JP2014521335A - 糖尿病治療用膵島細胞および小膵島細胞クラスターテンプレート - Google Patents

Abstract

細胞を培養するための基材および装置、ならびにそれの使用方法が開示される。基材および装置は、頂面、およびその面内に配置された１つまたは複数のくぼみを含む。各くぼみは、頂面中の開口部、開口部から距離をあけて配置された丸い底面、および丸い底面と開口部の間をつなぐ内壁面により画定される。基材の頂面および装置は、任意選択で、壁に囲まれ、１つまたは複数のくぼみを含むウエルを形成する。基材および装置は、細胞を再凝集させて、例えば、小さい膵島細胞クラスターを形成するために、および高処理試験手法のために、使用可能である。
【選択図】図１

Description

本発明は、一般的には、生存可能な膵島細胞、膵島、および小さい膵島細胞クラスターを生成するための組成物およびプロセスに関する。

関連技術の説明
米国における糖尿病の症例の増加は、流行病と呼ばれている。糖尿病は、病死の３番目の主要な原因であり、米国民の主要死因として心臓疾患および癌と肩を並べる。理由は明らかでないが、１型糖尿病の発生が世界中で増加し、発症年齢もここ１０年間で３〜５才低下しており、そのために、現在、多くの小児が入学前に糖尿病に罹患している。その結果、さらに多くの糖尿病の人が、１型糖尿病に関連する慢性合併症の発症の危険にさらされながら人生の大半の時間を送るということになる。ほとんどの糖尿病関連慢性合併症の発生の危険性は、血糖コントロールに関係しているので、血糖コントロールを改善するための膵島移植などの新規治療法に多くの注目が集まっている。

膵島移植は、最初、１９８０年代に試みられた。ヒトの膵島移植の初期の成功率は期待外れの数値で、移植を受けた患者の５％が一部の機能を実現できるのみであった。Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、「ミネソタ大学における糖尿病患者のための腎臓、膵臓、および膵島移植の進展（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｋｉｄｎｅｙ、ｐａｎｃｒｅａｓ、 ａｎｄ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ
ｗｉｔｈ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１６６：４５６−４９１（１９９３）、を参照されたい。数々の失敗事例の中で、１〜２年の長期にわたる糖尿病の回復を実現する人たちのサクセスストーリーがあちこちで登場し、この手法を糖尿病の治療のために継続する研究者を勇気づけた。２０００年には、グルココルチコイドを使用しない抑制療法により幾人かの糖尿病患者の膵島移植に成功した。この方法は、現在ではエドモントンプロトコルと呼ばれている。Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．、「膵島細胞移植：臨床現場での進歩（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｅｔｔｉｎｇ）」、Ｔｒｅａｔ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２（３）：１７３−１８９（２００３）、を参照されたい。このように、膵島移植の転帰は大きく改善された。Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．、「膵島移植後の臨床的結果（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｆｔｅｒ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｍｅｄ．４９（６）：５５９−５６２（２００１）；Ｂａｌａｍｕｒｕｇａｎ ｅｔ ａｌ．、「自己免疫性糖尿病の治療に関する膵島移植の展望と課題（Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ）」、Ｐａｎｃｒｅａｓ ３２（３）：２３１−２４３（２００６）、を参照されたい。しかし、これらの結果から生まれた楽観論にもかかわらず、実際の糖尿病の治療としての膵島移植の使用にはいまだいくつかの障壁があり、１つの障壁は、たいていの人がインスリン非依存を実現するために複数回の移植を必要とすることを考えると、ドナー臓器の数に限りがあることである。

膵島の物理的特性などの多くの因子が移植の成功に影響を与える可能性がある。およそ２０年前、研究者は、膵島の大きさと形を詳細に報告し、膵島体積を推定する方法を決定した。Ｂｏｎｎｅｖｉｅ−Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、膵島体積分布：灌流により染色した調製物の原位置での直接測定（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅ
ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ：ｄｉｒｅｃｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐｒｅｐ
ａｒａｔｉｏｎｓ ｓｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｓｉｔｕ）」、Ａｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（Ｃｏｐｅｎｈ）１０５（３）：３７９−８４（１９８４）、を参照されたい。長年の間、次に示すいくつかの理由から、大きい膵島が移植部位にとって望ましいと考えられてきた：（１）膵島は、過剰消化によって断片化する場合があるので、大きい膵島の存在が良好な膵液消化の特徴であると考えられること、および（２）体積を使って、移植に必要な膵島の最小数が決定され、膵島の直径の２倍は、体積では８倍の増加に等しいことから、大きい膵島が、調製物中の膵島等量（ｉｓｌｅｔ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ＝ＩＥＱ）に主要な寄与をすると考えられること。

近年、研究者は、膵島を経由する酸素、グルコース、およびインスリン輸送をモデル化した。Ｄｕｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、「移植可能なバイオ人工膵臓の幾何学的最適化に対する有限要素モデルの寄与（Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ａ ｆｉｎｉｔｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｐａｎｃｒｅａｓ）」、 Ａｒｔｉｆ． Ｏｒｇａｎｓ ２６（７）：５８３−９ （２００２）、を参照されたい。制限された酸素輸送により、末梢細胞による酸素消費速度が膵島中への酸素拡散速度を上回る場合に、膵島の芯部で細胞死が広がる可能性がある。例えば、最近の研究は、より大きい膵島では、低酸素条件に暴露されると、壊死が増加することを示している。実際、膵島直径が１００〜１５０μｍを越えると、ほとんど全てのベータ細胞が死滅した。Ｇｉｕｌｉａｎａ ｅｔ ａｌ．、「低酸素性のヒト分離膵島の中心部壊死；分離後虚血の証拠（Ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｈｙｐｏｘｉｃ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔｓ；ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｐｏｓｔｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ）」、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １４７６７−７６（２００５）；ＭａｃＧｒｅｇｏｒ ｅｔ ａｌ．、「ラットの小さい膵島は、インビトロ機能および移植結果において大きい膵島より優れている（Ｓｍａｌｌ ｒａｔ ｉｓｌｅｔｓ ａｒｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ｌａｒｇｅ ｉｓｌｅｔｓ ｉｎ ｉｎｖｉｔｒｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｕｔｃｏｍｅｓ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２９０（５）：Ｅ７７１−７７９（２００６）、を参照されたい。生じた酸化ストレスがアポトーシスおよび移植に対する免疫応答を悪化させる可能性がある。Ｂｏｔｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．、「ヒト膵島の分離ストレスに対する応答および抗酸化剤処理の効果（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｓｌｅｔｓ ｔｏ
ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、Ｄｉａｂｅｔｅｓ５３（１０）：２５５９−６８（２００４）、を参照されたい。細胞死が起こらなかった場合でも、膵島芯部で代謝速度の低下が起こる可能性がある。

また、グルコースおよびインスリンの輸送の遅れも、膵島の機能を漸減させる。膵島内のグルコース勾配が、末梢細胞を、膵島芯部に含まれるものよりもはるかに高い濃度のグルコースに接触させる。Ｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．、「ランゲルハンス島内でのグルコース勾配の直接測定および物質輸送（Ｄｉｒｅｃｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｗｉｔｈｉｎ
ｉｓｌｅｔｓ ｏｆ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０４（２）：３７１−７（２００３）、を参照されたい。この勾配の形は、膵島の直径およびグルコース代謝速度に直接関係する。膵島直径が増加すると、膵島内の全面でこの拡散および消費障壁を高める。

インスリン産生ベータ細胞の別の供給源を探すために、ベータ細胞をインビトロで培養する試みがなされてきた。これらの方法は、胎児組織からベータ細胞を培養すること、またはこのような細胞を膵島産生幹細胞または前駆細胞から得ることに注力されてきた。例
えば、Ｐｅｃｋ ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，７０３，０１７号；Ｂｒｏｔｈｅｒｓ、国際公開第ＷＯ９３／００４１１号（１９９３）；Ｎｅｉｌｓｅｎ、国際公開第ＷＯ８６／０１５３０号（１９８６）；Ｚａｙａｓ、欧州特許第０３６３１２５号（１９９０）；Ｂｏｎｅ ｅｔ ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ；「膵島細胞培養のための新手法（Ａ Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｉｓｌｅｔ Ｃｅｌｌ
Ｃｕｌｔｕｒｅ）」、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｖｏｌ．１８、Ｎｏ．２Ｆｅｂ．（１９８２）、を参照されたい。残念ながら、このような技術は、通常、時間がかかり、また、それらの供給源として希少な胎児組織または幹細胞を入手する必要があるため、培養ベータ細胞の集密的単層しか形成できない結果になる。従って、より効率的で、利用しやすい、信頼性の高い技術を使って、生存可能な膵島細胞を作り出す必要性が残されている。

未処理の大きい膵島の構築で直面するする拡散障壁を克服するために、本件の発明者により、移植用ポリマー微小球上に複数層の膵島細胞を増殖させる種々の試みが行われた。図１Ａに示す微小球を、未処理の膵島の大きさの範囲内に入るように処理した。微小球の外表面にベータ細胞を付着させることにより、拡散障壁による細胞死がほとんど無いか、全く無くなるはずであると理論付けた。極めて高密度の細胞懸濁液の使用、などの細胞の微小球への付着を最適化する各種培養環境を使って、複数の試みを行った。しかし、この方法は、培地の栄養素を急速に枯渇させ、細胞生存はよくなかった。他の技術には、細胞を微小球の上にゆっくり「滴下」して細胞の微小球との物理的相互作用を高めるもの、または微小重力チャンバー中で週日間細胞と微小球を共培養するもの、などがある。一部のベータ細胞は、ポリマー微小球に付着するが、その分布は不均一であり、複数層の付着細胞がバラツキもなく実現されることはなかった（図ＩＢ）。

関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年４月６日出願の米国特許出願第１２／７９８，５２９号の一部継続出願である２０１２年５月２９日出願の米国特許出願第１３／４８２，６７１号の一部継続出願である。本出願は、さらに、２０１１年７月２７日出願の米国仮出願特許第６１／５１２，３０３号の利益を主張する。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載：該当なし

一態様では、細胞培養基材は、ほぼ平らな頂面、および頂面に配置された複数のくぼみを含む。各くぼみは、頂面の開口部、開口部から距離をあけて配置された丸い底面、および丸い底面とその開口部の間をつなぐ内壁面により画定される。各くぼみは、深さが、５０〜３００μｍ（±２０％）であり、直径が、１００〜１０００μｍ（±２０％）である。

別の態様では、細胞培養装置は、ほぼ平らな頂面、および頂面に配置された複数のくぼみを有する基材を含む。各くぼみは、頂面にある開口部、その開口部から距離をあけて配置された丸い底面、および丸い底面とその開口部の間をつなぐ内壁面により画定される。各くぼみは、深さが５０〜３００μｍ（±２０％）であり、直径が１００〜１０００μｍ（±２０％）である。装置は、頂面に配置された少なくとも１つのウエルをさらに含む。ウエルは、頂面により画定される平面にほぼ垂直な方向に、頂面から上側に広がり、ウエル内の内部空間を形成する周囲側壁を含む。周囲側壁は、少なくとも１つのくぼみの開口部を取り囲み、ウエルの外縁内側にある少なくとも１つのくぼみおよびウエルの外側の隣接くぼみの間の液体の連通を防ぐ。

さらなる態様では、細胞培養装置は、ほぼ平らな頂面、通常、頂面により画定される平面に垂直な方向に、頂面から上側に広がり、表面の一部を取り囲む側壁を有する基材を含
む。側壁と頂面は、一体となって液体不透過性ウエルを形成する。ウエルは、側壁およびウエルの底面に配置されたくぼみにより取り囲まれる頂面の一部に相当する底面を有する。くぼみは、ウエル底面の開口部、開口部から距離をあけて配置された丸い底面、および丸い底面と開口部の間をつなぐ内壁面により画定される。

さらなる態様では、本明細書記載のマイクロモールドを使って、生体異物の生物活性を評価する方法も提供される。典型的な例では、このような実施形態における装置は、複数のウエルを含み、各ウエルが１つまたは複数のくぼみを含む。細胞は、くぼみ中で培養され、各くぼみ中に、３次元細胞クラスターを形成する。第１の生体異物が少なくとも１つのウエルに加えられ、そのウエルの各くぼみ中の細胞クラスターと接触する。生体異物の細胞に与える効果は、その後評価される。複数のくぼみ（従って、複数の細胞クラスター）が各ウエル中にある場合、生体異物の細胞クラスターに与える平均の効果が計算できる。さらに、このプロセスを、複数ウエルにわたって複数の生体異物を使って行い、複数の薬剤、生物薬剤、または他の化合物の高処理選別を促進することができる。

本特許または出願ファイルは、少なくとも１つの着色図を含む。着色図を含む本特許または特許出願公告のコピーは、要求と必要な料金の支払いがあれば、事務所により提供される。

