KR102087927B1 - 지방세포 및 마크로파지 공동 배양을 이용한 지방 입자 측정 방법 - Google Patents

지방세포 및 마크로파지 공동 배양을 이용한 지방 입자 측정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지방세포와 마크로파지의 공동 배양에 의해 형성되는 인슐린 저항성을 가지는 유사 지방 모델을 이용하여 지방 입자의 정량화가 가능한 고속 대량 스크리닝(high throughput screening) 및 이의 활용에 관한 것으로, 본 발명은 비드(bead) 형태의 하이드로겔 스캐폴드를 이용해 지방세포와 마크로파지를 3차원으로 공동 배양하여 인슐린 저항성을 가지는 유사 지방 모델을 형성할 수 있고, 하이드로겔 스캐폴드 내부에 형성된 지방조직세포에 지질 특이적인 염료를 처리해 지방조직세포에 형성된 지방 입자 측정을 고속으로 대량 스크리닝 할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

Description

지방세포 및 마크로파지 공동 배양을 이용한 지방 입자 측정 방법{Method for measuring lipid using co-culture of adipocytes with macrophages}
본 발명은 지방세포와 마크로파지의 공동 배양에 의해 형성되는 지방조직을 이용하여 지방 입자의 정량화가 가능한 고속 대량 스크리닝(high throughput screening) 및 이의 활용에 관한 것이다.
화합물, 약물 등 어떠한 물질에 의한 효과를 확인하는 방법은 물리, 화학, 생물 등 다양한 분야의 연구 개발 과정에서 중요하다. 특히, 생물 분야에 있어서 신약을 개발하는 과정 중 후보 신약 물질의 효과를 신속하고, 정확하게 스크리닝 하는 방법은 매우 중요하다.
신약 후보 물질의 효과를 확인하는 스크리닝 시스템 중 특정 표적에 대한 대량의 생물 및 화학 화합물의 효과를 확인하는 고속 대량 스크리닝 방법(High throughput screening) 방법은 스크리닝의 자동화를 가능하게 하고, 신속하며 비용이 절감되는 등 신약 개발에 있어 주요 기술로 각광 받고 있다.
고속 대량 스크리닝을 위한 핵심 기술이나 소재에 대한 개발도 활발한데, 고속 대량 스크리닝에 사용되는 소재는 균일한 특성을 가지고, 내구성이 좋으며, 처리되는 물질에 대한 민감도가 높을 필요가 있다. 세포나 조직을 직접 이용하는 경우, 세포나 조직에 손상을 가하지 않으면서 구획화가 가능하고 이들을 효과적으로 담지할 수 있는 담체 등이 필요하다. 이러한 담체는 약물과 같은 시험 물질, 세포나 조직을 성장시키거나 자극하기 위한 배지나 다양한 성분을 흡수할 수 있어야 하고 시험 물질 처리에 의해 나타나는 세포나 조직의 생물학적 현상에 영향을 미치지 않아야 한다. 예를 들어 한국 공개특허 제10-2015-01432177호에서는 오일 내 하이드로겔 에멀젼에 세포를 포함시키는 방법을 이용한 고속 대량 스크리닝 방법을 개시하고 있다.
또한, 신약 스크리닝에 있어서 세포를 이용한 고속 대량 스크리닝을 위해서는 세포의 3차원 배양을 통해 체내 환경과 같은 상호작용이 가능하도록 하여야 인간을 포함한 동물에서 나타날 수 있는 신약 후보 물질의 효과를 예측할 수 있다. 세포의 3차원 배양을 위해서는 세포의 증식과 분화를 3차원 적으로 유도할 수 있는 스캐폴드(구조체)가 필요한데, 고속 대량 스크리닝 과정에서 구조가 일정하게 유지될 수 있고 다양한 물질이 용이하게 흡수되어 스캐폴드 내부로 효과적인 전달이 가능하여야 한다. 예를 들어, 한국 공개특허 제10-2014-0043808호에서는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane)과 하이드로겔을 이용하여 3차원 세포 배양이 가능한 기술과, 이를 이용한 고속 대량 스크리닝 방법을 개시하고 있다.
대한민국 공개특허공보 제2015-0143177호. 대한민국 공개특허공보 제2014-0043808호.
본 발명은 지방세포 및 마크로파지을 포함한 하이드로겔 스캐폴드에서 지방세포와 마크로파지를 3차원으로 공동 배양(co-culture)하여 인슐린 저항성을 가지는 유사 지방 모델을 형성하고, 이를 이용하여 초고속으로 지방조직세포의 지방 입자를 측정할 수 있는 방법 및 이를 활용한 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 a) 지방전구세포, 마크로파지 및 알지네이트 하이드로겔을 포함한 혼합물을 3차원 세포-적하 시스템을 이용하여 하이드로겔 스캐폴드를 제조하는 단계; b) 하이드로겔 스캐폴드에 배양액을 처리하여 지방전구세포 및 마크로파지가 인슐린저항성을 가지는 유사 지방 모델을 형성하도록 증식 및 분화시키는 단계; c) 하이드로겔 스캐폴드에 지방 입자에 특이적인 염료를 처리하는 단계; 및 d) 하이드로겔 스캐폴드를 용해하고 세포에서 나타나는 발색을 측정하는 단계;를 포함하는 지방 입자의 측정 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 d) 단계에서 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 하이드로겔 스캐폴드의 용해 전 시험 물질을 처리할 수 있다.
본 발명에서, 상기 시험 물질은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 지방 세포의 증식 또는 분화와 관련된 물질일 수 있다.
