KR102428959B1 - 혼합기질을 이용한 효소의 동시 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혼합기질을 이용한 효소의 동시 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 상기 방법은 전분(starch) 및 스킴 밀크(skim milk)를 포함하는 혼합기질 플레이트(mixed substrate plate) 또는 전분 및 피브리노겐(fibrinogen)을 포함하는 혼합기질 겔(mixed substrate gel)을 이용하여 아밀라아제 및 프로테아제를 검출할 수 있으며, 혼합기질에 혼합된 각각의 기질에 대한 서로 다른 두 가지 효소(아밀라아제 및 프로테아제)를 단일 플레이트 또는 단일 겔 상에서 동시에 검출할 수 있는 효과가 있다. 이를 통해 본 발명은 박테리아 등으로부터 아밀라아제 또는 프로테아제를 동시에 검출함으로써 효소 스크리닝 및 정제 등 효소 관련 연구 분야에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

혼합기질을 이용한 효소의 동시 검출 방법 {Method for simultaneously detecting enzyme using mixed substrate}
본 발명은 혼합기질을 이용한 효소의 동시 검출 방법에 관한 것이다.
효소(enzyme)는 세제, 식품 및 사료 생산과 같은 청정 산업 제품 및 공정에 기여하는 주된 촉매이며, 산업용 효소에 대한 최대 수요는 아밀라아제(amylase) (EC 3.2.1.1), 셀룰라아제(cellulose) (EC 3.2.1.4), 리파아제(lipase) (EC 3.1.1), 및 프로테아제(protease) (EC 3.4)와 같은 가수분해 효소 (EC class 3)에 대한 것이다.
이 중 아밀라아제(amylase)는 대표적인 전분(starch) 분해 효소로, 그 작용 양식에 따라 α-아밀라아제 (α-amylase), β-아밀라아제 (β-amylase) 및 글루코아밀라아제 (glucoamylase)로 분류되며, 전분(starch) 또는 글리코겐(glycogen)이 크기가 다른 올리고당으로 분해되는 것을 촉진하고, 제빵, 양조, 직물, 종이, 제약, 및 세제 산업에서 없어서는 안될 필수 효소이다. 특히, 알파-아밀라아제(α-amylase)는 인간이 섭취하여 영양원으로 사용하고 있는 당 성분인 곡물의 전분이나 글리코겐 같은 다당류를 단당류로 분해하여 인체에 흡수, 이용 되도록 하는 소화 효소의 일종이다. 알파-아밀라아제는 전분, 글리코겐이나 다른 탄수화물의 α-D-(1->4)-glucoside 결합을 분해하는 효소로서 사람, 동물, 미생물, 곤충 등의 탄수화물 대사 작용에 필수적인 효소이다.
또한, 프로테아제(protease)는 단백질과 폴리펩타이드에서 펩타이드 결합을 선택적으로 분해하는 효소로서, 어디에나 존재하며 산업 응용 분야에서 가장 중요한 효소이다. 프로테아제는 광범위한 생리과정, 예를 들어, 혈액응고, 호르몬 활성화 및 성숙화, 단백질 소화, 어팝토시스, 수정, 생장 분화 및 세포신호화 등에서 중요한 역할을 담당한다. 특히 미생물 프로테아제는 세제 산업 및 식품 첨가제에 널리 사용되며, 다양한 산업 공정에서 단백질 분해에 상업적으로 이용되어 왔다. 또한, 몇몇 논문들에서 프로테아제는 HIV 등의 바이러스 감염, 심혈관 질환, 암, 알츠하이머 질환 및 염증 질환 같은 많은 질병들과 연관되어 있다고 말하고 있다. 이와 같은 프로테아제와 질병 간의 관련성으로 인해, 지난 수십 년 간 빠르고, 민감하고 특이적인 프로테아제 분석 물질의 합성에 대한 요구는 상당히 증가하였다.
