KR20170011522A - 지방세포와 마크로파지의 3차원 공동 배양 방법 - Google Patents

지방세포와 마크로파지의 3차원 공동 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지방전구세포와 마크로파지의 3차원 공동배양에 관한 것으로 지방전구세포와 마크로파지를 포함한 하이드로겔 스캐폴드에서 지방전구세포와 마크로파지를 공동배양하여 지방유사 조직을 형성할 수 있고, 이를 이용하여 지방조직과 관련된 대사성 질환 치료를 위한 연구 및 신약개발에 활용할 수 있다.

Description

지방세포와 마크로파지의 3차원 공동 배양 방법{Method for 3-dimensional co-culture of adipocytes with macrophages}
본 발명은 지방세포와 마크로파지의 3차원 공동 배양 방법에 관한 것으로 3차원으로 구성된 생체 지방조직과 유사한 구조체를 이룰 수 있는 세포 배양 방법이다.
비만, 당뇨, 동맥경화 등과 같은 대사성 질환(metabolic disease) 치료제 개발에서 초기 in vitro에서 우수한 약효를 보였던 약물들이 in vivo 동물 실험에서 약효가 떨어져 신약 개발에 많은 어려움이 따르고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 약물 개발의 초기 단계에서부터 정확한 효능 및 독성을 예측할 수 있는 생체 내(in vivo) 모델과 유사한 시험관 내(in vitro) 모델이 필요하다.
인간 세포 및 조직(tissue) 등 생체 내에서는 세포와 세포간의 상호작용에 의한 성장과 분화가 일어나기 때문에 복잡한 3차 구조를 가지게 된다. 반면, 실험실 등에서 세포나 조직배양을 위해 사용되는 방법은 2차원적인 배양에 해당하기 때문에 생체 내 조직의 기능이나 실제 조직에서 일어나는 반응을 연구하는데 많은 어려움이 있다.
생체 내 조직에서의 반응 및 이의 기능 연구를 위해 조직 공학이나 생명공학분야에서는 3차원 스캐폴드(scaffold)를 이용한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 3차원 인공 조직 스캐폴드를 이식하여 세포 분화 기전, 질병 치료제 개발, 조직 재생 등과 같은 연구들이 응용 되고 있다. 그러나, 3차원 스캐폴드도 인공적으로 제조되는 것이어서 실제 조직이나 기관과 같이 세포와 세포간의 상호작용으로 구성되는 생체 내 구조는 너무나 다양하고 복잡하기 때문에 조직과 같은 유사 구조를 형성하기 위한 기술적인 한계가 존재한다.
이와 같은 기존의 문제 해결 및 대사성 질환의 신약 개발을 위해 본 발명자들은 서로 다른 세포들이 생체 내와 같은 3차원 환경에서 세포와 세포간의 상호작용을 통해 지방조직과 유사한 기능을 나타내는 배양 방법을 개발하였다.
한국공개특허 제2013-0119663호
본 발명은 둘 이상의 세포를 공동배양하여 세포와 세포간의 상호작용을 통해 생체 내 조직과 같은 유사한 기능을 나타내고, 이를 통해 생체 내 조직의 기초 연구 및 대사성 질환 치료를 위한 약물 효능 스크리닝 시스템 및 신약을 개발 하고자 한다.
본 발명은 유사 지방 조직 구조체를 형성하기 위해 지방전구세포, 마크로파지 및 하이드로겔이 균일하게 혼합된 혼합물을 준비하는 단계, 상기 혼합물을 3차원 세포-프린팅 (three dimentional cell printing) 시스템을 이용하여 지방전구세포 및 마크로파지가 포함된 하이드로겔 스캐폴드를 제조하는 단계 및 배양액을 처리하여 상기 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 지방전구세포 및 마크로파지가 유사 지방 조직구조체를 형성하도록 분화시키고 증식시키는 단계를 포함하는 지방세포 및 마크로파지의 3차원 공동 배양 방법을 제공한다.
본 발명은 하이드로겔에 포함되는 마크로파지가 지방전구세포의 전체 수에 대비 1 에서 10%(w/v)인 지방세포 및 마크로파지 공동 배양 방법을 제공한다.
본 발명은 지방전구세포, 마크로파지 및 하이드로겔이 균일하게 혼합된 혼합물에서 하이드로겔이 알지네이트, 콜라겐 및 젤라틴을 포함하는 알지네이트 하이드로겔인 것을 특징으로 하는 지방세포 및 마크로파지를 공동 배양 방법을 제공한다.
본 발명은 알지네이트 하이드로겔에 포함되는 알지네이트가 혼합물 대비 2.0 내지 4.0%(w/v)인 지방세포 및 마크로파지를 공동 배양 방법을 제공한다.