患者への移植用微小球ポリマー上でベータ細胞を育成するための以前の試みを示す。この画像は、キトサンポリマー被覆ＰＬＧＡ微小球に付着された細胞の不均等分布を示す。部分的な細胞の単層が、ベータ細胞と共に長期間インキュベーションした後に得られた全てであった。 培養したラットの大きい膵島（１２５μｍ超）、小さい膵島（１２５μｍ未満）、および分散ベータ細胞の時間の関数としての細胞生存率を比較したグラフである。３日を過ぎると、大きい膵島の生存率の減少が統計的に有意となる（ｐ＜０．０５）。 図３ａ及び図３ｂは、小さい膵島（１２５μｍ未満）または大きい膵島（１２５μｍ超）の糖尿病性ラットへの移植結果のまとめである。小さい膵島を使った場合には、正常血糖への順調な復帰が、約８０％の時間で観察されたが、大きい膵島を移植した場合は、正常な血漿グルコースレベルへの復帰に失敗した。これは、移植の６０日後の各群の動物の血漿グルコースレベルを示すことにより最もよく説明できる。大きい膵島を受けた動物は、移植後も高血糖のままであるが、小さい膵島を受けたラットは正常血糖であった。＊は、ｐ＜０．０１で有意差を示す。 図３ａ及び図３ｂは、小さい膵島（１２５μｍ未満）または大きい膵島（１２５μｍ超）の糖尿病性ラットへの移植結果のまとめである。小さい膵島を使った場合には、正常血糖への順調な復帰が、約８０％の時間で観察されたが、大きい膵島を移植した場合は、正常な血漿グルコースレベルへの復帰に失敗した。これは、移植の６０日後の各群の動物の血漿グルコースレベルを示すことにより最もよく説明できる。大きい膵島を受けた動物は、移植後も高血糖のままであるが、小さい膵島を受けたラットは正常血糖であった。＊は、ｐ＜０．０１で有意差を示す。 移植の約８週後の腎被膜から取り出し、インスリンの免疫標識をした膵島移植組織である。左パネルの像は、小さい膵島（１２５μｍ未満）を使った場合の、相対的に多いインスリン免疫標識（赤）および移植組織中の樹立された毛細管ネットワークを示す。対照的に、大きい膵島（１２５μｍ超）の移植組織は、インスリン免疫標識はほとんど認められず、顕著な線維化が認められた（右パネル）。これらの像は、４匹の異なる動物由来の代表的なものである。 ベータ細胞を特定するためにジチゾンで染色したラットの小さい膵島細胞クラスターを示す。共焦点開口絞りを非常に薄いＺ切片に設定したので、サブユニット内であるが、フォーカス面下の細胞がぼやけて、赤色には見えない。しかし、共焦点面内でこれらの細胞に調節することにより、これらもジチゾンではっきり染色されていることが示された。 （パネルＡ）は、酵素分散により未処理の成体膵島から作成した小さい膵島細胞クラスターの生死染色を示す。この小さい膵島細胞クラスターは、約４０μｍの直径である。上段パネル（パネルＢ）では、未処理の膵島をカルシウム枯渇培地中で培養することにより得られた小さい膵島細胞クラスターを示す。小さい膵島細胞クラスターは、ほぐされるか、開放されて、培地がクラスター中の細胞を取り囲むことが可能となった。パネルＣでは、カルシウム枯渇および酵素分散の両手法を使って得た小さい膵島細胞クラスターを示す。断片の直径は、約１５μｍであった。パネルＤは、カルシウム枯渇手法および酵素消化手法の組み合わせの後で、マニュアルピペット操作により得た個別の膵島細胞を示す。赤は死細胞を示し、緑は生存細胞を示す。パネルＢのスケールバーは、パネルＡからＣにも適用できる。 本発明に従って、多層の膵島細胞を付着させたパッチ製作の模式図である。 （Ａ）キトサン（Ｍｗ＝１００ｋＤａ）および（Ｂ）ラミニン、に付着したベータ細胞の光学顕微鏡写真である。挿入図は、アクチン用のシトクロムＢ（緑）染色をしたラミニン上のベータ細胞の光学および蛍光顕微鏡写真を示す。 ５０：５０藻類−カルボキシル（５．５ｋＤａ）から作られるポリマーパッチ上に膵島細胞を層状に形成する場合の結果を示す。パッチを共焦点顕微鏡を使って光学的に切断した。示されたＺ切片を得るように像を描画した。上段のパネルは、１つまたは２つの細胞層のパッチを示すが、その後、図に示すように、いくつかの細胞層が追加された。プレート遠心機を使って約３５００ｒｐｍで約１０分間回転することにより細胞を足場上に積層した。すすぎを繰り返した後も層はポリマー足場に接着のまま残った。 くぼみを有するマイクロモールドの一般的デザインを模式的に示す。この例では、ＰＤＭＳは、マイクロモールドのハウジングを構成する材料であり、エッチングガラスは、くぼみがエッチングで形成される基材である。 マイクロモールド中の空のくぼみを上から見下ろした図を示す顕微鏡写真である。ここで示したくぼみの様式は、マイクロモールドデザインＢの代表的なものである。 単一くぼみの深さ、およびくぼみの丸底形状を例示する表面形状測定装置により生成されたグラフである。 マイクロモールド製作に利用される足場の模式図である。マイクロモールドを形成するためのマイクロモールドおよび足場の部品は、［１］大きな銅管、［２］小さな銅管、［３］くぼみ面を収容するシステムを構成するＰＤＭＳポリマー、［４］ベースとして使用され、その上にマイクロモールドが形成されるアルミニウムフォイルに包まれた大きな正方形ガラスなどの平面、［５］マイクロモールドハウジングの垂直壁、［６］マイクロモールドのベース（ここでは深さ２ｍｍまで流し込まれた状態で示されている）、および［７］くぼみの基材であるエッチングガラス、である。 ２および５日目にマイクロモールドのくぼみ内での膵島細胞再凝集を示す顕微鏡写真である。 くぼみ領域に隣接したくぼみ形成基材のくぼみが形成されていない端部を示す顕微鏡写真である。くぼみは、小さな再凝集膵島細胞を含むが、くぼみが形成されていない表面上に入ったこれらの細胞は、再凝集し、大きなメガ膵島を形成した。 市販プレートのウエルの端部に集まった生存膵島細胞を示す顕微鏡写真である。膵島細胞の再凝集体は、マイクロモールドほど球形ではなく、膵島細胞の再凝集群は、マイクロモールド中に形成される９０μｍの膵島よりもかなり大きい。 図１７Ａ及び図１７Ｂは、２種の可能なマイクロモールド用のくぼみ様式を示す一組の模式図である。図１７Ａは、くぼみが相互に近接しているデザインであり、これは、単一マイクロモールドで形成される再凝集体の数を最大化しようとする場合には、有用であると思われる。図１７Ｂは、相互に隙間をおいて離れているデザインであり、これは、個別くぼみ中の細胞の処理を操作する場合には、有用であると思われる。 単一くぼみ内に含まれる２つの再凝集膵島を示す顕微鏡写真である。 図１９Ａ及び図１９Ｂは、再凝集膵島中の生存染色を示す一組の顕微鏡写真である。赤は死細胞を示す。図１９Ａは、マイクロモールド内の膵島再凝集体は、極わずかの死細胞を含み、上側の膵島のただ１個の死細胞が染色されるが、一方、下側の膵島中には細胞死の証拠がないことを示す。図１９Ｂは、マイクロモールドのくぼみ形成されていない表面上に形成されたメガ膵島を示し、共焦点面視野中に少なくとも２３個の死膵島細胞が存在する。 小さいおよび大きい天然膵島の生存率を再凝集膵島と比較したグラフである。全膵島を同じラットから取り出し、分離した膵島の一部を再凝集のために膵島細胞中に分散した、５日目に、再凝集膵島をマイクロモールドから取り出し、全膵島に対し生／死の生存率染色を行った。再凝集膵島中の生存細胞割合は、大きいまたは小さい天然膵島の割合よりも高かった。 マイクロモールドのくぼみ中で再凝集後６日目の２つの代表的膵島を示す。ここでは、三重染色して、ベータ細胞（緑）、アルファ細胞（赤）、およびデルタ細胞（青）を特定した。上段の膵島は、４３ｘ５５μｍの直径（ＸとＹ方向に測定して）であり、下段の膵島は、４８ｘ６５μｍの直径である。 マイクロモールドのくぼみ中で形成された再凝集後６日目の膵島を示す。ここでは、インスリン（緑）およびプロインシュリン（赤）の染色が行われた。この膵島は、４５ｘ５４μｍの直径（ＸとＹ方向に測定して）である。 異なるグルコース条件に暴露した３種の膵島型のインスリン分泌を示すグラフである。マイクロモールドのくぼみ中の小さい天然膵島および再凝集膵島を低グルコース条件（３ｍＭ）に暴露した。培地中へ分泌されたインスリンを集めて、Ｙ軸で示されたように定量した。マイクロモールドのくぼみ中の小さい天然膵島、大きい天然膵島および再凝集膵島を高グルコース条件（２０ｍＭ）に暴露した。培地中へ分泌されたインスリンを集めて、Ｙ軸で示されたように定量した。 本発明のマイクロモールドを使用して最適の大きさの膵島に再凝集させる一般的方法を示すフローチャートである。 高処理薬物試験のための本発明のマイクロモールドの１つの代表的使用例を示すフローチャートである。追加の代表的使用例は、図３４〜３５に示されている。 ２−［Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−ｌ、３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｄグルコース（２−ＮＢＤＧ；２０ｍＭ）を含む培地中で再凝集した膵島を示す。丸は膵島の位置を示す。蛍光性のグルコース類似体である２−ＮＢＤＧは、各再凝集膵島中に完全に組み込まれている。 生体高分子モールドの作成に使用できると思われるネガティブスタンプ（金属またはＳＵ−８製）のデザインを示す。最終製品は、ガラスモールドで作られたものと類似のくぼみを持つことになる。 図１８Ａ及び図２８Ｂは、各マイクロモールド中のくぼみの領域内のそれぞれのくぼみの位置を特定する標識を含むネガティブスタンプデザインを示す。図２８Ａに示すように、異なる形状をガラスエッチング法よりもさらに精密なくぼみの底としてデザインしてもよい。図２８Ｂは、識別可能標識を有するくぼみを含む最終生体高分子モールドの一部を示す。 図２９Ａ及び図２９Ｂは、ほぼ同じ大きさの２つの膵島の比較である。図２９Ａは、球状再凝集膵島の一例である。形、大きさ、および滑らかなカプセル様外縁は、両方の膵島で類似である。図２９Ｂは、小さい天然膵島を示す。形、大きさ、および滑らかなカプセル様外縁は、両方の膵島で類似である。 同じドナー由来の大きな、および小さい膵島からのグルコース刺激インスリン放出の比較を示す。 実施例５で記載されるマイクロモールドの模式図である。 マイクロモールドが、標準的プレートのウエル内に適合するように製作されたもの（上段パネル）、または自立型モールド（下段パネル）であってもよいことを示す。 より多くの特異性をユーザーに提供できるくぼみ深さの多様性を示す。 壁に囲まれたマイクロモールドのデザインの模式図である。この場合、壁がそれぞれ単一のくぼみを取り囲む。 壁に囲まれたマイクロモールドのデザインの模式図である。この場合、壁が複数のくぼみを取り囲む。 均一な大きさのマイクロモールド由来の膵島細胞クラスターの形成を示す。 膵島の芯部へのグルコース拡散がほとんど無い大きい膵島を示す。スケールバー＝１００μｍ。 マイクロモールド由来ラット膵島細胞クラスターの高グルコース（２０ｍＭ）に対する応答を示す。グルコース刺激後、予期されたインスリン分泌の鋭い立ち上がりが８０分に起こり、その後、基底レベルに戻る。 医薬品産業でよく使われる自動分散設備を使った標準的３８４ウエルプレート中への天然の膵島の不均等分散を示す。各番号は、所与のウエル中に沈殿した天然の膵島の数を示す。 高処理選別に使われる同じマイクロモールドによる細胞クラスターの生成方法の模式図である。 マイクロモールド由来膵島細胞クラスターに比較して、天然の膵島細胞の生存率を示す。天然の膵島の死細胞の染色（赤または緑）は、わずか２、３時間の培養後の芯部での死亡を示す（上段パネル）。天然の膵島に比較し、マイクロモールド由来膵島細胞クラスターの生存率は大きく改善される（下段パネル）。 開示マイクロモールド中で生成されたヒト肺癌球状体を示す。

好ましい実施形態の詳細な説明
Ａ．一般論
本明細書で使われる用語の「ランゲルハンス島」または「膵島」は、ホルモンを作り分泌する膵臓中の特殊な細胞群を意味する。膵島は、通常、次の細胞型の内の１つまたは複数を含む：（１）血液中のグルコース（糖）のレベルを上げるグルカゴンを作るアルファ細胞、（２）インスリンを作るベータ細胞、（３）多くの他の体内のホルモンを抑制するソマトスタチンを作るデルタ細胞、（４）膵臓ペプチド産生ＰＰ細胞、（５）血管作用性小腸ペプチドを分泌するＤ１細胞、および（６）セクレチン、モチリンおよびサブスタンスＰを分泌するＥＣ細胞。

本明細書で使われる用語の「膵島細胞」は、膵島中で見出されるいずれか１つの細胞を意味する。本発明で使われる膵島細胞は、インスリン産生ベータ細胞と他の膵島細胞型との組み合わせであることが好ましい。

本明細書で使われる用語の「小さい膵島細胞クラスター」または「膵島断片」は、一緒に結合した一群の膵島細胞で、通常、そのクラスター中に約２５個未満の膵島細胞を含む。小さい膵島細胞クラスターは、クラスター内のいずれかの細胞に対する（例えば、栄養素、酸素、グルコースなどに対する）拡散障壁が、約７細胞以下である形態を有することが好ましい。典型的な例では、拡散障壁は、約５細胞であり、４、３、または２細胞まで少なくてもよい。「小さい膵島細胞クラスター」は、主要構成細胞型としてベータ細胞を含むのが好ましく、任意選択で、１つまたは複数の他の膵島細胞型を含んでもよい。小さい膵島細胞クラスターは色々な形状であってよい（例えば、通常は、球状、細長い形状、または他の非対称形状であってもよい）。小さい膵島細胞クラスターの例は、図５および６（Ａ）、６（Ｂ）、６（Ｃ）に示されている。「小さい膵島細胞クラスター」は、ドナー膵臓から分離された未処理のより大きな膵島を分散させることにより得られるものが好ましい。

本明細書で使われる用語の「天然の膵島」は、哺乳類膵臓から得られた膵島を意味する
。天然の膵島は、１２５μｍを越える直径、好ましくは、１５０μｍを越える直径を有する「大きい天然膵島」、または１２５μｍ未満の直径を有する「小さい天然膵島」として特徴付けることができる。

本明細書で使われる用語の「メガ膵島」は、約３００μｍを越える直径の再凝集膵島を意味する。

本明細書で使われる用語の「成体天然膵島」は、成体哺乳類膵臓から得られる大きい天然膵島または小さい天然膵島を意味し、この場合、膵島はバラバラに分離されていない。

本明細書で使われる用語の「分散膵島細胞」は、細胞の懸濁液を意味し、大きい膵島を分解して膵島細胞を懸濁液中に均一に分散させることにより得るのが好ましい。懸濁液中の９０％以上の膵島細胞が単一細胞であり、残りは、ダブレット細胞（２個の細胞が一緒に結合）およびトリプレット細胞（３個の細胞が一緒に結合）、さらに、４個以上の細胞が互いに結合した極わずかのさらに大きな集団を含むのが好ましい。

本明細書で使われる用語の「再凝集膵島」は、一緒に結合した一群の膵島細胞を意味し、大きい膵島を単一の膵島細胞に分解し、それらの単一膵島細胞をまとめて一緒に培養することによりこれを得て膵島を形成するのが好ましい。単一膵島細胞の膵島への再凝集が、マイクロモールド中のくぼみの物理的寸法により影響を受けるのが好ましい。再凝集膵島を形成するために使われる個別の膵島細胞の数は、膵島生成物の所望の大きさに依存する。

本明細書で使われる用語の「拡散障壁」は、高濃度領域（例えば、細胞外の酸素またはグルコース濃度）から低濃度領域（例えば、細胞内の酸素またはグルコース濃度）への分子の移動の抑制を意味する。大きい膵島は、酸素に対し比較的高い拡散障壁を示し、これがそれらの移植における生存率および有用性を制限する。マイクロモールド中での膵島再凝集体は、大きい天然膵島に比べて小さく、比較的低い拡散障壁を示し、これが再凝集膵島内の細胞生存率に寄与する。

本明細書で使われる用語の「細胞生存率」は、全体細胞試料に対する生または死の細胞量の尺度を意味する。本明細書で定義される高細胞生存率は、全細胞の８５％を越える生存可能な細胞、好ましくは、９０〜９５％を越える生存可能な細胞、また、さらに好ましくは、９９％を越える生存可能な細胞を含む高細胞生存率を特徴とする細胞集団を意味する。

生体液または組織と接触することが意図される（例えば、対象への埋め込み、または移植による）本明細書で使われる材料は、「生体材料」と命名される。生体材料は、材料と生理的な環境の間での反応の誘発が最小限であることが望ましい。生理的な環境に置かれた後、最小限の炎症性反応のみである、アナフィラキシー性反応の証拠がない、および生体材料表面上で最小限の細胞増殖のみである場合、生体材料は、「生体適合性」であると見なされる。宿主哺乳動物への移植に際し、生体適合性生体材料は、マイクロカプセルの機能に対し有害となる影響を与えるのに充分な宿主応答を誘発しない。このような宿主応答には、生体材料上または周辺への線維状構造の形成、免疫学的な生体材料の拒絶、または生体材料から周辺宿主組織中への有毒、または発熱性化合物の放出、が含まれる。

本明細書で使われる用語の「エッチング」は、酸を使って基材にくぼみを形成する化学プロセスを意味する。

本明細書で使われる用語の「くぼみ」は、基材中の底および側壁を含む局所的ウエルま
たは空洞（すなわち、幅と深さを有するくり抜かれた空間）を意味する。一実施形態では、膵島の再凝集のために、くぼみは、直径１００μｍおよび深さ６０μｍ未満である。例えば、くぼみは、直径８０μｍおよび深さ４８μｍであってもよい。他の実施形態では、膵島の再凝集を行いたい場合は、くぼみは、直径８０〜１２０μｍおよび深さ４８〜７２μｍである。薬剤試験のためのミニ腫瘍の成長、などの他の目的に対しては、最適くぼみは、直径１００〜２００μｍおよび深さ６０〜１００μｍであろう。

本明細書で使われる用語の「くぼみ形成基材」は、飛び飛びの個別くぼみを含むように修正された固体支持体またはいずれかの材料を意味する。

本明細書で使われる用語の「マイクロモールド」は、複数のくぼみから構成される面を含む装置を意味し、くぼみは、直径約１０００μｍ未満の寸法である。マイクロモールド中のくぼみの物理的形式は、マイクロモールドの製造者が指定できる。マイクロモールドは、別々に形成した後、一体化して１個のものとして取り付けるか、または１個のものとして形成できる２つの主要部分、すなわち、ｉ）くぼみ形成基材、およびｉｉ）くぼみ形成基材を収容し、細胞と培地を含むシステムを含むのが好ましい。マイクロモールドを使って、内部に置かれた細胞の増殖または再凝集を誘導もしくは規定する。

本明細書で使われる用語の「モールドハウジング」は、くぼみ形成基材ならびにそれに加えられたいずれかの液体および細胞物質の両方を保持する構造体を意味する。

本明細書で使われる用語の「ハウジング足場」は、マイクロモールド作成の間に材料の形を支持し、その形に影響を与えるために使用される一時的骨組みを意味する。

本明細書で使われる用語の「スパッタリング」は、基材上に薄膜コーティングを沈着させるために使われる蒸着方法を意味する。

本明細書で使われる用語の「ウエル」は、数十ナノリットルから数ミリリットルまでの液体または相当する量の粉末などの固体を保持するための容量を有する内部空間を意味する。ウエルは、典型的な例では、円形または正方形、円柱状または円錐形であるが、他の形状も同様に使用可能である。

本明細書で使われる用語の「側壁」は、少なくとも１つの空間を別の空間から分離することにより領域を画定するほぼ垂直な面を意味する。本発明で特に有用な側壁は、実質的に液体タイトであることが意図されている。

本明細書で使われる用語の「実質的にタイト」は、充分な圧力下で、不透過性面で構造的不連続性を作り出す場合を除いて、液体に不透過性であることを意味する。例えば、開示された壁に囲まれたくぼみ形成マイクロモールドの側壁は、側壁の面は、側壁に隣接する化合物の少なくとも９７％、９８％、９９％、または１００％に対し不透過性であるという点で実質的に液体タイトである。

