KR101663556B1

KR101663556B1 - 세포를 함유하는 오일 내 하이드로겔 에멀젼, 세포외 구획화 방법 및 신규효소 초고속 스크리닝법

Info

Publication number: KR101663556B1
Application number: KR1020140072359A
Authority: KR
Inventors: 송재준; 최종현; 고경철; 이빛나
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2014-06-13
Publication date: 2016-10-07
Also published as: WO2015190730A1; KR20150143177A

Abstract

본 발명은 세포를 함유하는 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsions), 세포외 구획화(in vitro compartmentalization; IVC) 방법 및 신규 효소 초고속 대량 스크리닝법(ultra-High-throughput screening; uHTS)에 관한 것이다. 하이드로겔 내에서 세포와 기질 사이의 반응 산물의 확산을 방지하여 형광강도가 강하므로, FACS 분석에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 세포외 구획화(IVC) 방법에 따른 에멀젼은 안정하여 장기 보관이 가능하고, 세포의 배양이 가능하여 단일 세포로부터 2~3개의 세포로 증식할 수 있는 이점이 있다.

Description

세포를 함유하는 오일 내 하이드로겔 에멀젼, 세포외 구획화 방법 및 신규효소 초고속 스크리닝법{Hydrogel-in-oil emulsion containing cell, method for in vitro compartmentalization and ultra-high throughput screening of novel enzyme}

본 발명은 세포를 함유하는 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsions), 세포외 구획화(in vitro compartmentalization; 이하 'IVC'라고 함) 방법 및 신규 효소 초고속 대량 스크리닝법(ultra-High-throughput screening, 이하 'uHTS'라고 함)에 관한 것이다.

보편적으로 알려진 신규 효소를 발굴하는 방법은 아가 플레이트(agar plate) 또는 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)를 기반으로 효소활성을 검출하는 것이다(Chem. Biol. 2004, 11: 981-990; Enz. Microbiol. Technol. 2004, 34: 429-436). 상기 신규 효소 발굴 방법은 자동화 시스템의 발전에도 불구하고 하루에 스크리닝 할 수 있는 라이브러리 개수는 약 10³내지 10⁵개 정도를 넘지 못하고 있는 실정이다.

하지만, 산업의 발달과 더불어, 현재 처리할 수 있는 스크리닝법보다 더 효율적으로 초고속 대량 스크리닝(ultra High-throughput screening; 이하 'uHTS'라고 함)할 수 있는 기술의 개발이 절실히 요구되고 있다(Nat. Biotechnol. 2001, 19: 537-542; Curr. Opin. Biotechnol. 2004, 15:323-329; Nat. Chem. Biol. 2008, 4:290-294).

최근 들어, 10⁷개/시간 이상의 세포를 분석할 수 있는 유세포분석기(fluorescence-activated cell sorting; 이하 'FACS' 라고 함)가 uHTS의 유망한 툴로서의 가능성이 제시되고 있다(Curr. Opin. Chem. Biol. 2005, 9, 210-216; Chem Biol. 2005, 12:1255-1257). FACS 분석은 대량의 라이브러리를 효율적으로 스크리닝 하는 것이 가능하고, 나아가 유도 진화(directed evolution)의 분석에도 효과적인 툴로서 잠재력을 가지고 있다.

하지만 형광검출 기반인 FACS를 이용해 효소를 스크리닝 하기 위해서는 특정 효소를 발현하는 세포가 기질을 분해하여 생성된 형광산물이 세포 표면에 흡착되거나 세포 밖으로의 확산이 제한되어 내부에 머무르는 경우에만 가능한다(Nat. Biotechnol. 2000, 18: 1071-1074; PNAS 2005, 102: 6855-6860; PNAS 2005, 120: 10082-10087). 그러나 대부분의 기질은 세포 내부로 유입되어 효소와 반응한 후 생산된 형광산물이 빠르게 세포 밖으로 확산되어 나가는 큰 단점이 있어(Appl. Biochem. Biotechnol. 2010, 161, 301-312), FACS 시스템에 적합한 기질을 찾기가 매우 어렵다는 것이 가장 큰 문제점이다. 또한 발현된 효소가 세포 밖으로 분비되어 세포 외부에서 효소 반응이 일어나는 경우에는 특정 타겟 효소의 검출이 불가능하다.

상기 문제점을 해결하기 위한 방법으로 오일-내-수분 에멀젼(water-in-oil emulsions; 이하 'w/o' 라고 함)을 이용하는 세포외 구획화(in vitro compartmentalization; IVC) 기술이 보고되었다(EMBO J. 2003, 22: 24-35; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011, 89:1453-1462).

IVC는 본래 단백질의 유도 진화(directed evolution)를 위한 인공세포(artificial cells)를 생성하기 위한 기술로 개발되었으며(Nat. Methods 2006, 3: 561-570), 오일을 이용하여 수용액 층에 있는 단일 유전자와 그의 전사 및 해독에 필요한 구성물을 특정 기질과 함께 둘러싸 인공막(artificial membrane)을 형성하고, 그 내부에서 단일 유전자의 발현에 따른 형광신호를 FACS로 분석할 수 있도록 하는 것이다(Nat. Methods 2006, 3: 561-570; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011, 89:1453-1462). 이러한 IVC 기술은 단일 세포를 독립적으로 가두는데 응용될 수 있으며 기질분해에 따른 형광산물이 인공세포(artificial cell) 내부에서 머무르도록 하여 FACS로 분석할 수 있는 조건을 제공한다(Nat. Methods 2006, 3: 561-570).

그러나 종래의 오일-내-수분 에멀젼(water-in-oil emulsions; w/o)의 IVC 기술을 이용한 신규효소탐색 연구 과정에서 IVC기술의 한계점이 확인되었는데, IVC기술의 한계점은 특정 효소반응에 의해 기질로부터 분해된 매우 작은 분자의 형광물질이 오일 막을 통과하여 빠른 시간 안에 바깥쪽인 수용액 층으로 확산이 일어나는 현상을 보인다는 것이다.

즉, IVC 내의 형광강도가 저하되어 FACS 검출에 한계가 있으며, 형성된 에멀젼이 쉽게 파괴될 수 있는 불안정성으로 장기간 보관이 어렵다는 문제점이 있다. 이와 같은 종래의 오일-내-수분 에멀젼(water-in-oil emulsions; w/o)을 이용한 IVC의 문제점인 낮은 민감도 및 불안정성을 해소할 수 있는 IVC 기술이 절실히 필요한 상황이다.