본 발명에서, 상기 c) 단계의 염료는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, AdipoRed일 수 있다.
본 발명에서, 상기 b) 단계의 인슐린저항성을 가지는 유사 지방 모델은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 지방조직세포의 인슐린 저항성이 유도된 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 b) 단계의 지방전구세포 및 마크로파지 배양은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 세포외기질(Extra Cellular Matrix)이 존재하지 않는 조건에서 배양될 수 있다.
본 발명에서, 상기 측정 방법은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 세포의 DNA를 정량화하고, DNA 정량화 값을 형광 측정으로 정량화된 지방 입자의 정규화에 사용하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 a) 단계의 알지네이트 하이드로겔은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 알지네이트, 젤라틴 및 콜라겐을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 지방전구세포, 마크로파지 및 알지네이트 하이드로겔을 포함한 혼합물을 3차원 세포-적하 시스템을 이용하여 하이드로겔 스캐폴드를 제조하는 단계; b) 하이드로겔 스캐폴드에 배양액을 처리하여 지방전구세포 및 마크로파지가 인슐린저항성을 가지는 유사 지방 모델을 형성하도록 증식 및 분화시키는 단계; c) 하이드로겔 스캐폴드에 시험 물질과 지방 입자에 특이적인 염료를 처리하는 단계; 및 d) 하이드로겔 스캐폴드를 용해하고 세포에서 나타나는 형광을 측정하는 단계;를 포함하는 대사질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 대사질환은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 비만, 당뇨병, 지방간, 고혈압, 허혈성 심질환, 심부전증, 골다공증 및 암 등으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 비드(bead) 형태의 하이드로겔 스캐폴드를 이용해 지방세포와 마크로파지를 3차원으로 공동 배양하여 인슐린저항성을 가지는 유사 지방 모델을 형성할 수 있고, 하이드로겔 스캐폴드 내부에 형성된 지방세포에 지질 특이적인 염료를 처리해 지방세포에 형성된 지방 입자 측정을 고속으로 대량 스크리닝 할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 지방 입자 측정 고속 대량 스크리닝을 위한 3차원 비드 하이드로겔 스캐폴드의 구조체와 2% 알지네이트 농도에서의 입경을 보여준다.
도 2는 본 발명의 하이드로겔 스캐폴드에서 지방전구세포(3T3-L1)의 생존률을 보여주는 형광현미경 이미지이다.
도 3은 본 발명의 하이드로겔 스캐폴드에서 배양된 지방전구세포(3T3-L1) 및 마이크로파지 세포주(RAW264.7)의 공동 배양 결과로, 지방전구세포의 지방세포로의 분화 및 지방조직 형성의 형광현미경 이미지를 보여준다.
도 4는 본 발명의 하이드로겔 스캐폴드에서 배양된 지방세포, 지방전구세포 및 마크로파지의 공동배양에서 발현된 단백질의 발현 정도를 보여준다.
도 5는 본 발명의 지방 입자 측정 방법에 사용된 형광 염료(AdipoRed, Nile Red, BODIPY)들의 발색 정도 차이를 보여준다.
도 6은 본 발명의 지방 입자 측정 방법을 이용하여 지방세포 단독 배양 모델 및 지방전구세포와 마크로파지 공동 배양 모델에서의 지방입자 정량에 대한 고속 대량 스크리닝 결과를 보여준다.
도 7은 본 발명의 지방 입자 측정 방법을 이용하여 지방세포 단독 배양 모델 및 지방전구세포와 마크로파지 공동 배양 모델에서의 로지글리타존 및 GW9662 약물 효과를 고속 대량 스크리닝한 결과를 보여준다.
도 8은 본 발명의 지방 입자 측정 방법을 수행하기 위한 과정을 도식화한 것이다.
도 9는 2 차원 세포배양환경에서 분화한 지방세포에서의 로지글리타존 및 GW9662의 지방 입자 축적에 대한 약물 효과 결과를 보여준다.
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 지방 입자의 측정을 고속 대량 스크리닝(High throughput screening)으로 할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 지방 입자 측정 방법은 하이드로겔 스캐폴드를 이용한 지방세포와 마크로파지의 3차원 공동 배양을 활용한 방법이다. 지방세포와 마크로파지의 3차원 공동 배양은 인체에서 형성되는 지방 조직과 유사한 지방 조직을 형성할 수 있어, 지방 조직, 지방 조직에 포함된 세포나 단백질에 영향을 줄 수 있는 다양한 물질의 효과를 실제 당뇨유발 동물에서 일어나는 인슐린 저항성의 개선효과와 거의 동일한 수준으로 측정할 수 있다.
본 발명의 지방 입자 측정 방법은 지방전구세포 및 마크로파지를 포함한 하이드로겔 스캐폴드를 제조하고, 지방전구세포 및 마크로파지를 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 채로 공동 배양하여 지방전구세포를 지방세포로 분화 및 증식시키고, 유사 지방 조직이 형성된 하이드로겔 스캐폴드 지방 입자에 특이적인 염료를 처리하고 염료에 의해 나타나는 발색을 측정하는 과정을 통해 수행될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 지방 입자의 측정 방법은 a) 지방전구세포, 마크로파지 및 알지네이트 하이드로겔을 포함한 혼합물을 3차원 세포-적하 시스템을 이용하여 하이드로겔 스캐폴드를 제조하는 단계 b) 하이드로겔 스캐폴드에 배양액을 처리하여 지방전구세포 및 마크로파지가 인슐린저항성을 가지는 유사 지방 모델을 형성하도록 증식 및 분화시키는 단계 c) 하이드로겔 스캐폴드에 지방 입자에 특이적인 염료를 처리하는 단계 및 d) 하이드로겔 스캐폴드를 용해하고 세포에서 나타나는 형광을 측정하는 단계 단계를 포함한 방법으로 수행될 수 있다.
