KR102087928B1 - 지방세포 및 마크로파지 공동 배양을 이용한 글루코스 수용성 평가 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지방세포와 마크로파지의 공동 배양에 의해 형성되는 인슐린저항성을 가지는 유사지방모델을 이용한 글루코스 수용성 고속 대량 스크리닝(high throughput screening) 및 이의 활용에 관한 것으로, 본 발명은 비드(bead) 형태의 하이드로겔 스캐폴드를 이용해 지방세포와 마크로파지를 3차원으로 공동 배양하여 인슐린저항성을 가지는 유사지방모델을 형성할 수 있고, 내부에 지방조직이 형성된 하이드로겔 스캐폴드를 이용하여 당뇨병을 포함한 대사성 질환 치료 및 예방을 목적으로 하는 약물 개발에 필요한 글루코스 수용성 평가를 고속 대량 스크리닝 방법으로 수행할 수 있다.

Description

지방세포 및 마크로파지 공동 배양을 이용한 글루코스 수용성 평가 방법{Method for glucose uptake assay using co-culture of adipocytes with macrophages}

본 발명은 지방세포와 마크로파지의 공동 배양에 의해 형성되는 인슐린 저항성을 가지는 유사 지방 모델을 이용한 글루코스 수용성 고속 대량 스크리닝(high throughput screening) 및 이의 활용에 관한 것이다.

화합물, 약물 등 어떠한 물질에 의한 효과를 확인하는 방법은 물리, 화학, 생물 등 다양한 분야의 연구 개발 과정에서 중요하다. 특히, 생물 분야에 있어서 신약을 개발하는 과정 중 후보 신약 물질의 효과를 신속하고, 정확하게 스크리닝 하는 방법은 매우 중요하다.

신약 후보 물질의 효과를 확인하는 스크리닝 시스템 중 특정 표적에 대한 대량의 생물 및 화학 화합물의 효과를 확인하는 고속 대량 스크리닝 방법(High throughput screening) 방법은 스크리닝의 자동화를 가능하게 하고, 신속하며 비용이 절감되는 등 신약 개발에 있어 주요 기술로 각광 받고 있다.

고속 대량 스크리닝을 위한 핵심 기술이나 소재에 대한 개발도 활발한데, 고속 대량 스크리닝에 사용되는 소재는 균일한 특성을 가지고, 내구성이 좋으며, 처리되는 물질에 대한 민감도가 높을 필요가 있다. 세포나 조직을 직접 이용하는 경우, 세포나 조직에 손상을 가하지 않으면서 구획화가 가능하고 이들을 효과적으로 담지할 수 있는 담체 등이 필요하다. 이러한 담체는 약물과 같은 시험 물질, 세포나 조직을 성장시키거나 자극하기 위한 배지나 다양한 성분을 흡수할 수 있어야 하고 시험 물질 처리에 의해 나타나는 세포나 조직의 생물학적 현상에 영향을 미치지 않아야 한다. 예를 들어 한국 공개특허 제10-2015-01432177호에서는 오일 내 하이드로겔 에멀젼에 세포를 포함시키는 방법을 이용한 고속 대량 스크리닝 방법을 개시하고 있다.

또한, 신약 스크리닝에 있어서 세포를 이용한 고속 대량 스크리닝을 위해서는 세포의 3차원 배양을 통해 체내 환경과 같은 상호작용이 가능하도록 하여야 인간을 포함한 동물에서 나타날 수 있는 신약 후보 물질의 효과를 예측할 수 있다. 세포의 3차원 배양을 위해서는 세포의 증식과 분화를 3차원 적으로 유도할 수 있는 스캐폴드(구조체)가 필요한데, 고속 대량 스크리닝 과정에서 구조가 일정하게 유지될 수 있고 다양한 물질이 용이하게 흡수되어 스캐폴드 내부로 효과적인 전달이 가능하여야 한다. 예를 들어, 한국 공개특허 제10-2014-0043808호에서는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane)과 하이드로겔을 이용하여 3차원 세포 배양이 가능한 기술과, 이를 이용한 고속 대량 스크리닝 방법을 개시하고 있다.

신약 스크리닝 기술에서 당뇨나 비만과 같은 대사질환 치료제를 개발하는데 사용하는 방법은 특정 대사질환에서 발생하는 현상이나 작용기전 등을 억제 또는 조절할 수 있는 물질의 처리로 수행될 수 있다. 예를 들어, 한국 공개특허 제10-2018-002503호는 지방 세포 분화를 억제할 수 있는 특정 물질을 활용한 스크리닝 방법을 개시하고 있다. 이러한 방법은 특정 대사질환에 특화되어 스크리닝의 정확성이 높은 장점이 있으나 다양한 대사질환에 적용하기는 어려울 수 있다.

이에 본 발명자들은 대사성 질환과 관련된 세포 배양 모델에 대한 연구를 지속한 결과 고속 대량 스크리닝에 적합하고 다양한 대사성 질환 치료제 스크리닝이 가능한 방법을 개발하게 되었다.

대한민국 공개특허공보 제2015-0143177호 대한민국 공개특허공보 제2014-0043808호 대한민국 공개특허공보 제2018-002503호

본 발명은 지방세포 및 마크로파지를 포함한 하이드로겔 스캐폴드에서 지방세포와 마크로파지를 3차원으로 공동 배양(co-culture)하여 인슐린 저항성을 가지는 유사 지방 모델을 형성하고, 이를 이용하여 초고속으로 대량의 글루코스 수용성 평가가 가능한 방법 및 이를 활용한 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 a) 지방전구세포, 마크로파지 및 알지네이트 하이드로겔을 포함한 혼합물을 3차원 세포-적하 시스템을 이용하여 하이드로겔 스캐폴드를 제조하는 단계; b) 하이드로겔 스캐폴드에 배양액을 처리하여 지방전구세포 및 마크로파지가 인슐린 저항성을 가지는 유사 지방 모델을 형성하도록 증식 및 분화시키는 단계; c) 하이드로겔 스캐폴드에 혈청 결핍(serum free) 배지를 처리하는 단계; d) 하이드로겔 스캐폴드에 크랩스-링거 중탄산염 완충용액(Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer)을 처리하는 단계; e) 하이드로겔 스캐폴드에 시험 물질을 처리하는 단계; f) 하이드로겔 스캐폴드에 인슐린을 처리하는 단계; g) 하이드로겔 스캐폴드에 글루코스 또는 글루코스 유사체(glucose analogue)를 처리하는 단계; 및 h) 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 세포 내부의 글루코스 또는 글루코스 유사체 함량을 측정하는 단계;를 포함하는 글루코스 수용성 평가(glucose uptake assay) 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 d) 단계의 크랩스-링거 중탄산염 완충용액은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 글루코스 또는 글루코스 유도체를 포함하지 않고, 염화칼슘(CaCl₂)를 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 e) 단계의 시험 물질은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 대사질환 치료제 또는 대사질환 치료제 후보 물질 등일 수 있다.