상기한 문제를 해결하기 위한, 본 발명의 목적은 세포를 함유하는 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsions; 이하 'h/o' 라고 함), 세포외 구획화 방법 및 신규효소 초고속 스크리닝법을 제공하는 것으로, 더욱 상세하게는 에멀젼 내 물질의 확산을 방지하기 위하여, 에멀젼 내부를 수분(water)이 아닌 하이드로겔(hydrogerl)을 이용한 세포외 구획화(IVC) 방법, 이로부터 단일 세포를 함유하는 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsions) 및 상기 에멀젼을 이용한 신규효소 초고속 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 세포를 함유하는 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsions), 세포외 구획화(in vitro compartmentalization; IVC) 방법 및 신규 효소 초고속 대량 스크리닝법(ultra-High-throughput screening; uHTS)을 제공한다.

보다 상세하게는 (a) 하이드로겔화 형성 물질을 포함하는 액체배지를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 액체배지를 세포에 첨가하여 현탁액을 형성시키는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 현탁액을 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture)에 첨가하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c) 이후에, 현탁액을 균질화(homoginization) 하고, 겔(gel)화 하여 세포가 함유된 오일 내 하이드로겔(hydrogel-in-oil) 에멀젼을 형성하는 단계;를 포함하는 세포외 구획화(in vitro compartmentalization; IVC) 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포외 구획화(IVC) 방법으로 제조된 세포가 함유된 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsions)을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포가 함유된 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsions)을 이용하여 유세포분석(fluorescence-activated cell sorting; FACS) 방법으로 신규효소 초고속 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 세포를 함유하는 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsions), 세포외 구획화(in vitro compartmentalization; IVC) 방법 및 신규 효소 초고속 대량 스크리닝법(ultra-High-throughput screening; uHTS)에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포를 함유하는 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsions)을 이용한 세포 내 효소 및 기질 반응에서 생성된 작은 분자의 형광물질이 하이드로겔 층을 통과하지 못하므로, 형광강도의 손실을 줄일 수 있어 FACS 분석 시 매우 유용하다.

또한, 본 발명의 세포외 구획화 방법에 따른 세포를 함유하는 에멀젼은 안정하여 2 내지 4℃에서 1 내지 10일 동안 보관할 수 있으며, 에멀젼의 하이드로겔 내에서 세포의 생존 및 증식이 가능하므로 단일 세포를 2~3개의 세포로 증식하여 분석하는 경우, 기질분해를 보다 더 원활하게 확인할 수 있는 이점이 있다.

도 1은 균질화(homoginization) 시간에 따라 형성된 마이크로비드의 크기를 나타낸 것으로 30(A), 60(B), 90(C), 120(D), 150(E) 및 180(F)초 동안 8,000 rpm으로 균질화(homoginization)한 것이다.
도 2는 균질화(homoginization) 시간에 따라 형성된 마이크로비드의 크기를 나타낸 것으로 30(A), 60(B), 90(C), 120(D), 150(E) 및 180(F)초 동안 9,500rpm으로 균질화(homoginization)한 것이다.
도 3은 균질화(homoginization) 시간에 따라 형성된 마이크로비드의 크기를 나타낸 것으로 30(A), 60(B), 90(C), 120(D), 150(E) 및 180(F)초 동안 13,500rpm으로 균질화(homoginization)한 것이다.
도 4는 균질기의 rpm과 작동시간에 따른 마이크로비드의 크기를 나타낸 것이다.
도 5는 입도분석기를 이용한 마이크로비드의 크기를 분석한 도면이다.
도 6은 OD₆₀₀ 값이 0.2(A), 0.4(B), 0.6(C), 0.8(D), 1.0(E)인 세포 배양액 내의 GFP 세포를 이용한 h/o 에멀젼 형성을 나타낸 것으로, 왼쪽은 광학과 형광 사진을 겹쳐 나타낸 것이고, 오른쪽은 형광사진을 나타낸 것이다.
도 7은 GFP 세포를 이용한 h/o 에멀젼 형성을 나타낸 것으로, h/o 에멀젼 제작 직후 관찰(A)한 것과 24시간 배양 후 관찰(B)한 것이다. 왼쪽은 광학과 형광사진을 겹쳐 나타낸 것이고, 오른쪽은 형광사진을 나타낸 것이다.
도 8은 GFP 세포를 함유하는 마이크로비드를 관찰한 사진으로 왼쪽은 광학과 형광사진을 겹쳐 나타낸 것이고, 오른쪽은 형광사진을 나타낸 것이다.
도 9는 GFP 세포를 함유한 겔 비드의 FACS 분석결과이다. 음성대조군(A), GFP 세포를 포함하는 마이크로비드(B), 마이크로비드의 형광 강도별 분리(sort)(C)을 나타낸 것이다(NF : no fluorescence, LF : low fluorescence, HF : high fluorescence).
도 10은 FACS 분석 후, 형광 강도 별로 분리(sort)하여 배양한 후, UV에서 관찰한 결과 사진이다(NF : no fluorescence, LF : low fluorescence, HF : high fluorescence).
도 11은 1mM MU를 함유하는 h/o 에멀젼을 나타낸 것으로 왼쪽은 h/o 에멀젼, 오른쪽은 h/o 에멀젼의 오일 제거 후 희석된 20분 후의 마이크로비드 사진이다.
도 12는 1mM MU를 함유하는 마이크로비드의 FACS 분석결과이다. 위 도면은 음성대조군이고, 아래쪽 도면은 1mM MU를 함유하는 마이크로비드이다.
도 13은 엑소셀룰라아제 발현 세포와 MUG₂를 함유하는 마이크로비드를 24시간 반응시킨 후 관찰한 사진을 나타낸 것이다. 야생형 E. coli XL1-blue 세포 함유(A), 엑소셀룰라아제 발현 세포 함유(B)한 마이크로비드를 나타낸 것이다.
도 14는 엑소셀룰라아제 발현 세포와 MUG₂를 함유한 h/o 마이크로비드를 24시간 반응 후 FACS 분석한 결과이다. 위: 야생형 E. coli XL1-blue 세포를 함유한 비드를 관찰한 결과이고, 아래: 엑소셀룰라아제 발현 세포를 함유한 마이크로비드를 관찰한 결과이다.
도 15는 야생형 E. coli XL1-blue 세포와 엑소셀룰라아제 발현 세포를 9:1로 마이크로비드를 제작하여 24시간 반응 시킨 후, FACS를 분석한 결과이다. 위는 음성대조군이고, 아래는 야생형 E. coli XL1-blue 세포와 엑소셀룰라아제를 함유한 세포를 9:1로 혼합한 마이크로비드를 관찰한 것이다.
도 16은 분리(sort)된 분획을 배양한 결과로, 왼쪽은 UV 트랜스일루민네이터(transiluminator) 위에서 찍은 사진이고, 오른쪽은 Victor를 이용하여 형광 값을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 PEGDA를 이용한 GFP 세포가 함유되어 제작된 하이드로겔 비드를 관찰한 결과로, 왼쪽은 광학과 형광사진을 겹쳐서 나타낸 것이고, 오른쪽은 형광사진을 나타낸 것이다.
도 18은 PEGDA를 이용하여 제작된 하이드로겔 비드에서의 GFP 세포의 FACS 분석 결과로, 위는 음성대조군이고, 아래는 GFP 세포를 함유한 하이드로겔 비드를 분석한 결과이다.
도 19는 혈구계수기(hemacytometer)를 이용한 마이크로비드의 개수를 관찰한 결과이다. (A)는 혈구계수기(hemacytometer)의 모식도이고, (B)는 h/o 에멀젼의 비드, PBS, 헥산(hexane), 미네랄 오일로 오일 막을 제거한 후의 마이크로비드이다.
도 20은 수분-내-오일-내-수분(water-in-oil-in-water; w/o/w) 이중 에멀젼의 광학 및 형광 사진으로 왼쪽은 광학 및 형광 사진을 겹친 사진이며, 오른쪽은 형광사진이고, 붉은 색 화살표는 대장균에서 발현한 GFPuv를 표시한 것이다(스케일 바는 50.0㎛이다).
도 21은 4-메틸움벨리퍼론(4-Methylumbelliferone; 이하 'MU'라고 함)를 포함하는 에멀젼의 현미경 사진으로 왼쪽은 광학과 형광 사진을 겹친 사진이고, 오른쪽은 형광 사진이다(스케일 바는 50.0㎛이다).
도 22는 4-메틸움벨리퍼릴-β-D-셀로바이오사이드(4-Methylumbelliferyl-β-D-cellobioside; 이하 'MUG₂'라고 함)가 포함되어 생성된 에멀젼 사진으로 에멀젼 제작 직 후의 현미경 사진(A)과 에멀젼을 제작하여 24시간 반응 시킨 후 현미경 사진(B)으로 왼쪽은 광학 현미경 사진이고 오른쪽은 형광현미경 사진이다(스케일 바는 50.0㎛이다).
도 23은 w/o/w 에멀젼의 IVC 외부로 MU의 확산을 확인한 것으로, MU를 함유하는 w/o/w 에멀젼과 함유하지 않은 w/o/w 에멀젼을 1:1로 섞은 직 후의 사진과(A) 섞은 후 20분 후 관찰한 사진(B)을 나타낸 것이다. 왼쪽은 광학 현미경 사진이고 오른쪽은 형광현미경 사진이다(스케일 바는 50.0㎛이다).
도 24는 MU를 이용한 w/o/w 에멀젼의 FACS 분석결과로, 위쪽 도면은 음성대조군이고, 아래쪽 도면은 1mM MU 양성 대조군을 나타낸 것이다.
도 25는 GFP 세포를 이용한 w/o/w 에멀젼의 FACS 분석결과로, 위쪽 도면은 음성대조군이고, 아래쪽 도면은 GFP 발현 양성 대조군을 나타낸 것이다.