본 발명은 지방세포 및 마크로파지 공동 배양 방법을 통해 지방조직과 유사한 구조체를 형성한 후 이를 이용한 유전자 발현 또는 단백질 활성 중 어느 하나 이상을 조사하여 대사성 질환을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 지방세포 및 마크로파지 공동 배양 방법은 하이드로겔 스캐폴드 내에서 지방세포 및 마크로파지의 세포와 세포간의 상호작용에 생체 내 지방조직과 유사한 기능을 가지는 구조체를 형성할 수 있다. 그리고, 하이드로겔 스캐폴드 내에서 형성된 지방조직 유사 구조체는 생체 내 지방조직과 유전자 발현 및 단백질 활성이 비슷하게 나타나 지방조직과 관련된 대사성 질환 치료를 위한 연구 및 신약개발에 이용될 수 있다.
도 1에서 삼차원 세포-프린팅 시스템에 의해 제작된 하이드로겔 스캐폴드를 나타낸다.
도 2는 하이드로겔 스캐폴드에서 3T3-L1 지방전구세포의 증식 및 세포 생존을 나타내는 것으로 (A)에서 녹색형광은 살아있는 세포, 붉은형광은 죽은 세포로 나타난 형광 이미지를 보여주고, (B)는 1x105cells/ml 의 농도의 3T3-L1 지방전구세포를 서로 다른 농도를 가지는 알지네이트와 혼합하여 구조체를 만들었을 때 세포들의 증식 정도를 나타내는 그래프이고, (C)는 1x105cells/ml의 농도로 3T3-L1 지방전구세포를 서로 다른 농도를 가지는 알지네이트와 혼합하여 구조체를 만들었을 때 세포들의 증식 정도를 나타내는 형광이미지이고, (D)는 3%(w/v) 알지네이트 스캐폴드에서 3T3-L1 지방전구세포수를 달리하여 구조체를 만들었을 때 세포 증식을 나타낸 그래프이고, (E)는 스캐폴드 높이에 따른 3T3-L1 지방전구세포 증식을 나타낸 그래프이며, 결과는 중복실험에 따라 평균±표준오차(S.E.M)로 나타내었다(첫날 대비 #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001).
도 3은 (A), (B)는 하이드로겔에서 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 BODIPY(boron-dipyrromethene)를 사용한 형광 이미지로 나타낸 것으로, 3% 알지네이트 농도의 하이드로겔에서 분화된 3T3-L1 지방세포 (adipocyte)를 비교하였고, (C)는 3T3-L1 지방전구세포와 3T3-L1 지방세포의 G6PD 효소의 활성 차이를 비교하였으며, (D)는 지방세포분화(adipogenesis) 및 인슐린저항성과 관련된 대표적인 유전자의 변화를 나타낸 것이고, (E)는 지방세포분화 및 인슐린 저항성과 관련된 대표적인 단백질의 발현 차이를 나타낸 것이며, 결과는 중복실험에 따라 평균±표준오차(S.E.M)로 나타내었다(지방전구세포군 대비 #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001).
도 4에서 (A)는 3%(w/v) 알지네이트 농도의 하이드로겔 스캐폴드에서 마크로파지의 세포증식을 지방전구세포와 비교하여 나타내었고, (B)는 3%(w/v) 알지네이트 농도의 하이드로겔 스캐폴드에서 마크로파지의 생존 정도를 나타내는 형광 이미지이고, (C)는 지방전구세포수의 10%(w/v) 농도의 마크로파지를 혼합한 공동 배양에서 지방세포분화 및 인슐린 저항성과 관련된 대표적인 단백질의 발현 차이를 비교하였으며, (D)~(F)는 마크로파지 농도를 달리하였을 때 공동 배양에서 지방세포분화 정도 및 지방세포분화 및 인슐린 저항성과 관련된 대표적인 단백질의 발현 차이를 비교한 것이며, (G)~(I)는 마크로파지 농도를 보다 세분화 하였을 때의 지방세포분화 및 인슐린 저항성과 관련된 단백질 발현 차이 및 지방세포분화 정도에 대한 형광 이미지를 보여주고 있다.
도 5의 (A)는 3차원 세포 공동 배양 스캐폴드에서 지방세포분화 및 인슐린 저항성과 관련된 단백질 발현의 변화를 나타내고 있으며, (B)는 3차원 세포 공동 배양 스캐폴드에서의 인슐린 저항성에 대한 변화를 글루코스 수용 시험(glucose uptake)을 통해 보여주고 있다.
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 발명에 대한 설명 및 도면에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 공지의 내용은 기재를 생략할 수 있다. 본 발명에 대한 설명을 위해 따로 정의하지 않는 용어에 대하여는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해할 수 있는 의미로 해석되어야 한다.
본 발명은 지방세포(adipocytes) 및 마크로파지(macrophages)의 3차원 공동 배양 방법 및 기술에 관한 것이다.