본 발명에서, 상기 대사질환은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 비만, 당뇨병, 지방간, 고혈압, 허혈성 심질환, 심부전증, 골다공증 및 암 등으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명에서, 상기 글루코스 유도체는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-ul)Amino)-2-Dedoxyglucose) 등일 수 있다.

본 발명에서, 상기 2-NBDG의 농도는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 300 내지 500 μM일 수 있다.

본 발명에서, 상기 b) 단계의 인슐린 저항성을 가지는 유사 지방 모델은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 인슐린 저항성이 유도된 유사지방조직 내 세포일 수 있다.

본 발명에서 상기 b) 단계의 유사 지방 모델 형성은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 지방조직 형성 촉진을 위해 인슐린을 포함한 배지에서 증식 및 분화되고, 분화 종료 후 상기 하이드로겔 스캐폴드에 잔류된 인슐린을 제거하는 단계일 수 있다.

본 발명에서, 상기 b) 단계의 지방전구세포 및 마크로파지 배양은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 세포외기질(Extra Cellular Matrix)이 존재하지 않는 조건에서 배양될 수 있다.

본 발명에서, 상기 평가 방법은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 세포의 세포의 DNA를 정량화하고, DNA 정량화 값을 글루코스 또는 글루코스 유도체의 정량화에 사용하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 a) 단계의 알지네이트 하이드로겔은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 알지네이트, 젤라틴 및 콜라겐을 함유할 수 있다.

본 발명은 비드(bead) 형태의 하이드로겔 스캐폴드를 이용해 지방세포와 마크로파지를 3차원으로 공동 배양하여 인슐린 저항성을 가지는 유사 지방 모델을 형성할 수 있고, 내부에 인슐린 저항성을 가지는 유사 지방 모델이 형성된 하이드로겔 스캐폴드를 이용하여 당뇨병을 포함한 대사성 질환 치료 및 예방을 목적으로 하는 약물 개발에 필요한 글루코스 수용성 평가를 고속 대량 스크리닝 방법으로 수행할 수 있다.

도 1은 본 발명의 글루코스 수용성 고속 대량 스크리닝을 위한 3차원 비드 하이드로겔 스캐폴드의 구조체와 버퍼의 종류에 따른 비드 형태의 구조 유지력 비교를 보여준다.
도 2는 본 발명의 하이드로겔 스캐폴드에 적합한 크랩스-링거 중탄산염 완충용액(Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer)의 조성을 보여준다.
도 3은 본 발명의 하이드로겔 스캐폴드에서 배양된 지방전구세포(3T3-L1) 및 마이크로파지 세포주(RAW264.7)의 공동 배양 결과로, 지방전구세포의 지방세포로의 분화 및 지방조직 형성의 형광현미경 이미지((A))와 그래프((B))를 보여준다.
도 4는 본 발명의 하이드로겔 스캐폴드에서 배양된 지방세포, 지방전구세포 및 마크로파지의 공동배양에서 발현된 단백질의 발현 정도((A))와, 글루코스 유사체인 2-NBDG의 수용 정도 차이를 보여준다((B)).
도 5는 본 발명의 글루코스 수용성 평가 방법에 따라 인슐린 저항성 치료제인 로지글리타존(Rosiglitazone)과 GW9662의 글루코스 수용 정도를 평가한 결과를 보여준다.
도 6은 본 발명의 글루코스 수용성 평가를 수행하기 위한 과정을 도식화한 것이다.

도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 고속 대량 스크리닝(High throughput screening)을 적용할 수 있는 글루코스 수용성 평가(glucose uptake assay) 방법에 관한 것이다.

본 발명의 글루코스 수용성 평가는 하이드로겔 스캐폴드를 이용한 지방세포와 마크로파지의 3차원 공동 배양을 활용한 방법이다. 지방세포와 마크로파지의 3차원 공동 배양은 인슐린 저항성을 가지는 지방 조직과 유사한 지방 모델을 형성할 수 있어, 지방 조직, 지방 조직에 포함된 세포나 단백질에 영향을 줄 수 있는 다양한 물질의 효과를 실제 동물에서 일어나는 효과와 거의 동일한 수준으로 측정할 수 있다.

본 발명의 글루코스 수용성 평가는 지방전구세포 및 마크로파지를 포함한 하이드로겔 스캐폴드를 제조하고, 지방전구세포 및 마크로파지를 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 채로 공동 배양하여 지방전구세포를 지방세포로 분화 및 증식시키고, 유사 지방 조직이 형성된 하이드로겔 스캐폴드에 인슐린, 글루코스 또는 글루코스 유도체, 신약 후보 화합물과 같은 물질을 처리하는 과정을 통해 수행될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 글루코스 수용성 평가는 a) 지방전구세포, 마크로파지 및 알지네이트 하이드로겔을 포함한 혼합물을 3차원 세포-적하 시스템을 이용하여 하이드로겔 스캐폴드를 제조하는 단계, b) 하이드로겔 스캐폴드에 배양액을 처리하여 지방전구세포 및 마크로파지가 인슐린 저항성을 가지는 유사지방모델을 형성하도록 증식 및 분화시키는 단계, c) 하이드로겔 스캐폴드에 혈청 결핍(serum free) 배지를 처리하는 단계, d) 하이드로겔 스캐폴드에 크랩스-링거 중탄산염 완충용액(Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer)을 처리하는 단계, e) 하이드로겔 스캐폴드에 시험 물질을 처리하는 단계, f) 하이드로겔 스캐폴드에 인슐린을 처리하는 단계, g) 하이드로겔 스캐폴드에 글루코스 또는 글루코스 유사체(glucose analogue)를 처리하는 단계 및 h) 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 세포 내부의 글루코스 또는 글루코스 유사체 함량을 측정하는 단계를 포함한 방법으로 수행될 수 있다.