본 발명은 세포를 함유하는 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsions), 세포외 구획화(in vitro compartmentalization; IVC) 방법 및 신규 효소 초고속 대량 스크리닝법(ultra-High-throughput screening; uHTS)에 관한 것이다.

상기 단계 (d) 이후에, 에멀젼에 함유된 세포를 30 내지 37℃에서 1 내지 24시간 동안 배양하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 단계 (b)에서, 제조된 액체 배지를 배양된 세포에 첨가하여 현탁액을 형성시키는 단계에서, 기질을 더 첨가하여 현탁액을 형성하는 것이 특징이다.

상기 기질은 세포 내의 효소와 반응하는 물질로서, 효소와 기질반응에 따른 형광신호를 확인할 수 있는 것이 특징이다.

상기 하이드로겔화 형성 물질은 아가로오스(agarose), 키토산(chitosan), 알지네이트(alginate), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(polyethylene glycol diacrylate; PEGDA) 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(ployvinylpyrrolidone), 잔탄(xanthan), 히알루로난(hyaluronan), 젤라틴(gelatin), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 카복시메틸셀룰로오즈(carboxymethyl celluose) 및 콜라겐(collagen) 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 2 내지 4%(w/v) 저융점 아가로오스(low melting agarose) 또는 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(polyethylene glycol diacrylate; PEGDA)인 것이지만 이에 한정하지 않고, 하이드로겔을 형성할 수 있고, 세포독성이 없는 물질이라면 어느 것이든 무방하게 사용될 수 있다. 상기 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol; 이하 'PEG'라고 함)은 폴리머 재료(ploymeric materials) 중에서 뛰어난 생체 적합성과 견고성 및 비반응성의 특성을 가진 생체적합 물질이며, 세포 캡슐화(encapsulation), 세포의 마이크로어레이(microarray), 약물전달(drug delivery) 등 다양하게 적용될 수 있는 물질이다 (Biomed Mater. 2009, 4:011001-011008; Materials 2009, 2:577-612). 따라서 PEG 기반의 폴리머는 친수성 폴리머로서 생체적합 하이드로겔을 형성하는데 매우 바람직한 물질이다.

상기 균질화(homoginization)는 균질기를 이용하여 8,000 내지 13,500rpm으로 30 내지 180초 동안 균질화(homoginization) 하는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않고, 마이크로비드를 형성할 수 있는 방법은 어느 방법이든 무방하게 사용될 수 있다.

상기 에멀젼은 2 내지 50㎛의 평균직경을 갖는 마이크로비드인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 10 내지 30㎛의 평균직경을 갖는 마이크로비드인 것이며, 가장 바람직하게는 단일 세포를 마이크로비드 내에 IVC하는데 알맞은 크기인 평균직경이 20㎛인 마이크로비드인 것이다.

상기 세포는 단일 세포인 것이 바람직하며, 대장균세포인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.

상기 세포가 함유된 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsions)의 크기는 2 내지 50㎛의 평균직경으로 이루어져 있으며, 2 내지 4℃에서 1 내지 10일 동안 보관할 수 있는 것이 특징이고, 에멀젼의 하이드로겔 내에서 세포를 배양 시, 온도는 30 내지 37℃에서 1 내지 24시간 동안 배양하는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명은 (a) 세포가 함유된 오일 내 하이드로겔 에멀젼에 기질을 첨가하는 단계;

(b) 상기 단계(a)에서 첨가된 기질과 하이드로겔 내의 세포에서 발현된 효소가 반응하는 단계; 및

(c) 상기 단계(b)의 반응 결과를 유세포분석(fluorescence-activated cell sorting; FACS) 방법으로 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 신규효소 초고속 스크리닝 방법을 제공한다.

오일 내 하이드로겔 에멀젼은 점도가 높아 FACS를 이용한 분석이 불가능하기 때문에 h/o 에멀젼 제작 후, 오일을 제거하고 마이크로비드들을 최대한 수득하기 위하여 세포가 함유된 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsion)으로부터 오일을 제거하는 단계를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 오일의 제거는 미네랄 오일(mineral oil), 헥산(hexane) 및 2-프로판올(2-propanol)　중에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 미네랄 오일(mineral oil)을 이용하는 것이지만, 이에 한정하지 않는다. 상기한 미네랄 오일(mineral oil), 헥산(hexane) 및 2-프로판올(2-propanol) 등의 유기용매로 오일을 제거한 비드를 배양하여 생성된 콜로니 수를 확인함으로써 세포의 생존에 보다 안전한 유기용매를 선정하는 것이 바람직하다.

