of Biological Resources <120> A Novel beta-agarase AgaJ9 from Gayadomonas joobiniege G7 and use thereof <130> PA-D16501 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1182 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Gayadomonas joobiniege G7 <400> 1 Val Thr Glu Thr Glu Ile Asn Leu Asn Val Arg His Asn Thr Asn Gly 1 5 10 15 Ala Asp Thr Phe Asp Arg Glu Arg Phe Val Thr Ile His Ala Ser Leu 20 25 30 Thr Glu Asn Asp Leu Lys Gly Glu Asn Gln Val Ile Asp Tyr Leu Val 35 40 45 Asn Glu Leu Asp Val Tyr Phe Gly Arg Asp Asn Gly Ser Met Val Trp 50 55 60 Gln Leu Asn Gln Ser Gln Glu Asp Pro Asn Arg Pro Gly Tyr Val Asp 65 70 75 80 Pro Asn Trp Met Ser Thr Ala Gly Lys Arg Gln Arg Glu Val Ile Trp 85 90 95 Gly Gln Asn Ser Gln His Leu His Ala Tyr Glu Asn Asn Glu Asn Leu 100 105 110 Met Ile Gly Gly Gln Ala His Ala His Ile Pro Gly His Ile Thr Thr 115 120 125 Pro Cys Cys Gly Gly Thr Ser Trp Thr Ile Gly Ser Gly Asp Ala Ile 130 135 140 Gly Glu Tyr Met Gly His Tyr Leu Asn Glu Phe Tyr Arg Asn Pro Gly 145 150 155 160 Gln Pro Val Glu Met Gly His Glu Arg Pro Glu Tyr Leu Glu Ile Leu 165 170 175 Asn Glu Pro Leu Trp Glu Leu Val Thr Thr Gly Ser Trp Gln Pro Leu 180 185 190 Gln Val Phe Asn Leu His Asn Glu Val Ala Glu Gly Ile Arg Arg Val 195 200 205 Asn Ser Glu Val Lys Ile Gly Gly Tyr Thr Thr Ala Phe Pro Ile Phe 210 215 220 Glu Glu Asn Asn Phe Gln Arg Trp His Asp Arg Met Lys Leu Phe Val 225 230 235 240 Asp Thr Ser Gly Glu Tyr Met Asp Tyr Phe Ser Leu His Phe Tyr Asp 245 250 255 Phe Asn Lys Lys Gly Asn Ala Asn Lys Ala Gly Phe Asp Ser Pro Val 260 265 270 Asn Phe Lys Gly Ser Arg Ile Glu Ala Thr Leu Asp Met Leu Glu Asn 275 280 285 Tyr Ser Lys Ile Ala Leu Gly Glu Thr Lys Pro Leu Leu Ile Ser Glu 290 295 300 Tyr Gly Gly Arg Asp His Ser Leu Glu Gly Lys Pro Trp Thr Pro Gln 305 310 315 320 Arg Asp Trp Val Phe Met Lys Ala Met Thr Pro Leu Met Met Ser Phe 325 330 335 Leu Asp Arg Pro Asp Gln Ile Leu Lys Thr Ile Pro Phe Ile Thr Ser 340 345 350 Lys 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gtttcgttac catacatgcg tcgttaacag aaaatgatct caaaggcgaa 120 aatcaagtca ttgactatct agtgaatgaa ctcgatgttt attttggccg cgataatggc 180 agtatggttt ggcaactcaa tcagtctcaa gaagatccca atcggcctgg atatgttgac 240 cctaattgga tgtcaactgc cggtaaacgg caacgtgaag ttatctgggg tcaaaatagc 300 cagcatttgc atgcttatga aaacaacgaa aatttgatga ttgggggtca agctcatgcc 360 catatcccag gccatatcac cacaccatgc tgcggcggta ccagctggac tataggcagc 420 ggcgatgcca ttggcgaata tatggggcat tatttaaacg aattttatcg caaccccggc 480 caaccagtcg agatggggca cgaacgacct gaatatttag agatattaaa cgagccgctt 540 tgggagttag tgaccacagg cagttggcag ccgttgcaag tttttaactt gcacaacgag 600 gtggctgaag gcatcagacg ggtcaatagc gaagtcaaaa tcggcggcta tacaacggca 660 tttcctattt ttgaagaaaa taacttccag cgctggcacg acaggatgaa attatttgtt 720 gataccagtg gcgaatacat ggattatttt tcgctacatt tttacgactt taataaaaaa 780 ggcaacgcga acaaagcggg atttgatagc ccggttaact ttaaaggcag tcgtatagaa 840 gccacgttag atatgctcga aaactatagc aaaattgcct taggtgagac caaaccatta 900 ttaatttcgg aatatggtgg 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cgttccaatg tcgcaaatac aaaccgataa ccaaataaaa 1800 atccgctttt cagactcagg cggacatgtc agcagcgtca ccatgcaagc ctaccaattt 1860 agcagtgaca ttcgcaataa aacagccgac gtccaaaacg ttataataac gccacaaacg 1920 caaattctgg cagccaataa tcaaagccaa ctagaggcct atgccctacc cttttatgct 1980 caagacaagg cgttgagctt tgtttctagc gatccttctg tagctactgt tgatagctca 2040 ggtttagtca ctgcgatatc gcccggcact gccactatta cagcgagttc aaacaatggc 2100 ttctctgata ccgccgatgt tcaagttgaa gatcctgtgc ctgcttctat tagctttgac 2160 aacagaaatc agtatatcgc cactgaatat gttaatactc agactttgcc cgtaagcatc 2220 aattatgacg ctggcacagg ttatcgcatt gacgagcgct tttcgggtat cagctatatg 2280 ttgcgcgaat taagatccga ctggactgtt gtgaaggatc ttgtgttcaa tgacaaccaa 2340 gttatcggca agcaaagagg cacctctatg gtcaatttac cattggcggg catcacccca 2400 agttcagagt taccggatgg ccatttttac tttttatttg tgcgatttgg ctcaacctcg 2460 ggcgaaacta aatctattgg cgttaatcca attaccatta ttagtgaccc agacgctatc 2520 caggcctcat tagccttaga tgatccagca aaatacctta atcaaagcta tcaaagtggc 2580 agcgcaatgc aggtcacgac tgattttcat gccggtacgg gccaaaccat aggcgataag 2640 tttaacggca ttcaatatat gttgcgtgag cttcgccctg attggtctgt ggtaaaagac 2700 taccttgccg ttgacgacac tgtgattggt cagtctcaag gtacctcaac tgccagtatc 2760 tcattgcaag gtgtgccagc cagtgatgaa ctaccggatg gccactttta ctttttattt 2820 gttcgctttg ctgactcgaa cggaaagcaa gtaaataccg ctggtttgca acccattcat 2880 atcgaagcga gcgaggtgcc agcagggtta accttaatca acaaacaaac gctactaaac 2940 agcgactatt cggctaatag ccagttatcg gtcgaaatag attttgcagc tggcactggg 3000 caaaccgtat caggcgatct caacgggatt aaagtcatgt tgcgccacct tagagctgat 3060 tggtcggtcg ttaaggatat tgtagttgac gacaactcgg tgatcggtga acaaaacgga 3120 caagttaccg tacaagtacc actcgctggg gtcacgccaa gcaaaaagct agcggatggt 3180 cacttttact ttttatttgt gcgatttaaa tccagcaacg gcactgtata tcaaacaact 3240 gcacatccta ttagtatttt agctgatttt gattcagatg gtgtcgcaga taagcatgat 3300 gacgatgatg acaatgacgg cgtattagat gttaatgatg cattcccgtt caatgcccag 3360 cttggaattt taggtgattt tgacaaggac gcagatgtcg accgcaaaga tctcgctcta 3420 tttgttcgtt atattcgcga tccacaaaaa cgacatatcg aattcgattt tgatggcgac 3480 ggtcaagtgc acagaaatga tgtccgaaaa ctaagagatt tatgtactaa acctcgctgt 3540 gcagaataa 3549 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for AgaJ9 <400> 5 aactgccata tgggtgacag aaaccgaaat taa 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for AgaJ9 <400> 6 aactgcctcg aggcggcttg cgccgcttga gct 33