한편, 자이모그래피(zymography)법은 SDS 겔 전기영동 상에서 효소 활성을 직접적으로 검출하는 것이 가능한 기술로서, 전기영동에 의한 단백질 분리와 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 겔 함유 기질에서 효소 활성의 검출을 포함하는 단순하고 민감하며 다양한 2 단계 기술이다. 이 방법은 특정효소에 대한 기질을 SDS 겔 속에 포함시켜 고형화시킨 후 전기영동을 수행한다. 효소 활성은 전기 영동 수행 후 겔 상에 전개된 단백질에 의해 기질이 분해됨으로써 확인할 수 있다. 자이모그래피 기술은 아주 높은 민감도 (ng 수준)를 가질 뿐만 아니라, 겔 상에서 효소 활성을 지닌 단백질의 분자량 또는 측정이 가능하여 효소 스크리닝 및 정제 등 효소 공학연구에 많이 이용되고 있다. 자이모그램(zymogram)에서의 활성은 활성 효소가 겔에 존재하는 기질을 분해하여 투명 밴드(clear band)로서 시각화된다.
종래에 효소의 활성을 검출하는 방법에 있어서 상기와 같은 자이모그래피 법 등 다양한 연구가 진행되어 왔으나, 둘 이상의 상이한 기질을 포함하는 혼합기질을 이용하여 단일 혼합기질 플레이트 또는 단일 혼합기질 겔에서 혼합된 각각의 기질에 대한 둘 이상의 효소를 동시에 검출하는 방법에 대해서는 아직까지 잘 알려진 바가 없다.
한국등록특허공보 제1321756호
본 발명자들은 혼합기질을 이용하여 서로 다른 두 효소를 동시에 검출하는 방법에 대해 연구한 결과, 전분(starch) 및 스킴 밀크(skim milk)가 혼합된 혼합기질 플레이트(mixed substrate plate) 및 전분 및 피브리노겐(fibrinogen)이 혼합된 혼합기질 겔(mixed substrate gel)을 이용하여 플레이트 및 겔 상에서 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease)를 동시에 검출하는 방법을 개발하였으며, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 혼합기질을 이용한 효소의 동시 검출 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 혼합기질을 이용한 효소의 동시 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 혼합기질에 시료를 처리하는 단계; 및
상기 혼합기질과 시료의 반응을 통해 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 혼합기질을 이용한 효소의 동시 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 혼합기질에 시료를 처리하는 단계; 및
상기 혼합기질과 시료의 반응을 통해 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 혼합기질을 이용한 효소의 동시 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 방법은 혼합기질 플레이트(mixed-substrate plate) 또는 혼합기질 겔(mixed-substrate gel)상에서 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 혼합기질 플레이트 또는 혼합기질 겔은 단일 플레이트 또는 단일 겔일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법은 2가지 이상의 서로 다른 효소를 동시에 검출하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 효소는 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 혼합기질 플레이트 상에서 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계는, 시료가 처리된 혼합기질 플레이트를 루골 용액(Lugol's solution)으로 염색한 후 클리어존(clear zone)을 확인함으로써 아밀라아제를 검출하는 단계; 및
상기 혼합기질 플레이트를 증류수(distilled water)로 탈색시킨 후 클리어존(clear zone)을 확인함으로써 프로테아제를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 혼합기질 겔 상에서 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계는 자이모그래피(zymography) 방법을 이용하는 것으로서,
시료가 주입된 혼합기질 겔을 전기영동하는 단계;
상기 혼합기질 겔을 루골 용액(Lugol's solution)으로 염색하였을 때 나타나는 밴드를 확인함으로써 아밀라아제를 검출하는 단계; 및
상기 혼합기질 겔을 증류수로 탈색시킨 후 쿠마시 블루(Coomassie blue) 용액으로 염색하였을 때 나타나는 밴드를 확인함으로써 프로테아제를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 혼합기질 플레이트 또는 혼합기질 겔은 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 의해 분해되는 기질을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 혼합기질 플레이트는 전분(starch) 및 스킴 밀크(skim milk)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 혼합기질 겔은 전분(starch) 및 피브리노겐(fibrinogen)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 스크리닝 방법에 있어서, 혼합기질 플레이트 상에서 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계는, 시료가 처리된 혼합기질 플레이트를 루골 용액(Lugol's solution)으로 염색한 후 클리어존(clear zone)을 확인함으로써 아밀라아제를 스크리닝하는 단계; 및