이하, 실시예 및 비교예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예 및 비교예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 신규효소의 초고속탐색을 위한 아가로오스 비드(agarose beads)의 IVC 제작 및 FACS 분석

(1) h/o 에멀젼의 형성 및 마이크로비드의 크기 조절

아가로오스를 이용한 하이드로겔 형태의 에멀젼은 'h/o 에멀젼'으로 명명하였다. 겔 비드의 크기는 균질기의 rpm 및 균질화(homoginization) 시키는 시간에 의해 조절되는 것을 확인하였다.

3%(w/v) 저융점 아가로오스(3%(w/v) low melting agarose)를 함유하는 LB 액체 배지를 멸균 후, 65℃의 인큐베이터에 보관하였다. 상기 보관된 아가로오스-LB 배지 용액 1㎖을 취하여 1.5㎖ 마이크로튜브에 넣고, 40℃로 세팅된 힛 블럭(hit block)에 넣어 용액의 온도가 40℃가 되도록 하였다. 40℃의 아가로오스-LB 배지 용액 200㎕를 채취하여 400㎕의 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture; 2.9% ABIL EM 90 in mineral oil)에 넣어주었다. 40℃의 힛 블럭(hit block)에 고정시킨 상태에서 균질기를 이용하여 균질화(homoginization)하였다.

상기 균질기의 rpm은 8,000, 9,500 및 13,500rpm을 사용하였으며, 각각의 rpm 당 30, 60, 90 120, 150 및 180초 동안 균질화(homoginization) 하였다. 균질화(homoginization) 한 후, 얼음 위에서 5분 동안 방치하여 겔화 하였다.

완성된 h/o 에멀젼은 현미경을 통해 확인하였다(도 1 내지 3). 균질화(homoginization) rpm과 시간이 증가함에 따라 비드의 크기는 점점 줄어들고, 개수는 증가함을 확인하였다.

상기 제작된 마이크로비드의 크기는 평균 직경으로 정하였으며 그 결과를 그래프로 나타내었다(도 4).

본 실시예서는 단일 세포를 비드 내에 IVC 하기 위해, 20㎛ 직경을 형성시키는 9,500rpm, 1분의 조건을 선택하였으며, 입도분석기(MasterSizer 2000, Malvern Instruments Ltd.)를 이용하여 균일한 20㎛의 평균직경으로 이루어진 마이크로비드가 제작되었음을 확인하였다(도 5).

(2) GFP 세포의 광학밀도( optical density ; 이하 OD 라 명명)에 따른 h/o 에멀젼 형성

세포 각각의 OD₆₀₀에 따른 h/o 에멀젼 형성 시 세포를 포함하는 마이크로비드의 비율을 확인하였다. 실험은 하기의 방법으로 진행하였다.

3%(w/v) 저융점 아가로오스(low melting agarose)를 함유하는 LB 액체 배지를 멸균 후, 65℃의 인큐베이터에 보관하였다. 상기 보관된 아가로오스-LB 배지 용액 1㎖을 취하여 1.5㎖ 마이크로튜브에 넣고, 40℃로 셋팅된 힛 블럭(heat block)에 넣어 용액의 온도가 40℃가 되도록 하였다. 배양한 세포(GFPuv E. coil)를 각각의 OD(OD₆₀₀=0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0)가 되도록 맞춘 후 각각의 세포 배양액 1㎖ 채취하여 6,000rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고 세포를 1×PBS로 세척하였다. 세포를 40℃에서 1㎖의 아가로오스-LB 배지 용액에 재현탁시키고, 그 중에서 200㎕를 채취하여 400㎕의 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture; 2.9% ABIL EM 90 in mineral oil)에 넣어주었다. 40℃의 힛 블럭(heat block)에 고정시킨 후 균질기를 이용해 9,500rpm에서 1분 동안 균질화 한 후, 얼음 위에서 5분 동안 방치하여 겔화 하였고, 상기 제작된 h/o 에멀젼을 광학 및 형광현미경으로 확인하였다(도 6). OD 값이 1인 세포 배양액을 사용하였을 때 세포를 함유하는 비드가 약 80% 비율로 존재하는 것을 확인하였으며 실험의 목적에 따라 알맞은 OD 값을 선정하여 사용하였다.

(3) GFP 세포를 이용한 h/o 에멀젼 제작 및 비드 내부에서 세포의 증식 관찰

GFP(green fluorescent protein) 세포를 함유하는 h/o 에멀젼을 하기의 방법으로 제작하였다. 3%(w/v) 저융점 아가로오스(low melting agarose)를 함유하는 LB 액체 배지를 멸균 후, 65℃ 인큐베이터에 보관하였다. 상기 보관된 아가로오스-LB 배지 용액 1㎖을 취하여 1.5㎖ 마이크로튜브에 넣고, 40℃로 셋팅된 힛 블럭(hit block)에 넣어 용액의 온도가 40℃가 되도록 하였다. 1㎖의 세포 culture broth (GFPuv E. coil 세포, OD₆₀₀=0.6)를 채취하여 6,000rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고 세포를 1×PBS로 세척하였다. 세포를 40℃의 1㎖의 아가로오스-LB 배지 용액에 재현탁시키고, 그 중에서 200㎕를 채취하여 400㎕의 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture; 2.9% ABIL EM 90 in mineral oil)에 넣어주었다. 40℃의 힛 블럭(hit block)에 고정시킨 후 균질기를 이용해 9,500rpm에서 1분 동안 균질화(homoginization) 한 후, 얼음 위에서 5분 동안 방치하여 겔화하였고, 상기 제작된 h/o 에멀젼을 광학 및 형광현미경으로 확인하였다. 각각의 마이크로비드에 단일 GFP 세포를 포함하는 h/o 에멀젼이 성공적으로 생성되었음을 확인하였다.

또한, h/o 에멀젼을 제작한 후, 37℃에서 24시간동안 배양하여 아가로오스 겔 내부에서 세포가 생존 및 증식을 확인하였다. h/o 에멀젼을 만든 직 후와 24시간 후, 형광현미경으로 확인하여 증식 여부를 판단하였다. 관찰 결과 24시간 후 세포가 증식하는 것을 확인하였다(도 7). 따라서 단일 세포의 수가 2~3개로 증식하면서 좀 더 원활한 기질분해가 이루어질 수 있을 것으로 판단하였다.