a) 단계는 지방세포 및 마크로파지의 공동 배양을 위한 하이드로겔 스캐폴드를 제조하는 단계로서, 알지네이트 하이드로겔과 함께 지방전구세포와 마크로파지를 혼합한 혼합물을 제조하고 3차원 세포-적하 시스템을 통해 본 발명에서 목적하는 하이드로겔 스캐폴드를 제조할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 하이드로겔 스캐폴드는 3차원 세포-적하 시스템을 통해 비드(bead) 형태로 제조될 수 있고, 하이드로겔 스캐폴드 내의 세포 배양을 포함한 지방 입자 측정 과정에서 사용되는 배양액이나 버퍼 등에 따라 지방 입자 염색이 진행되는 동안 비드 형태를 유지할 수 있다.
본 발명에서 알지네이트 하이드로겔은 조류로부터 유래된 알지네이트를 포함하여 제조한 하이드로겔을 의미한다. 알지네이트 하이드로겔에서 알지네이트는 수용성 고분자 전해질로 염화칼슘과 같은 다원자가 양이온 염을 사용하여 가교결합을 이룰 수 있다. 조류 베이스의 하이드로겔의 경우 알지네이트의 함량이 하이드로겔 스캐폴드 생성을 위한 지방세포, 마크로파지 및 알지네이트 하이드로겔 혼합물 대비 1 내지 4%, 1.5 내지 4%, 바람직하게는 1 내지 3% 보다 바람직하게는 1.5 내지 2.5%일 수 있다. 알지네이트의 함량이 충분하지 못한 경우 구조체의 용해도가 증가하고, 알지네이트의 함량이 높은 경우 세포들의 증식 및 생존율이 감소할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 알지네이트의 함량을 조절하여 지방 입자 염색이 진행되는 동안 비드 형태를 일정하게 유지할 수 있다.
하이드로겔과 혼합되는 세포 수가 많은 경우 배양 시간이 지날수록 증식률이 상승하게 되어, 혼합된 세포 수는 1x105cells/ml 이상인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 세포수가 1x104 cells/ml 미만일 경우 증식이 원활하게 이루어지지 않을 수 있다. 본 발명에서 하이드로겔 스캐폴드는 공동 배양 시 세포들이 분화, 증식 및 세포와 세포간의 상호작용에 의해 유사 조직이 형성되는 장소이다. 일반적인 2차원 세포배양과 같이 평평한 상태에서 세포배양을 하는 경우 세포 각각이 특정 부분에서만 세포와 세포간의 상호작용을 하고, 증식 방향이 일방적이며, 분화 및 증식을 통해 세포 수가 증가되는 경우에도 세포 각각이 세포와 세포간의 상호작용을 할 수 있는 세포들이 한정적이다. 또한, 세포에서 분비되는 다양한 대사물질들이 축적되게 된다. 그리하여, 이차원적으로 체외에서(in vitro)에서 세포 배양하는 경우에는 세포와 세포간의 상호작용이 체내에서(in vivo)와 같은 상호작용이 유도될 수 없으며, 체내와 유사한 구조체를 형성하기도 어렵다.
하이드로겔에는 젤라틴 및 콜라겐이 더 포함될 수 있으며, 젤라틴과 콜라겐의 함량은 지방전구세포, 마크로파지 및 하이드로겔 혼합물 각각 0.01 내지 10.0%(w/v), 좋게는 0.05 내지 5%(w/v), 더욱 좋게는 0.1 내지 2%(w/v)인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 하이드로겔 스캐폴드의 경우 지방세포와 마크로파지가 입체적인 구조의 하이드로겔 스캐폴드에 포함되어 있어, 세포 각각이 생체내의 세포와 같이 주위 모든 방향으로 세포와 세포간의 상호작용이 가능하고, 증식 방향이 일방적이지 않으며, 분화 및 증식을 통해 세포 수가 증가되는 경우에도 세포 각각이 지속적으로 주위 세포들과 세포와 세포간의 상호작용을 할 수 있다. 또한, 세포에서 분비되는 다양한 대사물질들이 생체 내에서와 같이 주위 모든 방향으로 분비될 수 있어 불균일한 농도 구배를 방지할 수 있다. 이러한 특징에 의해, 지방세포와 마크로파지의 공동 배양시 체내와 같은 세포와 세포간의 상호작용을 유도할 수 있고, 이에 따라 체내 지방 조직과 같이 기능이 유사한 유사 지방 조직을 형성하게 된다.
b) 단계는 3차원 세포-적하 시스템을 이용하여 제조된 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 세포를 배양하여 분화 및 증식을 시키는 단계로, 세포를 포함한 하이드로겔 스캐폴드에 배양액을 처리하면 하이드로겔 스캐폴드 내부로 배양액이 흡수되고 하이드로겔 스캐폴드 내부에서 지방전구세포와 마이크로파지가 공동 배양될 수 있다. 지방전구세포는 지방세포로 분화하게 되고, 대사증후군 질환 관련 인슐린 저항성을 갖는 지방 조직 생체 모사 시스템을 형성할 수 있게 된다.