a) 단계는 지방세포 및 마크로파지의 공동 배양을 위한 하이드로겔 스캐폴드를 제조하는 단계로서, 알지네이트 하이드로겔과 함께 지방전구세포와 마크로파지를 혼합한 혼합물을 제조하고 3차원 세포-적하 시스템을 통해 본 발명에서 목적하는 하이드로겔 스캐폴드를 제조할 수 있다.

상기 하이드로겔 스캐폴드 제조 방법은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지않으며, 일예로, 주사기 등을 이용하여 수작업으로 형성하는 방법, 장비를 활용하는 방법 등 사용 가능한 방법을 제한 없이 적용하여 제조할 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 하이드로겔 스캐폴드는 3차원 세포-적하 시스템을 통해 비드(bead) 형태로 제조될 수 있으나, 그 형태 또한 한정되는 것은 아니며, 하이드로겔 스캐폴드 내의 세포 배양을 포함한 글루코스 수용성 평가 과정에서 사용되는 배양액이나 버퍼 등에 따라 글루코스 수용성 평가가 진행되는 동안 비드 형태를 유지할 수 있다.

본 발명에서 알지네이트 하이드로겔은 조류로부터 유래된 알지네이트를 포함하여 제조한 하이드로겔을 의미한다. 알지네이트 하이드로겔에서 알지네이트는 수용성 고분자 전해질로 염화칼슘과 같은 다원자가 양이온 염을 사용하여 가교결합을 이룰 수 있다. 조류 베이스의 하이드로겔의 경우 알지네이트의 함량이 하이드로겔 스캐폴드 생성을 위한 지방세포, 마크로파지 및 알지네이트 하이드로겔 혼합물 대비 1 내지 4%, 1.5 내지 4%, 바람직하게는 1 내지 3% 보다 바람직하게는 1.5 내지 2.5%일 수 있다. 알지네이트의 함량이 충분하지 못한 경우 구조체의 용해도가 증가하고, 알지네이트의 함량이 높은 경우 세포들의 증식 및 생존율이 감소할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 알지네이트의 함량을 조절하여 글루코스 수용성 평가가 진행되는 동안 그 형태를 일정하게 유지할 수 있다.

하이드로겔과 혼합되는 세포 수가 많은 경우 배양 시간이 지날수록 증식률이 상승하게 되어, 혼합된 세포 수는 1x10⁵ cells/ml 이상인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 세포수가 1x10⁴ cells/ml 미만일 경우 증식이 원활하게 이루어지지 않을 수 있다. 본 발명에서 하이드로겔 스캐폴드는 공동 배양시 세포들이 분화, 증식 및 세포와 세포간의 상호작용에 의해 유사 조직이 형성되는 장소이다. 2차원 세포배양을 하는 경우 세포 각각이 특정 부분에서만 세포와 세포간의 상호작용을 하고, 증식 방향이 일방적이며, 분화 및 증식을 통해 세포 수가 증가되는 경우에도 세포 각각이 세포와 세포간의 상호작용을 할 수 있는 세포들이 한정적이다. 또한, 세포에서 분비되는 다양한 대사물질들이 축적되고, 불균형한 농도 구배를 이루게 된다. 그리하여, 이차원적으로 체외에서(in vitro)에서 세포 배양하는 경우에는 세포와 세포간의 상호작용이 체내에서(in vivo)와 같은 상호작용이 유도될 수 없으며, 체내와 유사한 구조체를 형성하기도 어렵다.

하이드로겔에는 젤라틴 및 콜라겐이 더 포함될 수 있으며, 젤라틴과 콜라겐의 함량은 지방전구세포, 마크로파지 및 하이드로겔 혼합물 대비 각각 0.01 내지 10.0%(w/v), 좋게는 0.05 내지 5%(w/v), 더욱 좋게는 0.1 내지 2%(w/v)인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 하이드로겔 스캐폴드의 경우 지방세포와 마크로파지가 입체적인 구조의 하이드로겔 스캐폴드에 포함되어 있어, 세포 각각이 생체내의 세포와 같이 주위 모든 방향으로 세포와 세포간의 상호작용이 가능하고, 증식 방향이 일방적이지 않으며, 분화 및 증식을 통해 세포 수가 증가되는 경우에도 세포 각각이 지속적으로 주위 세포들과 세포와 세포간의 상호작용을 할 수 있다. 또한, 세포에서 분비되는 다양한 대사물질들이 특정 지역에 축적되는 것이 아니며 생체 내에서와 같이 주위 모든 방향으로 분비될 수 있어 불균일한 농도 구배를 방지할 수 있다. 이러한 특징에 의해, 지방세포와 마크로파지의 공동 배양시 체내와 같은 세포와 세포간의 상호작용을 유도할 수 있고, 이에 따라 인슐린저항성을 가지는 지방조직과 같이 기능이 유사한 유사 지방 조직을 형성하게 된다.

b) 단계는 3차원 세포-적하 시스템을 이용하여 제조된 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 세포를 배양하여 분화 및 증식을 시키는 단계로, 세포를 포함한 하이드로겔 스캐폴드에 지방세포 분화용 배양액을 처리하면 하이드로겔 스캐폴드 내부로 배양액이 흡수되고 하이드로겔 스캐폴드 내부에서 지방전구세포와 마이크로파지가 공동 배양될 수 있다. 지방전구세포는 지방세포로 분화하게 되고, 대사증후군 질환 관련 지방 생체모사시스템을 형성할 수 있게 된다.