본 발명에서 지방세포 및 마크로파지의 공동 배양 방법은 지방전구세포, 마크로파지 및 하이드로겔이 균일하게 혼합된 혼합물을 준비하는 단계, 상기 혼합물을 3차원 세포-프린팅 시스템을 이용하여 지방전구세포 및 마크로파지가 포함된 하이드로겔 스캐폴드를 제조하는 단계 및 배양액을 처리하여 상기 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 지방전구세포 및 마크로파지가 지방조직과 유사한 기능을 할 수 있도록 지방전구세포를 지방세포로 분화 시키고 증식시키는 단계를 포함하는 지방세포 및 마크로파지를 이용한 3차원 공동 배양 방법이다.
본 발명의 공동 배양 방법에서 지방전구세포, 마크로파지 및 하이드로겔 혼합물에 포함된 마크로파지의 농도 또는 세포 밀도는 공동 배양시 지방세포의 생존, 분화, 증식 및 유사 지방조직 구조체 형성을 위해 조절될 수 있다. 마크로파지가 극히 미량 또는 존재하지 않는 경우 지방조직의 기능을 가지기가 어렵고, 마크로파지의 농도가 증가할수록 지방세포의 분화율이 감소에 따라 지방세포에서 발현되어 유사 지방조직을 형성할 수 있는 특이 유전자 발현 감소, 단백질 활성 감소 등이 발생한다.
본 발명에서 하이드로겔 스캐폴드 형성을 위한 지방전구세포, 마크로파지 및 하이드로겔 혼합물에서 지방전구세포의 함량은 1x105cells/ml 이상, 바람직하게는 1x105cells/ml 내지 1x107cells/ml이다. 지방전구세포가 1x105cells/ml 미만일 경우에는 증식 및 생존이 원활하지 않거나, 1x107cells/ml를 초과하는 경우에는 스캐폴드 외부로 떨어져 나올 수 있다.
본 발명에서 하이드로겔 스캐폴드 형성을 위한 지방전구세포, 마크로파지 및 하이드로겔 혼합물에서 마크로파지의 함량은 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 지방전구세포와 대비하여 10% 이하, 10 내지 5.5%, 5.5 내지 4.5%, 4.5 내지 3.5%, 3.5 내지 2.5 %, 2.5 내지 1.5%, 1.5 내지 0.5%, 바람직하게는 2.0 내지 1.0%, 보다 바람직하게는 1.2 내지 0.8%(w/v)이다. 예를들어, 지방전구세포가 1x105cells/ml인 경우 1.0 내지 2.0%의 마크로파지 함량을 위해 마크로파지세포를 1x103cells/ml 내지 2x103cells/ml개 이하로 조절하여 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 마크로파지의 함량은 하이드로겔 스캐폴드 생성을 위한 지방전구세포와 대비하여 1.0 내지 2.0%(w/v)에서 지방세포의 분화가 원활하게 이루어지며, 인슐린 저항성의 증가하는 결과와 같이 실제의 지방조직과 유사한 기능이 나타난다.
본 발명에서 하이드로겔(hydrogel)은 세포 배양 배지, 배양액 또는 물을 용매로 하여 폴리머 사슬이 네트워크를 이룰 수 있는 것으로 수용성 고분자 등이 화학적으로 가교결합을 이루거나, 물리적으로 결합할 수 있어 3차원 하이드로겔 스캐폴드를 형성할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 하이드로겔은 크게 제한되지 않으며 콜라겐, 키토산, 히알루론산, 젤라틴을 사용할 수 있고 바람직하게는 조류(algae)로부터 유래된 알지네이트(alginate)를 포함하는 것이 바람직하다. 조류 베이스(base)의 하이드로겔을 사용하는 경우 알지네이트의 함량을 적합하게 조절하여 지방세포와 마크로파지 공동 배양시 지방전구세포의 분화기간 및 이후의 추가 실험의 진행기간 동안 하이드로겔 스캐폴드가 용해되지 않고 유지되게 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 알지네이트 하이드로겔은 조류로부터 유래된 알지네이트를 포함하여 제조한 하이드로겔을 의미한다. 알지네이트 하이드로겔에서 알지네이트는 수용성 고분자 전해질로 염화칼슘과 같은 다원자가 양이온 염을 사용하여 가교결합을 이룰 수 있다. 조류 베이스의 하이드로겔의 경우 알지네이트의 함량이 하이드로겔 스캐폴드 생성을 위한 지방세포, 마크로파지 및 알지네이트 하이드로겔 혼합물 대비 2.5% 초과, 2 내지 4%, 2.5 내지 4%, 2.8 내지 3.0%, 3 내지 4%, 3.5 내지 4%, 바람직하게는 2.5% 초과 3.0%(w/v)이하이다. 알지네이트의 함량이 충분하지 못한 경우 구조체의 용해도가 증가하고, 알지네이트의 함량이 높은 경우 세포들의 증식 및 생존율이 감소할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 갈조류로부터 유래된 알지네이트의 함량이 2.0%(w/v)인 경우 지방세포의 생존 및 증식이 매우 활발하나, 하이드로겔 스캐폴드에서 지방세포 및 마크로파지 공동 배양시 상대적으로 형태가 오래 유지되지 않아 배양 및 연구의 적용에 어려움이 있을 수 있다. 그리고, 알지네이트의 함량이 2.5%(w/v) 및 3.0%(w/v)일 때 하이드로겔 스캐폴드의 형태가 유사 지방조직 형성될 때까지 충분히 유지될 수 있었으며 지방세포의 생존 및 증식도 일정하게 유지된다. 또한, 알지네이트 함량이 3.5%(w/v) 이상인 경우 하이드로겔 스캐폴드의 형태의 지속력은 우수하나, 지방세포의 생존 및 증식이 감소할 수 있다.