세포 배양액은 둘베코수정이글배지(Dulbecco’s　modified　Eagle’s　medium)와 같이 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 사용되는 배지를 사용할 수 있고, 지방전구세포의 분화 및 증식과 지방조직 형성에 적합한 배지나 성분을 적절하게 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 지방 세포의 성숙과 세포 내 지방입자의 축적을 유도하기 위해 인슐린을 함유하는 분화 배지에서 배양할 수 있다.
세포 배양 기간은 5 내지 10일, 바람직하게는 6 내지 10일, 보다 바람직하게는 7 내지 9일이나 이에 제한되는 것은 아니고 하이드로겔 스캐폴드 제조를 위한 혼합물에 포함된 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 이온 함량, 세포의 밀도 등에 의해 적절하게 조절할 수 있다.
b) 단계에 의해 형성된 지방조직에 포함된 세포는 인슐린 저항성이 유도되므로 당뇨병을 포함하는 대사 질환에 대한 약물 효과를 예측할 수 있으며, 지방 입자 측정에 적합한 지방조직을 포함하는 고속 대량 스크리닝 하이드로겔 스케폴드 모델을 제공할 수 있다.
c) 단계는 하이드로겔 스캐폴드에서 형성된 지방조직의 세포에 축적된 지방입자를 염색하는 단계로서, 하이드로겔 스캐폴드에 처리된 염료는 하이드로겔 스캐폴드에 흡수되고 하이드로겔 스캐폴드 내부에 존재하는 지방조직세포의 지방 입자를 특이적으로 인식하여 결합하게 된다. 지방 입자와 결합한 염료의 발색을 측정하여 하이드로겔 스캐폴드 내부에 존재하는 지방 입자를 정량적으로 측정할 수 있게 된다.
염료는 형광 염료가 바람직하며, 아디포레드(AdipoRed), 나일레드(Nile Red) 및 보론-다이피로메텐(boron-dipyrromethene, BODIPY 493/503)으로 이루어진 군에서 하나 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 아디포레드는 하이드로겔 스캐폴드 내의 지방세포에서 다른 염료에 비해 1.5 ~ 4배 이상의 염색 효율을 나타낼 수 있어, 지방입자의 시각화와 정량화에 매우 적합하다. 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 염료를 버퍼(buffer)나 배지에 첨가(또는 희석)하고, 염료를 포함한 버퍼나 배지를 하이드로겔 스캐폴드에 처리하여 하이드로겔 스캐폴드의 용해 등 후속 과정의 시간을 단축시킬 수 있다.
지방 입자는 염료에 따라 그 대상에 차이가 있을 수 있으나, 일반적으로 지방 또는 지질분자로 불리는 생체물질 전반을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중성지방인 트리글리세라이드(triglyceride), 글리세롤, 지방산, 인지질, 콜레스테롤 및 이들의 유도체를 포함할 수 있고, 체내에서 소비되지 않고 남은 여분의 지방 성분들의 축적에 의해 형성되는 지질방울(lipid droplet) 또는 지질입자(Lipid vesicle)를 포함할 수 있다.
d) 단계는 하이드로겔 스캐폴드의 지방 입자에 결합된 염료에 의해 나타나는 발색을 측정하여 하이드로겔 스캐폴드 내에 존재하는 지방 입자의 시각화 및 정량화를 수행하는 단계이다. 지방 입자의 측정을 위해 하이드로겔 스캐폴드를 알지네이트를 용해시킬 수 있는 용액으로 용해시키고, 하이드로겔 스캐폴드에 포함되어 있던 지방조직세포를 수득하여 세포 내에 축적된지방입자와 결합된 염료를 측정하게 된다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 알지네이트를 용해시킬 수 있는 용액으로 바람직하게는 EDTA(ethylene-diamine-tetraacetic　acid)를 사용할 수 있다. EDTA를 사용하는 경우 고농도의 EDTA의 처리시 DNA나 지방입자를 측정하기 위한 형광 염료에 EDTA에 의한 방해 현상이 나타날 수 있다. EDTA의 농도는 제한되지는 않으나, 일예로 1 내지 10mM, 바람직하게는 2 내지 8mM, 더욱 바람직하게는 3 내지 7 mM로 사용하여 형광 값에 대한 방해를 줄이고, 하이드로겔 스캐폴드를 짧은 시간에 효율적으로 용해시킬 수 있다.
d) 단계에 이어 세포에 포함되어 있는 DNA를 분석하고, 분석한 값을 지방 입자 측정값에 대한 정규화(Normalization)를 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 지방 입자 측정 방법은 대사성 질환을 묘사한 지방조직 모델인 3차원 비드 타입의 하이드로겔 스캐폴드를 이용하여 대사성 질환을 타겟으로 하는 화합물의 스크리닝에 사용할 수 있다. 그리고, 본 발명의 지방 입자 측정 방법은 지방 세포와 마크로파지의 3차원 공동 배양에 의해 형성되는 지방 입자를 간단하고 빠른 방법으로 정량화함으로써, 지방세포로의 분화를 조절하는 약물을 고속 대량 스크리닝하는데 핵심기술로 활용될 수 있다. 또한, 일반적인 3차원 세포배양법은 HTS가 불가능하지만 본 시스템은 저렴하면서도 다량으로 실험이 가능하기 때문에 고속 대량 스크리닝에 적합한 방법으로 대사성 질환을 타겟으로 하는 신약 개발의 핵심 기술로 활용될 수 있다.
이하에서 본 발명을 실시하기 위한 실시예에 대하여 설명한다. 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 하나의 예시에 해당하는 것으로서 본 발명이 실시예에 의해 한정 해석되어서는 안된다.