상기 혼합기질 플레이트를 증류수(distilled water)로 탈색시킨 후 클리어존(clear zone)을 확인함으로써 프로테아제를 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 혼합기질 겔 상에서 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계는 자이모그래피(zymography) 방법을 이용하는 것으로서,
시료가 주입된 혼합기질 겔을 전기영동하는 단계;
상기 혼합기질 겔을 루골 용액(Lugol's solution)으로 염색하였을 때 나타나는 밴드를 확인함으로써 아밀라아제를 스크리닝하는 단계; 및
상기 혼합기질 겔을 증류수로 탈색시킨 후 쿠마시 블루(Coomassie blue) 용액으로 염색하였을 때 나타나는 밴드를 확인함으로써 프로테아제를 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 혼합기질을 이용한 효소의 동시 검출 방법은 전분(starch) 및 스킴 밀크(skim milk)를 포함하는 혼합기질 플레이트(mixed substrate plate) 또는 전분 및 피브리노겐(fibrinogen)을 포함하는 혼합기질 겔(mixed substrate gel)을 이용하여 아밀라아제 및 프로테아제를 검출할 수 있으며, 혼합기질에 혼합된 각각의 기질에 대한 서로 다른 두 가지 효소(아밀라아제 및 프로테아제)를 단일 플레이트 또는 단일 겔 상에서 동시에 검출할 수 있는 효과가 있다. 이를 통해 본 발명은 박테리아 등으로부터 아밀라아제 또는 프로테아제를 동시에 검출함으로써 효소 스크리닝 및 정제 등 효소 관련 연구 분야에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 skim milk plate에서의 α-아밀라아제 활성을 확인한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 starch plate에서의 트립신 활성을 확인한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 혼합 기질 (skim milk + starch) plate에서의 α-아밀라아제 및 트립신 활성을 확인한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 skim milk, starch, 및 혼합 기질 (skim milk + starch) plate에서 α-아밀라아제, 트립신, Bacillus sp. CBS-A, Bacillus subtilis D1, Paenibacillus 146(Pb 146), Bacillus subtilis 4, 및 Bacillus subtilis 6를 처리하여 아밀라아제 및 프로테아제 활성을 확인한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 MS zymography gel (starch + fibrinogen)에서의 아밀라아제 및 프로테아제 동시 검출 방법의 과정을 간략하게 나타낸 도면이다.
도 6a는 본 발명의 일 구현예에 따른 starch zymography gel에서 α-아밀라아제 활성을 확인한 도면이다.
도 6b는 본 발명의 일 구현예에 따른 fibrinogen zymography gel에서 트립신 활성을 확인한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 MS zymography gel (starch + fibrinogen)에서의 α-아밀라아제 및 트립신 활성을 확인한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 MS zymography gel (starch + fibrinogen)에서 α-아밀라아제, 트립신, Bacillus sp. CBS-A, Bacillus subtilis D1, Paenibacillus 146(Pb 146), Bacillus subtilis 4, 및 Bacillus subtilis 6의 효소 활성을 확인한 도면이다.
본 발명은 혼합기질에 시료를 처리하는 단계; 및
상기 혼합기질과 시료의 반응을 통해 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 혼합기질을 이용한 효소의 동시 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 혼합기질에 시료를 처리하는 단계; 및
상기 혼합기질과 시료의 반응을 통해 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 혼합기질을 이용한 효소의 동시 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "효소(enzyme)"는 생체 내의 화학반응을 매개하는 단백질 촉매로서, 특정 반응물과 결합하여 활성화 에너지(activation energy)를 낮춰 반응을 촉진하는데, 효소와 결합하는 반응물을 "기질(substrate)"이라고 한다.