본 발명에서 하이드로겔에는 젤라틴 및 콜라겐이 더 포함될 수 있으며, 젤라틴과 콜라겐의 함량은 지방전구세포, 마크로파지 및 하이드로겔 혼합물 대비 각각 5.0 내지 10.0%(w/v)인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 하이드로겔 스캐폴드 형성을 위한 지방전구세포, 마크로파지 및 하이드로겔을 균일하게 혼합한 후 혼합물은, 3차원 세포-프린팅 시스템을 이용하여 하이드로겔 스캐폴드를 제조하기 위한 기계의 디스펜서를 통해 이루어진다.
본 발명에서 3차원 세포-프린팅 시스템(3D cell-printing system)은 입체구조의 하이드로겔 스캐폴드를 생성하기 위해 사용되는 시스템이다. 3차원 세포-프린팅을 위해 x-y-z 스테이지(stage), 디스펜서, 실린지 노즐(syringe nozzle), 압축 컨트롤러 및 컴퓨터 시스템을 구비하여 포함한 기계를 통해 수행될 수 있다. 본 발명에서 3차원 세포-프린팅 시스템을 통해 제조되는 하이드로겔 스캐폴드는 입체적인 구조로서 일반적으로 수행되는 배지에서의 세포 배양과 같은 이차원적 배양과 구분되는 3차원적 세포 배양이 가능하다. 하이드로겔 스캐폴드의 구조는 혼합물에 포함된 성분 및 농도, 프로그램을 통한 디자인, 세포-플로팅 시 압력 및 속도에 의해 적절하게 형성될 수 있다. 세포 공동 배양을 위한 하이드로겔 스캐폴드의 스캐폴드 패턴 및 구조의 제한은 없으나, 스캐폴드 패턴이 직교 방향이고 다층 세포-플로팅에 의해 스캐폴드를 형성하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 스캐폴드 패턴은 직교 방향이 되도록 프로그램 및 디자인하고, 0.2 내지 0.3mm 두께의 세포-플로팅된 스캐폴드를 형성하여 세포-플로팅된 스캐폴드를 적층시키면서 2.0 내지 3.0mm 내외의 두께로 하이드로겔 스캐폴드를 제조하는 것이 바람직하다. 두께는 0.1 내지 3.0mm, 0.4 내지 2.5mm, 0.8 내지 2.5mm, 0.4 내지 2.5mm, 0.8 내지 2.5mm, 1.2 내지 2.5mm, 1.6 내지 2.5mm, 0.4 내지 2.0mm, 0.8 내지 2.0mm, 1.2 내지 2.0mm, 바람직하게는 0.2 내지 0.3mm, 보다 바람직하게는 1.6 내지 2.0mm이다. 두께를 보다 증가시키는 경우 하이드로겔 스캐폴드 형성시 가장 아래에 위치한 세포-플로팅된 스캐폴드 층의 구조가 붕괴될 수 있다. 하이드로겔 스캐폴드의 구조가 일정하게 유지되지 않는 경우 공동배양시 세포 생존률, 증식 및 분화 정도가 감소할 수 있다. 하이드로겔 스캐폴드는 사각형 모양으로 넓이는 10 내지 30cm2, 15 내지 25cm2, 바람직하게는 20 내지 25cm2로 제조할 수 있다.
본 발명에서 세포-플로팅에 따라 하이드로겔 스캐폴드가 제조될 때 혼합되는(cells seeding) 지방전구세포의 수는 혼합물 또는 하이드로겔 스캐폴드의 디자인에 따라 일정한 증식이 일어나도록 조절하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 하이드로겔과 혼합되는 세포 수가 많은 경우 배양 시간이 지날수록 증식률이 상승하게 되어, 혼합된 세포 수는 1x105cells/ml 이상인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 세포수가 1x105 cells/ml 미만일 경우 증식이 원할하게 이루어지지 않을 수 있다. 본 발명에서 하이드로겔 스캐폴드는 공동 배양시 세포들이 분화, 증식 및 세포와 세포간의 상호작용에 의해 유사 조직이 형성되는 장소이다. 평면 배지와 같이 일반적인 배지에서 세포배양을 하는 경우 세포 각각이 특정 부분에서만 세포와 세포간의 상호작용을 하고, 증식 방향이 일방적이며, 분화 및 증식을 통해 세포 수가 증가되는 경우에도 세포 각각이 세포와 세포간의 상호작용을 할 수 있는 세포들이 한정적이다. 또한, 세포에서 분비되는 다양한 대사물질들이 축적되고, 불균형한 농도 구배를 이루게 된다. 그리하여, 이차원적으로 체외에서(in vitro)에서 세포 배양하는 경우에는 세포와 세포간의 상호작용이 체내에서(in vivo)와 같은 상호작용이 유도될 수 없으며, 체내와 유사한 구조체를 형성하기도 어렵다.