本明細書で使われる用語の「マイクロ細胞培養プレート」は、「マイクロタイタープレート」、「マイクロプレート」、または「マイクロウェルプレート」とも呼ばれ、試験管に類似の小さい内容積として機能する複数の飛び飛びのウエルを有する平面プレートを意味する。マイクロ細胞培養プレートは、典型的な例では、６、２４、９６、３８４、１５３６、３４５６または９６００ウエルの２：３矩形マトリックス形に配置されウエルを含む。各ウエルは、数十ナノリットルから数ミリリットルの液体を保持する容量を有する。マイクロ細胞培養プレートは、典型的な例では、８５．５ｍｍＸ１２７．８ｍｍである。

本明細書で使われる用語の「対照化合物」は、実験のベースライン応答を規定するために使用される化合物を意味する。対照を使って、化合物に対する陽性、陰性、またはゼロ応答のためのベースライン基準を決定できる。

Ｂ．多層として付着される膵島細胞
一実施形態では、本発明は、移植用の生存可能な個別膵島細胞または小さい膵島細胞クラスターの生成方法に関する。一態様では、非胎性ドナー膵臓から分離された個別膵島細胞または小さい膵島細胞クラスターが、適切な生体材料足場の表面に多層に付着される。

一態様では、個別膵島細胞好ましくは、ベータ細胞が生体材料足場に付着される。別の態様では、種々の膵島細胞型の組み合わせが生体材料足場に付着される。さらに別の態様では、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の細胞から構成される小さい膵島細胞クラスターが生体材料足場に付着される。

さらに別の実施形態では、１から２、３、４、または５層の多層膵島細胞が生体材料足場に付着される。生体材料足場上の膵島細胞および小さい膵島細胞クラスターは、約１０〜５０μｍ厚さ、最も好ましくは、約２０〜４０μｍ厚さの細胞の多層を形成する。

一態様では、膵島細胞の多層は、実質的に均一な厚さを有するため、細胞厚さは、生体材料足場の表面の垂直方向に１〜２細胞より少ない程度しか変化しないのが好ましい。

一態様では、個別膵島細胞および／または小さい膵島細胞クラスターは、ドナー成体対象の膵臓から直接単離され、未処理の膵島と分離される。膵島を個別細胞および／または小さい膵島細胞クラスターに分ける適切な方法には、酵素消化手法および金属ベース分散（カルシウム枯渇）手法、またはこれらの組み合わせ、が含まれる。

別の態様では、生体材料足場は、個別膵島細胞または小さい膵島細胞クラスターの適切な付着力を足場に付与する材料から構成される。無機および有機材料を含む種々の型の材料を本発明の生体材料足場として使用可能であることが意図されている。これらの材料の非制限的例には、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）、ポリ（リン酸エステル）、ポリ（ホスファゼン）、などが含まれる。その他の非制限的材料には、例えば、多糖類、ポリエステル（例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（Ｌ−リシン）、ポリ（グリコール酸）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸））、ポリ（乳酸−ｃｏ−リシン）、ポリ（乳酸−移植組織−リシン）、ポリ酸無水物（例えば、ポリ（脂肪酸ダイマー）、ポリ（フマル酸）、ポリ（セバシン酸）、ポリ（カルボキシフェノキシプロパン）、ポリ（カルボキシフェノキシヘキサン）、これらのモノマーの共重合体、など）、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）、ポリ（アミド）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（イミノ炭酸）、ポリ（ウレタン）、ポリ（オルガノファスファゼン）、ポリ（リン酸）、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、およびその他のアシル置換セルロース酢酸とその誘導体、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（炭酸）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（アクリル酸）、ポリアセタール、ポリ（シアノアクリル酸）、ポリ（スチレン）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（フッ化ビニル）、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、共重合体、ポリスチレン、ならびにこれらのブレンドまたは共重合体）が含まれる。特定の好ましい態様では、生体材料には、多糖類、アルギン酸塩、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡ）、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレンイミン、キトサン（ＣＳ）、キチン、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸コンドロイチン、ゼラチン、など、およびそれらの誘導体、共重合体、ならびにそれらの混合物が含まれる。その他の適切な生体材料には、ナイロン、ヒアルロナン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニルフォルムアミド、および、Ｖａｔｓ、ｅｔ ａｌ．「組織工学用足場と生体材料：臨床的適用への概説（Ｓｃａｆｆｏｌ
ｄｓ ａｎｄ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ｃｌｉｎ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ａｌｌｉｅｄ Ｓｃｉ．２８（３）：１６５−７２（２００３）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、「膵島の免疫分離のためのカプセル封入系（Ａｎ
ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔｓ）」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（４）：３５８−６２（１９９７）；Ｏｒｉｖｅ ｅｔ ａｌ．、「細胞のカプセル封入：将来性と進捗（Ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ：ｐｒｏｍｉｓｅ
ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ）」、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（１）：１０４−７（２００３）、に記載されたものが含まれる。

好ましい態様では、生体材料足場は、生分解性材料から構成される。適切な生分解性生体材料には、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、またはポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）が含まれる。ＰＬＧは、薬剤送達用としてよく研究されたポリマーであり、多くのインビボ適用に関しＦＤＡ認可を受けている。Ｂｅｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、「正確に制御された、単分散のサイズ分布を有するＰＬＧ微小球の製作（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＬＧ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅｃｉｓｅｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ａｎｄ ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ）」、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ Ｍａｙ １８、７３（ｌ）：５９−７４（２００１）、を参照されたい。

別の態様では、生体材料足場は、膵島とベータ細胞間接着を高めるコーティングで全体または一部が被覆されてもよい。代表的コーティングには、フィブロネクチン、ポリエチレングリコール酢酸、ラミニン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレン−ａｌｔ−マレイン酸（ＰＥＭＡ）、およびキトサン（ＣＳ）が含まれる。

また、足場は、それに接着した１つまたは複数の膵島細胞接着分子（「ＣＡＭ」）を保持して、個別細胞の足場付着および／または小さい膵島細胞クラスターの足場付着を促進してもよい。ＣＡＭは、細胞−対−細胞および細胞−対−細胞外マトリックス（ＥＣＭ）接着に受容体として機能する細胞表面上に認められる糖タンパク質であり、組織工学に関与し、ポリマー基材に対する細胞付着を促進することが示されている（Ｄｕｎｅｈｏｏ ｅｔ ａｌ．、「標的化薬物送達のための細胞接着分子（Ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９５：１８５６−１８７２（２００６））。ＣＡＭには、インテグリン（例えば、ａｖｂ３、ａｖｂ５、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−４）、カドヘリン（例えば、Ｅ−、Ｐ−、およびＮ−カドヘリン）、セレクチン（例えば、Ｅ−、Ｌ−、およびＰ−セレクチン）、免疫グロブリンスーパーファミリー（例えば、ＩＣＡＭ−１、１ＣＡＭ−２、ＶＣＡＭ−１、およびＭａｄＣＡＭ−１）、細胞外マトリックスタンパク質（例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノゲン、コラーゲン、ラミニン、およびヴォンヴィレブランド因子）、ＲＧＤペプチド、ＩＣＡＭ−１ペプチド、ＶＣＡＭ−１ペプチド、カドヘリンペプチド、およびＬＦＡ−１ペプチド由来の直鎖および環式細胞接着ペプチドならびにペプチド模倣薬が含まれる。ＣＡＭは、組織再生、細胞形態学、移動、有糸分裂、細胞質分裂、食作用、および細胞極性の維持に重要な分子である。以前、ＲＧＤペプチドなどの細胞接着分子は、組織工学、組織再生、創傷治癒、再建手術、神経再生、骨移植組織、および臓器移植のプロセスを支援できることが示された。さらに、Ｅ−カドヘリンは、Ｐ−細胞接着に重要であることが示されている（Ｈａｕｇｅ−Ｅｖａｎｓ
ｅｔ ａｌ．、「栄養素刺激に対する統合された応答のためには、膵臓ベータ細胞−対−ベータ細胞相互作用が必要：ＭＩＮＥ偽膵島のＣａ^２＋およびインスリン分泌応答の強化（ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃａ^２＋ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｒｅ
ｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ＭＩＮＥ ｐｓｅｕｄｏｉｓｌｅｔｓ）」、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４８：１４０２−１４０８（１９９９））。

一実施形態では、ＣＡＭは、ペプチド、チオエーテル、ジスルフィド、またはエステル結合、などの共有結合により、ポリマー基材上に固定できる。細胞接着分子およびポリマー基材の間にスペーサー分子を加えて、ポリマー上の接着分子と細胞表面上の細胞接着受容体との間の自由相互作用を可能にする。異なる細胞をＲＧＤペプチドを点在させたポリマー基材に付着させる研究では、細胞表面受容体によりＲＧＤペプチドが最も良好に認識されるためのポリマーとＲＧＤペプチドとの間の最適スペーサーは、凡そ１１〜４６オングストロームであることが示された。スペーサーは、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧＳ）、ポリアミノ酸（例えば、ポリグリシン（ｐｏｌｙ−Ｇｌｙ）、ポリリシン（ｐｏｌｙ−Ｌｙｓ）、ポリアラニン（ｐｏｌｙ−Ａｌａ））、ポリアミノカプロン酸（ポリ−Ａｃａ）、およびこれらの内の２回または３回のアミノ酸反復の組み合わせ（例えば、ポリ−Ａｃａ−Ｇｌｙ）から作ることができる。共有結合に加えて、膵島細胞を付着させる前に、ポリマー上にＣＡＭを最初に付着させることにより（例えば、静電的に、または他の非共有結合的相互作用により）、ＣＡＭを基材に吸着させてもよい。

別の態様では、生体材料足場は、個別膵島細胞または小さい膵島細胞クラスターの足場表面への付着を容易にする形状を有する。足場は、典型的な例では、パッチまたはディスク上の平面、などのほぼ平らな表面を有する。好ましい実施形態では、生体材料足場は、ほぼ平らで柔軟なパッチ材料を含む。

生体材料足場は、個別膵島細胞または小さい膵島細胞クラスターの付着に適した大きさを有する。例えば、一態様では、平面パッチは、典型的な例では、約０．２〜３センチメートルのオーダーの寸法を有する。パッチの厚さは、典型的な例では、約５０μｍ〜１センチメートルのオーダーである。

意図された生体材料足場は、増殖因子、免疫抑制剤、抗生物質、抗酸化剤、抗サイトカイン、抗エンドトキシン、Ｔ細胞接着遮断薬、血管新生因子、栄養素、またはこれらの組み合わせの内の１つまたは複数を制御できる状態で放出してもよい。代表的増殖因子には、エピレギュリン、上皮増殖因子（「ＥＧＦ」）、内皮細胞増殖因子（「ＥＣＧＦ」）、繊維芽細胞増殖因子（「ＦＧＦ」）、神経増殖因子（「ＮＧＦ」）、白血病抑制因子（「ＬＩＦ」）、骨形成タンパク質−４（「ＢＭＰ−４」）、肝細胞増殖因子（「ＨＧＦ」）、血管内皮細胞増殖因子−Ａ（「ＶＥＧＦ−Ａ」）、コレシストキニンオクタペプチド、インスリン様増殖因子、インスリン、およびこれらの組み合わせが含まれる。一般的な事項に関しては、Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．、「神経増殖因子で処理後の膵島生存のインビトロおよびインビボ改良（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｓｌｅｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）」、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｆｅｂ ２７；８１（４）：５１９−２４（２００６）；Ｔａ ｅｔ ａｌ．、「増殖因子の一定組み合わせによる成体マウス膵臓培養由来の長期間複製膵島前駆体様細胞の生成の制御（Ｔｈｅ ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｉｓｌｅｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｐａｎｃｒｅａｓ）」、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、Ｍａｒ ２３（２００６）；Ｊｏｈａｎｎｓｏｎ、「膵島内皮細胞および膵臓ベータ細胞増殖：成体ラットのインビトロおよび妊娠の間の調査（Ｉｓｌｅｔ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ：ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｒａｔｓ）」、Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｍａｙ；１４７（５）：２３１５−２４（２００６）、Ｅｐｕｂ
Ｊａｎ ２６（２００６）；Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．、「膵臓ベータ細胞増殖およびインスリン分泌に与えるエピレギュリンの作用（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎｏｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）」、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｄｅｃ ２３（４）：２８５−９３（２００５）；Ｖａｓａｄａｖａ、「増殖因子およびベータ細胞複製（Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３８（５−６）：９３１−５０（２００６）、Ｅｐｕｂ Ａｕｇ ３１ Ｒｅｖｉｅｗ（２００５）；Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．、「コレシストキニンオクタペプチド：糖尿病性ラットの膵臓ベータ細胞のための有望な増殖因子（Ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅ：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒａｔｓ）」、ＪＯＰ、Ｎｏｖ １０；５（６）：４６４−７５（２００４）、を参照されたい。

代表的免疫抑制剤は、ステロイド系でも、非ステロイド系でもよい。一実施形態では、ステロイド系薬剤は、プレドニゾンを含む。別の実施形態では、非ステロイド系薬剤は、いわゆるエドモントンプロトコルで使われるもの：シロリムス（ラパミューン、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ Ｃａｎａｄａ）、タクロリムス（プログラフ、Ｆｕｊｉｓａｗａ Ｃａｎａｄａ）、およびａｎｔｉ＿ＩＬ２Ｒダクリズマブ（ゼナパックス、Ｒｏｃｈｅ Ｃａｎａｄａ）、の内の１つまたは複数を含んでもよい。他の候補の免疫抑制剤には、１５−デオキシスパガリン、クロスポリン、ラパマイシン、ラパミューン（シロリムス／ラパマイシン）、ＦＫ５０６、またはリソフィリン（ＬＳＦ）が含まれる。

代表的免疫抑制剤は、よく知られており、ステロイド系でも、非ステロイド系でもよい。好ましいステロイド系薬剤は、プレドニゾンである。好ましい非ステロイド系薬剤には、いわゆるエドモントンプロトコルで使われるもの：シロリムス（ラパミューン、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ Ｃａｎａｄａ）、タクロリムス（プログラフ、Ｆｕｊｉｓａｗａ Ｃａｎａｄａ）、およびａｎｔｉ＿ＩＬ２Ｒダクリズマブ（ゼナパックス、Ｒｏｃｈｅ Ｃａｎａｄａ）、が含まれる、他の免疫抑制剤薬剤には、１５−デオキシスパガリン、クロスポリン、ラパマイシン、ラパミューン（シロリムス／ラパマイシン）、ＦＫ５０６、またはリソフィリン（ＬＳＦ）、が含まれる。

代表的抗生物質には、アモキシシリン、ペニシリン、サルファ剤、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、クラリスロマイシン、シプロフロキサシン、テルコナゾール、アジスロマイシン、などを含んでもよい。

種々の抗酸化剤には、１つまたは複数のチオール基を持つもの、例えば、還元グルタチオン（ＧＳＨ）またはその前駆物質、グルタチオンまたはグルタチオン類似体、グルタチオンモノエステル、およびＮ−アセチルシステインを含んでもよい。他の適切な抗酸化剤には、超酸化物ジスムターゼ、カタラーゼ、ビタミンＥ、トロロクス、リポ酸、ラザロイド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ビタミンＫ、などを含んでもよい。例えば、グルタチオンは、約２〜約１０ｍＭの濃度範囲で使用可能である。例えば、米国特許第５，７１０，１７２号；同５，６９６，１０９号；および同５，６７０，５４５号、を参照されたい。

適切な抗サイトカインは、当技術分野でよく知られており、ジメチルチオ尿素（約１０ｍＭ）、シチオロン（約５ｍＭ）、プラバスタチンナトリウム（プラバコール、約２０ｍｇ／ｋｇ）、Ｌ−ＮＧ−モノメチルアルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ、２ｍＭ）、ラクトフェリン（約１００ｐｇ／ｍｌ）、４−メチルプレドニゾロン（約２０ｐｇ／ｍｌ）、などが含
まれる。

抗エンドトキシンは、当技術分野でよく知られており、Ｌ−ＮＧ−モノメチルアルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ、約２ｍＭ）、ラクトフェリン（約１００ｕｇ／ｍｌ）、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ、約１ｍＭ）、アデノシン受容体アンタゴニスト、例えば、バミフィリン（テオフィリン）、および抗リポ多糖類化合物、例えば、エキノマイシン（約１０ｎＭ）、などが含まれる。