본 발명에 따른 혼합기질을 이용한 효소의 동시 검출 방법은 2가지 이상의 서로 다른 효소를 동시에 검출하는 것일 수 있으며, 이 때 상기 효소는 기질을 분해할 수 있는 효소로 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 따르면 α-아밀라아제(α-amylase) 및 트립신(trypsin)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "시료"는 일반적으로 효소를 함유한다고 짐작되는 물질 또는 효소를 발현하는 박테리아 등을 의미한다. 예컨대, 상기 시료는 혈액, 간질액, 침, 안구렌즈액, 뇌척수액, 땀, 소변, 모유, 복수액, 점액, 윤활액, 복막액, 질액, 양수 등을 포함하는 생리학적 체액과 같은 생물학적 공급원, 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직, 또는 Bacillus subtilis D1, Paenibacillus 146(Pb 146), Bacillus subtilis 4, 및 Bacillus subtilis 6과 같은 박테리아로부터 수득되거나 유래될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "검출"은 시료 내의 효소를 대상으로 하는 것으 로서, 효소의 존재 유무의 감지 또는 상기 효소의 활성 수준을 측정(정성적 또는 정량적 측정을 모두 포함)하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, "동시 검출"은 서로 다른 2가지 이상의 효소를 대상으로, 상기 2가지 이상의 효소의 존재 유무 또는 각각의 활성 수준을 함께 측정하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 혼합기질 플레이트(mixed-substrate plate) 또는 혼합기질 겔(mixed-substrate gel)상에서 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "혼합기질 플레이트"는 검출하고자 하는 효소에 의해 각각 분해될 수 있는 서로 다른 둘 이상의 기질을 포함하고 있는 효소 스크리닝용 플레이트(plate) 배지를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 혼합기질 플레이트는 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 의해 분해되는 기질을 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 아밀라아제에 의해 분해되는 기질은 전분(starch)일 수 있고 상기 프로테아제에 의해 분해되는 기질은 스킴 밀크(skim milk)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "혼합기질 겔"은 검출하고자 하는 효소에 의해 각각 분해될 수 있는 서로 다른 둘 이상의 기질을 포함하고 있는 겔(gel)을 말하는 것으로서, 상기 겔은 종래 알려진 방법에 의하여 제조될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 혼합기질 겔은 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 의해 분해되는 기질을 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 아밀라아제에 의해 분해되는 기질은 전분(starch)일 수 있고 상기 프로테아제에 의해 분해되는 기질은 피브리노겐(fibrinogen)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 혼합기질 플레이트 또는 혼합기질 겔은 단일 플레이트 또는 단일 겔일 수 있다.
본 발명에 있어서, "분해"는 기질이 효소와의 반응으로 인해 고분자에서 저분자로 나뉘어져 새로운 물질이 되는 현상을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 혼합기질 플레이트 상에서 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계는, 시료가 처리된 혼합기질 플레이트를 루골 용액(Lugol's solution)으로 염색한 후 클리어존(clear zone)을 확인함으로써 아밀라아제를 검출하는 단계; 및
상기 혼합기질 플레이트를 증류수(distilled water)로 탈색시킨 후 클리어존(clear zone)을 확인함으로써 프로테아제를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혼합기질 겔 상에서 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계는 자이모그래피(zymography) 방법을 이용하는 것으로서,
시료가 주입된 혼합기질 겔을 전기영동하는 단계;
상기 혼합기질 겔을 루골 용액(Lugol's solution)으로 염색하였을 때 나타나는 밴드를 확인함으로서 아밀라아제를 검출하는 단계; 및
상기 혼합기질 겔을 증류수로 탈색시킨 후 쿠마시 블루(Coomassie blue) 용액으로 염색하였을 때 나타나는 밴드를 확인함으로써 프로테아제를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 효소 동시 스크리닝 방법에 있어서, 혼합기질 플레이트 상에서 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계는, 시료가 처리된 혼합기질 플레이트를 루골 용액(Lugol's solution)으로 염색한 후 클리어존(clear zone)을 확인함으로써 아밀라아제를 스크리닝하는 단계; 및