세포 배양액은 둘베코수정이글배지(Dulbecco’s　modified　Eagle’s　medium, DMEM)와 같이 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 사용되는 배지를 사용할 수 있고, 지방전구세포의 분화 및 증식과 지방조직 형성에 적합한 배지나 성분을 적절하게 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 지방 세포의 성숙과 세포 내 지방입자의 축적을 유도하기 위해 인슐린을 함유하는 분화 배지에서 배양할 수 있다.

세포 배양 기간은 5 내지 10일, 바람직하게는 6 내지 10일, 보다 바람직하게는 7 내지 9일이나 이에 제한되는 것은 아니고 하이드로겔 스캐폴드 제조를 위한 혼합물에 포함된 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 이온 함량, 세포의 밀도 등에 의해 적절하게 조절할 수 있다.

b) 단계에 의해 형성된 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 세포는 인슐린 저항성이 유도되어 글루코스 수용성 평가에 적합한 대사증후군 질환 관련 지방 생체모사 모델을 제공할 수 있다.

c) 단계는 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 혈청(serum)을 고갈시키는 단계로서, 혈청이 포함되지 않은 혈청 결핍(serum free) 배지에서 하이드로겔 스캐폴드를 배양하여 혈청 기아(serum starvation) 단계를 유도하게 된다. 상기 혈청 기아 단계를 유도하는 것은 혈청이 소의 태아로부터 얻어진 물질로 세포들의 성장과 안정성을 유지하지만, 혈청 내의 구성 성분에 대해서는 정확히 알려져 있지 않고, 전문 제조사에 따라 상이할 뿐만 아니라, 고비용의 혈청 및 구성 성분의 불확실성을 극복하기 위한 세포용 배지가 개발되어 왔기 때문에, 성장률이 다소 저하되더라도 세포의 성장과 유지에 영향이 없도록 하면서 단순 성장 배지 조성 성분 만으로 배양이 가능하며, 이를 통해 세포를 이용한 실험 수행 중 각종 성장 인자에 대한 간섭을 억제할 수 있기 때문이다. c) 단계에 앞서(혹은 b) 단계 후), 하이드로겔 스캐폴드 내에 잔류되어 있는 인슐린의 제거와 세포의 안정성을 위해 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)과 페니실린이나 스트렙토마이신과 같은 항생물질을 포함한 배지에서 하루 정도 배양할 수 있다.

d) 단계는 크랩스-링거 중탄산염 버퍼(Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer, KRB Buffer)을 처리하여 하이드로겔 스캐폴드 구조체 내부의 버퍼(buffer)를 교환하는 단계이다. d) 단계에서 처리하는 크랩스-링커 중탄산염 버퍼는 글루코스(glucose)를 포함하지 않고, 염화칼슘(CaCl₂)를 포함하고 있는 조성으로 사용할 수 있다. KRB 버퍼를 처리하는 이유는 일반 배지에서의 높은 당 성분을 제거하여 분석하고, 버퍼 내에 포함된 칼슘에 의한 스캐폴드의 형태 유지를 위한 것이다. 도 2는 본 발명에서 사용한 크랩스-링커 중탄산염 버퍼의 조성을 나타낸 것으로 염화칼슘이 포함되어 있어 하이드로겔 스캐폴드의 형태를 비드 형태로 유지시켜 줄 수 있다.

e) 단계는 글루코스 수용성 평가를 통해 평가할 시험 물질을 처리하는 단계이다. 시험 물질은 특별히 제한되지 않으며 신약 후보 물질과 같은 화합물, 이온, 금속 등 다양한 물질을 처리할 수 있다. 시험 물질이 하이드로겔 스캐폴드에 흡수되어 지방조직에 잘 작용할 수 있도록 2 내지 4시간 정도의 처리 시간을 가질 수 있다. 시험 물질은 글루코스 수용성 평가 결과를 반영할 수 있는 대사질환 치료제 또는 대사질환 치료제 후보 물질이 바람직하다. 대사질환은 포도당, 지방, 단백질 등의 대사 이상에서 기인한 질병으로 예를 들어, 제2형 당뇨병을 포함한 여러 종류의 당뇨병, 당뇨병 합병증, 심혈관질환(고혈압, 허혈성 심질환, 심부전증 등), 비만이나 고콜레스테롤, 지방간과 같은 지질대사질환, 골다공증, 암 등을 포함할 수 있다.

f) 단계는 시험 물질 처리 후, 인슐린을 처리하여 하이드로겔 스캐폴드에 형성된 지방조직세포에서 인슐린에 의한 글루코스 또는 글루코스 유사체의 수용이 유도될 수 있도록 하는 단계이다. 인슐린의 처리는 100 내지 300 ng/㎕, 바람직하게는 150 내지 250 ng/㎕이나 이에 제한되는 것은 아니다.