반면, 본 발명에 따른 하이드로겔 스캐폴드의 경우 지방세포와 마크로파지가 입체적인 구조의 하이드로겔 스캐폴드에 포함되어 있어, 세포 각각이 생체내의 세포와 같이 주위 모든 방향으로 세포와 세포간의 상호작용이 가능하고, 증식 방향이 일방적이지 않으며, 분화 및 증식을 통해 세포 수가 증가되는 경우에도 세포 각각이 지속적으로 주위 세포들과 세포와 세포간의 상호작용을 할 수 있다. 또한, 세포에서 분비되는 다양한 대사물질들이 특정 지역에 축적되는 것이 아니며 생체 내에서와 같이 주위 모든 방향으로 분비될 수 있어 불균일한 농도 구배를 방지할 수 있다. 이러한 특징에 의해, 지방세포와 마크로파지의 공동 배양시 체내와 같은 세포와 세포간의 상호작용을 유도할 수 있고, 이에 따라 체내 지방 조직과 같이 기능이 유사한 유사 지방 조직을 형성하게 된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 일반 배지에서 지방전구세포(preadipocyte) 및 지방세포(adipocyte)를 배양한 경우와 하이드로겔 스캐폴드에서 지방세포 및 마크로파지를 공동 배양한 경우 생체 내 지방 조직의 유전자 발현 및 단백질 활성의 차이가 확연하게 나타났으며, 하이드로겔 스캐폴드에서 지방세포 및 마크로파지 공동 배양으로 형성된 유사 지방 조직은 비만 및 당뇨 모델로 널리 알려져 있는 C57BL/6-DIO 생쥐 및 C57BL/6Job / ob 생쥐의 생체 내 지방 조직에서 지방분화 인자들이 증가하고 인슐린 저항성이 증가하는 것과 유사한 유전자 발현 및 단백질 활성을 나타내었다.
본 발명에 따라 하이드로겔 스캐폴드를 제조한 후 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 세포들의 세포와 세포간의 상호작용에 의해 유사 조직을 형성하도록 세포를 증식 및 분화시킨다. 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 세포를 증식 및 분화는 증식 또는 분화를 위한 배양액을 하이드로겔 스캐폴드에 처리하여 하이드로겔 스캐폴드에 배양액이 흡수되어 일어난다. 하이드로겔 스캐폴드의 다공성의 입체적인 구조에 의해 흡수된 배양액이 각 세포들에 균일하게 처리될 수 있다.
배양액 처리에 의해 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 지방전구세포 및 마크로파지가 분화 및 증식하게 되고 지방세포 및 마크로파지가 서로 세포와 세포간의 상호작용에 의하여 지방조직과 유사한 기능을 나타내게 된다.
본 발명에 따라 3차원적 공동 배양된 지방세포와 마크로파지는 유사 지방조직 구조체를 형성하게 되고, 유사 지방조직의 형성 여부는 구조체에서의 지방세포분화 및 인슐린 저항성과 관련된 단백질의 발현 정도 차이 및 글루코스 수용 평가(glucose uptake) 시험을 통해 알 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 하이드로겔 스캐폴드에서 지방세포 및 마크로파지 공동 배양에 따라 형성된 유사 지방구조체는 FABP4, FAS, ACC 및 PPARg2와 같은 지방세포분화 관련 마커 단백질의 발현이 증가하고, Akt 인산화 및 GLUT4와 같은 인슐린 저항성 관련 마커 단백질의 발현 및 활성 정도가 감소한다. 반면, 하이드로겔 스캐폴드에서 지방전구세포 또는 지방세포를 각각 단일 배양한 경우 지방세포 분화 및 인슐린 저항성 관련 마커 단백질의 발현이 모두 증가한다.
이하에서 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 실시예에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 발명이 하기 실시예로 제한되거나 실시예에 의해 제한 해석되는 것은 아니다.
다음과 같은 방법으로 지방세포와 마크로파지를 공동 배양하여 유사 지방구조체를 형성하였다.
지방전구세포 및 마크로파지 배양 및 준비
지방전구세포인 3T3-L1(#CL-173, ATCC) 및 마크로파지로 RAW264.7(#TIB-71, ATCC)를 준비하여 10% 소태아혈청(Invitrogen, Carsbad, CA, USA), 100㎍/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(Invitrogen)의 혼합물 1%를 포함한 둘베코 수정 이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco)를 이용하여 세포들은 37℃, 5% CO2 조건의 배양용 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, Gibco)으로 세척하고 0.2% 트립신-EDTA(trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid, Invitrogen) 2㎖ 첨가하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1분 동안 배양하였다. 다음으로, 1,500rpm에서 2분간 세포 현탁액(suspension)을 원심분리하고 세포 펠렛(pellet)을 수득하여 실험에 이용하였다.