상기 혼합기질 플레이트를 증류수(distilled water)로 탈색시킨 후 클리어존(clear zone)을 확인함으로써 프로테아제를 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 혼합기질 겔 상에서 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계는 자이모그래피(zymography) 방법을 이용하는 것으로서,
시료가 주입된 혼합기질 겔을 전기영동하는 단계;
상기 혼합기질 겔을 루골 용액(Lugol's solution)으로 염색하였을 때 나타나는 밴드를 확인함으로써 아밀라아제를 스크리닝하는 단계; 및
상기 혼합기질 겔을 증류수로 탈색시킨 후 쿠마시 블루(Coomassie blue) 용액으로 염색하였을 때 나타나는 밴드를 확인함으로써 프로테아제를 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 "클리어존(clear zone)"은 혼합기질 플레이트 상에서 아밀라아제 또는 프로테아제의 작용으로 인해 전분(starch) 또는 스킴밀크(skim milk)가 분해되어 투명하게 나타나는 부위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 루골 용액(Lugol's solution)에 의해 전분(starch)이 염색될 수 있으며, 이 때 아밀라아제의 활성으로 인해 전분이 분해될 경우 겔 상에 투명한 밴드(clear band)가 나타날 수 있다. 또한, 상기 쿠마시 블루(Coomassie blue)에 의해 피브리노겐(fibrinogen)이 염색될 수 있으며, 이 때 프로테아제의 활성으로 인해 피브리노겐이 분해될 경우 겔 상에 투명한 밴드가 나타날 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 skim milk 및 starch를 혼합한 혼합기질을 포함하는 혼합기질 플레이트를 제조하고, α-amylase, trypsin, 및 프로테아제를 분비하는 박테리아 등을 처리하여 Lugol's solution으로 염색한 후 나타나는 클리어존 및 이를 증류수로 탈색했을 때 클리어존을 확인함으로써, 하나의 플레이트에서 α-amylase 및 trypsin의 활성을 동시에 검출할 수 있음을 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 starch 및 fibrinogen을 혼합한 혼합기질을 포함하는 혼합기질 겔을 제조하고, α-amylase, trypsin, 및 프로테아제를 분비하는 박테리아 등을 처리하여 Lugol's solution으로 겔을 염색한 후 나타나는 밴드 및 겔을 증류수로 탈색하고 Coomassie blue 용액으로 염색하였을 때 나타나는 밴드를 확인함으로써, 하나의 겔에서 α-amylase 및 trypsin의 활성을 동시에 검출할 수 있음을 확인하였다(실시예 2 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. Plate를 이용한 효소 검출
1-1. Skim milk plate를 이용한 프로테아제 활성 확인
1%(w/v)의 skim milk (BD Difco, USA, NJ, Bergen: #232100) (1.5%(w/v) agar (BD Difco, USA, NJ, Bergen: #214010) 포함)를 포함하는 평판배지를 제조하여 hole을 만든 후, 시료로 트립신(Trypsin, TPCK treated, Form bovine pancreas (Sigma, USA, St. Louis, MO: T1426))을 12.5, 25, 500, 1000, 또는 2000 μg/ml (순서대로 각각 T1, T2, T3, T4, T5로 나타냄)의 농도로 각각 spotting하고 37℃에서 12시간 이상 배양하여 기질이 분해되어 나타나는 clear zone을 확인하였다.
Skim milk enzyme activity test plate에서 skim milk의 불투명한 점을 이용하여 clear zone생성 유무를 확인한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 트립신을 spotting한 hole 주변으로 clear zone이 나타나는 것을 확인함으로써 protease (트립신)의 활성을 확인할 수 있었다.
1-2. Starch plate를 이용한 α-아밀라아제 활성 확인
1%(w/v) soluble starch (MERCK, Germany, FR, Darmstadt: 1.01252.1000) (1.5%(w/v) agar 포함)를 포함하는 평판배지를 제조하여 hole을 만든 후 시료로 α-아밀라아제(α-Amylase, Heat stable, From Bacillus licheniformis (Sigma, USA, St. Louis, MO: A4551))를 12.5, 25, 50, 100, 또는 200 μg/ml (순서대로 각각 A1, A2, A3, A4, A5로 나타냄)의 농도로 각각 spotting하고 37℃에서 12시간 이상 배양하고, iodine solution인 Lugol's solution (Sigma, USA, St. Louis, MO: L6146)을 이용하여 염색한 후, 효소에 의해 기질이 분해되어 생성된 clear zone을 확인하였다.
Starch enzyme activity test plate에서 Lugol's solution을 이용하여 염색 후 α-amylase의 활성이 있는 부위만 증류수(distilled water)를 이용하여 간단하게 탈색한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 α-아밀라아제를 spotting한 hole 주변으로 clear zone이 나타나는 것을 확인함으로써 이의 활성을 확인할 수 있었다. 또한, Lugol's solution에 염색된 starch가 distilled water에 의해 완벽하게 탈색되는 것을 알 수 있었다.