g) 단계는 글루코스 또는 글루코스 유사체(glucose analogue)를 처리하여, 하이드로겔 스캐폴드에 형성된 지방조직세포에 글루코스 또는 글루코스 유사체가 수용이 유도될 수 있도록 하는 단계이다. 본 발명의 하이드로겔 스캐폴드에 형성된 지방조직세포는 인슐린 저항성이 유도되어 있어 글루코스 또는 글루코스 유사체를 처리하여도 이들의 수용 정도가 인슐린을 처리하지 않은 경우와 큰 차이가 없다. 그러나, 앞서 처리한 시험 물질이 인슐린 저항성을 치료할 수 있는 물질인 경우 글루코스 또는 글루코스 유사체의 수용 정도가 증가하게 되고, 이를 통해 시험 물질의 글루코스 수용 효과를 확인할 수 있게 된다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 글루코스 유사체로 방사성 물질을 대체할 수 있고 인체에 무해하며 형광 측정이 가능한 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-ul)Amino)-2-Dedoxyglucose)를 사용할 수 있다. 2-NBDG를 사용할 경우 200μM 초과, 250 내지 550μM, 바람직하게는 300 내지 500μM, 보다 바람직하게는 350 내지 450μM, 더욱 바람직하게는 375 내지 425μM에서 글루코스 수용성이 현저히 향상될 수 있어 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 200μM의 2-NBDG를 사용할 경우 농도가 너무 낮아 세포가 수용하게 되는 2-NBDG의 함량이 너무 적어 대조군과 실험군 사이에서 수용 정도의 차이가 크게 나타나지 않고(약 1.5배), 400μM의 2-NBDG를 사용할 경우 대조군과 실험군 사이에서 3 내지 4배 이상의 수용 정도가 나타날 수 있다. 2-NBDG를 사용할 경우 하이드로겔 스캐폴드 내부로 충분히 전달될 수 있도록 처리 시간은 1 내지 4시간, 바람직하게는 1 내지 3시간으로 하는 것이 바람직하다. h) 단계는 하이드로겔 스캐폴드에서 형성된 지방조직세포에 수용된 글루코스 또는 글루코스 유사체의 함량을 측정하여 글루코스의 수용 정도를 측정하는 단계이다. 글루코스의 수용 정도의 측정을 위해 하이드로겔 스캐폴드를 알지네이트를 용해시킬 수 있는 용액으로 용해시키고, 하이드로겔 스캐폴드에 포함되어 있던 지방조직세포를 수득하여 세포 내에 잔류하고 있는 글루코스 함량을 측정하게 된다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 알지네이트를 용해시킬 수 있는 용액으로 바람직하게는 EDTA(ethylene-diamine-tetraacetic　acid)를 사용할 수 있다. EDTA를 사용하는 경우 고농도의 EDTA의 처리시 DNA나 글루코스 유사체 등을 측정하기 위한 형광 염료에 EDTA에 의한 방해 현상이 나타날 수 있다. EDTA의 농도는 10 내지 20mM, 바람직하게는 바람직하게는 14 내지 18mM로 사용하여 형광 값에 대한 방해를 줄이고, 하이드로겔 스캐폴드를 짧은 시간에 효율적으로 용해시킬 수 있다.

h) 단계에 앞서(또는 g) 단계 이후) DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)와 같은 세척 버퍼(buffer)를 사용하여 하이드로겔 스캐폴드에 잔류된 글루코스 또는 글루코스 유사체를 세척하여 하이드로겔 스캐폴드의 용해를 용이하게 할 수 있고, 글루코스 수용 정도를 보다 정확하게 측정할 수 있다.

h) 단계에 이어 세포에 포함되어 있는 DNA를 분석하고, 분석한 값을 세포에 수용된 글루코스 또는 글루코스 유사체 측정값에 대한 정량화를 위해 사용할 수 있다.

본 발명의 글루코스 수용성 평가 방법은 대사성 질환을 모사한 지방조직 모델인 3차원 비드 타입의 하이드로겔 스캐폴드를 이용하여 대사성 질환을 타겟으로 하는 화합물의 스크리닝에 사용할 수 있다. 그리고, 통상적인 3차원(3D) 세포 배양 시에 한 번에 몇 가지 정도의 샘플에 대한 스크리닝 수행이 가능한 정도이지만, 본 발명의 글루코스 수용성 평가 방법은 한 번 수행시 수십종의 약물 스크리닝이 가능한 고속 대량 스크리닝에 적합한 방법으로 대사성 질환을 타겟으로 하는 신약 개발의 핵심 기술로 활용될 수 있다.

이하에서 본 발명을 실시하기 위한 실시예에 대하여 설명한다. 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 하나의 예시에 해당하는 것으로서 본 발명이 실시예에 의해 한정 해석되어서는 안된다.

[실시예 1] 세포의 3차원 공동 배양을 위한 3차원 비드 형태의 하이드로겔 스캐폴드 제작 및 지방세포와 마크로파지의 공동배양

글루코스 수용성 평가에 사용하기 위해, 지방세포 및 마크로파지의 3차원 공동 배양이 가능한 3차원 비드(bead) 형태의 스캐폴드를 다음과 같은 방법으로 제작하였다.

실시예 1-1. 세포 배양

지방 전구 세포주인 3T3-L1 (ATCC #CL-173) 및 RAW264.7 마크로파지(macrophage) (ATCC #TIB-71)는 ATCC (American Type Culture Collection, VA, USA)로부터 구매하였다. 3T3-L1 및 RAW264.7은 10%의 FBS(Fetal Bovine Serum, Invitrogen, CA, USA) 및 100㎍/ml의 페니실린과 100㎍/ml의 스트렙토마이신 (Invitrogen)의 혼합물 1%를 함유하는 DMEM(Dubecco Modified Eagle Medium; Invitrogen) 내에서 유지되었다. 이어서, 세포들은 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 내의 T75 세포 배양 플라스크 내에서 성장 및 유지되었다.

DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline, Invitrogen)로 세척된 후에, 플레이트에 부착된 3T3-L1은 37 ℃의 5% CO₂ 인큐베이터 내에서, 1 ㎖의 0.5% 트립신-EDTA(Invitreogen)에서 인큐베이션 하였고, 이어서, 3㎖의 배지로 중화 후 1,500 rpm에서 2 분간 세포 현탁액(suspension)을 원심분리하여 세포 펠렛(pellet)을 수득 한 후 실험에 이용하였다.

RAW264.7은 5 ㎖의 DPBS에서 30분 간 인큐베이션 후, 스크랩하여 1,500rpm에서 2분간 원심분리하여 세포 펠렛(pellet)을 수득하여 사용하였다.

실시예 1-2. 3차원 비드 스캐폴드 제작을 위한 세포 및 알지네이트 하이드로겔 혼합물 준비

젤라틴(Sigma-Aldrich, MO, USA), 콜라겐(Sigma-Aldrich), 알긴산 나트륨(Sigma-Aldrich), 지방전구세포(3T3-L1) 및 마크로파지(RAW264.7)를 균일하게 혼합하고 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco’s　modified　Eagle’s　medium)로 최종 부피를 조절하여 세포를 포함한 알지네이트 하이드로겔 혼합물을 준비하였다. 알지네이트 하이드로겔 혼합물에 포함된 3T3-L1 및 RAW264.7는 혈구계산기-기반 세포계수기(SKC Co. Ltd., Seoul, Korea) 및 도립현미경(inverted microscope, Eclipse TE2000-U, Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 3T3-L1(1.5×10⁶ 세포/ml) 및 RAW264.7 (1.5×10⁴ 세포/ml)가 되게 시딩(seeding) 밀도를 조절하였고, 알지네이트는 2%(w/v), 젤라틴 0.5%(w/v), 및 콜라겐 0.5%(w/v)을 함유하도록 하였다.