하이드로겔 스캐폴드 제조를 위한 지방전구세포, 마크로파지 및 알지네이트 하이드로겔을 포함한 혼합물의 제조
젤라틴 500ul(Sigma-Aldrich), 콜라겐 500ul(Sigma-Aldrich)와 1x107 개의 지방전구세포 및 1x105 개의 마크로파지를 균일하게 혼합한 후에 둘베코 수정 이글배지로 최종 9.7ml로 맞춘다. 혼합물에 3mg 알긴산 나트륨(Sigma-Aldrich)을 넣은 후 신속하게 교반시켜 3% 알지네이트 하이드로겔 스캐폴드 제조를 위한 혼합물을 준비하고 3차원 스케폴드 제작을 위해 200~300㎛ 사이즈의 노즐로 구성된 디스펜서로 옮겼다. 원활한 세포-프린팅을 위하여 1000rpm 으로 10 초간 원심분리 하여 하이드로겔 스케폴드를 제작준비를 한다.
이상의 방법과 동일한 혼합물 제조방법으로 젤라틴, 콜라겐의 양은 동일하게 하고 둘베코 수정 이글배지를 사용하여 지방전구세포, 마크로파지 및 알긴산 나트륨의 함량이 각각 서로 다른 혼합물을 제조하였다. 알지네이트의 함량은 2, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0%로 각각 조절하여 서로 다른 농도의 하이드로겔 스캐폴드를 제조할 수 있도록 하였다. 그리고, 지방세포의 밀도(seeding density)는 일회용 혈구계산판(hemocytometer-based cell counter, SKC Co. Ltd., Seoul, Korea)으로 계산하여 1x104, 5x104, 1x105, 4x105, 8x105 및 1x106 cells/ml로 각각 세포수를 달리하여 서로 다른 지방세포를 포함한 하이드로겔 스캐폴드를 제조할 수 있도록 하였다. 마크로파지는 지방세포대비 1, 2, 3, 4, 5, 10%(w/v)로 각각 조절하여 지방세포와 마크로파지의 공동배양시 마크로파지의 농도에 따른 변화를 관찰하였다.
디스펜서를 통해 만들어진 하이드로겔 스케폴드는 신속하게 미리 준비되어진 5% 염화칼슘 수용액과 반응시켜 준다. 이때 스케폴드는 염화칼슘처리에 의해 가교결합을 이루게 된다.
3차원 세포- 프린팅 시스템을 이용한 하이드로겔 스캐폴드의 제조
3차원 세포-프린팅 시스템(3D cell-printing system)을 이용한 하이드로겔 스캐폴드의 제조는 x-y-z 스테이지(stage), 디스펜서, 실린지 노즐(syringe nozzle), 압축 컨트롤러 및 컴퓨터 시스템을 구비한 기계를 이용하였다(3D Bio-Scaffold Plotting system, PROTek). 디스펜서는 하이드로겔 홀딩을 위한 저장 탱크이고 컴퓨터 시스템은 압력, 피딩(feeding) 속도, 스트랜드(strand) 크기 및 스캐폴드의 모양을 조절하였다. 세포-플로팅(cell-plotting) 시스템의 속도는 150mm/s. 압력은 650kPa로 각각 조절하였다. 디스펜서에 일정한 압력이 가해지면서 지방세포, 마크로파지 및 하이드로겔 혼합물이 3차원 스캐폴드 형태로서 x-y-z 스테이지에 세포-플로팅된 스캐폴드가 층상(layer-by-layer)으로 플로팅 되어 제조하였다. 스캐폴드 패턴은 직교 방향이 되도록 디자인하여 제조하였고, 사각형(5×5cm) 모양의 세포-플로팅된 스캐폴드를 적층하여 두께가 각각 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2mm가 되도록 지방전구세포 및 마크로파지가 포함된 하이드로겔 스캐폴드를 제조하였다.
제조된 하이드로겔 스캐폴드는 100㎍/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(Invitrogen)및 소태아혈청 10%를 포함한 둘베코 수정 이글배지에서 1일 동안 증식 및 세포들의 안정화를 유도하였으며, 이후 덱사메타손, 이소부틸메틸잔틴, 인슐린을 처리한 소태아혈청 10%를 포함한 둘베코 수정 이글배지로 교체하여 분화를 유도하였다. 분화 유도 후 2일 에서 3일 이후 인슐린을 처리한 소태아혈청 10%를 포함한 둘베코 수정 이글배지로 교체 하였으며, 인슐린 처리 2일 이후 소태아혈청 10%를 포함한 둘베코 수정 이글배지에서 1일 에서 20일 까지 실험목적에 맞게 배양하여 세포 생존, 증식, 분화에 대한 분석을 수행하였다. 배양 배지는 최대 2일에 한번씩 교체하였다.