1-3. 혼합 기질 plate를 이용한 효소 활성 확인
상기 실시예 1-1 및 1-2의 결과를 바탕으로 하나의 enzyme activity test plate에서 우선적으로 protease활성을 확인하고 다음으로 Lugol's solution 염색을 통하여 α-amylase의 활성을 확인할 수 있는 mixed substrate (skim milk + starch) plate를 고안하였다.
구체적으로, mixed substrate (skim milk + starch) enzyme activity test plate를 이용하여 amylase 및 protease activity test plate를 이용한 enzyme activity test를 한 개의 test plate에서 손쉽게 확인할 수 있는지 확인하고자 하였으며, mixed (fibrinogen + starch) zymography를 시행하기 전 사용할 α-amylase와 trypsin 두 가지 enzyme을 mixed (skim milk + starch) enzyme activity test plate를 사용하여 어느 정도의 활성을 보일 것인지 확인하고자 하였다.
이에, 12.5 ~ 200 ㎍/㎖의 α-amylase를 2배씩 희석하였으며, 12.5 ~ 2,000 ㎍/㎖의trypsin을 2배씩 희석하여 사용하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, mixed (skim milk + starch) enzyme activity test plate에서 α-amylase와 trypsin 모두 clear zone을 나타내 농도의존적으로 활성을 보였으며, 상기 실시예 1-1 또는 1-2에서 확인한 각각의 enzyme (skim milk 또는 starch) activity test plate와 같은 크기의 활성을 보였다. Lugol's solution으로 test plate를 염색하기 전 trypsin을 처리한 well에서만 clear zone이 확인되었으며, Lugol's solution으로 염색한 결과 α-amylase를 처리한 well에서만 clear zone을 확인할 수 있었다. 상기 결과로 보아 mixed (skim milk + starch) enzyme activity test plate가 α-amylase와 protease의 활성 확인에 있어서 한 개의 plate로 두 가지의 enzyme activity를 손쉽게 확인할 수 있는 방법임을 알 수 있었다.
또한, test plate의 활성이 α-amylase와 trypsin 외에도 bacteria 배양 상등액을 직접 처리하였을 때 활성을 나타내는지 상기와 동일한 실험 방법으로 확인하였다. 시료로는 α-amylase, trypsin, Bacillus subtilis D1, Paenibacillus 146(Pb 146), protease를 분비하는 bacteria로 알려진 Bacillus sp. CBS-A, Bacillus subtilis 4, 및 Bacillus subtilis 6을 각각 80μl씩 처리하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 mixed (skim milk + starch) enzyme activity test plate를 Lugol's solution으로 염색하기 전에는 protease를 분비하는 bacteria로 알려진 Bacillus sp. CBS-A, B. subtilis 4, B. subtilis 6에서만 clear zone이 확인되었으며, Lugol's solution으로 염색한 후 amylase를 분비하는 bacteria로 알려진 Bacillus sp. CBS-A, B. subtilis 6에서만 clear zone이 확인되었다. 상기 결과 역시 각각의 plate (skim milk 또는 starch)를 이용한 활성 test 에서도 동일하게 확인되었다. 결과적으로 mixed (skim milk 및 starch) plate는 bacteria 배양 상등액에서도 적용이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. Zymogram 겔 (12% 아크릴아마이드 겔)에서의 효소 검출
먼저, 하기 표 1에 나타낸 조성으로 피브리노겐(fibrinogen), 전분(starch), MS zymography 겔을 제조하였다.
Figure 112021124807986-pat00010
상기 실시예 1-3에서의 mixed substrate (skim milk 및starch) enzyme activity test plate와 반대로 Lugol's solution이 distilled water에 의해 완벽히 탈색되지만, fibrinogen의 염색시약인 Coomassie brilliant blue(CBB)가 완전히 탈색되는 것은 어렵다는 점을 이용하여 하나의 zymography gel에 두 가지의 substrate를 첨가하여 두 가지의 효소활성을 확인 할 수 있는 방법을 고안하였으며, 이를 도 5에 나타내었다.