실시예 1-3. 세포를 포함한 3차원 비드 스캐폴드 제작

3차원 비드 스캐폴드 제작을 위한 3차원 세포-적하(cell-drop) 시스템은 다음과 같이 준비하였다. 3 차원 디스펜싱(dispensing) 구조를 조립하기 위한 3 차원 세포-적하 시스템은 x-y-z 스테이지, 디스펜서, 시린지 노즐, 압축 컨트롤러, 및 컴퓨터 시스템으로 구성하였다. 디스펜서는 비드 스캐폴드 제작을 위한 하이드로겔을 보유하는 리저버 탱크(reservoir tank)이고 컴퓨터 시스템으로 디스펜서 내의 세포-적하 시스템의 공기압을 50~120 kPa로 조절하여 디스펜서에 적용하였다. 직경1.22mm 노즐을 가지는 디스펜서로 준비한 알지네이트 하이드로겔 혼합물을 적하하여 구형의 비드 형태 하이드로겔 스캐폴드를 제작하였다. 비드 모양의 스캐폴드 제작 장비 및 관련 소프트웨어는 한국화학연구원(Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT))에서 제공하였다.

세포를 포함한 3차원 하이드로겔 스캐폴드는 세포 배지에서 최대 8일간 배양하였고, 3일과 7일에서 비드 구조체의 직경 및 형태를 확인하였다. 고속대량스크리닝이 가능한 글루코스 수용성 평가에 가장 적합한 비드를 확인하기 위해 배양 및 실험과정에서 처리되는 물질(DPBS, PBS, HBSS, KRB buffer와 같은 배지, 버퍼 등)을 서로 달리하여 비드 구조를 확인하였다. DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline), PBS(Phosphate-buffered saline), HBSS(Hank's Balanced Salt Solution), KRB buffer(Krebs-Ringer Bicarbonate buffer)를 사용하여 3차원 비드 모양의 하이드로겔 스캐폴드의 구조 유지력을 확인한 결과는 도 1과 같다. KRB buffer는 본 발명에 적합하도록 글루코스를 제거하고, 염화칼슘(CaCl₂)를 첨가하여 사용하였다(도 2의 KRB buffer 조성 참고).

세포 배양 배지에서 올바르게 스웰링(swelling)된 비드는 직경 약 6.37 mm를 가졌다. 칼슘과 같은 이가 이온이 결여된 버퍼인 DPBS는 약 7.8 mm의 직경으로 측정되었으며 비드 형태의 무너짐을 관찰할 수 있었다. 그 외 칼슘 이온을 포함하는 HBSS, KRB buffer의 경우 1 시간의 인큐베이션에도 비드의 형태와 직경에서 배양 배지와 큰 차이를 나타내지 않았다. 이 결과를 토대로 본 실험에 사용되는 세척(washing) 버퍼는 HBSS로 하였으며, 본 발명에서 제작한 KRB의 조성이 비드의 형태를 보존 할 수 있음을 확인하였다. DPBS의 경우 비드의 형태와 직경에 차이를 보였으나, 이후에 EDTA를 사용한 알지네이트 비드 용해를 위해 사용되었다.

실시예 1-4. 3차원 비드 스캐폴드 내 세포의 공동 배양

지방전구세포인 3T3-L1의 지방세포(adipocyte)로의 분화를 위해, 2 ㎍/ml 인슐린, 500 μM 이소부틸메틸잔틴(IBMX) 및 0.25 μM 덱사메타손(DEX)을 함유하는 분화 배지에서 4 일 동안 배양하였고, 지방 세포의 성숙 및 세포 내 지방입자 축적을 위해, 2 ㎍/ml 인슐린을 함유하는 분화 배지에서 4일 동안 배양하였다.

RAW264.7 마크로파지의 경우 3T3-L1과 같이 지방세포 분화 배지와 함께 지방세포 분화 및 지방 세포 성숙기간인 8일 동안 함께 배양 되었다.

비드 형태의 3차원 하이드로겔 스캐폴드에서 세포의 2 차원적 세포 성장이 불가하도록 3차원 비드 스캐폴드는 ECM (Extra Cellular Matrix)이 처리되지 않은 세포 배양기(SPL Life Science, KOR)에서 배양하였고, 배양기는 최대 4 일의 간격 이후로 교체하였다. 배양기의 경우 6-웰 플래이트에서 4 ㎖의 배양액을, 24-웰 플래이트에서 2 ㎖의 배양액을, 48-웰 플래이트에서 0.5 ㎖의 배양액을 사용하여 배양하였다.

도 3은 3차원 하이드로겔 스캐폴드 내의 지방세포의 형광 이미지(도 3A) 및 그래프(도 3B)를 보여준다. 세포의 형태는 BODIPY 지방 염색 분석 키트를 이용해 분석하였고, 200 x 배율로 시각화되었다. 8 일 동안 3차원 하이드로겔 스캐폴드 내 세포를 증식 및 분화 유도한 결과, 지방세포 단독 또는 지방세포와 마크로파지 공동 배양 실험군에서 지방 세포의 분화가 유도되는 것을 확인할 수 있었다. 지방 입자의 정량화 평가를 통해 일반 지방 세포군과 공동 배양 세포군에서 지방 세포로의 분화 및 지방 입자의 축적은 지방 전구세포에 비하여 약 4 배의 증가를 나타내었으며 두 그룹간의 차이는 확인되지 않았다.

이러한 결과는 2차원 세포배양에서 마크로파지의 성장을 억제하지 못하여 정상적인 지방 세포의 분화가 불가능했던 지방세포 및 마크로파지 공동 배양 시스템문제를 해결한 것으로, 3차원 비드 형태의 하이드로겔 스캐폴드를 사용하여 지방전구세포가 정상적인 지방 세포로 분화 및 증식하고 지방조직을 형성할 수 있는 지방세포와 마크로파지의 공동 배양 시스템이 가능함을 보여주는 것이었다.