[실시예 1] 세포의 3차원 공동 배양을 위한 3차원 비드 형태의 하이드로겔 스캐폴드 제작 및 지방세포와 마크로파지의 공동배양
지방 입자 측정에 사용하기 위해, 지방세포 및 마크로파지의 3차원 공동 배양이 가능한 3차원 비드(bead) 형태의 스캐폴드를 다음과 같은 방법으로 제작하였다.
실시예 1-1. 세포 배양
지방 전구 세포주인 3T3-L1 (ATCC #CL-173) 및 RAW264.7 마크로파지(macrophage) (ATCC #TIB-71)는 ATCC (American Type Culture Collection, VA, USA)로부터 구매하였다. 3T3-L1 및 RAW264.7은 10%의 FBS(Fetal Bovine Serum, Invitrogen, CA, USA) 및 100㎍/ml의 페니실린과 100㎍/ml의 스트렙토마이신 (Invitrogen)의 혼합물 1%를 함유하는 DMEM(Dubecco Modified Eagle Medium, Invitrogen) 내에서 유지되었다. 이어서, 세포들은 37℃의 5% CO2 인큐베이터 내의 T75 세포 배양 플라스크 내에서 성장 및 유지되었다.
DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline, Invitrogen)로 세척된 후에, 플레이트에 부착된 3T3-L1은 37℃의 5% CO2 인큐베이터 내에서, 1㎖의 0.5% 트립신-EDTA(Invitreogen)에서 인큐베이션 하였고, 이어서, 3㎖의 배지로 중화 후 1,500 rpm에서 2 분간 세포 현탁액(suspension)을 원심분리하여 세포 펠렛(pellet)을 수득 한 후 실험에 이용하였다.
RAW264.7은 5㎖의 DPBS에서 3분 간 인큐베이션 후, 스크랩하여 1,500rpm에서 2분간 원심분리하여 세포 펠렛(pellet)을 수득하여 사용하였다.
실시예 1-2. 3차원 비드 스캐폴드 제작을 위한 세포 및 알지네이트 하이드로겔 혼합물 준비
젤라틴(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)), 콜라겐(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)), 알긴산 나트륨(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)), 지방전구세포(3T3-L1) 및 마크로파지(RAW264.7)를 균일하게 혼합하고 둘베코수정이글배지(Dulbecco’s　modified　Eagle’s　medium)로 최종 부피를 조절하여 세포를 포함한 알지네이트 하이드로겔 혼합물을 준비하였다. 알지네이트 하이드로겔 혼합물에 포함된 3T3-L1 및 RAW264.7는 혈구계산기-기반 세포계수기(SKC Co. Ltd., Seoul, Korea) 및 도립현미경(inverted microscope, Eclipse TE2000-U, Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 3T3-L1(1.5×106 세포/ml) 및 RAW264.7 (1.5×104 세포/ml)가 되게 시딩(seeding) 밀도를 조절하였고, 알지네이트는 2%(w/v), 젤라틴 0.5%(w/v), 및 콜라겐 0.5%(w/v)을 함유하도록 하였다.
실시예 1-3. 세포를 포함한 3차원 비드 스캐폴드 제작
3차원 비드 스캐폴드 제작을 위한 3차원 세포-적하(cell-drop) 시스템은 다음과 같이 준비하였다. 3 차원 디스펜싱(dispensing) 구조를 조립하기 위한 3 차원 세포-적하 시스템은 x-y-z 스테이지, 디스펜서, 시린지 노즐, 압축 컨트롤러, 및 컴퓨터 시스템으로 구성하였다. 디스펜서는 비드 스캐폴드 제작을 위한 하이드로겔을 보유하는 리저버 탱크(reservoir tank)이고 컴퓨터 시스템으로 디스펜서 내의 세포-적하 시스템의 공기압을 50~120 kPa로 조절하여 디스펜서에 적용하였다. 직경1.22mm 노즐을 가지는 디스펜서로 준비한 알지네이트 하이드로겔 혼합물을 적하하여 구형의 비드 형태 하이드로겔 스캐폴드를 제작하였다. 비드 모양의 스캐폴드 제작 장비 및 관련 소프트웨어는 Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT)에서 제공하였다.
세포를 포함한 3차원 하이드로겔 스캐폴드는 세포 배지에서 최대 8일간 배양하였고, 3일과 7일에서 비드 구조체의 직경 및 형태를 확인하였다(도 1).
세포 배양 배지에서 올바르게 스웰링(swelling)된 비드는 직경 약 3.5 내지 4.5nm를 가졌다.
실시예 1-4. 3차원 비드 스캐폴드 내 세포의 공동 배양
지방전구세포인 3T3-L1의 지방세포(adipocyte)로의 분화를 위해, 2㎍/ml 인슐린, 500μM 이소부틸메틸잔틴(IBMX) 및 0.25μM 덱사메타손(DEX)을 함유하는 분화 배지에서 4 일 동안 배양하였고, 지방 세포의 성숙 및 세포 내 지방입자 축적을 위해, 2㎍/ml 인슐린을 함유하는 분화 배지에서 4일 동안 배양하였다.
RAW264.7 마크로파지의 경우 3T3-L1과 같이 지방세포 분화 배지와 함께 지방세포 분화 및 지방 세포 성숙기간인 8일 동안 함께 배양 되었다.
비드 형태의 3차원 하이드로겔 스캐폴드에서 세포의 2 차원적 세포 성장이 불가하도록 3차원 비드 스캐폴드는 ECM (Extra Cellular Matrix)가 처리되지 않은 세포 배양기(SPL Life Science, KOR)에서 배양하였고, 배양기는 최대 4 일의 간격 이후로 교체하였다. 배양기의 경우 6-웰 플래이트에서 4㎖의 배양액을, 24-웰 플래이트에서 2㎖의 배양액을, 48-웰 플래이트에서 0.5㎖의 배양액을 사용하여 배양하였다.