세포 생존 및 증식 분석
하이드로겔 스캐폴드에서 세포 생존은 Live/Dead 세포 분석 키트(Live/Dead cell assay kit, invitrogen) 및 형광현미경(TE2000-U, Nikon)을 사용하여 확인하였다. 하이드로겔 스캐폴드를 PBS로 세척하고 칼세인(calcein) 및 EthD-1(ethidium homodimer)으로 PBS에서 15분간 착색시켰다. 착색 후 PBS로 두 번 세척하고 형광현미경으로 녹색(생존세포, 495~515 nm) 및 붉은(죽은세포, 495~635nm) 형광을 관찰하였다. 세포 증식은 세포 계산 키트(Cell Counting Kit-8(CCK-8), Dojindo Laboratories)를 사용하였다. 하이드로겔 스캐폴드를 24-웰(well) 플레이트에서 CCK-8 100㎕가 포함된 배지 1㎖를 처리하고 37℃에서 4시간동안 배양 후 마이크로-플레이트 분광광도계(BIORAD Inc.)로 450nm에서의 흡광도를 측정하였다.
3T3-LI 세포 증식 및 생존은 알지네이트가 2%일 때 가장 활발하였으나, 알지네이트가 2%일 때 하이드로겔 스캐폴드 구조가 약 2주 후부터 변형되거나 무너져 형태가 유지되지 않았다. 알지네이트가 2.5%일 때 세포 증식 및 생존은 활발하였으나 3주 후부터는 마찬가지로 하이드로겔 스캐폴드 구조가 변형되거나 무너져 형태가 유지되지 않았다. 알지네이트가 3%일 때 세포가 세포 증식 및 생존이 활발하고 4주 이상의 장기간 동안에도 하이드로겔 스캐폴드의 구조가 유지되었다. 알지네이트가 3.5% 이상일 때 하이드로겔 스캐폴드의 구조는 장기간 지속적으로 유지되었으나 세포 증식 및 생존이 육안으로 확일할 수 있을 정도로 감소하였다(도 2의 B, C).
3T3-L1 세포의 수가 1x105 cells/ml 미만일 때에는 증식이 원활하게 일어나지 않았다(도 2의 D). 그리고, 하이드로겔 스캐폴드의 높이가 2.0mm일 때 증식률이 가장 높았으며, 3.0mm를 초과하는 경우 하이드로겔 스캐폴드의 하부 구조가 2주~3주 사이에 변형되거나 무너져 형태가 유지되지 않았다.
제조한 스캐폴드 속 지방세포 및 마크로파지 분화
하이드로겔 스캐폴드를 20㎍/㎖ 인슐린, 0.5mM 아이소부틸메틸잔틴(isobutylmethylxanthine), 1μM 덱사메타손(dexamethasone)이 포함된 분화 유도 배지를 이용하여 3일동안 분화시키고 20㎍/㎖ 인슐린을 포함한 배지로 교체하여 2일 동안 두었고, 이후 세포들을 일반 배지(maintained medium) 에 1일 동안 배양하였다.
배양 이후 BODIPY(boron-dipyrromethene)(BODIPY 493/503, Invitrogen)로 성숙된 지방세포의 지방 입자를 착색시켰다. 착색시킨 이 후 PBS로 두 번 세척하고 형광현미경으로 착색된 지방 입자를 확인하였고, 고르게 분포되어 있는 지방 입자를 확인하였다(도 3의 A 및 B).
배양 이후 G6PD 분석 키트(Glucose 6 Phosphate Dehydrogenase Assay Kit, abcam)으로 하이드로겔 스캐폴드에서 G6PD 효소 활성을 측정하여, 분화된 지방세포에서 활성화되는 G6PD 효소 활성을 확인하였다(도 3의 C).
또한, 트리졸(Tri-reagent)(TRIzol®, Invitrogen)을 사용하여 하이드로겔 스캐폴드내 세포에서 RNA를 분리하고 RNA 2㎍을 역전사시킨 후 mRNA의 Real-Time PCR을 통한 유전자 발현 정도 및 웨스턴 블랏(western blot assay)을 통해 단백질의 활성을 확인하였다. 역전사는 AccuPower RT PreMix (Bioneer Inc.,Korea)를 사용하였고, 모든 프라이머 디자인은 프라이머 3 소프트웨어(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)를 이용하였으며 이들의 5' 에서 3' 서열은 표 1에 나타나있다.
유전자 발현 정도 및 단백질 활성 확인 결과 지방세포분화과정과 관련된 전사 인자 및 지방세포 관련 마커인 PPARγ2, CEBP/α FABP4, FAS, G3PD and GLUT4가 상당량 증가한 것을 알 수 있었다(도 3의 D, E).