[실시예 2] 글루코스 수용성 평가(glucose uptake assay)

실시예 2-1. 웨스턴 블랏(western blot)을 이용한 세포의 발현 단백질 측정

하이드로겔 스캐폴드를 용해하고 세포 용출물을 수득하였다. 세포 용출물에 프로테아제 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail, Roche life science, Seoul, Korea)을 함유하는 프로-프렙(PRO-PREP) 단백질 추출 용액 (iNtRON Biotechnology Inc., Seoul, Korea)을 처리하였다. 이어서, 세포 용출물을 13,000 rpm에서 원심분리한 후, 각각의 샘플들로부터 얻은 20㎍의 단백질을 NuPage Bis-Tris Mini Gels(Invitrogen) 상에 로딩하고 PVDF 멤브레인 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)으로 트랜스퍼(transfer)하였다.

카제인(casein; Sigma-Aldrich)으로 블로킹된 멤브레인에 이어서 FABP4 (fatty acid binding protein 4), 지방산 합성(fatty acid syntheses, FAS), 페리리핀(Perilipin), GLUT4 (Glucose transporter type 4), β액틴(Cell Signaling, MA, USA)의 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 면역반응성 밴드들을 Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Fisher Sientific inc, MA, USA)의 화학발광(chemiluminescent)시약으로 발색시켰고, 단백질 밴드들을 화학발광장치(BIORAD, Inc. CA, USA)로 시각화하였다.

세포에서 발현된 단백질을 확인한 결과, 3차원 비드 형태의 하이드로겔 스캐폴드 내에서 지방세포와 마크로파지의 3차원 공동 배양에 의해 지방의 축적과 분화는 나타났으나, GLUT4가 결여된 대사성 질환과 유사한 지방 조직 모델이 형성됨을 확인할 수 있었다(도 4A).

실시예 2-2. 글루코스 유사체를 이용한 글루코스 수용 평가

실시예 1에 따라 제조한 대사성 질환 모델인 3 차원 비드 형태의 하이드로겔 스캐폴드를 이용하여 글루코스 수용 평가를 수행하였다.

하이드로겔 스캐폴드 내 세포의 공동 배양 후(배양 8일 후), 스캐폴드 내 잔류한 인슐린의 제거 및 세포 안정(Stability)를 위하여 하이드로겔 스캐폴드는 10% FBS, 100㎍/ml의 페니실린과 100㎍/ml의 스트렙토마이신(Invitrogen)의 혼합물 1%를 함유하는 DMEM (Dubecco Modified Eagle Medium, Invitrogen) 내에서 24 시간 동안 유지하였다. 이후, 100 ㎍/ml의 페니실린과 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신의 혼합물 1%만을 함유하는 DMEM 배지에서 하이드로겔 스캐폴드를 16 시간 배양하여 세포 배양에 사용되었던 혈청을 제거하여 혈청 기아(Serum starvation) 상태를 진행하였다.

하이드로겔 스캐폴드는 혈청 기아 상태로 만든 후(약 16시간 후), 48-웰 플레이트에 2개의 하이드로겔 스캐폴드를 옮겨 500㎕의 KRB(도 2의 조성 참고)로 15 분간 총 3 회에 걸쳐 버퍼를 교환하여, 스캐폴드 구조체가 KRB로 완전히 교체되도록 하였다.

다음으로, 시험 물질 전처리 단계를 진행하였다. 인슐린 저항성 치료제로 사용되는 PPAR-γ (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 아고니스트(agonist)인 로지글리타존(Rosiglitazone) 또는 PPAR-γ 안타고니스트(antagonist)인 GW9662를 포함한 KRB 500㎕를 각 웰에 교체하고, 0.5% BSA(Bovine serum albumin, Sigma-aldrich #A8806)를 첨가하여 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 로지글리타존 및 GW9662는 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 20 mM 농도로 제작된 스톡(Stock)을 필요 농도로 희석하여 처리하였다. (* 하이드로겔 스캐폴드를 이용한 지방세포와 마크로파지의 3차원 공동 배양 후 2-NBDG 수용성 확인을 통한 인슐린 저항성 확인은 인슐린 저항성 치료제 물질의 처리 없이 진행되었다.)

1시간 배양 후, 200ng/㎕의 인슐린 추가 처리하여 16 시간 동안 배양하였다.

16시간 후 글루코스 유사체인 2.5㎕의 80mM 2-NBDG(stock)를 처리하여 2 시간 인큐베이션하였다(세포에 처리된 2-NBDG 최종 농도는 400 uM). 2-NBDG 처리가 완료된 하이드로겔 스캐폴드는 500㎕의 DPBS로 교체하여 15 분간 총 3 회에 걸쳐 하이드로겔 스캐폴드 내에 비특이적으로 잔류된 2-NBDG를 제거하였다.

2-NBDG 세척(washing)이 완료된 하이드로겔 스캐폴드를 500㎕의 16mM EDTA 용액이 담긴 1.5 ml 튜브(tube)로 옮겨 알지네이트 용해(lysis)를 유도하였다. 약 10 분에서 15 분간 인큐베이션 된 용액을 13000ｘg에서 1분 30초간 원심분리하여 세포만 수득한 후 세포 내 잔류된 2-NBDG의 양을 Fluorescence microplate reader (Molecular devices, CA, USA)를 사용하여 여기(excitation) 파장 : 485 nm / 방출(emission) 파장 : 535 nm의 필터로 측정하였다.

2-NBDG 양을 측정하고, -80 ℃에서 세포를 동결시킨 후 DNA 정량 측정에 사용하였다. DNA는 FluoReporter Blue Fluorometric dsDNA(double strand DNA) Quantitation Kit(Molecular Probes, #F-2962, USA)를 사용하여 측정하였다. 동결된 세포를 얼음 위에서 용해시켜 세포의 용해를 유도한 후, Kit에 동봉된 Hoechst 33258 용액을 1/4000으로 희석한 용액을 5 ㎕의 양으로 각 웰에 첨가하였다. 24 ℃에서 5 분간 인큐베이션 후, dsDNA 특이적으로 염색된 형광을 여기(excitation) 파장 : 360nm / 방출(emission) 파장 : 460nm에서 측정하여 그 값을 세포에 수용된 2-NBDG의 정량화에 사용하였다. 실험은 각 샘플의 DNA양으로 정규화(Normalization)하여 나타내었다.