3 차원으로 제작된 비드 모양의 하이드로겔 스캐폴드 내에서의 세포 생존률은 세포 생존 분석(live/dead cell assay) 키트 (Invitrogen, CA, USA)를 이용하여 측정되었으며, 형광 현미경 (ECLIPSE TE2000-U; Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰되었다. 스캐폴드 세포들은 HBSS (Hank's Balanced Salt Solution, Gibco, CA, USA)로 15 분간 총 3 회 세척하였고, HBSS 내에서 칼세인 AM(calcein AM) 및 EthD-1(ethidium homodimer-1)로 60 분 동안 염색하였다. 염색된 세포는 HBSS로 15 분간 3 회 세척되었고, 녹색(Live cell, ex495 nm/em515 nm) 및 적색(Dead Cell, ex495 nm/em635 nm) 형광 이미지를 수득하였다. 하이드로겔 스캐폴드 내에서의 지방세포 분화 형태는 BODIPY 지방입자 염색기법을 이용해 분석되었으며 100 x 배율에서 시각화되었다.
배양 결과, 3차원 비드 모양의 하이드로겔 스캐폴드에서 우수한 세포 생존률이 나타났고 배양 종료일인 8 일 후부터 세포 염색 혹은 기타 후속 실험 종료까지 둥근 모양을 유지하였다(도 2). 그리고, 지방세포의 형광 이미지 측정 결과 성숙한 지방세포의 세포질 내에 지방입자(Lipid vesicle)가 균등하게 분포된 것이 관찰되었다(도 3).
이러한 결과는 2차원 세포배양에서 마크로파지의 성장을 억제하지 못하여 정상적인 지방 세포의 분화가 불가능했던 지방세포 및 마크로파지 공동 배양 시스템문제를 해결한 것으로, 3 차원 비드 형태의 하이드로겔 스캐폴드를 사용하여 지방전구세포가 정상적인 지방 세포로 분화 및 증식하고 지방조직을 형성할 수 있는 지방세포와 마크로파지의 공동 배양 시스템이 가능함을 보여주는 것이었다.
[실시예 2] 지방 입자의 측정
실시예 2-1. 웨스턴 블랏(western blot)을 이용한 세포의 발현 단백질 측정
하이드로겔 스캐폴드를 용해하고 세포 용출물을 수득하였다. 세포 용출물에 프로테아제 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail, Roche life science, Seoul, Korea)을 함유하는 프로-프렙(PRO-PREP) 단백질 추출 용액 (iNtRON Biotechnology Inc., Seoul, Korea)을 처리하였다. 이어서, 세포 용출물을 13,000 rpm에서 원심분리한 후, 각각의 샘플들로부터 얻은 20㎍의 단백질을 NuPage Bis-Tris Mini Gels(Invitrogen, CA, USA) 상에 로딩하고 PVDF 멤브레인 (Amersham Biosciences, NJ, USA)으로 트랜스퍼(transfer)하였다.
카제인(casein, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 블로킹된 멤브레인에 이어서 FABP4 (fatty acid binding protein 4), 지방산 합성(fatty acid syntheses, FAS), GLUT4 (Glucose transporter type 4), β액틴(Cell Signaling, MA, USA)의 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 면역반응성 밴드들을 Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific inc., MA, USA)의 화학발광 (chemiluminescent)시약으로 발색시켰고, 단백질 밴드들을 화학발광장치(BIORAD, Inc. CA, USA)로 시각화 하였다.
세포에서 발현된 단백질을 확인한 결과, 3차원 비드 형태의 하이드로겔 스캐폴드 내에서 지방세포와 마크로파지의 3차원 공동 배양에 의해 지방의 축적과 분화는 나타났으나, GLUT4가 결여된 대사성 질환과 유사한 지방 조직 모델이 형성됨을 확인할 수 있었다(도 4).
실시예 2-2. 형광 염료를 활용한 지방 입자 정량화 고속대량스크리닝
실시예 1에 따라 제조한 대사성 질환 모델인 3 차원 비드 형태의 하이드로겔 스캐폴드를 이용하여 지방 입자 측정을 수행하였다.
3 차원 비드 모양 스캐폴드 내의 성숙한 지방세포의 지방 입자 염색은 총 3 가지의 형광염료를 비교하였고, 그 결과를 고속대량스크리닝(High Throughput Screening)기법 개발을 위해 활용하였다. 형광 염료로 1) AdipoRed (#PT-7009, Lonza, SUI), 2) Nile Red (#19123, Sigma-Aldrich), 3) 보론-다이피로메텐 (Boron-dipyrromethene, BODIPY 493/503)(Invitrogen)를 사용하였고, 각 염료를 사용한 지방입자 특이적 염색법은 아래와 같이 수행하였다.