(4) GFP 세포를 함유하는 마이크로비드의 FACS 분석

FACS 분석을 위해서는 h/o 에멀젼의 오일 막을 제거하고 아가로오스 겔 비드 입자들을 수득하여야 하기 때문에 오일을 제거하는 과정을 수행하였다.

GFP 세포가 함유된 100㎕의 h/o 에멀젼을 채취하여 1㎖의 PBS (10% hexane 함유)에 넣은 후, 10초간 vortexing하였다. 이후에 5,000rpm에서 30초간 원심분리 한 후 상층액을 조심히 모두 제거하였다. 1㎖의 PBS를 넣고 마이크로비드를 조심히 재현탁 한 후, 5,000rpm에서 30초 동안 원심분리하고, 상층액을 조심히 제거하였다. 다시 1㎖의 PBS로 마이크로비드를 조심히 재현탁 한 후, 새로운 마이크로튜브에 옮겨 담았다.

상기의 방법으로 오일을 제거한 후, 회수한 GFP 세포를 함유하는 마이크로비드(도 8)를 FACS로 분석하여 유의한 결과를 얻었다.

FACS 분석은 GFPuv 파장대(Excitation 395nm, Emission 509nm)에 적합한 blue 레이져가 사용되었다. GFPuv 세포가 포함된 비드 및 불포함 비드의 형광강도의 차이가 뚜렷이 구분되는 양상을 보였다(도 9A 및 9B). 또한 형광 강도별로 정렬하였으며(도 9C), 정렬된 비드를 LB 아가 플레이트에 spreading하여 배양한 후, 비드의 GFPuv 세포 포함 여부를 확인하였다(도 10). 대조군 (GFP 불포함 겔 비드)과 비교하여 높은 형광강도를 보이는 집단을 분리(sort)하여 배양한 결과 GFP 콜로니가 형성되는 것을 확인하였으며, 대조군과 비슷한 형광강도를 가지는 집단을 분리(sort)하여 배양한 플레이트에서는 GFP 콜로니가 형성되지 않는 것을 확인하였다. 따라서 FACS 분석을 통해 GFPuv 세포를 포함하는 마이크로비드와 GFPuv 세포를 포함하지 않는 마이크로비드를 구분하고 분리할 수 있음을 증명하였다.

(5) MU 를 함유하는 마이크로비드의 제작 및 FACS 분석

엑소셀룰라아제의 대표적인 기질인 4-메틸움벨리퍼릴-β-D-셀로바이오사이드(4-Methylumbelliferyl-β-D-cellobioside; 이하 'MUG₂'라고 함)의 분해 산물인 4-메틸움벨리퍼론(4-Methylumbelliferone; 이하 'MU'라고 함)을 이용하여 h/o 에멀젼을 제작한 후, 오일을 제거하고 마이크로비드를 수득하여 형광현미경 및 FACS 분석을 실시하였다.

3%(w/v) 저융점 아가로오스(low melting agarose)를 함유하는 LB 액체 배지를 멸균 후, 65℃ 인큐베이터에 보관하였다. 상기 보관된 아가로오스-LB 배지 용액 1㎖을 취하여 1.5㎖ 마이크로튜브에 넣고, 40℃로 셋팅된 힛 블럭(hit block)에 넣어 용액의 온도가 40℃가 되도록 하였다.

1㎖의 culture broth (E. coil XL1-blue, OD₆₀₀=0.6)를 채취하여 6,000rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고 세포를 1×PBS로 세척하였다. 세포를 40℃의 1mM MU가 함유된 1㎖의 아가로오스-LB 배지 용액에 재현탁하고 그 중에서 200㎕를 채취하여 400㎕의 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture; 2.9% ABIL EM 90 in mineral oil)에 넣어주었다.

40℃의 힛 블럭(hit block)에 고정시킨 후 균질기를 이용해 9,500rpm에서 1분 동안 균질화(homoginization) 한 후, 얼음 위에서 5분 동안 방치하여 겔화 하였고, 상기 제작된 h/o 에멀젼을 형광현미경으로 확인하였다.

오일 제거 후 FACS 분석을 하였으며, FACS 분석에는 MU의 파장대 (Excitation 360 nm, Emission 460 nm)에 적합한 violet 레이져가 사용되었다.

형광 현미경 관찰을 통해 마이크로비드가 성공적으로 형성되었으며 20분이 지난 후에도 강한 형광강도를 가지는 것을 확인하였다(도 11).

FACS 분석 또한 대조군 (MU를 함유하지 않은 비드)에 비해 형광강도가 뚜렷하게 높아져서 확실하게 구별되어지는 것을 확인함(도 12)으로써, 기존의 w/o/w 에멀젼 방법의 MU 확산 문제점이 개선되었음을 의미하며, 이를 이용한 신규효소의 초고속스크리닝의 실용가능성을 확인한 것이다.

(6) 엑소셀룰라아제 발현 세포와 MUG ₂ 기질을 이용한 h/o 제작 및 FACS 분석

엑소셀룰라아제 발현 대장균(E. coil) 세포와 MUG₂ 기질을 적용하여 h/o 에멀젼을 제작하였다. 엑소셀룰라아제 발현을 위한 DNA가 포함된 pHSG-celEdx16 plasmid (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011, 89:1453-1462)를 E. coil XL1-blue에 형질전환 시켰다. 형질 전환된 E. coil 세포를 OD₆₀₀=0.6이 될 때까지 키웠다.

1㎖의 culture broth를 채취하여 6,000rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고 세포를 1×PBS로 세척하였다. 상기 세척된 세포를 1 mM MUG₂가 함유된 1㎖의 agrose-LB 배지 용액에 재현탁하고 그 중에서 200㎕를 채취하여 400㎕의 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture; 2.9% ABIL EM 90 in mineral oil)에 넣어주었다. 40℃의 hit block에 고정시킨 후 균질기를 이용해 9,500rpm에서 1분 동안 균질화(homoginization)하여 h/o 에멀젼을 형성시킨 후, 얼음 위에서 5분 동안 방치하여 겔화하였다. 제작된 h/o 에멀젼을 37℃에서 24시간 반응시킨 후 오일을 제거하여 형광현미경으로 확인하고 FACS 분석을 실시하였다.

엑소셀룰라아제 발현 E. coil 세포가 마이크로비드 내의 MUG₂ 기질을 분해하여 비드에서 형광이 나타나는 것을 확인하였다(도 13). 또한, FACS분석 결과 대조군 (와일드 타입의 E. coil XL1-blue가 들어있는 비드)에 비해 높은 형광강도를 나타내어 둘 사이를 확실하게 구별할 수 있음을 확인하였다(도 14).

또한 와일드 타입의 대장균(E. coil) 세포와 엑소셀룰라아제 발현 대장균(E. coil) 세포를 9:1 비율로 섞어 상기와 동일한 방법으로 h/o 마이크로비드를 제작한 후 24시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 오일을 제거하여 마이크로비드 수득 후 FACS로 분석 및 형광강도 순으로 분리(sort)하였다(도 15).