Claims (15)

1. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 유효성분으로 함유하는 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 생산용 효소 조성물.
2. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 유효성분으로 함유하는 아가로오스(agarose) 분해용 효소 조성물.
3. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 함유하는 베타-아가레이즈(beta-agarase) 생산용 재조합 벡터.
4. 제 3항에 있어서,
   상기 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
5. 삭제
6. 제 3항 또는 제 4항의 재조합 벡터로 형질전환된 베타-아가레이즈(beta-agarase) 생산용 형질전환체.
7. 삭제
8. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 아가로오스(agarose)와 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 생산방법.
9. 제 8항에 있어서,
   상기 네오아가로올리고당은 네오아가로바이오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)로 이루어진 군 중에서 선택된 네오아가로올리고당인 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 생산방법.
10. 제 8항에 있어서,
    상기 효소반응이 pH 4 내지 8에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 생산방법.
11. 제 8항에 있어서,
    상기 효소반응이 5 내지 30℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 생산방법.
12. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 아가로오스(agarose)와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 아가로오스 분해방법.
13. 제 12항에 있어서,
    상기 접촉이 pH 4 내지 8에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 아가로오스 분해방법.
14. 제 12항에 있어서,
    상기 접촉이 5 내지 30℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 아가로오스 분해방법.
15. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 포함하여 이루어지는 DNA가 함유된 아가로오스 겔(agarose gel)로부터 DNA를 추출하기 위한 키트.
    

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