1) AdipoRed: 분화가 완료된 지방전구세포(3T3-L1) 또는 마크로파지(RAW264.7)와 공동 배양을 통해 분화가 진행된 지방전구세포(3T3-L1)를 포함한 3 차원 비드 모양의 하이드로겔 스캐폴드는 HBSS에서 15분간 총 2 회에 걸쳐 세척하여 잔류된 배양액을 제거하였다. 이후, DPBS 내에 1/33으로 희석된 AdipoRed 염색약을 48-웰 플레이트에 400 ㎕ 첨가 후, 24 ℃에서 20분간 인큐베이션 하였다. 염색이 완료된 세포를 포함한 하이드로겔 스캐폴드는 16mM EDTA를 500 ㎕ 포함한 1.5 ㎖ 마이크로-튜브(micro-tube)로 옮겨 알지네이트 용해를 유도하였다. 약 10 분간의 인큐베이션 후, 위 아래로 흔들어 알지네이트의 완벽한 용해를 유도하고 13000 ×g에서 1 분 30 초간 원심 분리하여 세포 펠렛(pellet)을 수득하였다. 세포 펠렛은 100 ㎕의 DPBS로 피펫팅하여 형광측정용 384-웰 플래이트 내에서 형광측정기 (Fluorescence microplate reader; Molecular Devices, USA)로 여기(excitation) 파장 : 485 nm / 방출(emission) 파장 : 535 nm에서 측정하였다.
2) Nile Red: 분화가 완료된 지방전구세포(3T3-L1) 또는 마크로파지(RAW264.7)와 공동 배양을 통해 분화가 진행된 지방전구세포(3T3-L1)를 포함한 3 차원 비드 모양의 하이드로겔 스캐폴드는 HBSS에서 15 분간 총 2 회에 걸쳐 세척 및 잔류된 배양액을 제거하였다. Nile Red stock solution은 1 mg/㎖의 농도로 아세톤을 용매로 하여 제작하였다. 이 후, DPBS에 1/100으로 희석된 Nile Red 용액을 48-웰 플래이트에 400 ㎕ 첨가 후, 24 ℃에서 20 분간 인큐베이션하였다. 이 후 수득된 세포 펠렛은 384-웰 플래이트로 이동하여 형광측정기 (Fluorescence microplate reader, Molecular Devices)로 여기(excitation) 파장 : 555 nm / 방출(emission) 파장 : 585 nm 에서 측정하였다.
3) 보론-다이피로메텐(Boron-dipyrromethene, BODIPY 493/503): 분화가 완료된 지방전구세포(3T3-L1) 또는 마크로파지(RAW264.7)와 공동 배양을 통해 분화가 진행된 지방전구세포(3T3-L1)를 포함한 3 차원 비드 모양의 하이드로겔 스캐폴드는 HBSS에서 15 분간 총 2 회에 걸쳐 세척 및 잔류된 배양액을 제거하였다. 디메틸 설폭사이드(DMSO) 내의 BODIPY 493/503 Stock solution(2mg/㎖)이 준비되었으며, 염색을 위해 HBSS 내에 1/2,000 (1㎍/㎖ BODIPY)으로 희석하여 48-웰 플래이트에 400 ㎕ 첨가 후, 24 ℃에서 30 분간 인큐베이션하였다. 이 후 수득된 세포 펠렛은 384-웰 플래이트로 이동하여 형광측정기(Fluorescence microplate reader, Molecular Devices)로 여기(excitation) 파장 : 485 nm / 방출(emission) 파장 : 535 nm에서 측정하였다.
이후, -80 ℃에서 시료를 동결시킨 후 DNA 정량 측정에 사용하였다. DNA는 FluoReporter Blue Fluorometric dsDNA Quantitation Kit (Molecular Probes, #F-2962, USA)를 사용하여 측정하였다. 동결된 시료를 얼음 위에서 용해시켜 세포의 용해를 유도한 후, Kit에 동봉된 Hoechst 33258 용액을 1/4000으로 희석한 용액을 5 ㎕의 양으로 각 384-웰에 첨가하였다. 24 ℃에서 5 분간 인큐베이션 후, dsDNA 특이적으로 염색된 형광을 여기(excitation) 파장 : 360 nm / 방출(emission) 파장 : 460 nm에서 측정하여 그 값을 염색된 지방 입자의 정량화 값에 대한 정규화(Normalization)로 사용하였다. 모든 실험은 각 샘플의 DNA양으로 정규화(Normalization)하여 나타내었다.
측정 결과들은 평균 ± 표준 오차 (S.D.)로 표시하였고, 통계적 유의도는 GraphPad Prism 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 통계적 유의도는 스튜던트의 T 검정 또는 일원분산분석 (one-way analysis of variance, ANOVA)에 이은 Tukey의 다중비교분석(Tukey's multiple-comparison test)로 분석하였다.
지방 입자 측정 결과, 3 가지의 형광 염색시료 모두 지방 세포에서 지방 전구세포에 비해 높은 수준의 염색 효율을 보였으나, AdipoRed 염료는 약 9 배, Nile Red 염료는 약 6 배, BODIPY 염료는 약 2 배의 염색 효율을 나타내었다(도 5). 한 그룹 당 2 개의 비드를 4 세트로 하여 진행하였으며, 지방 전구세포와의 ** P < 0.01, ** P < 0.001의 평균 ± 표준 오차 (S.D.)의 값으로 나타내었다. 본 실험 결과는 고속대량스크리닝(High Throughput Screening)에 활용하기 위한 지방 분화 검출 염료로 AdipoRed(Lonza, #PT-7009)가 다른 염료에 비하여 현저히 우수한 효과를 나타내는 것을 보여주었다. AdipoRed(Lonza, #PT-7009)를 사용하여 지방 입자를 측정한 결과도 앞서 웨스턴 블랏을 이용한 세포 발현 단백질의 측정 결과와 같이, 지방 세포 단독 배양 모델 및 지방 세포와 마크로파지 공동 배양 모델에서 비슷한 수준의 지방 세포 분화와 세포 내 지방 입자 축적을 보여주었다(도 6).