別の実施形態では、Ｔ細胞接着遮断薬は、本開示の装置と連携して使用可能である。例えば、Ｔ細胞接着遮断薬は、基材の移植、または再凝集膵島の移植の場合に、膵島細胞を含む生体高分子基材に結合するか、または別の方法で連携して、その後に起こりうる免疫反応を抑制できる。Ｔ細胞接着遮断薬は、臓器移植および自己免疫疾患において、Ｔ細胞活性化および免疫応答を抑制することが示された（Ｙｕｓｕｆ−Ｍａｋａｇｉａｎｓａｒ
ｅｔ ａｌ．、「炎症および自己免疫疾患に対する治療方法としてのＬＦＡ−ｌ／ＩＣＡＭ−１およびＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−Ｉの抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＬＦＡ−ｌ／ＩＣＡＭ−１ ａｎｄ ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−Ｉ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）」、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２２、１４６−１６７（２００２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｓｉａｈａａｎ、「自己免疫疾患の制御のためのターゲティング１ＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用：ペプチドおよび小分子阻害剤の設計（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ １ＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ： Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２４、４８７−５０１（２００３）、を参照）。Ｔ細胞接着遮断薬には、限定されないが、（ａ）ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、Ｂ７、ＣＤ２８、ＣＤ２、およびＶＬＡ−４に対するモノクローナル抗体、（ｂ）可溶性タンパク質およびその断片、例えば、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、（ｃ）ＲＧＤペプチドおよびペプチド模倣薬、（ｄ）ＶＣＡＭ−１ペプチドおよびペプチド模倣薬、（ｅ）ＩＣＡＭ−１ペプチドおよびペプチド模倣薬、ならびに（ｆ）ＬＦＡ−１ペプチドおよびペプチド模倣薬、が含まれる。さらに、グルタミン酸デカルボキラーゼ６５（ＧＡＤ６５）およびＧＡＤ二官能性ペプチド阻害剤（ＧＡＤ−ＢＰＩ）由来のペプチド（例えば、ＧＡＤ２０８−２１７）は、免疫寛容を誘導し、Ｔ細胞による膵島浸潤（膵島炎）を抑制することが示された。ＧＡＤ２０８−２１７は、Ｔ細胞：ＡＰＣ相互作用の間にＴＣＲ−ＭＨＣ−Ａｇ複合体形成を調節する（シグナル−１）ことにより、非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスのベータ細胞を攻撃するＴ細胞の活性化を阻止することが示された（Ｔｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．、「ＧＡＤ６５−特異的調節性Ｔ細胞の誘導により、非肥満性糖尿病性マウスの進行中の自己免疫性糖尿病が抑制される（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＡＤ６５−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ−ｃｅｌｌｓ
ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｏｎｇｏｉｎｇ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ
ｎｏｎｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍｉｃｅ）」、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７：８９４−８９９（１９９８））。好ましいＧＡＤ−ＢＰＩは、ＬＦＡ−１ペプチド（配列：ＥＩＡＰＶＦＶＬＬＥ−［Ａｃ−Ｇ−Ａｃ−Ｇ−Ａｃ］−ＩＴＤＧＥＡＴＤＳＧ）の一部に結合したＧＡＤ２０８−２１７を含み、Ｍｕｒｒａｙ、らによる「シグナル−１／シグナル−２二官能性ペプチド阻害剤（Ｓｉｇｎａｌ−１／ｓｉｇｎａｌ−２ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」の名称の米国特許公開第２００５／０１０７５８５号に記載されているように、ＮＯＤマウスのＴ細胞活性化および膵島炎を阻止することが示された。従って、これらの分子は、同時投与して、膵島移植または基材移植の拒絶反応を防ぐことができる。また、これらの分子は、徐放機序により送達し、膵島移植／移植の拒絶反応を防ぐこともできる。一実施形態では、分子は、ベータ細胞が足場に付着する前に、生体材料足場の内部で捕捉される可能性がある。

このような薬剤の徐放は、Ｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．、「ＰＬＧ微小球からの小分子放出のモデル化：ポリマー分解および不均一薬剤分布の効果（Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ＰＬＧ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｎｕｎｉｆｏｒｍ ｄｒｕｇ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）」、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ．Ｍａｒ ２；１０３（１）：１４９−５８（２００５）；Ｂｅｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、「ＰＬＧ微小球の大きさの正確な制御により薬剤放出速度制御が強化される（Ｐｒｅｃｉｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＰＬＧ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ ｓｉｚｅ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｒａｔｅ）」、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ．Ｊｕｌ １８；８２（１）：１３７−４７（２００２）；Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ、「注射可能ＰＬＧＡデリバリーシステムにおけるカプセル化タンパク質の安定化に関する最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ＰＬＧＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１９（ｌ）：７３−９８（２００２）；Ｓｅｒｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、「薬剤送達調節のための植え込み型ポリマー系（Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ、ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５；５４（９）：１２２５−１２３５（２００２）、に記載のプロトコルを使って行うことができる。

Ｃ．くぼみ形成マイクロモールドによる膵島の産生
また、本発明は、生存可能な小さい膵島のインビトロ産生方法に関する。一態様では、非胎性ドナー膵臓から分離した分散膵島細胞は、マイクロモールドの個別くぼみ中にグループに分けて配置後、培養して再凝集膵島を形成できる。再凝集膵島の形と大きさは、くぼみの寸法の影響を受ける。

マイクロモールドのくぼみは、小さい膵島の形成に適した大きさとすることができる。例えば、マイクロモールドは、直径約３０〜３５ｍｍのオーダーの寸法であってよいが、この大きさは、産生方法によって制限されることなく、３０ｘ３０ｃｍまで大きくできる。典型的な例では、くぼみは、直径約１００〜２００μｍ（±２０％）、深さ６０〜１００（±２０％）μｍのオーダーの寸法である。好ましくは、膵島の産生のために、くぼみは、直径１００μｍ（±２０％）、深さ６０μｍ（±２０％）である。

本開示のマイクロモールドを使って、移植またはインビトロ研究用に適する最適形状と大きさの膵島集団を生成できるであろうと考えられる。例えば、マイクロモールド中で生成される膵島の集団は、５０μｍ以下の平均直径であってもよい。別の態様では、集団は、少なくとも８５％生存可能な細胞、好ましくは、９０％または９５％を越える生存可能な細胞を特徴とし、より好ましくは、集団は、９９％を越える生存可能な細胞を特徴とする。

さらに別の態様では、マイクロモールドで生成される膵島集団は、高レベルのインスリン分泌を特徴とてもよい。例えば、マイクロモールドを使った小さい膵島の再凝集は、小さい天然膵島に比較して、より高いレベルのインスリン分泌を特徴とし、好ましくは、２０倍を超えるインスリン分泌、より好ましくは、１００倍を超えるインスリン分泌を特徴とする。例えば、再凝集膵島では、図２３に示すように約１０ｎｇ／ＩＥの分泌が測定された。この値は、Ｃｒｉｍ ｅｔ ａｌ．、２０１０、の値から計算された最も高い値より、４１倍大きい。研究室間でのインスリン分泌データの比較で起こる１つの難しい点は、多くの研究者が膵島容量当たりのインスリン分泌を報告していないことである。Ｃｒｉ
ｍ、らの場合は、５０個の膵島当たりのインスリン分泌を報告しているが、膵島の平均の大きさを示さなかった。従って、それらの５０個の膵島がそれぞれ前に定義した１膵島当量（ＩＥ）の膵島容量に等しかったと仮定するしかない。我々の研究室は、いつも膵島の全ＩＥで割った体積と細胞で表して正規化したインスリン分泌を報告している。Ｃｒｉｍ、らの論文に対しこの仮定を採用すると、本明細書記載の再凝集膵島は、高グルコースに応答して、Ｃｒｉｍ、らによる報告の最良状態に比べ４０倍を超えるインスリンを放出する。

本発明の一実施形態では、マイクロモールドを使って、インビトロ試験および他のインビトロ適用に有用な細胞が生成される。その実施形態では、マイクロモールド表面は、ＰＤＭＳ製のモールド側面（ハウジングシステム）を有するガラスで作られることが好ましい。

別の実施形態では、マイクロモールドは、移植可能であり、前述の生体適合性材料から作られてもよい。

別の態様では、マイクロモールドのくぼみは、非膵島細胞に対し最適物理的再構成状態を提供するように作られる。種々の型の細胞が本発明のくぼみ中で形成できることが意図されている。非制限的例には、長ニューロン細胞経路、糸球体様フィルター、血管、補充肺胞、などが含まれる。また、マイクロモールドなどの小さい、輪郭の明確な形状物中での幹細胞または再構成された細胞の凝集は、本発明の使用に適するであろう。好ましい細胞型には、３−Ｄ構造が細胞機能に重要である細胞が含まれる。

図２４は、本開示のマイクロモールドの播種を一般的に示す模式図である。膵臓または他の膵島供給源から採取された天然の膵島クラスターが単一の膵島細胞に分散され、くぼみのあるマイクロモールドに充填される。「分散細胞」という表現により、われわれは、ほとんどの（典型的な例では、少なくとも９０％の）細胞が単一細胞であり、より少ない比率の細胞がダブレット細胞またはトリプレット細胞として一緒に結合していることを意図する。分散細胞が各くぼみ中に沈降した分散細胞集団を生ずるようにマイクロモールド中に配置される。３０〜１５０個の細胞が各くぼみ中に沈殿するのが好ましい。

実施例５は、膵島を単一細胞に分散する、およびマイクロモールド中で細胞をインキュベーションする好ましい方法を開示する。ＫＵ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで配合された培地混合物で解離が行われるのが好ましい。この混合物は、９部のカルシウム−マグネシウム不含ハンクス平衡塩類溶液および１部のパパイン（５０ユニット／ｍｌ）を含む。対照的に、大抵の膵島解離は、トリプシン、またはパパイン以外の酵素を使って行われる。解離を３７℃で回転を加えながら行った。最終的に、膵島は、少なくとも９０％の細胞が単一細胞に分離されるまで血球計数器で観察しながらマニュアルでピペット操作を行い、単一細胞に分散する。また、実施例５では、膵島細胞のマイクロモールド内での再凝集のための好ましい条件も開示する。一般的に、図１４に示すように、細胞は、２日目まで単一細胞または緩く付着した細胞集団として残る。しかし、多くの場合、５または６日目までに、これらのくぼみ中の細胞は球状の３Ｄ構造に再構成された（例えば、図１８〜１９Ａおよび２１参照）。典型的な例では、５日目までに、再凝集膵島は、モールドから取り出しができるようになり、独立した膵島として機能するようになる。

この期間中、細胞は、天然の膵島の３次元形状を呈する。くぼみ中に形成された膵島の平均直径は、５０μｍ未満である。実施例５では、マイクロモールド中に形成された小さい膵島の形態学的性質について記載している。

本発明の一実施形態では、低濃度に分散された細胞が、マイクロモールドに添加され、わずか２個または３個程度の少ない細胞が各くぼみに沈降し、くぼみ内の細胞の成長と分裂が可能となる。この方法によりくぼみ中で成長した細胞集団の形と大きさは、くぼみの物理的寸法に影響される可能性がある。マイクロモールドには、膵島細胞を充填し、わずか２個または３個程度の膵島細胞が各くぼみを占め、そこで膵島細胞が成長し、一緒に凝集して小さい膵島、好ましくは、直径３０〜４０μｍの膵島を形成するように膵島細胞を集結させるのが好ましい。

本発明の別の実施形態では、再凝集時に化学薬品または生物学的分子を処理膵島中に組み込むことが望まれる。これらの分子には、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、ＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、抗炎症薬、および抗生物質、が含まれる。特に、移植可能なマイクロモールド基材が使われる場合に、移植部位での酸素分圧を高めるための分子または小型装置を再凝集膵島中に組み込むことができる。再凝集時に添加可能な他の非制限的な種類の分子には、インスリン放出を誘発する薬剤、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体（例えば、アンタゴニストＣＤｌｌａ、ＣＤｌｌｂ、ＣＤｌｌｃ、ＣＤ１８）、および核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が含まれる。

典型的な例では、このような分子は、マイクロモールドへの充填時に膵島に組み込むことができる。分子は、分散細胞を含む培地に加えられ、凝集の間に細胞に取り込まれるか、または細胞に付着することになる。あるいは、細胞は、ユーザーの標的タンパク質の産生の増加、または減少をもたらす標準的形質移入法により再凝集前に改変可能である。再凝集体の形成後、新しく形成された膵島は、化学薬品、例えば、免疫抑制剤またはその他の増殖因子などの所望の分子を保持できる生体高分子を使ってカプセル化してもよい。あるいは、移植可能なマイクロモールドを使って、選択した分子をモールドに含浸させることもできる。

本発明の方法は、その後の移植または試験薬剤もしくは装置のための細胞凝集体を形成するように作ることができる。実施例５は、移植および薬剤選別のための、ならびにそれを行うための好ましい再凝集細胞形成方法について説明している。

また、別の態様では、本発明は、薬剤、化学薬品、または他の小分子の高処理選別の方法に関する。本マイクロモールドのくぼみの型および寸法は、各くぼみへの個別介入に適応できるように設計できることが意図されている。

別の態様では、くぼみ形成マイクロモールドは、動物宿主への移植に適した生体高分子から生成される。我々は、移植可能なマイクロモールド中での再凝集細胞は、くぼみ形成基材に付着する場合も、しない場合もあることを想定している。インビトロでの作業には、ガラスなどの非粘着性基材表面が好ましい。しかし、移植可能なモールド、または生体高分子パッチに対しては、粘着性基材が、移植前後の膵島の損失を減らし、移植プロセスの効率を高めるであろう。細胞の生体高分子に対する付着力が試験され、表１と図８に示されている。

Ｄ．マイクロモールドを使って生物活性により化合物を選別する方法
請求発明の好ましい実施形態は、上部平面およびそこに配置された複数のくぼみを含むマイクロモールドである。各くぼみは、頂面中の開口部、開口部から距離をあけて配置された内側底面、および底面および頂面の開口部の間をつなぐ内壁面により画定される。一部の実施形態では、底面は、丸い形状、または凹面形状であってよい。くぼみは、頂面により画定される平面の下方に、通常垂直の方向に伸び、通常は、凹面形構造に形成され、その中で膵島が培養できる。別の実施形態では、壁で変更を加えられたマイクロモールドが提供され、この場合、壁は、頂面から、通常は、頂面により画定される面の上方に垂直
方向に伸びる。壁は協調して、分離、隔離、分割、または他の方法により頂面の隣接くぼみ開口部を壁で仕切って、個別くぼみまたはくぼみ集団を分離するのに使用できる（それぞれ、図３４と３５を参照）。壁は、マイクロモールドの頂面と組み合わせされて、飛び飛びの内部空間または「ウエル」を画定する。ウエルは、液体、例えば、培地および／または追加の化学薬品をウエル内に含まれる１つまたは複数のくぼみ中で培養された３Ｄ細胞クラスターに加えることを可能とする。壁で変更を加えられたマイクロモールドは、特に、高処理選別に好都合である。

現在の薬剤選別および毒性試験は、最初にペトリ皿の底に単層として培養した細胞を使って篩を通すことを含む。単層で成長した細胞は、同じ型のインビボの細胞と比べて化合物に対し異なる応答を示す場合がある。例えば、インスリン分泌ベータ細胞は、ペトリ皿中で単層として培養される場合、インビボの細胞構造により良く似ている３Ｄ球状体として培養される場合と同じようにはインスリンを分泌しない。しかし、化合物選別における３Ｄ球状体の使用は、極めて問題をはらんでいた。例えば、既知の技術を使って培養された３Ｄ球状体は、不均一細胞数および組成ならびに高拡散障壁を呈する。このような差異は、試験化合物に対し一貫性のない細胞応答をもたらす。さらに、細胞の３Ｄ球状体の現在の培養方法は、産業用高処理機器に適合せず、高速処理のニーズのレベルにまで規模拡大できず、また、長期間実験を維持するのに適さない。既知の技術のさらなる課題は、同じドナー由来の膵島内の大きさの変動である。小さい膵島は、高グルコース濃度に応答して、大きい膵島より多くのインスリンを放出する（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ ｅｔ ａｌ．、２００６；図３０）。

実施例５で記載されるマイクロモールドは、得られた細胞クラスターが、研究または移植の目的用にモールドから取り出される場合に、特に有用である。実施例６で記載のマイクロモールドは、高処理選別を含む薬剤および毒物選別に特に有用である。実施例６で記載のマイクロモールドは、単一くぼみまたは複数のくぼみ（それぞれ、図３４および３５）を別々のウエルに隔離することを可能とする。例えば、高処理選別の場合の標準となっている、既知の３８４−または１５３６−ウエルプレートデザイン（寸法８５．５Ｘ１２７．８ｍｍ）を使って、複数の（例えば、２〜１４個またはそれ以上の）くぼみを１５３６−ウエルプレートの単一ウエル内に生成できる。１４個のくぼみ／ウエルを有する１５３６−ウエルプレートは、２１，５０４細胞クラスターを培養するのに適するくぼみを有することになる。単一ウエル中に分散された化合物は、１４個までの異なる細胞クラスターと接触することができ、平均応答／ウエルを測定するための１４個の複写物が得られることになる。ウエル当たり生成される細胞クラスターの数を変えて、最終ユーザーの目的に合わせることができる。