Gene Forward Reverse
PPARγ2 ccctggcaaagcatttgtat gaaactggcacccttgaaaa
G3PD agagatgctcgccacagaat aaagggtctctggggtctgt
FABP4 catcagcgtaaatggggatt tcgactttccatcccacttc
GLUT4 ctccttctatttgccgtcctc ctgttttgcccctcagtcatt
FAS acatggtagctgccctcaag gcgcagtaccgtagaaggac
18S rRNA cggttctattttgttggt agtcggcatcgtttatggtc
마크로파지와의 공동 배양에 의한 유사 지방조직 구조체 형성 확인
우선, 공동 배양시 마크로파지의 농도에 따른 3T3-L1 생존, 증식 및 분화능을 확인하였다. 마크로파지와 공동 배양시 FABP4, GLUT4 및 PPARγ의 발현이 10%정도 감소하였다. 그리고, 마크로파지의 농도가 증가할수록 FABP4, GLUT4의 발현 및 G6PD 활성 정도가 감소하는 것을 확인하였고, 지방세포와 마크로파지의 공동 배양시 마크로파지의 농도는 2% 일 때 FABP4는 증가하나 GLUT4는 감소하고, 마크로파지의 농도가 3%일 때 FABP4의 활성도 급격히 감소하며 지방전구세포가 지방세포로의 분화가 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 4의 G 내지 I).
지방전구세포의 3차원 단독 배양 및 분화에서는 비만과 연관된 ACC, FAS 및 FABP4 의 발현 증가와 인슐린 저항성과 연관된 AKT의 인산화 및 GLUT4의 발현이 증가 되었으며(도 5 의 A), 지방전구세포와 마크로파지의 3차원 공동배양 및 분화된 스캐폴드에서는 지방전구세포의 3차원 단독 배양 및 분화된 스캐폴드에 비하여 비만과 연관된 ACC, FAS 및 FABP4 의 발현의 차이는 나타나지 않아, 지방세포로의 분화가 원활히 이루어 졌음을 확인할 수 있었으며(도 5 의 A), 인슐린 저항성과 연관된 AKT 의 인산화 및 GLUT4 의 발현이 감소하여 인슐린 저항성이 마크로파지 공동배양에 의해 유도되는 것을 단백질 수준에서 확인할 수 있었다. 이는 일반적으로 알려진 지방전구세포의 2차원적인 단독 배양 및 분화에서 ACC, FAS 및 FABP4 와 같은 지방생성과 연관된 인자들의 증가, 인슐린 저항성과 연관된 AKT의 인산화 및 GLUT4와 같은 인자들이 같이 증가되어 인슐린 저항성이 높아지지 못하는 결과와 확연한 차이를 나타내고 있다. 글루코스 수용 평가 시험 키트(abcam®, UK)를 이용한 글루코스 수용(glucose uptake) 시험 결과(도 5 의 B)에서도 마크로파지 공동배양한 스캐폴드에서 지방세포만 단독배양한 스캐폴드에 비해 고농도의 인슐린(1㎍/ml) 공급에도 불구하고 유의적으로 감소에 따른 인슐린 저항성이 증가하는 것을 확인하였다.
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Claims (6)

  1. (a) 지방전구세포, 마크로파지 및 하이드로겔이 포함된 혼합물을 준비하는 단계;
    (b) 상기 혼합물을 3차원 세포-프린팅 시스템을 이용하여 지방전구세포 및 마크로파지가 포함된 하이드로겔 스캐폴드를 제조하는 단계; 및
    (c) 배양액을 처리하여 상기 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 지방전구세포 및 마크로파지가 유사 지방조직을 형성하도록 증식 및 분화시키는 단계를 포함하는 지방세포 및 마크로파지 공동 배양 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 마크로파지는 상기 지방전구세포 대비 1.0 내지 2.0%(w/v)인 지방세포 및 마크로파지 공동 배양 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 알지네이트, 콜라겐 및 젤라틴이 포함된 알지네이트 하이드로겔인 지방세포 및 마크로파지 공동 배양 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 알지네이트의 함량은 상기 (a) 단계의 혼합물 대비 2.0 내지 4.0%(w/v)인 지방세포 및 마크로파지 공동 배양 방법.
  5. (a) 지방전구세포, 마크로파지 및 하이드로겔이 포함된 혼합물을 준비하는 단계;
    (b) 상기 혼합물을 3차원 세포-프린팅 시스템을 이용하여 지방전구세포 및 마크로파지가 포함된 하이드로겔 스캐폴드를 제조하는 단계;
    (c) 배양액을 처리하여 상기 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 지방전구세포 및 마크로파지가 유사 지방조직을 구성하도록 증식 및 분화시키는 단계; 및
    (d) 지방세포에서 유전자 발현 또는 단백질 활성 중 어느 하나 이상을 조사하는 단계를 포함하는 지방 조직과 관련된 대사성 질환 분석 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 대사성 질환은 제2형 당뇨병인 지방 조직과 관련된 대사성 질환 분석 방법.
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