측정 결과들은 평균 ± 표준 오차 (S.D.)로 표시하였고, 통계적 유의도는 GraphPad Prism 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 통계적 유의도는 스튜던트의 T 검정 또는 일원분산분석 (one-way analysis of variance, ANOVA)에 이은 Tukey의 다중비교분석(Tukey's multiple-comparison test)로 분석하였다.

약물을 처리하지 않은 하이드로겔 스캐폴드에서 배양된 세포에 수용된 2-NBDG 측정 결과, 지방 세포만을 포함한 하이드로겔 스캐폴드의 경우 고농도의 인슐린을 처리 하였을 시에 세포 내 글루코스 수용이 증가한 것을 확인하였으며 이는 ^††† P < 0.001의 유의성이 확인되었다. 반면 지방세포와 마크로파지 공동 배양 모델의 경우 지방 세포로의 분화가 유도되었으나(도 3A, 3B, 4A), 인슐린 저항성 또한 유도되어 세포 내 글루코스 수용이 고농도의 인슐린을 처리하여도 증가하지 않았다(도 4 B). 이러한 결과는 본 발명의 대사성 질환 모델을 구축할 수 있는 3 차원 비드 타입 세포 배양 시스템을 사용하여, 대사성 질환을 타깃으로 한 약물 개발을 위한 글루코스 수용 평가(Glucose uptake assay)를 고속 대량 스크리닝(High Throughput Screening)에 활용할 수 있음을 보여주는 것이다.

실시예 2-3 고속 대량 스크리닝(HTS) 글루코스 수용성 평가

상기 실시예 2-2에서 하이드로겔 스캐폴드에 인슐린 저항성 치료제 물질인 로지글리타존 (Rosiglitazone, CAS Number 122320-73-4; Waterstone Technology LLC, IN, US) 및 GW9662 (CAS Number 22978-25-2; TOCRIS bioscience inc, UK)를 처리하는 것을 포함하여 글루코스 수용성을 측정하였다.

인슐린 저항성 치료제 물질인 로지글리타존 및 GW9662를 처리한 하이드로겔 스캐폴드에서 배양된 세포에 수용된 2-NBDG 측정 결과, 로지글리타존의 경우 모든 농도(1, 10, 20 μM)에서 대조군(약물을 처리하지 않은 대조 실험군)에 비하여 글루코스 수용이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 20 μM의 농도에서 * P < 0.05의 유의성을 확인하였다. 또한, GW9662의 경우에도 모든 농도(1, 10, 20 μM)에서 대조군에 비하여 글루코스 수용이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 10 μM 의 농도에서 ^** P < 0.01 및 20 μM의 농도에서 ^*** P < 0.001의 유의성을 확인하였다(도 5).

상기 결과로부터 본 발명에 따른 대사증후군 질환 관련 지방 생체모사시스템이 고속 대량 스크리닝(High Throughput Screening, HTS)에 활용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

Claims (11)

1. a) 지방전구세포, 마크로파지 및 알지네이트 하이드로겔을 포함한 혼합물을 3차원 세포-적하 시스템을 이용하여 하이드로겔 스캐폴드를 제조하는 단계;
   b) 하이드로겔 스캐폴드에 배양액을 처리하여 지방전구세포 및 마크로파지가 인슐린 저항성을 가지는 염증성 유사지방 모델을 형성하도록 증식 및 분화시키는 단계;
   c) 하이드로겔 스캐폴드에 혈청 결핍(serum free) 배지를 처리하는 단계;
   d) 하이드로겔 스캐폴드에 크랩스-링거 중탄산염 버퍼(Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer)을 처리하는 단계;
   e) 하이드로겔 스캐폴드에 염증성 질환과 인슐린 저항성이 유발된 대사질환인 비만 또는 당뇨병의 대사질환 치료제 또는 대사질환 치료제 후보 물질을 처리하는 단계;
   f) 하이드로겔 스캐폴드에 인슐린을 처리하는 단계;
   g) 하이드로겔 스캐폴드에 300 내지 500 μM 농도의 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-ul)Amino)-2-Dedoxyglucose)를 처리하는 단계; 및
   h) 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 세포 내부의 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-ul)Amino)-2-Dedoxyglucose) 함량을 측정하는 단계;
   를 포함하는 글루코스 수용성 평가(glucose uptake assay) 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항에 있어서,
   상기 b) 단계의 염증성 유사 지방모델은 마크로파지 공동배양을 통한 지방조직세포의 인슐린 저항성이 유도된 것인 글루코스 수용성 평가 방법.
8. 제1항에 있어서,
   상기 b) 단계는 염증성 유사 지방 모델 형성은 지방조직 형성 촉진을 위해 인슐린을 포함한 배지에서 증식 및 분화되고, 분화 종료 후 상기 하이드로겔 스캐폴드에 잔류된 인슐린을 제거한 후, 글루코스 기아(starvation) 및 인슐린 자극을 수행하는 단계인 글루코스 수용성 평가 방법.
9. 제1항에 있어서,
   상기 b) 단계의 지방전구세포 및 마크로파지 배양은 세포외기질(Extra Cellular Matrix)이 존재하지 않는 조건에서 배양되는 글루코스 수용성 평가 방법.
10. 제1항에 있어서,
    세포의 DNA를 정량화하고, DNA 정량화 값을 글루코스 유사체인 2-NBDG의 정량화에 사용하는 단계를 더 포함하는 글루코스 수용성 평가 방법.
11. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계의 알지네이트 하이드로겔 비드는 알지네이트, 젤라틴 및 콜라겐을 함유하며, 96-웰 세포배양플레이트에 적합한 크기를 갖으며, 장기 배양에서 3차원 세포배양체 구조가 유지되는 글루코스 수용성 평가 방법.

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