少なくとも、このアッセイは、測定可能な応答を生成する単一の未処理の膵島に依存ぜず、また、単一の細胞クラスターにも依存しないという理由から、壁に囲まれたマイクロモールドデザインは、同じ条件下の天然の膵島の試験に比べて、試験化合物に対するマイクロモールド由来細胞クラスター応答の信頼性を改善する。むしろ、各ウエルでアッセイされた応答は、３〜１４細胞クラスターからの平均応答である。好都合にも、細胞クラスターの成長に使われる同じマイクロモールドは、試験化合物の分注用の標準的産業機器と適合する。細胞クラスターの生成および試験で各移動ステップが省略されることにより、選別効率が改善され、汚染のリスクが減る。

一実施形態では、本方法は、コンピュータシステムで行われる態様を含めてもよい。従って、計算システムは、方法を実行するためにコンピュータで実行可能な命令を有する記憶装置を含んでもよい。コンピュータが実行可能な命令は、いずれかの請求項のいずれかの方法を実行するための１つまたは複数のアルゴリズムを含むコンピュータプログラム製品の一部であってもよい。

請求発明の他の実施形態では、壁に囲まれたマイクロモールドは、非膵島細胞型、例えば、少なくとも、癌細胞、および心臓疾患、血管疾患および内分泌障害に関連する細胞の再凝集および選別に使用できる。本明細書記載の壁に囲まれたマイクロモールドを使って１つまたは複数の化合物で処理される場合、非膵島細胞を培養し、その後、生物活性の試験を行うことが意図されている。好都合にも、開示マイクロモールドを使って、１つまたは複数の化合物を１つまたは複数の非膵島細胞クラスターに適用することができる。

利点およびそれに付随する新規特徴に加えて、本発明のさらなる態様は、一部は以下の説明および実施例で記述され、一部は以下の内容の調査に基づき当業者に明らかになるか、または本発明の実施により知ることができよう。本発明の目的と利点は、特に添付の請求項中で指摘される手段および組み合わせにより理解され、また、達成できるであろう。

実施例
実施例１：膵島の大きさが生存率と移植の成功に影響を与える
この実施例は、膵島の大きさがどのようにラットの移植の成功に影響を与えるかを調査した。この実施例では、膵島を分離する技術が説明され、細胞生存率が測定された。大きい膵島（１２５μｍ超）および小さい膵島（１２５μｍ未満）の両方を移植して、膵島の大きさが移植の成功に与える影響を評価した。下で考察のように、インビトロ機能およびインビボ移植結果に関し、小さいラット膵島は大きい膵島より優れている。また、これらの実験は、ＭａｃＧｒｅｇｏｒ ｅｔ ａｌ．、「インビトロで機能および移植結果に関し、小さいラット膵島は、大きい膵島より優れている（Ｓｍａｌｌ ｒａｔ ｉｓｌｅｔｓ ａｒｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ｌａｒｇｅ ｉｓｌｅｔｓ ｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｕｔｃｏｍｅｓ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．Ｍａｙ；２９０（５）：Ｅ７７１−９（２００６）、にも記載されている。

ラット膵島分離
大きい、および小さい膵島を分離するために、ケタミンとキシラジンの混合物の腹腔内注射により成体雄ＤＡラットを麻酔した。腹膜腔を露出し、膵管の腸への連結部をクランプした。膵臓に総胆管を介してカニューレを原位置に挿入し、コラゲナーゼの冷溶液を管中にポンプ圧送する事により膨張させた。コラゲナーゼ（ＣＬＳ−１、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）を２０ｍｌの４５０Ｕ／ｍｌのＬｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ１５に溶解した。その後、膨張膵臓を摘出し、５０ｍｌ遠心チューブに移し、インキュベーター中で静かに転回させながら３７℃で約２０〜３０分インキュベートした。インキュベーション後、チューブに軽く振盪を加え、膵島を遊離させた。チューブの含有物を、希釈した氷冷１０％の新生児仔ウシ血清含有ハンクス平衡塩類溶液（「ＨＢＳＳ」）中に置いた。消化物を１ｘｇで遠心沈降させ、上清を取り除いた。さらにＨＢＳＳ／血清を加え、前記プロセスを繰り返した。洗浄された消化物を５００ミクロンステンレス鋼篩を通過させた後、約１分間、３００ｘｇの冷蔵遠心機で沈降させた。ペレットを１０ｍＬの１．１１０ｇｍ／ｍＬ Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（密度＝１．１０８５、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）と混合し、８００ｘｇで１０分間、遠心分離した。勾配上に浮遊した膵島を集め、別々に沈降させた後、１０％の胎仔ウシ血清含有ハムＦ１２培地中に置き、３７℃の５％ＣＯ_２含有培養チャンバー中に入れた。

収率
収率測定のために、それぞれ約２％の膵島比率を含む３組の膵島の各バッチ試料を試験した。個別膵島を計数し、その直径を測定した。不規則形状膵島に対しては、膵島の異なる位置で３〜４回の直径測定値を採取し、平均した。膵島容量を計算し、その試料の膵島
当量、および全体膵島比率に換算した。約１２５μｍ以上の直径の大きい膵島と対比させて、小さい膵島を約１２５μｍ未満の直径の膵島と定義した。

大きい膵島から小さい膵島を分離するために、新鮮な膵島または一晩培養した膵島を沈降させた後、１〜２ｍｌのＬ１５培地中に置いた。次に、膵島を、Ｌ１５中の５％ＢＳＡの１ステップ勾配上に素早く層形成させた。大きい膵島がチューブの底に観察されるようになるまで経験的に設定した時間、１ｘｇでの遠心沈降を行った。その時点で、上部の２ミリリットル（ＢＳＡなし）の勾配を廃棄し、底部の２ｍｌ以外の全てを注意深く取り出して、小さい膵島集団とした。沈殿した膵島および底部の２ｍｌ中の膵島を合わせて大きい膵島画分とした。大きい、および小さい膵島の分離を最適化する必要に応じ、勾配分離法を繰り返した。最終膵島画分を沈殿させ、グルコース感受性実験を行うまで、ハムＦ１２培地とグルコース不含ＲＰＭＩ １６４０（グルコース＝５ｍＭ）の１：１混合物の培養液中に置いた。

生存率
生存率を試験するために、膵島を、生死フルオロフォア、Ｓｙｔｏｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、１μＭ）およびＣａｌｃｅｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、０．５μＭ）を含む５００μｌの容量のＬ−１５培地中に置き、３７℃で約１５〜３０分間インキュベートした。膵島を、１３７ＮａＣｌ、２．７ＫＣ１、４．３Ｎａ_２ＨＰＯ_４および１．４ＫＨ_２ＰＯ_４（ｍＭ単位）、ｐＨ７．４を含む燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｆｌｕｏｖｉｅｗ３００共焦点顕微鏡の備えられたＡｔｔｏｆｌｕｏｒ Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）中に置いた。４０Ｘまたは６０Ｘ対物レンズを使って画像を取得した。培地から膵島を取り出した後の２０分以内に全画像を取得した。Ｈｅ：Ｎｅおよびアルゴンレーザーおよび第３明視野像を使って、各膵島に対し３枚の同時画像を取得した。

図２に示すように、ヒトでもラットの場合でも、培養液中で維持された大きな未処理の膵島（１２５μｍ超）は、典型的な例では、細胞死が時間と共に増加し、ただの４日後に、大きな割合の壊死（１２．６％）およびアポトーシス性（６．３％）細胞を示す。より小さい膵島（１２５μｍ未満）は、長期の生存率を示したが、それでも、それ以降の時点（１週間以降）で急激な細胞死を示した。これらの小さい膵島の生存率は、１週間まで続き、９９〜８６％の高い生存割合を維持することが明らかになった。これは、培養液中での数日後に５０％未満に低下する生存率レベルである１０個の未処理の大きい膵島との比較である。図２に示すように、別々に分散した膵島細胞は、培養液中で小さい未処理の膵島に類似の高生存率プロファイルを維持する。

生死分析は、視野中の膵島を特定し、目的の領域を取り囲むマークをすることにより完遂した。バックグラウンド蛍光を全画像から差し引いた。目的視野からＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ）を使って色相ヒストグラムを作り、緑色相（生存）および赤色相（死）の合計ピクセルを計算することにより生存率割合を求めた。生存細胞を合計膵島面積で割った比率をパーセント生存値として計算した。膵島の直径および周長をＳｃｉｏｎソフトウェアを使って計算し、それにより、生存率値が、膵島の大きさに従って分類可能となった。

移植の調査
また、膵島の大きさの移植の成功に対する効果も調査された。その実験では、ストレプトゾトシン（６５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射（１回の注射）によりレシピエント動物に糖尿病を誘導した。血液グルコースレベルが、３連続日の間、２５０ｍｇ／ｄｌより高い場合には、ラットは、糖尿病と見なされた。

ラットをペントバルビタール４５ｍｇ／ｋｇで麻酔した。ラットを剪毛し、ベタダイン洗浄により浄化後、左脇腹の体壁の切開を行った。腎臓を創傷中に送り出し、小さい切開を腎被膜に行った。大きい、または小さい膵島を小さいボアピペットを使ってその被膜の下に置いた。腎臓を元の位置に戻し、創傷クリップで切開を閉じた。肉牛／ブタ亜鉛−インスリン（ＮＰＩ−１イレチンＩ）注射（２回／日）を、膵島移植後３日間、レシピエントに投与し、新規移植膵島に加わる高血糖症のストレスを減らした。

大きい、または小さいラット膵島の移植を完了した（ｎ＝１０移植／群）。ストレプトゾトシン誘導された糖尿病性ＤＡラットは、限界量（１０００ＩＥ）の大きい（１５０μｍ超）または小さい（１２５μｍ未満）同系膵島を腎被膜下に投与を受けた。血液グルコースレベルを８週間モニターした。図３（Ａ）および３（Ｂ）は、各群の最初の５匹の移植の結果を示す。大きい膵島の全レシピエントは、移植後も高血糖のまま残った（１０移植の内の１０移植）、対照的に、移植の７〜１０日後、小さい膵島の１０移植のレシピエントの内の８移植は、血液グルコースレベルが正常に近いか、または正常なレベルであり、全８週間の間、そのレベルのままであった。

腎被膜からの膵島移植組織は、移植後８週で取り出された。組織を固定し、インスリン用の免疫標識を行った。図４（左パネル）は、小さい膵島移植を受け、８週間正常血糖であった動物由来の移植組織を示す。移植組織には、かなりのインスリンの染色が存在する。対照的に、大きい膵島の移植を受けが動物は、８週間にわたり高血糖性が継続し、移植組織中、わずかなインスリンの免疫標識を示した（図４、右パネル）。

全体として、前出の実験は、生存率、インビボ機能アッセイ、および移植結果に関し、より小さい膵島（１２５μｍ未満）が、大きい膵島（１２５μｍ超）より優れていたことを示す。さらに、平均膵臓量に関しては、大きい膵島より約３倍多い量の小さい膵島が得られ、また、より小さい膵島は、約２０％多くの量が生存可能であった。糖尿病性動物に移植される場合には、小さい膵島は、大きい膵島よりもはるかに優れていたことは、最も重要である。

実施例２：大きい膵島の個別膵島細胞または小さい膵島細胞クラスターへの変換
この例は、断片化または未処理の膵島の小さい膵島細胞クラスター（図５に示すクラスターなどの）および個別膵島細胞への分散の方法を例示する。図６Ａの小さい膵島細胞クラスターは、従来の酵素消化手法を使って生成し、一方、図６Ｂの小さい膵島細胞クラスターは、段階的カルシウム枯渇手法を使って形成した。図６Ａの像が示すように、酵素分散は、膵島を小さい膵島細胞クラスターに分解するが、クラスターを「解放（ｏｐｅｎ）」しないので、クラスターの内部にある細胞は、数個の細胞の厚さの拡散障壁を持つことになる。対照的に、カルシウム枯渇手法により形成した小さい膵島細胞クラスター（図６Ｂ）に対しては、クラスターは、「解放」形態であり、それにより、小さい膵島細胞クラスターの場合は、各細胞に対し、より小さな拡散障壁になる。酵素消化手法およびカルシウム枯渇手法の組み合わせは、また、図６Ｃに示すように、未処理の膵島を小さい膵島細胞クラスターに変換するために使用可能であることが期待される。

酵素消化
異なる酵素混合物を使って、未処理の膵島を小さい膵島細胞クラスターおよび個別膵島細胞に断片化できる。代表的酵素消化方法は、米国特許第６，７８３，９５４号に開示されている。この例では、パパインを含む反応混液などの１２種の酵素混合物が使用され、成功の程度は、様々であった。

膵島を分離するために、ケタミンとキシラジンの腹腔内注射によりＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを麻酔した。腹膜腔を露出し、腸への膵管連結部をクランプした。膵臓
の原位置に総胆管経由でカニューレを挿入し、コラゲナーゼの冷溶液を管中にポンプ圧送する事により膨張させた。その後、膨張した膵臓を摘出し、遠心管に移し、静かに転回しながら３７℃で約３０分間、インキュベートした。洗浄した消化物を篩を通過させた後、冷蔵遠心機で沈降させた。ペレットをＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（密度＝１．１０８５、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と混合し、遠心分離した。その後、膵島を１０％の胎仔ウシ血清含有ハムＦ１２培地中に置き、３７℃の５％ＣＯ_２を含む培養チャンバーに入れた。

ベータ細胞分離用標準的プロトコルには、未処理の膵島を、４．８ｍＭヘペスを含むハンクス液（「ＨＢＳＳ」）中でインキュベートすること（本明細書記載の技術を使った分離）が含まれた。Ｂａｌａｍｕｒｕｇａｎ ｅｔ ａｌ．、「酵素消化の弾力的運用により、最適でない次善のドナー膵臓由来のヒト膵島分離結果が改善される（Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｈｕｍａｎ ｉｓｌｅｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｕｔｃｏｍｅ ｆｒｏｍ ｓｕｂ−ｏｐｔｉｍａｌ ｄｏｎｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔａ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ３（９）：１１３５−４２（２００３）、を参照されたい。酵素消化に対して、１ｍｌのパパイン（５０ユニット／ｍｌ）を含む最終９ｍｌのハンクス液を膵島に加えた。最初に、ピペットによる膵島の吸い込みと吐き出しをゆっくり繰り返して膵島のすすぎを完全に行った。膵島をチューブの底に沈殿させ、大部分の上清を除去した。酵素中の膵島を３７℃で約３０分間、ゆっくり回転させた（約１０ｒｐｍ）。この時点で、少しの単一分散細胞と共に、小さい膵島クラスターが形成され、溶液から取り出された。典型的な例では、細胞を、最終培地としＣＭＲＬ１０６６またはＭｅｍｐｈｉｓ ＳＭＦに移した。

図５と６Ａ（酵素）に大まかに示されるように、細胞をジチゾンで染色し、クラスター内のベータ細胞を特定した。

金属ベース断片化手法
また、金属ベース断片化手法を使って未処理の膵島を小さい膵島細胞クラスターおよび個別膵島細胞に断片化できる。金属ベース断片化手法の興味ある知見は、得られた小さい膵島細胞クラスターが、緻密化度が低いこと、または「開放」形態を有することである。Ｅ−カドヘリンなどの細胞接着分子は、膵島を相互に保持するが、機能するためには２価の金属が必要である。Ｈａｕｇｅ−Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．、「栄養素刺激に対する統合応答のためには、膵臓ベータ細胞−対−ベータ細胞相互作用が必要：ＭＩＮ６偽膵島の強化されたＣａ^２＋およびインスリン分泌応答」、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８（７）：１４０２−８（１９９９）、を参照されたい。従って、カルシウム不含培地中での約１時間の膵島の培養により、より緻密な膵島構造を生成する酵素単独の利用（図６Ａ参照）に比べて、膵島構造の「弛み（ｌｏｏｓｅｎｉｎｇ）」および破壊が生ずる（図６Ｂ参照）。さらに、カルシウム枯渇手法を使った膵島の「弛み」生成後、残りのベータ細胞塊は、従来の酵素を使って、より容易に分散される（図６Ｃ参照）。

金属ベース断片化手法の詳細は、以下の通りである。個別膵島細胞および小さい膵島細胞クラスターを得るために、膵島をカルシウム−マグネシウム不含ＨＢＳＳ＋４．８ｍＭヘペス中に置いた。約３７℃で約３０分間のインキュベーション後、細胞をピペットで採取し、小さい膵島細胞クラスターまたは単一細胞に分散させた。細胞を最終培地としてＣＭＲＬ１０６６に移した。必要に応じ、小さい膵島細胞クラスターまたはベータ細胞をジチゾンで特定した。Ｍｙｔｈｉｌｉ ｅｔ ａｌ．、「移植前の培養により、サル膵島の超微細構造の健全性が保存される（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ ｔｈｅ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ｍｏｎｋｅｙ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔｓ）」、Ｊ
．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃ．（Ｔｏｋｙｏ）５２（４）：３９９−４０５（２００３）、を参照されたい。