음성 대조군과 비슷한 형광 값을 가지는 집단과 높은 형광 값을 가지는 집단을 각각 분리(sort)한 후 LB 아가플레이트에 spreading하여 밤새(overnight) 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니를 96-웰 세포 배양 플레이트에 1 mM MUG₂가 함유 된 LB 배지에 접종하여 12시간 배양 한 후 UV transilluminator를 이용하여 확인하였다(도 16).

또한 검은색 플레이트에 100㎕씩 옮겨 담은 후, 1420 VICTOR multilabel counter(PerkinElmer Life Sciences, Wallac Finland Oy, Turku, Finland; excitation=365 nm, emission≥460 nm)에서 형광 값을 측정하였다(도 16).

측정 결과, 음성대조군에 비해 형광 값이 높게 나온 집단을 분리(sort)하여 얻은 28개의 콜로니 중 3개만이 와일드 타입의 E. coil 세포였으며, 나머지 모두는 MUG₂를 분해하는 엑소셀룰라아제 발현 세포임을 확인하였다. 아마도 3개의 false positive는 에멀젼 형성 시, 하나의 마이크로비드 안에 와일드 타입 세포와 엑소셀룰라아제 발현 세포가 함께 섞여 들어가 발생된 결과라고 예상하였다. 또한, 음성대조군과 비슷한 형광 값을 보이는 집단을 분리(sort)하여 얻은 콜로니는 모두 와일드 타입의 E. coil 세포임을 확인하였다.

따라서 양성 세포를 포함한 비드를 FACS를 통해 성공적으로 검출 및 분리해 낼 수 있음을 확인하였으며, 이는 본 발명이 신규효소의 초고속 스크리닝하기 위한 툴로서 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 2. 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(polyethylene glycol diacrylate; PEGDA ) 비드의 IVC 기술을 이용한 h/o 제작 및 FACS 분석

PEGDA의 폴리머화(polymerization)를 위한 용액의 조성은 Lee 박사팀의 연구(Biotechnol Bioeng. 2010, 107(4):747-751)를 참고하였다.

GFP 발현 E. coil 세포를 OD₆₀₀=0.6이 될 때까지 키웠다. 1㎖의 culture broth를 채취하여 6,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 세포를 1×PBS로 세척하였다. 세포를 1㎖의 PEGDA 용액[0.19%(w/v) 과황화칼륨(potassium persulfate), 0.6%(w/v) D-솔비톨(D-sorbitol),24.8%(w/v) PEGDA in 1×PBS]에 재현탁시키고 그 중에서 200㎕를 채취하여, 0.1% TEMED가 함유된 400㎕의 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture; 2.9% ABIL EM 90 in mineral oil)에 넣어주었다. 균질기를 이용해 8,000rpm에서 1분 동안 균질화(homoginization)하여 h/o 에멀젼을 제작한 후, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션(incubation)하여 폴리머화(polymerization) 시켰다. 헥산(hexane)을 사용하여 오일을 제거한 후, 형광현미경으로 확인하고, FACS 분석을 실시하였다(도 17 및 18).

현미경 관찰결과, 하이드로겔 비드가 성공적으로 형성된 것을 확인하였으며 FACS 분석에서도 GFP를 포함하는 하이드로겔 비드를 성공적으로 하였다.

실시예 3. h/o 에멀젼에서 효과적인 오일 막 제거 및 마이크로비드 수득 양 측정

(1) h/o 에멀젼에서 오일 막 제거 방법에 따른 세포 생존율

2㎖ 마이크로튜브에 1×PBS로 희석한 다양한 농도의 유기용매(0, 10, 20, 30, 40, 50%)를 1㎖씩 분주하였다. 준비된 h/o 에멀젼을 100㎕ 채취하여 분주해 놓은 각 유기용매에 넣은 후 10초간 vortexing 한다. 8,000rpm에서 30초간 원심분리 한 후 상층액을 조심히 모두 제거한다. 1㎖의 PBS를 넣고 마이크로비드를 조심히 재현한 한 후 새로운 에펜 튜브에 옮겨 담는다. 이렇게 형성된 마이크로비드를 각각 50㎕ 씩 LB plate에 spreading 한 후 37℃에서 하루 동안 배양하여 콜로니 수를 관찰하였다(표 1).

또한 유기용매를 이용한 오일 제거 방법 개발 이 후 미네랄 오일을 이용한 오일 막 제거 방법을 개발하였으며 그 방법은 하기와 같다.

제작된 h/o 에멀젼 100㎕를 채취하여 1㎖의 미네랄 오일이 들어있는 2㎖의 에펜튜브에 넣는다. 1분 동안 vortexing한 후 3,000rpm에서 30초간 원심 분리하였다. 상층의 오일을 제거한 후, 다시 1㎖의 미네랄 오일을 넣고 1분간 vortexing하여 마이크로비드를 세척하였다. 30초간 원심분리 후, 상층의 오일을 제거하였다. 상기 세척과정을 한 번 더 반복한 후, 얻은 마이크로비드를 PBS로 재현탁하고, 3,000rpm으로 원심 분리하였다. 상층액을 조심히 제거하고, 1㎖의 PBS를 넣어 다시 재현탁 하였다. 이렇게 얻은 50㎕의 마이크로비드를 채취하여 LB plate에 spreading 한 후 37℃에서 하루 동안 배양하여 콜로니 수를 확인하였다(표 1).

표 1. 오일제거 방법에 따른 콜로니 생존 수

미네랄 오일을 이용한 오일제거 방법이 세포에 가장 안전하여 가장 높은 생존율을 나타났으며, 반면 2-프로판올(2-propanol)을 이용한 오일제거 방법이 가장 낮은 안전성을 보였다. 흥미롭게도 단지 PBS만으로 오일을 제거한 대조군에 비해서 헥산(hexane)을 사용하여 오일을 제거하였을 때 콜로니 수가 증가하였다. 이것은 비드의 회수 양으로 설명할 수 있는데, 단지 PBS로 제거하였을 때 보다 헥산(hexane)을 사용하였을 때 원활한 오일제거가 이루어졌고, 마이크로비드의 수득 양이 많아져 양이 증가한 만큼 콜로니 수 또한 함께 증가한 것으로 해석되었다.

(2) h/o 에멀젼으로부터 오일 막 제거 방법에 따른 마이크로비드 회수율 측정

h/o 에멀젼 생성 시 형성되는 마이크로비드 개수와 헥산(hexane) 및 미네랄 오일을 이용하여 오일을 제거한 후 회수한 마이크로비드의 개수를 비교하여 회수율을 측정하였다. 각각의 방법으로 오일을 제거하였을 때의 마이크로비드 개수를 혈구계수기(hemacytometer)를 이용하여 확인하였다.(표 2 및 도 19).