이에, mixed (skim milk 및 starch) plate에서 사용한 α-amylase, trypsin, 및 bacteria 배양 상등액이 mixed (fibrinogen 및 starch) zymography에서도 활용이 가능한지 확인하였다. 우선 α-amylase와 trypsin이 상기 표 1의 조성으로 제조한 각각의 starch, fibrinogen zymography gel에서 어떠한 형태의 band를 나타내는지 확인하였다. 그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, starch zymography에서는 trypsin의 활성이 보이지 않았지만, α-amylase에 대해서는 농도의존적으로 band를 나타내는 것을 관찰하여, α-amylase의 활성을 확인할 수 있었다. 그러나, 도 6b에 나타낸 바와 같이 fibrinogen zymography에서는 starch zymography와 반대로 trypsin에 의한 활성만이 농도의존적으로 확인되었다. 또한, 상기 두 결과를 보아 α-amylase가 trypsin 보다 더 크기가 큰 protein으로 확인되었다.
상기와 같은 각각의 starch, fibrinogen zymography에서 확인된 결과가 상기 표 1의 조성으로 제조한 mixed (starch + fibrinogen) zymography gel (MS zymography gel)에서도 동일하게 나오는지에 대한 실험을 진행하였다. 상기 겔을 이용하여 전기영동한 후, 겔 내의 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 Triton X-100(USB, USA, OH, Cleveland: 22686)으로 처리하여 제거한 후 Lugol's solution으로 염색하였다. 그런 다음, 겔이 투명해질 때까지 증류수로 탈색하고, 이어서 Coomassie blue용액으로 겔을 염색하였다. 이후 Coomassie blue 용액으로 염색한 겔은 destaining solution(methanol:acetic acid:distilled water, 4:1:5)으로 탈색하였다.
그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이 mixed (starch + fibrinogen) zymography를 Lugol's solution으로 염색하였을 때, α-amylase에 의한 활성만이 starch zymography와 동일한 결과를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 상기 mixed (starch + fibrinogen) zymography를 distilled water로 destaining한 후 CBB (Biosesang, Korea, Gyeonggi-do, Senongnam: C2006)로 염색하여 활성을 확인한 결과 trypsin에서만 fibrinogen zymography와 동일한 결과를 나타내는 것을 확인하였다. α-amylase와 trypsin의 mixed (fibrinogen 및 starch) zymography activity를 보아 mixed (Skim milk + starch) enzyme activity test plate와 마찬가지로 한 개의 zymography gel에서 두 가지의 enzyme activity를 정확하게 확인할 수 있었다.
또한, mixed (starch + fibrinogen) zymography를 염색하여 α-amylase, trypsin, D1, Paenibacillus 146, Bacillus sp. CBS-A, Bacillus subtilis 4, 및 Bacillus subtilis 6에 대하여 실질적으로 bacteria 배양 상등액의 enzyme activity가 정확하게 나오는지 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 mixed (starch + fibrinogen) zymography를 Lugol's solution으로 염색하였을 때, α-amylase 및 amylase를 분비하는 bacteria로 알려진 Bacillus sp. CBS-A, B. subtilis 6에 의한 활성이 나타났으며, 상기 mixed (starch + fibrinogen) zymography를 distilled water로 destaining한 후 CBB (Biosesang, Korea, Gyeonggi-do, Senongnam: C2006)로 염색하여 활성을 확인한 결과, trypsin 및 protease를 분비하는 bacteria로 알려진 Bacillus sp. CBS-A, B. subtilis 4, B. subtilis 6에 의한 활성이 나타나는 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (18)

  1. 전분(starch) 및 스킴 밀크(skim milk)를 포함하는 혼합기질 플레이트(mixed-substrate plate) 상에서 혼합기질에 시료를 처리하는 단계;
    전분(starch) 및 피브리노겐(fibrinogen)을 포함하는 혼합기질 겔(mixed-substrate gel)상에서 혼합기질에 시료를 처리하는 단계; 및
    상기 혼합기질 플레이트 상에서 및 혼합기질 겔 상에서 각각 혼합기질과 시료의 반응을 통해 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 혼합기질을 이용한 효소의 동시 검출 방법으로서,