図６Ｂに示すように、カルシウム枯渇手法単独により得られた小さい膵島細胞クラスターは、クラスターの芯部の灌流に最適であると思われる不規則的管状配置である。さらに、金属ベース分散により得られるクラスターは、作成に要する時間は約１時間のみであるが、酵素による断片化手法は、４８時間かかる場合もある。

酵素消化および金属ベース分散手法の組み合わせ
また、分散技術として、酵素消化手法および金属枯渇手法の組み合わせを使って実験を行った。未処理の膵島を４．８ｍＭヘペス含有の９ｍｌのＨＢＳＳ（カルシウムまたはマグネシウム不含）ですすいだ。最初に、ピペットによる膵島の吸い込みと吐き出しをゆっくり繰り返して膵島のすすぎを完全に行った。膵島をチューブの底に沈殿させ、大部分の上清を取り除いた。膵島を反復洗浄し、全カルシウムとマグネシウムを取り除いた。

最後の、１ｍｌのパパイン（５０ユニット／ｍｌ）を含み、カルシウムとマグネシウム不含ＨＢＳＳの９ｍｌを膵島に加えた。酵素中の膵島をゆっくり（１０ｒｐｍ）３０分間、回転した。この時点で、小さい膵島クラスターは、溶液から取り出すことが可能であった。中等度の速度で強いピペット操作を２〜３回行って、単一細胞を得た。

細胞を２５℃、１５００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。適切な培地（その後のアッセイによる）を使って単一細胞を再懸濁した。３７℃および５％ＣＯ_２のインキュベーター中に細胞を貯蔵した。図６Ｃに示すように、酵素およびカルシウム枯渇手法の組み合わせにより、小さい膵島細胞クラスターまたは単一細胞が得られる。さらに、この組み合わせは、全体として、より速い分散プロトコルであったが、過剰消化細胞および細胞損傷を回避する注意が必要である。

これらの実験では、ＹＯ−ＰＲＯ−１およびヨウ化プロピジウム（Ｖｉｂｒａｎｔ Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ａｓｓａｙｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、壊死およびアポトーシス細胞を測定した。このアッセイのために、細胞をＰＢＳと一緒にＯｌｙｍｐｕｓ Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ３００レーザー共焦点顕微鏡のＡｔｔｏｆｌｕｏｒ Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）中に置いた。細胞を培地から取り出し後ｍ２０分以内に全画像を取得した。Ｈｅ：Ｎｅおよびアルゴンレーザーならびに第３明視野像を使って、各膵島に対し同時に３枚の画像を取得した。透過光を使ってその視野中の細胞を特定することにより生死分析を完結した。緑細胞は、アポトーシスを示し、黄色／赤は、壊死細胞を示す。蛍光発光の足りない細胞は生存していた。蛍光像の上に透過光像（灰色）を重ねた。

実施例３：パッチ生体材料足場上への個別膵島細胞および小さい膵島クラスターの調製
前出の実施例は、小さい膵島細胞クラスターおよび個別ベータ細胞でさえも、酸素、グルコース、などを輸送するための達成可能な最高の自由表面積を示すはずであることを示している。従って、この実施例では、個別膵島細胞または小さい膵島細胞クラスターを図７に一般的に示すパッチなどの生体材料足場上に、テンプレート化し、多層膵島細胞を形成した。

足場材料の選別
この実施例では、膵島細胞の生体材料への相対的付着力を測定することにより本発明の足場を調製するために有用な種々の生体材料の最適化について調査した。足場材料は、移植を容易にするために、組織および生体材料裏張りを分離させることなく、容易に取扱えることが好ましい。表１は、ベータ細胞との交互作用を基準に選択された各種の生体材料
を示す。これらの材料の内のいくつかは、移植組織として使用された履歴を有する。

典型的な実験では、列挙した生体材料の１％貯蔵液を最初に調製した。大抵の材料は、中性のｐＨで脱イオン水に溶解した。キトサンは、溶解するために、より低い約５．５のｐＨが必要であり（塩酸を使用した）、他の材料は、有機溶剤が必要であり、例えば、Ｃｅｌｌｆｏｒｍ（登録商標）はエタノールが必要で、およびポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）はジクロロメタンが必要であった。本来水に可溶なポリマー（例えば、硫酸デキストラン、アルギン酸塩、など）は、架橋して薄膜基材を形成できる。約２５μＬのそれぞれの貯蔵液を９６−ウエルプレート中の３つの別々のウエルに加え、蒸発させるか、または真空乾燥し、それにより、生体材料薄膜を各ウエルの底に沈着させた。残りの溶媒量は極微量で、細胞中に毒性を誘導しなかった。ウエルプレートへの細胞付着を促進するために商業的に提供されたいくつかのタンパク質（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、など）は、さらに細胞付着に関し前選別が行われた。

ベータ細胞の希釈懸濁液を９６−ウエルプレートで一晩インキュベートし、３回洗浄して非結合ベータ細胞を除去した。ベータ細胞懸濁液は均質で、ウエル当たり同じ分量は類似量のベータ細胞を含むことが仮定された。全細胞数を、生体材料薄膜を含まなかったウエル由来の細胞数に正規化した。一般的に、軽度に疎水性のポリマーが良好なベータ細胞に対する付着力を示した（表１）。

生体材料に播種した２４時間後の、３回の洗浄を行った後の細胞の数を数えることにより、細胞付着力を測定した。その数を、次の計算に従って、生体材料の無いウエルの底に付着した細胞の数で正規化した（空のウエル（対照）を参照）：目的のウエルに付着した細胞数／空のウエルの細胞数。各実験を３回繰り返した。

一般的に、軽度に疎水性のポリマーが良好なベータ細胞に対する付着力を示した。光学顕微鏡写真により、細胞形態も生体材料により影響を受けることが示された。キトサン（ＭＷ＝１００ｋＤａ）上のベータ細胞は、スムーズな、丸みを帯びた表面を示していたが、一方、ラミニン上のベータ細胞は、広がったひだ状の形態を示した（図８参照）。ラミニン基材上のベータ細胞中のアクチンの蛍光染色は、強い蛍光の細胞骨格結節点を示し、堅い細胞付着を示唆する。

膵島細胞パッチの調製
この実施例では、膵島細胞をＰＬＧＡ含有生体材料足場パッチに結合させた。血管化ランゲルハンス島で、平均ベータ細胞は、血管から約２５μｍほども離れていない。Ｗａｙｌａｎｄ、「膵臓機能における微小循環（Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．３７（５−６）：４１８−３３（１９９７）、を参照されたい。ベータ細胞は、直径約１０μｍ
であるから、約３個の細胞層の厚さにより、天然のベータ細胞環境が最も正確に模倣されるであろうことが期待される。

一般的に、膵島は、前述のように、ラット膵臓から分離され、単一細胞または小細胞クラスターに分散される。ＨＢＳＳ培地（０．５ｍｌ）中の膵島細胞および小さい膵島細胞クラスターを各ウエルに加え、３〜４時間、生体材料上で培養した。ウエル中に生体高分子を含むプレートを室温、約３５００ｒｐｍで約１０分間、遠心機で回転し、細胞が生体高分子に付着するのを支援した。培地の半分を各ウエルから取り出し、新鮮な膵島細胞または小さい膵島細胞クラスター懸濁液を含む培地と置換し、付着させた（重力または遠心機により）。これを３回繰り返した。これらの実験の結果を図９に示す。遠心分離方法を採用する場合、遠心分離なしにポリマー上に細胞培養する場合と異なり、反復洗浄後に、追加の膵島細胞層をポリマーのパッチに付着できる。反復培地交換を行うことにより、約３〜５層の細胞が、常に、０．５８ｄＬ／ｇ（ＨＦＩＰ）または０．９ｄＬ／ｇのポリマーの５０：５０ＰＬＧＡに付着して残される。反復沈着サイクルで、各ウエルに加えられる細胞培養容量、および／または各ウエルに一定分量を加える回数を制御することにより、ベータ細胞層の厚さの制御が可能である。

実施例４：生体材料足場上の膵島細胞の予測試験
この実施例では、付着多層膵島細胞を有する生体材料パッチがさらに調査される。生存率測定およびインスリン産生アッセイを行う。さらに、糖尿病の治療用の移植可能な装置を検討する。

生存率測定
アポトーシスと壊死による死亡比較実験を前述のように完遂する。天然の膵島との比較のためにベータ細胞層断面積当たりの生存細胞パーセンテージが、０、１、３、７、１４、および３０日目の３つの試料に対し計算される。データは、時間に対する生存可能な細胞パーセントとしてプロットされ、異なる数のベータ細胞層の生存率傾向間で統計的に有意差があるかどうかがｔ−検定を使って判定される。さらに、壊死またはアポトーシスに起因する細胞死パーセンテージが記録される。

インスリン産生アッセイ
インスリン産生が、低グルコース（３ｍＭ）、高グルコース（３０ｍＭ）、および高グルコース／脱分極（２５ｍＭ Ｋ^＋）（Ｄｅａｎ １９８９）の条件下で静的インキュベーション（ＥＬＩＳＡ）を使って測定される。１２−ウエルプレート中の各ウエルが新鮮な培地を使って３７℃、５％ＣＯ_２下でプレインキュベートされる。実験測定のために、種々のベータ細胞パッチが新鮮な３または３０ｍＭグルコース含有培地中で２時間、インキュベートされる。１つの追加のウエル群が２５ｍＭ ＫＣ１を含み、適切にＮａＣｌが低減された３０ｍＭのグルコース中でインキュベートされる。各パッチ型は、各試験条件で３回評価される。培地試料のインスリン含量がＥＬＩＳＡイムノアッセイを使ってアッセイされる。結果は、３つの試料の標準偏差付きの平均値として表され、ｔ検定を使って、統計的有意性が比較される。ＭａｃＧｒｅｇｏｒ ｅｔ ａｌ．、「インビトロ機能および移植結果において、小さいラット膵島が大きい膵島より優れる（Ｓｍａｌｌ ｒａｔ
ｉｓｌｅｔｓ ａｒｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ｌａｒｇｅ ｉｓｌｅｔｓ ｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
ｏｕｔｃｏｍｅｓ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２９０（５）；Ｅ７７１−７７９、（２００６）。

パッチおよび膵島の移植
ヒトの１型糖尿病に対応する自己免疫性糖尿病モデルである成体レシピエント糖尿病抵抗性バイオ育種（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＢｉｏＢｒｅｅｄｉｎｇ（Ｄ
ＲＢＢ））Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒラットで糖尿病が誘導される。４週齢のラットが、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｏｄｅｌｓ、Ｉｎｃ．から購入される。動物は、無作為に２群：パッチレシピエントおよび膵島レシピエント（群当たり６匹）に分けられる。糖尿病の誘導のために、ＤＲＢＢラットは、抗ＲＴ６モノクローナル抗体（ＤＳ４．２３ハイブリドーマ（マサチューセッツ大学医療センターのＤｒ．Ｄａｌｅ Ｌ．Ｇｒｅｉｎｅｒから提供を受けた；２ｍｌ組織培地を５回／週注射）および非特異的イミューンシステムアクティベーターポリＩ：Ｃ（Ｓｉｇｍａ；５ｕｇ／ｇ体重の３回／週注射）の組み合わせで処理される。注射は、３週間にわたり投与される。反復高血糖（３連続日に、血液グルコースレベル＞２５０ｍｇ／ｄｌ）の日をもって、動物は、糖尿病であると見なされ、処理が停止される（Ｓｅｍｉｓ、２００４）。この方法により、第３週の終わりまでに、９５％のラットが糖尿病になる。ベータ細胞パッチおよび膵島の移植は、腎臓被膜下に行われる。ＤＡ（Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ）ラットがベータ細胞ドナーとして使われる。ラットは、ペントバルビタール（４５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔され、腎臓は、左脇腹の体壁に作られた切開部に送り出される。中等度の切開が腎被膜で行われ、ベータ細胞パッチが被膜下に置かれる。種々の生体材料、および／または種々の細胞層厚さの最低限４個のパッチが移植される。典型的な例では、膵島移植には、より小さい切開および小さいボアピペットによる注入が必要である。レシピエント群は、１０００または２０００ＩＥの膵島の移植、または当量のパッチ基材上のベータ細胞を受ける。成功に最小限必要な膵島（１０００ＩＥ）が移植され、より大きい膵島体積（２０００ＩＥ）と比較される場合、大きな性能の改良（膵島に対するパッチタイプ）が検出されるはずである。膵島移植後の３日間、高血糖のストレス減らすために、肉牛／ブタ亜鉛インスリン（ＮＰＨイレチンＩ）注射（２回／日）が投与される。

血糖のインビボ測定
ラットの血液グルコースは、４週間、モニターされ、パッチまたは膵島移植が正常血糖を誘導できる否かを判定する。動物の血糖コントロールは、血液グルコース測定を毎日行うことにより追跡される。血漿グルコースレベルは、最初の３週間、その後、２回／週、原則毎日Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ血糖測定器（ＴｈｅｒａＳｅｎｓｅ）を使って血液試料を尾部から採取することによりモニターされる。通常、膵島移植の２４時間以内に糖尿病の回復が実現され、パッチでも同様の結果が実現されるはずである。

ベータ細胞パッチ体外移植片の分析。パッチまたは膵島は、１４または３０日後、免疫染色（インスリンおよびグルカゴン）、生存率測定、およびアポトーシスの検出のために回収される。一部の場合では、正常血糖を達成したラットが、分析前の８週間、維持される。切片の免疫組織化学的検査は、インスリンおよびグルカゴン用抗体を使って行われる。画像が比色分析を使って処理され、各染色に対し陽性の断面積が測定される。陰性対照スライドガラスが調製され、分析される。最初に、ジチゾン染色を使ってベータ細胞が特定される。細胞アポトーシスを示すＤＮＡ断片化が、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰニック末端標識法（ＴＵＮＥＬ）アッセイを使って行われる。我々が以前行ったように、パラフィン中に包埋された１０％ホルマリンを使って、組織検査用にパッチまたは膵島が調製される。ＴＵＮＥＬキット（原位置での細胞死検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使って、組織片に標識される。パッチおよび膵島は、ＴＵＮＥＬ^＋細胞の数と分布の両方が盲検化研究者により解析される。組織片の画像は、膵島の完全３Ｄ画像に再構成される。このように、単一膵島全体のアポトーシス細胞が特定できる。切片が、ヘマトキシリンと対比染色され、光学顕微鏡下で可視化される。膵島内のインスリン分泌細胞を特定するために、抗インスリン抗体を使って、試料が標識され、ローダミン二次抗体で検出される。我々は、アポトーシス分析のために、最小限でも移植後の１０匹の膵島／ラットを集めることを期待している。必要に応じ、陰性対照スライドガラスが調製される。ＴＵＮＥＬ分析に加えて、その後の電子顕微鏡観察のために、主要顕微鏡観察設備を使ってパッチが固定される。ベータ細胞層および
湿潤細胞の特定がこの方法で行われる。

実施例５：マイクロモールドを使った最適の大きさの細胞の調製
この実施例では、細胞を再凝集させるための追加の装置が開発、設計され、基材の表面にエッチングされた複数の個別くぼみを有するマイクロモールドを作成する方法が記載される。

一般的に、膵臓は、大きい天然膵島（１５０μｍ超）および、小さい天然膵島（１２５μｐｍ未満）に分解できる。大きいおよび小さい膵島は分離され、小さい膵島は、培養液中に置かれる（一部の実施形態では、小さい膵島の培養液は、後で新規再凝集膵島に戻される）。大きい天然膵島は、単一細胞懸濁液に分散され、マイクロモールド中に沈殿可能となる。産生膵島の大きさは、マイクロモールドに装填される細胞の数により操作可能である。典型的な例では、細胞懸濁液に応じて、２０〜１００（＋／−２０％）細胞が各くぼみに分配され、相互に結合し、新しい再凝集した小さい膵島を形成する。個別くぼみ中の単一細胞は、小さい天然膵島に似た３Ｄ構造の形成を促進する条件下で培養され、この場合、再凝集膵島の大きさと形は、くぼみの大きさと形に影響を受ける。濃度により（懸濁液中の細胞密度を測定することにより）くぼみ中の細胞数を変えることができるために、非常に小さい（３０μｍ未満）または中間サイズ（５０〜９０μｍ）の再凝集膵島を作ることが可能となる。化学療法試験のためにミニ腫瘍のような他の３Ｄ細胞構造を形成する場合に、この制御が重要であることが明らかになろう。

上記実施例３の生体材料足場パッチとは異なり、本実施例で記載のくぼみ形成マイクロモールドは、細胞を基材表面に付着させる必要がない。下記で考察のように、マイクロモールド中での膵島細胞再凝集は、最適な大きさで、生存可能であり、マイクロモールドで得られる細胞集団は、高率の生存と高レベルのインスリン分泌を特徴とする。