[실시예 3] 지방세포와 마크로파지 공동 배양으로 제조한 대사성 질환 모델에서 시험 물질 처리에 의한 지방 입자 축적의 영향 측정
시험 물질로 인슐린 저항성 치료제로 사용되는 PPAR-γ (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 아고니스트(agonist)인 로지글리타존(Rosiglitazone, CAS Number 122320-73-4; Waterstone Technology LLC, IN, US) 또는 PPAR-γ 안타고니스트(antagonist)인 GW9662를 사용하였다. 로지글리타존(Rosiglitazone) 및 GW9662 (CAS Number 22978-25-2; TOCRIS bioscience inc., UK) 약물 평가를 위해 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 20mM로 제작된 스톡(Stock)을 분화 배지에 필요 농도별(1, 10, 20 μM)로 희석하여 분화단계 동안 처리하였다.
이 후 앞의 실시예와 동일한 방법에 따라 염료 처리 및 발색(형광)을 측정하여 지방 입자를 측정하였다.
측정 결과, PPAR-γ를 활성화 시키는 로지글리타존(Rosiglitazone)을 1, 10, 20 μM의 농도로 분화 배지와 8 일 동안 함께 처리 한 결과, 대조군에 비하여 농도 의존적으로 지방 입자의 축적이 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 10 μM의 농도에서 ## P < 0.01, 20 μM의 농도에서 ### P < 0.001의 유의성을 확인하였다. 반면, PPAR-γ의 활성을 억제시키는 GW9662를 1, 10, 20 μM의 농도로 위와 동일한 방법을 통하여 지방 입자의 축적을 분석 한 결과, 10, 20 μM의 농도에서 대조군에 비하여 지방입자의 축적이 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 10 μM 및 20 μM의 농도에서 # P < 0.01의 유의성을 확인하였다(도 7).
2 차원 세포배양의 경우 일반적인 2차원 세포배양 및 지방세포 분화 법을 사용하여 로지글리타존 및 GW9662의 약물 효능을 확인하였다(도 9). 로지글리타존(Rosiglitazone) 및 GW9662 약물 평가를 위해 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 20mM로 제작된 스톡(Stock)을 분화 배지에 필요 농도별(20μM)로 희석하여 분화단계 동안 처리하였고, AdipoRed 염료를 사용한 지방 입자 측정법은 앞의 실시예와 동일하게 진행하였다.
측정 결과, 로지글리타존 20 μM의 농도로 8 일 동안 처리하였을 때, 대조군에 비하여 지방 입자의 축적이 증가하였고, ## P < 0.01의 유의성을 확인하였다. 반면, PPAR-γ의 활성을 억제시키는 GW9662의 경우 2 차원 배양된 세포에서 지방입자의 축적을 감소시키지 못하였다(도 9). 이상의 결과는 본 발명의 3차원 비트 형태의 하이드로겔 스캐폴드를 사용한지방 입자 측정 방법이 대사질환 치료제를 개발하기 위한 고속 대량 스크리닝에서 생체 내와 보다 유사하고 효과적인 핵심 기술로써 활용될 수 있음을 보여준다.

Claims (10)

  1. a) 지방전구세포, 마크로파지 및 알지네이트, 젤라틴 및 콜라겐을 함유하는 알지네이트 하이드로겔을 포함한 혼합물을 3차원 세포-적하 시스템을 이용하여 하이드로겔 스캐폴드를 제조하는 단계;
    b) 하이드로겔 스캐폴드에 배양액을 처리하여 지방전구세포 및 마크로파지가 인슐린 저항성을 가지는 유사 지방 모델을 형성하도록 증식 및 분화시키는 단계;
    c) 하이드로겔 스캐폴드에 지방 세포의 증식 또는 분화와 관련된 물질과 지방 입자에 특이적인 AdipoRed 염료를 처리하는 단계; 및
    d) 하이드로겔 스캐폴드를 용해하고 세포에서 나타나는 발색을 측정하는 단계;
    를 포함하는 지방 입자의 측정 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 b) 단계의 유사 지방 모델은 지방조직세포의 인슐린 저항성이 유도된 것인 지방 입자 측정 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 b) 단계의 지방전구세포 및 마크로파지 배양은 세포외기질(Extra Cellular Matrix)이 존재하지 않는 조건에서 배양되는 지방 입자 측정 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    세포의 DNA를 정량화하고, DNA 정량화 값을 형광 측정으로 정량화된 지방 입자의 정규화에 사용하는 단계를 더 포함하는 지방 입자 측정 방법.
  8. 삭제
  9. a) 지방전구세포, 마크로파지 및 알지네이트, 젤라틴 및 콜라겐을 함유하는 알지네이트 하이드로겔을 포함한 혼합물을 3차원 세포-적하 시스템을 이용하여 하이드로겔 스캐폴드를 제조하는 단계;
    b) 하이드로겔 스캐폴드에 배양액을 처리하여 지방전구세포 및 마크로파지가 인슐린 저항성을 가지는 유사 지방 모델을 형성하도록 증식 및 분화시키는 단계;
    c) 하이드로겔 스캐폴드에 지방 세포의 증식 또는 분화와 관련된 물질과 지방 입자에 특이적인 AdipoRed 염료를 처리하는 단계; 및
    d) 하이드로겔 스캐폴드를 용해하고 세포에서 나타나는 형광을 측정하는 단계;
    를 포함하는 대사질환 치료제의 스크리닝 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 대사질환은 비만, 당뇨병, 지방간, 고혈압, 허혈성 심질환, 심부전증, 골다공증 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 대사질환 치료제의 스크리닝 방법.
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