    상기 효소는 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease)인 것을 특징으로 하는, 혼합기질을 이용한 효소의 동시 검출 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 혼합기질 플레이트는 단일 플레이트이고,
    상기 혼합기질 겔은 단일 겔인 것을 특징으로 하는, 혼합기질을 이용한 효소의 동시 검출 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 혼합기질 플레이트 상에서 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계는, 시료가 처리된 혼합기질 플레이트를 루골 용액(Lugol's solution)으로 염색한 후 클리어존(clear zone)을 확인함으로써 아밀라아제를 검출하는 단계; 및
    상기 혼합기질 플레이트를 증류수(distilled water)로 탈색시킨 후 클리어존(clear zone)을 확인함으로써 프로테아제를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 혼합기질을 이용한 효소의 동시 검출 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 혼합기질 겔 상에서 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계는 자이모그래피(zymography) 방법을 이용하는 것으로서,
    시료가 주입된 혼합기질 겔을 전기영동하는 단계;
    상기 혼합기질 겔을 루골 용액(Lugol's solution)으로 염색하였을 때 나타나는 밴드(band)를 확인함으로써 아밀라아제를 검출하는 단계; 및
    상기 혼합기질 겔을 증류수로 탈색시킨 후 쿠마시 블루(Coomassie blue) 용액으로 염색하였을 때 나타나는 밴드를 확인함으로써 프로테아제를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 혼합기질을 이용한 효소의 동시 검출 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 전분(starch) 및 스킴 밀크(skim milk)를 포함하는 혼합기질 플레이트(mixed-substrate plate) 상에서 혼합기질에 시료를 처리하는 단계;
    전분(starch) 및 피브리노겐(fibrinogen)을 포함하는 혼합기질 겔(mixed-substrate gel)상에서 혼합기질에 시료를 처리하는 단계; 및
    상기 혼합기질 플레이트 상에서 및 혼합기질 겔 상에서 각각 혼합기질과 시료의 반응을 통해 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 혼합기질을 이용한 효소의 동시 스크리닝 방법으로서,
    상기 효소는 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease)인 것을 특징으로 하는, 혼합기질을 이용한 효소의 동시 스크리닝 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제11항에 있어서,
    상기 혼합기질 플레이트 상에서 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계는, 시료가 처리된 혼합기질 플레이트를 루골 용액(Lugol's solution)으로 염색한 후 클리어존(clear zone)을 확인함으로써 아밀라아제를 스크리닝하는 단계; 및
    상기 혼합기질 플레이트를 증류수(distilled water)로 탈색시킨 후 클리어존(clear zone)을 확인함으로써 프로테아제를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 혼합기질을 이용한 효소의 동시 스크리닝 방법.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 혼합기질 겔 상에서 혼합기질에 혼합된 각 기질의 분해 여부를 확인하는 단계는 자이모그래피(zymography) 방법을 이용하는 것으로서,
    시료가 주입된 혼합기질 겔을 전기영동하는 단계;
    상기 혼합기질 겔을 루골 용액(Lugol's solution)으로 염색하였을 때 나타나는 밴드(band)를 확인함으로써 아밀라아제를 스크리닝하는 단계; 및
    상기 혼합기질 겔을 증류수로 탈색시킨 후 쿠마시 블루(Coomassie blue) 용액으로 염색하였을 때 나타나는 밴드를 확인함으로써 프로테아제를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 혼합기질을 이용한 효소의 동시 스크리닝 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 혼합기질 플레이트에서 전분 및 스킴 밀크의 농도(%(w/v)) 비율은 1 : 1(전분 : 스킴 밀크)이고,
    상기 혼합기질 겔에서 전분 및 피브리노겐의 농도(%(w/v)) 비율은 0.5 : 0.12(전분 : 피브리노겐)인 것을 특징으로 하는, 혼합기질을 이용한 효소의 동시 검출 방법.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 혼합기질 플레이트에서 전분 및 스킴 밀크의 농도(%(w/v)) 비율은 1 : 1(전분 : 스킴 밀크)이고,
    상기 혼합기질 겔에서 전분 및 피브리노겐의 농도(%(w/v)) 비율은 0.5 : 0.12(전분 : 피브리노겐)인 것을 특징으로 하는, 혼합기질을 이용한 효소의 동시 스크리닝 방법.
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