マイクロモールドの開発
物理的再凝集環境としてのくぼみ。単一細胞を最適な大きさの小さい膵島に再凝集させることを試みて、我々は、物理的に制約された環境で膵島を形成すると、再凝集の間に細胞集団の形状を誘導するであろうと仮定した。この目的に対し、我々は、最適な物理的再凝集環境は、目的細胞最終生成物の形と大きさの両方に類似しているであろうという結論に至った。我々が最初の実験に使用した寸法範囲（直径１００μｍおよび深さ６０μｍ）は、直径５０μｍ（平均）未満の再凝集膵島の産生に最適である。深さ６０μｍにより、より小さい小片に破壊することなく再凝集膵島を容易に取り出すことが可能となる。各再凝集環境の丸底は、細胞集団の再凝集を大略球状形へと誘導した。我々は、これらの丸底を含む指定寸法の物理的再凝集環境を「くぼみ］と呼ぶ。くぼみの寸法と配置は、ユーザーの必要性に応じて変えることができる。

マイクロモールドデザイン
最適寸法の小さい膵島の集団を生成することを試みて、我々は、図１０の、多くのくぼみ１４を含む表面１２を含むマイクロモールド基材１０を基準として設計した。オートキャドソフトウェア（Ａｕｔｏｄｅｓｋ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｒａｆａｅｌ、ＣＡ、から入手可能）を使って、マイクロモールド１０の電子テンプレートを生成した。テンプレートは、モールド表面上の大きさ、形およびくぼみ１４の分布を図示する。くぼみ形成基材１０は、液体を漏出なく保持できる、より大きなハウジング内に設けてもよい。また、このハウジングは、本明細書では、モールドハウジングと呼ばれる（図１０）。マイクロモールド１０およびマイクロモールド内のくぼみ１４の両方の寸法は、ユーザーの必要性に応じて変えることができる。例えば、マイクロモールド１０を使用する目的が薬剤試験の場合には、より大きな、および／または、より深いくぼみ１４が、くぼみ当たりさらに大量の試験化合物を保持するように試験される。目的の細胞が膵島ではない場合には、くぼみ
の寸法は、目的の細胞型に対する最適再凝集または成長基準に適合するようにその他の数値に指定できるであろう。

くぼみ形成面用基材
基材選択で重要ないくつかの物理学的性質がある。緩衝化フッ化水素（ＨＦ）酸溶液で湿式エッチングを行うには、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）ベース物質の使用が好ましい。ＨＦ酸は、ＳｉＯ_２分子と反応することにより基材をエッチングする。さらに、マイクロモールドのインビトロ使用のためには、細胞が付着しない基材を選択し、再凝集膵島のくぼみからの除去をより容易にするのが好ましい。透明な基材は、別のプレートに移す必要もなく、顕微鏡下でくぼみ内の含有物を見ることを可能とする。滅菌基材は、再利用可能なモールドを提供する。ガラスは、これらの特性の全てを示すので、移植可能でないマイクロモールド用の可能性のある基材の１つとして選択された。さらに、ユーザーは、製造中にガラスの厚さと寸法を指定でき、マイクロモールドのさらなるカスタマイズが可能である。また、ガラスは、低コストに対する解決策も提供する。しかし、この材料は、移植可能ではない可能性がある。プラスチックおよび型成形可能なゲルもモールド基材として使用可能である。

モールドハウジングの設計のために、いくつかの基材特性が必要となる。モールドハウジングの形成のために選択される材料は、ユーザーの仕様に従って成形できる機能が必要である。これは、モールド中に注ぎ込むことができ、エッチングされた基材を取り囲む固体としての特性を形成するための時間と温度で硬化できる液体として出発することを意味する。ポリマーは、滅菌可能であるのが好ましい。ポリマーは、液体のモールドからの漏出を防ぐのを助けるために疎水性であってもよい。Ｓｙｌｇａｒｄ１８４ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ；Ｄｏｗ Ｃｏｍｉｎｇ、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｔｏｗｎ、ＫＹ）は、これらのモールドとして使用してもよい１つの可能性のあるポリマーである。ＰＤＭＳは、滅菌でき、疎水性であり、モールドに容易に注入でき、さらに固体生成物に硬化される。さらに、ＰＤＭＳは、−４５〜２００℃の温度範囲で長時間にわたり使用でき、凍結および蒸気滅菌の両方が可能である。ＰＤＭＳは、約２時間の作業時間があり、その後、室温硬化（約４８時間）または加熱硬化（凡そ２００℃まで）できる。製造仕様に混合されたＰＤＭＳは、ガラス基材に粘着する能力を有し、さらにモールドの液体の漏出から保護する（Ｍａｔａ ｅｔ ａｌ．、２００５）。ガラスとＰＤＭＳを使って設計されたマイクロモールドは、インビトロ実験用に特に設計され、インビボ用途には適さない。フォトリソグラフィーを使うのではなく、むしろ、最初は、ネガティブスタンプ作成により作られる、インビボ目的で使用できると思われる移植可能なモールドは、以下に記載される。

生成されるマイクロモールドプロトタイプは、くぼみがエッチングされたガラス基材を含む。くぼみ形成基材は、切断して、ユーザーのニーズに適合させることができる。例えば、基材は、標準的顕微鏡スライドの大きさに切断してもよい。作成された１つのプロトタイプでは、ソーダ石灰ガラス基材を直径３３ｍｍ、厚さ３ｍｍの環状に切断した。

基材表面の調整
くぼみ形成される基材の表面を、窒素ガスできれいにし、大きな粒子を除去した。酸および塩基ピラニア溶液を使って、基材を深部まできれいにして、有機化合物および金属沈着およびフォトリソグラフィーを妨げる可能性のある物質を除去した。その後、基材を３０〜６０分間、ベークした。当業者なら、基材表面から大きな粒子および有機化合物を除去する他の方法も採用できる。基材表面が清浄になるとすぐに、Ｌｅｓｋｅｒ Ｔｈｉｎ
Ｆｉｌｍ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋ．Ｊ．Ｌｅｓｋｅｒ、Ｃｏ．、Ｃｌａｉｒｔｏｎ、ＰＡ、から入手可能）を使って、金属層（３００ｎｍのクロム）を基材上にスパッタした。薄膜金属層を基材に適用するための代替技術は、当技術分野で既知であり、利用出来る。

フォトリソグラフィー
Ｂｒｅｗｅｒ ＣＥＥ１００ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏａｔｅｒ（Ｂｒｅｗｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｏｌｌａ、ＭＯ）を使って、ＡＺ１５１８ポジ型フォトレジスト（１ｍｌ）のコートを沈着金属の上面に適用した。スピンコーターを１．８ミクロン層のフォトレジストを得るように設定し、続けて、１００℃で２分間のソフトベークを行った。冷却後、フォトマスクを有するガラスを、ＵＶ Ｆｌｏｏｄ ＆ Ｍａｓｋ
Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＭ、Ｓｃｏｔｔｓ Ｖａｌｌｅｙ、ＣＡ）からのＵＶ光で４秒間露光し、続けて、ＡＺ３００ ＭＩＦ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（ＡＺ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ）に浸漬した。基材を軽く振り動かし、その後、１００℃で８〜１０分ベークした。その後、エッチングプロセスを支援するために攪拌を加えながら、ＣＲ７Ｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｅｔｃｈａｎｔ（Ｃｙａｎｔｅｋ Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）中に浸漬することによりクロム層にフォトレジストの現像バターンを彫り込んだ。像が現れるまでに約３０〜４５秒の浸漬が必要である。基材を水で軽く洗い、窒素で乾燥して、湿式エッチングプロセスの準備を行った。これにより、クロムで層化された１枚のガラス、およびクロムまたはフォトレジストが存在しない表面上のオープン箇所を含んだフォトレジストを生成した。これらのマスクされていない箇所はガラス表面を湿式エッチングプロセスに暴露されるが、クロムとフォトレジストで被覆された領域は、ガラス表面をエッチング溶液から保護する。これが、マスクされていない領域でのくぼみのエッチングになる。湿式エッチングは、２０：１４：６６の比率のＨＦ：ＨＮＯ_３：Ｈ_２Ｏ溶液中で行われた。低速のオービタルシェーカー上で、基材を溶液中に１８分間浸漬した。浸漬中、酸がＳｉＯ_２と反応することによりガラスを攻撃し、その結果、クロムとフォトレジストマスクで被覆されなかったガラスの可視部分を溶解し、表面１２上に均一なくぼみ１４を生成した（図１１）。この溶液は、凡そ４〜５μｍ深さ／分のエッチング速度になる（溶液の新しさに依存する）。オービタルシェーカー上での攪拌により、表面の均一なエッチングが確実に行われる。

その後、基材を炭酸カルシウム、続けて水で洗浄して中和し、過剰酸を除去して、最終的に窒素で乾燥した。過剰クロムが基材上に残っている場合は、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｅｔｃｈａｎｔ中に追加浸漬し、アセトンと水で洗浄し、全ての残余物を除去することが必要である。最終的に、基材を窒素で乾燥した。表面形状測定装置（図１２）を使ってくぼみ深さと直径を測定した。作成されたプロトタイプでは、くぼみの大きさのバラツキは、問題になるほどではなかった。プロトタイプくぼみは、指定寸法の±１０％の測定値であった。

我々は、モールドを作成するために使用される可能性のある他の２つの予測的方法について考えている：
ＳＵ−８ネガティブモールド：この実施形態では、ガラスが基材として再度使われる。ガラスは、上述と類似のフォトリソグラフィープロセスを受けるが、ネガティブテンプレートモールド（図２７〜２８）を生成するために元のデザインが変更され、次いで、マイクロモールドに変換できる。しかし、列挙した生体高分子の１つをスタンプに注入し、硬化させる。簡単に説明すると、ＳＵ−８フォトレジストを厚い層にスピンコートする（層の厚さは、くぼみの目的の深さと同じにすべきである）。次に、ソフトベークし、フォトマスクで被覆し（上述のように）、ＵＶ光に露光し、露光後再度ベークを行い、ＳＵ−８現像剤で現像し、最終的に、現像後ベークにかける。これは、デザイン仕様に基づくくぼみのネガティブ突出部を有する１枚のガラスを与える。次に、このネガティブテンプレートを使って、硬化してモールドインプリントを生成することにより、所与の生体高分子またはＰＤＭＳ製のモールドを鋳造する。その後、硬化ポリマーからスタンプが取り除かれる。完成したポリマーは、ＰＤＭＳ／ガラスマイクロモールドに似ており、決まった寸法のくぼみを有する。この方法の１つの利点は、薬剤試験または他の適用に際し、各くぼみ
が、デザインステップの間にユニークな識別子（例えば、文字、数字）で標識でき、可視インプリントとして完成モールドの各くぼみに存在させうることである（図２８参照）。さらに詳細なプロセスは、メーカーの処理ガイドライン（ＳＵ−８ ２０００−Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ Ｅｐｏｘｙ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｐｈｏｔｏｒｅｓｉｓｔ、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）に記載されている。

エッチングされた金属モールドネガティブ
この実施形態では、ポリマーモールドは、金属鋳型を使って生成が可能である。金属鋳型は、ＣＡＤソフトウェアで３Ｄモデルを設計することにより製造可能である。１つの可能な設計は、図２７に提供されている。金属は、レーザーエッチングされて、上述のＳＵ−８モールドに類似の鋳型が生成される。ポリマーは、金属鋳物中に注入され、硬化されて新しいマイクロモールドが形成される。再度、必要に応じ、文字、または数字を３Ｄモデルに組み込み、上記のように各くぼみに標識でき、可視インプリントを残せる。

ＳＵ−８およびエッチングされた金属テンプレートは、インビトロおよびインビボの両方の用途のために、所与の材料からモールドを作成する方法を可能とするように概念化される。さらに具体的には、これらの方法は、生体高分子を利用して移植可能なモールドを生成できる。また、これらの方法は、より詳細な設計（くぼみ標識、など）、およびくぼみ形成、形および大きさに対するより多くの制御（くぼみ測定値の変動は、指定寸法の±１％未満であるべきである）を可能とするはずである。

くぼみ形成基材のためのハウジングの構築
マイクロモールド製作における次のステップは、くぼみ形成表面が配置および固定され、培養用のより大きな容器として機能するシステムを開発することである（図１０のＰＤＭＳ「ハウジング」参照）。

モールドハウジングのベース［６］および垂直壁［５］は、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を使って構築された（図１３）。ＰＤＭＳは、１０部の基剤に対し１部の硬化剤の比率で、５０ｍｌ遠心機チューブ中で混合された（約２時間の作業時間）。チューブを、基剤および硬化剤が完全に分散されるようによく混合した。このプロセスの間、ボルテックスミキサーを使用して混合を容易にすることができる。ＰＤＭＳを１０００〜１５００ｒｐｍで１分間、遠心分離して気泡を除去した。ＰＤＭＳ以外の材料を使って、マイクロモールドに適するハウジングを構築できる。例えば、多目的インビトロ適用のためのマイクロモールドに適する材料には、限定されないが、移植可能なもの（インビボ用途）が含まれる。インビボでの使用のためのマイクロモールドは、生体材料のくぼみ形成表面およびモールドの側面で形成できる。しかし、側面の高さは最小限でよいと思われるので、移植される材料の全体積を減らすために、移植の前に除去してもよい。

インビボ適用を目的とするマイクロモールドに適する材料には、限定されないが、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）、ポリ（リン酸エステル）、ポリ（ホスファゼン）、などが含まれる。他の非制限的材料には、例えば、多糖類、ポリエステル（ポリ（乳酸）、ポリ（Ｌ−リシン）、ポリ（グリコール酸）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、など）、ポリ（乳酸−ｃｏ−リシン）、ポリ（乳酸−移植組織−リシン）、ポリ酸無水物（例えば、ポリ（脂肪酸ダイマー）、ポリ（フマル酸）、ポリ（セバシン酸）、ポリ（カルボキシフェノキシプロパン）、ポリ（カルボキシフェノキシヘキサン）、これらのモノマーの共重合体、など）、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）、ポリ（アミド）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（イミノ炭酸）、ポリ（ウレタン）、ポリ（オルガノファスファゼン）、ポリ（リン酸）、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ならびに他のアシル置換セルロース酢酸およびその誘導体、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（炭酸）、ポリ（アミノ酸）
、ポリ（アクリル酸）、ポリアセタール、ポリ（シアノアクリル酸）、ポリ（スチレン）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（フッ化ビニル）、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、共重合体、ポリスチレン、およびこれらの配合物またはコポリマー、が含まれる。特定の、好ましい態様では、生体材料には、多糖類、アルギン酸塩、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、Ｎイソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡ）、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレンイミン、キトサン（ＣＳ）、キチン、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸コンドロイチン、ゼラチン、などおよびそれらの誘導体、コポリマー、ならびにそれらの混合物、が含まれる。その他の適切な生体材料には、ナイロン、ヒアルロナン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニルフォルムアミド、などのＶａｔｓ ｅｔ ａｌ．、２００３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９７；およびＯｒｉｖｅ ｅｔ ａｌ．、２００３、に記載のものが含まれる。

モールドハウジングの形は、銅足場を使って形成された（図１３）。１つの大きな銅管（１．７５インチ直径）［１］の開口側を下にして平面［４］（例えば、アルミニウムフォイルで包んだ大きな正方形ガラス）上に置いた。ＰＤＭＳを管開口部の中心部に深さ２ｍｍまで加えて、モールドハウジングのベース［６］を形成した。次に、全体構造物を１００℃で４５分間、オーブン中でベークした。ベーキング後、くぼみ形成基材を、くぼみ側を上に向け、銅管の中心部の硬化ＰＤＭＳベース［６］の上面上に配置した（破線は大きい銅管に対してエッチングガラス［７］の位置を示す）。

くぼみ形成基材の縁に少量のＰＤＭＳを加え、その基材を硬化ＰＤＭＳベース［６］の中心部に固定する。次に、構造物を１００℃で３０分間ベークした。小さい銅管［２］（１インチ直径）をエッチング基材の上面上の中央に置き、ＰＤＭＳを大きい銅管［１］と小さい銅管［２］の間の空間に注入した。このステップを注意深く行い、ＰＤＭＳをモールドの中心部にこぼさないようにした。大きい銅管［１］と小さい銅管［２］の間の空間に注入するＰＤＭＳの量が、モールドハウジング［５］の高さを決定する。モールドハウジングの高さと幅は、ユーザーが指定できる。その後、銅ハウジング足場を含むマイクロモールドを１００℃で一晩（少なくとも１２時間）ベークし、ＰＤＭＳを完全に硬化させた。

一晩のベーキング後、銅足場機構を以下のように取り除いた。全体構造［１〜７］を冷却してＰＤＭＳを収縮させ、銅管足場からモールドを取り出すことを可能とした。冷却に必要な明確な時間は、温度に依存するが、−２０℃で３０〜６０分で充分である。底の箔／ガラス層［４］および小さい銅管［２］は注意深く取り除いた。次に、大きい銅管［１］をマイクロモールドから分離した。