* 한 batch 당 제작되는 마이크로비드의 총 개수 계산방법; 총 마이크로비드 개수/ batch (600㎕) = 겔 비드의 총 개수/4×10 ⁴ ×6

제작된 600㎕의 h/o 에멀젼 중에서 50㎕를 채취하여 950㎕의 미네랄 오일에 넣어 20배 희석한 후, 10㎕를 채취하고, 이를 혈구계수기(hemacytometer)를 이용하여 현미경으로 확인하였다(도 19).

또한 100㎕의 h/o 에멀젼을 PBS, 헥산(hexane) 및 미네랄 오일을 이용하여 상기 기재된 오일 막 제거 방법으로 오일을 각각 제거하였다. 오일이 제거된 마이크로비드는 최종 1㎖의 PBS에 재현탁(resuspension)하여 10배 희석하였다. 상기 10배 희석된 재현탁 용액들에서 10㎕씩 각각 채취하고, 이를 혈구계수기(hemacytometer)를 이용하여 현미경으로 확인하였다(도 19). 오일을 제거하기 전의 h/o 에멀젼의 경우 오일을 제거한 비드에 비해 2배 더 희석되었으므로 위의 계산방법에 곱하기 2를 하여 비드 개수를 계산하였다.

h/o 에멀젼으로부터 각각의 오일제거 방법으로 얻은 마이크로비드의 개수와 회수율을 표로 나타내었다(표 2).

표 2. 마이크로비드의 개수 및 회수율

오일 막 제거 전 h/o 마이크로비드 (600㎕ 에멀젼/tube) 총 개수는 약 1.06 × 10⁷개가 만들어졌다. 이 시료를 이용하여 10% 헥산(hexane)을 이용하여 오일을 제거하였을 때 총 8.16 × 10⁶ 개, 미네랄 오일을 사용하였을 때 7.56 × 10⁶개의 마이크로비드를 회수할 수 있다.

최종적으로 오일 막 제거 방법을 고려할 때, 마이크로비드의 수득율도 높고, 세포의 생존율이 가장 높은 미네랄 오일을 이용한 제거방법이 가장 적합함을 확인하였다.

비교예 1. 오일-내-수분 에멀젼(water-in-oil emulsions)의 IVC 를 이용한 FACS 분석

(1) GFP 세포를 이용한 w/o/w 제작 및 확인

LB 액체 배지에서 OD₆₀₀=0.6이 될 때까지 GFP(green fluorescent protein) 발현 대장균(E. coil) 세포를 키웠다. 1㎖의 culture broth를 채취하여 6,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 조심스럽게 제거하고, 1×PBS로 세포를 세척한 후, 1㎖의 LB 액체배지에 재현탁 하였다.

수분-내-오일-내-수분(water-in-oil-in-water; w/o/w) 이중 에멀젼(double emulsions) 형성의 최적 조건을 수립하였다(Nat. Methods 2006, 3: 561-570). 현탁된 200㎕의 세포를 채취하여 400㎕의 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture; 2.9% ABIL EM 90 in mineral oil)에 넣어주었다. 균질기(homogenizer; IKA Ultra Turrax T10)를 이용해 실온에서 8,000rpm으로, 1분 동안 균질화(homoginization)하여 w/o 에멀젼을 형성시켰다.

형성된 w/o 에멀젼에 500㎕의 완충용액(assay buffer; 1.5% CMC, 0.5% Triton X-100)를 넣고 실온에서 8,000rpm으로, 1분 동안 균질화(homoginization)하여 w/o/w 이중(double) 에멀젼을 완성하였다. 완성된 에멀젼은 1×PBS로 20배 희석한 후, 형광현미경(Leica)을 이용하여 성공적으로 GFP 세포를 함유하는 w/o/w 에멀젼의 IVC 형성되었음을 확인하였다(도 20).

(2) MU 형광체를 이용한 w/o/w 제작 및 확인

엑소셀룰라아제의 대표적인 기질인 4-메틸움벨리퍼릴-β-D-셀로바이오사이드(4-Methylumbelliferyl-β-D-cellobioside; 이하 'MUG₂'라고 함)의 분해 산물인 4-메틸움벨리퍼론(4-Methylumbelliferone; MU)을 이용하여 w/o/w의 IVC를 제작하고, IVC를 형광현미경을 이용하여 확인하였다. 상기 IVC는 셀룰라아제를 발현하고 분비하는 세포 및 기질을 실제 적용하기 위해 진행하였으며 제작방법은 하기와 같다.

OD₆₀₀=0.6이 될 때까지 대장균(E. coil XL1-blue) 세포를 키웠다. 1㎖의 culture broth를 채취하여 6,000rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고, 1×PBS로 세포를 세척하였다. 상기 대장균(E. coil XL1-blue) 세포를 1 mM의 MU가 포함된 1㎖의 LB 액체 배지에 재현탁하고, 그 중에서 200㎕를 채취하여 400㎕의 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture; 2.9% ABIL EM 90 in mineral oil)에 넣어주었다. 조식파쇄기(homogenizer)를 이용해 8,000rpm으로 1분 동안 균질화(homoginization)하여 w/o 에멀젼을 형성시켰다.

형성된 w/o 에멀젼에 500㎕의 완충용액(assay buffer; 1.5% CMC, 0.5% Triton X-100)를 넣고 조식파쇄기를 이용하여 실온에서 8,000rpm으로, 1분 동안 균질화(homoginization)하여 w/o/w 이중(double) 에멀젼을 완성하였다. 완성된 에멀젼은 1×PBS로 20배 희석한 후, 형광현미경(Reica)을 이용하여 확인하였다(도 21).

(3) 셀룰라아제 발현 세포와 MUG ₂ 기질을 이용한 w/o/w 제작 및 분석

실제 셀룰라아제를 발현하는 형질전환 세포와 MUG₂ 기질을 적용하여 w/o 에멀젼 내에서의 기질 분해에 따른 형광신호를 확인하였다.

엑소셀룰라아제 발현을 위한 insert가 포함된 plasmid DNA를 XL1-blue E. coil 세포에 도입하여 형질전환 시켰다. 형질 전환된 대장균(E. coil) 세포를 O.D₆₀₀=0.6이 될 때까지 키운다. 1㎖의 culture broth를 채취하여 6,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 세포를 1×PBS로 세척하였다. 세포를 1mM MUG₂가 포함된 1㎖ LB 액체 배지에 재현탁시키고 그 중에서 200㎕를 채취하여 400㎕의 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture; 2.9% ABIL EM 90 in mineral oil)에 넣어주었다. 균질기(homogenizer; IKA Ultra Turrax T10 homogenizer)를 이용해 8,000rpm에서 1분 동안 균질화(homoginization)하여 w/o 에멀젼을 형성시켰다. 형성된 w/o 에멀젼을 37℃에서 24시간 동안 반응시킨 후, 형광 현미경으로 확인하였다 (도 22).

w/o 에멀젼 내부의 액체 층에서 셀룰라아제 발현 세포에 의한 MUG₂ 기질의 분해에 따른 형광신호가 확인되었다. 그러나 w/o 에멀젼 내부에 세포의 유무와 상관없이 모든 에멀젼의 액체 층에서 형광신호가 확인되었다. 물론 세포가 포함되어있는 에멀젼에서의 형광 신호가 세포가 없는 에멀젼에 비해 조금 더 강하게 나타나기는 하였다. 세포가 없는 에멀젼에서의 형광신호는 MUG₂ 기질의 분해 산물인 MU가 오일 층을 통과하여 다른 에멀젼에 확산되는 것으로 확인되었다.

상기의 확산 결과를 확인한 후, MU의 오일 밖으로의 확산을 보다 더 명확히 확인하기 위해 하기와 같은 추가적인 확산 분석을 진행하였다. 100mM NaCl 용액에 1 mM MU가 첨가된 것과 첨가되지 않은 시료를 각각 200㎕씩 채취하여 400㎕의 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture; 2.9% ABIL EM 90 in mineral oil)에 넣어주었다. 균질기를 이용해 8,000rpm에서 1분 동안 균질화(homoginization)시켜 w/o 에멀젼을 형성시켰다.

형성된 w/o 에멀젼에 어세이 완충용액(assay buffer, 1.5% CMC, 0.5% Triton X-100) 500㎕를 넣고 균질기를 이용하여 8,000rpm, 실온에서 1분 동안 균질화(homoginization)하여 w/o/w double 에멀젼을 완성하였다. MU가 함유된 또는 함유되는 않은 각각의 w/o/w 에멀젼을 1:1 (v/v)로 혼합한 후 현미경을 통해 관찰하였다(도 23).

혼합 직후에는 w/o/w double 에멀젼의 IVC 내에서만 형광이 나타났으나, 20분이 지나면 형광신호의 강도의 차이는 있으나 모든 에멀젼에서 형광신호가 관찰되는 것을 확인하였다. 광학현미경 결과와 비교하더라도 IVC 형태는 유지하지만, IVC 외부에 형광이 빠져나가 있는 현상을 확인할 수 있었다.

MU가 오일 막 통과하여 확산이 일어나지 않는다면 MU가 함유된 에멀젼과 함유되지 않은 에멀젼의 비율이 약 1:1로 관찰되어야 하지만, 20분이 지난 후 모든 에멀젼에서 형광신호가 관찰되었으므로 이는 MU가 오일 막 통과하여 모든 에멀젼으로 확산되었다는 것을 의미한다.

또한, MU가 함유된 에멀젼을 PBS로 20배 희석하여 그 형광신호를 FACS (BD Biosciences, USA)로 분석하였다. FACS 분석에는 MU 검출의 파장대(Excitation 360 nm, Emission 460 nm)에 적합한 violet 레이져가 사용되었다.

대조군 (MU가 함유되지 않은 에멀젼)에 비해 형광신호가 더 높게 검출 될 것이라는 기대에도 불구하고 형광강도의 검출 양상이 대조군과 유사한 분석결과를 보였다(도 24). 이는 에멀젼을 PBS로 희석한 후 MU의 확산에 따른 형광강도의 저하 때문일 것으로 판단하였다. 상기 결과는 기 발표 된 논문을 통해서도 예측 가능한 것이다(Anal Bioanal Chem. 2012, 404(5):1439-1447, Anal Chem. 2013, 85: 9807-9814).

또한, GFP 세포가 함유된 w/o/w 에멀젼의 FACS 분석도 성공적인 결과를 얻지 못하였다. 대조군(E. coli)에 비해 커다란 차이로 검출 될 것이라 생각하였으나, 생각보다는 특이적으로 GFP 세포의 검출이 용의하지 않는 유사한 분석결과를 보였다(도 25). 정확한 이유는 알 수 없으나 w/o/w의 IVC 기법을 FACS 분석에 적용하는 것은 여러 가지로 민감한 것으로 판단되었다. 상기 결과들로부터, IVC 기반의 효소탐색 기법으로서 기존의 w/o/w 방식은 저분자 형광산물을 생성하는 기질을 이용하는 것에 민감성과 한계성을 가진다는 것을 확인하였다.

Claims

(a) 아가로오스(agarose) 또는 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(polyethylene glycol diacrylate: PEGDA)을 포함하는 액체배지를 제조하는 단계;
(b) 상기 제조된 액체배지를 세포에 첨가하여 현탁액을 형성시키는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 현탁액을 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture)에 첨가하는 단계; 및
(d) 8,000 내지 13,500rpm으로 30 내지 180초 동안 균질화 하고, 겔(gel)화 하여 단일세포가 함유되며, 10~20㎛의 평균직경을 갖는 오일 내 하이드로겔(hydrogel-in-oil) 에멀젼을 형성하는 단계;를 포함하는 세포외 구획화(in vitro compartmentalization; IVC) 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (d) 이후에, 에멀젼에 함유된 세포를 30 내지 37℃에서 1 내지 24시간 동안 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 구획화 (in vitro compartmentalization; IVC) 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (b)에서, 기질을 더 첨가하여 현탁액을 형성하는 것을 특징으로 하는 세포외 구획화(in vitro compartmentalization; IVC) 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 아가로오스는 2 내지 4%(w/v) 저융점 아가로오스 (low melting agarose)인 것을 특징으로 하는 세포외 구획화(in vitro compartmentalization; IVC) 방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 세포는 대장균 (E. coli)인 것을 특징으로 하는 세포외 구획화(in vitro compartmentalization; IVC) 방법.
제1항 내지 제3항, 제5항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 세포외 구획화(IVC) 방법으로 제조된 단일세포가 함유되며, 10~20㎛의 평균직경을 갖는 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsion).
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(a) 제9항에 따른 단일세포가 함유되며, 10~20㎛의 평균직경을 갖는 오일 내 하이드로겔 에멀젼에 기질을 첨가하는 단계;
(b) 상기 단계(a)에서 첨가된 기질과 하이드로겔 내의 단일세포에 포함된 효소가 반응하는 단계; 및
(c) 상기 단계(b)의 반응 결과를 유세포 분석(fluorescence-activated cell sorting; FACS) 방법으로 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 신규효소 초고속 스크리닝 방법.
제11항에 있어서, 상기 단계(a) 이전에 단일세포가 함유되며, 10~20㎛의 평균직경을 갖는 오일 내 하이드로겔 에멀젼(hydrogel-in-oil emulsion)으로부터 오일 막을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 신규효소 초고속 스크리닝 방법.
제12항에 있어서, 상기 오일 막의 제거는 미네랄 오일(mineral oil), 헥산(hexane) 및 2-프로판올(2-propanol)　중에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것을 특징으로 하는 신규 효소 초고속 스크리닝 방법.