マイクロモールドの滅菌
本発明のくぼみを含む表面は、滅菌できるのが好ましい。一実施形態では、完成したマイクロモールドに足場がない場合は、洗浄して、使用上の必要性に応じて、滅菌できる。エタノールおよび蒸気滅菌が好ましい滅菌方法であるが、当業者に既知の他の滅菌方法でも適する。マイクロモールドにＰＤＭＳを使う場合、アセトンは使ってはいけない。同様に、くぼみ形成基材またはモールドハウジングに使われている材料の健全性を損なうと思われる滅菌方法を使ってはいけない。滅菌は、インビトロでの用途へのマイクロモールドの反復使用を可能にする。

マイクロモールド内での細胞再凝集
膵島を再凝集させるのに使われる単一分散膵島細胞は、膵島細胞のいずれの供給源から入手してもよい。この実施例では、総胆管を介して動物膵臓の原位置にカニューレを挿入し、コラゲナーゼ冷溶液（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）を管中に
ポンプ圧送して膨張させた。その後、膨張した膵臓を摘出し、遠心チューブに移して、３７℃でゆっくり回転させながら３０分間、インキュベートした。次に、洗浄消化物を、篩を通過させ、冷蔵遠心機で沈殿させた。得られたペレットをＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（密度１．１０８５ｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と混合し、遠心分離した。その後、５％ウシ胎仔血清を含むハンクス液（ＨＢＳＳ）で４０μ篩を通して濾過することにより膵島から外分泌組織を除去し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）および１％抗生物質を含むペトリ皿中に置いた。膵島を３７℃、５％ＣＯ_２下で一晩維持した。

膵島を単一細胞に分散するために、５０ｍｌ遠心機チューブに入れ、遠心処理を行い、ペレットを１．５ｍｌ微量遠心機チューブに移すことにより、分離膵島を消化して生存可能な細胞懸濁液を得た。カルシウム−マグネシウム不含ＨＢＳＳで２回の洗浄剤後、９部のカルシウム−マグネシウム不含ＨＢＳＳおよび１部のパパイン（５Ｕｍｌ最終濃度）の混合物を加えた。ローテーターで３７℃、２０分間のインキュベーション後、膵島をピペッティングし、単一細胞に分散した。

マイクロモールド中での細胞のインキュベーション
最終培養用の特殊な凝集培地（１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＴＳ（ｌｇ／Ｌ）、ＢＳＡ（２ｇ／Ｌ）、ニコチン酸アミド（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）、エキセンディン−４（５ｎｍｏｌ／Ｌ）および１％抗生物質、を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）（Ｋｉｋｕｇａｗａ ｅｔ ａｌ．、２００９）中の単一分散細胞をマイクロモールドに移した。この凝集培地に、膵島再凝集を高める高カルシウム条件（２〜４ｍＭ）を付加した。分散時に、血球計数器を使って一定分量の細胞の顕微鏡検査を行った。ダブレット細胞またはトリプレット細胞に対する単一細胞のパーセンテージを測定する。細胞分散の成功を、最低限９０％の生存可能な単一細胞が存在し、残りの１０％がダブレット細胞およびトリプレット細胞であることとして定義する。血球計数器を使って細胞数から分散液中の細胞の密度を知ることにより、くぼみ当たりの細胞の数を推定できる。しかし、我々は、マイクロモールドが充填されるとすぐに、細胞数／くぼみの計数も行った。この数は、培地中細胞密度に起因して実験毎に変動したが、２０〜１５０個の範囲であった。細胞数／くぼみは、モールドに加えられる培地中の細胞の密度により操作でき、このことは、標的３Ｄ細胞構造の最終的大きさを制御できるという利点をユーザーに与える。

マイクロモールドをゆっくり振盪後、１５分間静置することにより、細胞が個別くぼみ中に沈殿した。５％ＣＯ２下、３７℃で９日間、毎日培地を交換して膵島を維持した。くぼみ側壁近傍から古い培地を静かに除去（吸引して）した後、モールド中に新鮮な培地を静かにピペッティングして、６０μｍ深さのくぼみを有するマイクロモールド中の培地の交換を簡単に行うことができた。

マイクロモールド内での細胞クラスターの再凝集
最初、細胞を無作為に各ウエルに分配した。各くぼみ中に沈殿させる細胞の数は、懸濁液中の細胞の密度により定まる。マイクロモールドへの装填の前に細胞密度を測定するために、一定量の膵島細胞懸濁液が取り出され、細胞数／容量が顕微鏡下で血球計数器を使って計数される。モールド中のくぼみの数、および各再凝集膵島の目標とする大きさを知ることにより、必要な出発細胞密度に応じて、懸濁溶液中の細胞の数が濃縮または希釈できる。モールドが１０，０００個のくぼみを有し、目的の結果が１００細胞／くぼみである場合は、マイクロモールドに装填される培地中に１，０００，０００個の細胞が存在しなければならない。図１４は、２日目に開始され、５日目まで進んだマイクロモールド中で成長している細胞を示す。３日目と４日目の間で、細胞は、天然の膵島の３Ｄ形状を取り始めた。くぼみ内で成長した膵島は、直径９０μｍ未満に制限された（平均直径５０μｍ未満）。膵島の芯部細胞まで栄養物を補償するために５０μｍは重要な大きさであるこ
とを示すデータを我々が発表していることから、この寸法は重要である（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．、２０１０）。５０μｍより大きい膵島は、芯部の細胞死を示すが、一方、５０μｍ未満の膵島は、培養中に芯部の細胞死をほとんど示さなかった。各くぼみの丸みを帯びた底は、球状再凝集膵島の形成に最適となるように、細胞が相互に引き合うのを支援した。図１４は、表面形状測定装置を使って単一くぼみ深さから採取した測定値を示す。この単一くぼみの深さは、６０μｍよりやや大きい。底部は帯びており、これにより、凝集させるために、くぼみの中心に向かって細胞が押つけられる。

最適大きさと形状の再凝集膵島生成の成功は、初期プロトタイプから得た結果から実証される。この初期プロトタイプは、くぼみ領域の周辺にくぼみが無い基材表面領域を含む（図１５）。播種されると、一部の細胞は、プロトタイプマイクロモールドのくぼみが無い表面上に落ちた。くぼみが無い表面上に落ちた一部の細胞は、単一細胞の形で留まったか、または小細胞クラスターに成長したが、他の細胞は、メガ膵島、すなわち、くぼみ仕様により制限されない巨大な複合体、を形成した（図１５）。この初期のプロトタイプモールド中で、同じ動物から分離されて、同じ培地中で培養され、かつ、同じ基材材料上で再凝集された細胞は、２種の異なる細胞再凝集体を生成した。すなわち、ｉ）くぼみ内で形成されたものは、小さいウエル形状膵島を形成し、ｉｉ）くぼみの物理的制約に制限されない平面上で形成されたものは、低い拡散特性になる傾向がある大きな細胞凝集塊を形成した。一部の制限されない膵島は、直径４００μｍの大きさまで成長した。これらの結果は、細胞の再凝集の物理的制約が最適な大きさの膵島形成につながるという優れた概念実証を与える。

実験データは、マイクロモールド中での膵島の再凝集は、小さい天然膵島により示される特性に類似の拡散特性を示すことを示唆している。マイクロモールド中での再凝集膵島の拡散特性を測定するために、再凝集膵島を蛍光性グルコース類似体：２−ＮＢＤＧ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、から入手可能）を含む培地に、１０分間暴露した。蛍光性グルコース類似体は、再凝集膵島の芯部まで完全に浸潤し、グルコース拡散に対する障壁は比較的低いことを示す（図２６）。対照的に、以前の仕事は、大きい天然膵島は、２−ＮＢＤＧへの数時間の暴露後でも、膵島の芯部までのグルコースの浸潤および細胞による取り込みを阻害する大きな拡散障壁を有することを示した（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．、２０１０）。まとめると、これらのデータは、マイクロモールド中での再凝集膵島は、大きい天然膵島に比べて低い拡散障壁を有することを示している。

マイクロモールドで形成された細胞と市販マルチウェルプレートで形成された細胞との比較
マイクロモールド中での再凝集膵島の結果を市販マイクロプレート中での再凝集膵島と比較した。市販プレートは、直径１７００μｍの大きさの正方形のウエルを含んでいた。分散膵島細胞を市販プレート中で培養し、予想通り、膵島様クラスターが形成された。いくつかの知見を得た。第1に、市販プレートで形成された膵島細胞は、ウエルの角に集まり、相互に結合し、それらが壁に接触する場合もある。図１６は、市販ウエルの側面に接触する再凝集膵島形成細胞の典型的な例を示す。これらの細胞は、再構成に接触誘導を使っている。

第２に、大きさ際限がなく、ますます多くの細胞が一緒に結合し、低い生存率の巨大な膵島を生成する（あるものは、直径４００μｍを越える）。再凝集膵島の形を最適に誘導するように設計された各ウエル内の細胞の数および物理的寸法の範囲内に制限するための小さいマイクロモールドが無い場合は、得られた膵島は、非常に大きく、高いパーセンテージの死細胞を含んでいた。市販プレートによる再凝集膵島の生存率アッセイでは、６日間の培養で、５０％を越える細胞死が認められた。この場合の大きな隙間には、細胞が単
一細胞として残されている場合が多く、これらは低い細胞生存率を示す。壁または角に沿ってクラスター形成された細胞は、天然の膵島が示す球形状を形成することは決して無く、低生存率であった。

第３に、市販モールド中で形成された細胞クラスターは、マイクロモールドを使って得られる球状膵島様の組織に再凝集しなかった。再凝集膵島の球形成能力は、おそらくインビトロ機能の成功を示す重要な特徴であろう。大抵のマルチウェルプレートは、図１６に示すように、平底ウエルと正方形側面を有するように製作される。このような市販プレート中での再凝集細胞は、天然の形を想起させる球形になるように相互に付着せず、従って、天然の膵島ほど効率的に機能しそうにない。これらの結果は、現在の市販のモールドは、最適膵島形成用の基剤としては不適当であるという考えを支持する。

再凝集細胞クラスターのモールドからの取り出し
一部の例では、細胞の健全性または生存率を損なわないようにマイクロモールドから再凝集膵島細胞を取り出すことが望ましい。これは、大きなピペットを直接くぼみの上に静かに置いて、吸引することにより容易に実現できる。再凝集膵島は、培地と共にくぼみから取り出される。その後のマイクロモールドの新鮮な培地での洗浄とくぼみ上での直接のピペット操作により、モールド中のほぼ全ての再凝集膵島を取り出せる。

マイクロモールド中で生成された細胞再凝集体のキャラクタリゼーション
マイクロプレートから取り出された膵島の大きさと生存率が測定された。天然のラット膵島は、直径２０〜３５０μｍの範囲である。マイクロモールドのくぼみ（直径１００μｍ、深さ６０μｐｍ）中で再凝集すると、１００％の膵島が９０μｍ未満の直径になり、再凝集膵島当たりの平均直径は、３６．６±１．２μｍであった（５００を越える個別再凝集膵島の共焦点顕微鏡測定）。元々、完全に単一細胞にまで消化されることが決して無く、そのため、くぼみ中に落ち込むことも決してなかった膵島であると思われる新規の大きな構造物を我々は見つけていた。それ以降、分散処理中、膵島９０％の細胞含有懸濁液を単一細胞、および主にダブレット細胞またはトリプレット細胞形態である残りの細胞へと、より注意深く移行させた。我々は、マイクロモールド様式ＡおよびＢ（図１７）を使って得られた全凝集体の８５〜９０％が直径９０μｍ未満であると推定している。まだ未解明の理由により、くぼみ中の一部の細胞は、くぼみ当たり１個の再凝集膵島を形成しないで、複数の膵島に分かれた。図１８は、１個のくぼみ中にある２個の再凝集膵島の例を示す。

形態的には、再凝集膵島は、同じ大きさの天然の膵島と同等のように見える。それらは、図２９でわかるように、形は球状で、膵島の周囲に被膜様外表面を有する。対照的に、図１５は、マイクロモールドなしで凝集した細胞では、球の形成、または明瞭な被膜の形成がないことを示す。

アポトーシス／壊死細胞染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｙｏ−Ｐｒｏ−１およびヨウ化プロピジウムを含むＶｙｂｒａｎｔ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ａｓｓａｙ）を使って再凝集膵島の生存率実験を行った。この二重標識アッセイでは、膜の健全性とＤＮＡの断片化の両方が測定される。再凝集膵島を、既知の方法を使って２種の標識で１時間、インキュベートした（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ ｅｔ ａｌ．、２００６；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．、２０１０）。その後、膵島をＰＢＳですすぎ、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ３００共焦点顕微鏡に備えられたＡｔｔｏｆｌｕｏｒ Ｃｈａｍｂｅｒ中に置いた。再凝集膵島を光学的に切断し、膵島の中心部の画像を、後に行う分析用に保存した。染色を含む膵島内の領域を全体膵島領域のパーセンテージとして計算し、生存率を決定した。５日目の再凝集膵島の生存率測定値は、極めて高い細胞生存率を実証し、極わずかの死細胞／膵島を示した。再凝集膵島の全体生存率は、９９．７６％であった。この値は、大きいおよび小さい天然膵
島、および単一膵島細胞分散に対する以前に報告された文献の値（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．、２０１０；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００９）より高い。

図１９は、生存率染色した典型的な膵島の例を示す。これらの試験では、赤染色は壊死による細胞死を、緑染色はアポトーシスによる細胞死を示す。図１９Ａは、マイクロモールド中の再凝集膵島で特定された極わずかな死細胞の内の１個の細胞を示す。赤染色細胞は、壊死による細胞死を経たものである。分離組織中では、細胞壊死が最初に発生する場合が多い。試験した５００個の膵島中で２個のみのアポトーシス細胞（緑）が認められた。対照的に、マイクロモールドの表面に大きなメガ膵島が形成された同じ動物由来の細胞の場合、塊全体でかなりの数の死細胞が存在した。図１９Ｂは、２３個の死細胞を含む１つの面をキャプチャーしたものである。顕微鏡の焦点面の調整により、塊の全ての面には、より多くの死細胞が存在することが示された。従って、くぼみ中の細胞の適切な比率の膵島への再凝集により、非常に高い生存率が得られるが、一方、くぼみの外側の大きな塊に再凝集した細胞は、かなりの細胞死を示した。モールド中のくぼみのない領域に落ちた細胞は、くぼみ中で形成された膵島中の細胞よりかなり低い生存率であったことから、これらの結果は、マイクロモールドの成功を実証している。

マイクロモールド中で形成された全細胞の生存率は、同じ動物由来の大きい天然膵島および小さい天然膵島の生存率を超えた（図２０）。前述のように、Ｖｙｂｒａｎｔ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って、ラットの大きいおよび小さい膵島、ならびに再凝集膵島間で生存率を比較した。分離６日後、２つの群の天然の膵島で、生存細胞パーセンテージに少し変動があったが、再凝集膵島ではほとんど死細胞がなく、エラーバーが小さすぎて視認できないほどであった。マイクロモールド中の再凝集膵島は、小さい天然膵島より約１０％高い生存率、および大きい天然膵島より約４０％高い生存率を示した（図２０）。

マイクロモールドから生成された細胞集団
天然の膵島（大きいおよび小さい両方の膵島）中には、膵島中全体細胞の約９０％を構成する３種の主要型の細胞が存在する。グルカゴンを分泌するアルファ細胞は、膵島中の全細胞の約２０％を構成する。インスリンを産生するベータ細胞は、６０〜６５％を構成し、ソマトスタチンを分泌するデルタ細胞は、膵島細胞組成物の５〜１０％を構成する。本マイクロモールド中で処理された膵島は、アルファ、ベータおよびデルタ細胞を含むことが明らかになった。例えば、図２１は、本マイクロモールド中で再凝集後６日間形成された２種の代表的膵島を示す。ベータ細胞は緑に、アルファ細胞は赤く、デルタ細胞は青に染色されている。これらの処理膵島は、平均天然膵島より低いパーセンテージのベータ細胞であるように見える。しかし、小さい天然膵島に比べると、アルファ：ベータ：デルタ細胞の相対的細胞組成およびそれらの構成は、小さい天然膵島に類似していると思われる。ラットの大きいおよび小さい天然膵島は、膵島の外側層上に位置するグルカゴン陽性およびソマトスタチン陽性の細胞で構成されている。インスリン陽性の細胞は、中心部で認められる。従って、インスリン陽性の細胞（ベータ細胞）のパーセンテージは、小さい膵島より少ないが、各膵島は、高い量のインスリンを含む。確実に判断できる充分な量の再凝集膵島では、ベータ／アルファ／デルタ細胞（インスリン／グルカゴン／ソマトスタチン陽性細胞）のパーセンテージを計算しなかったが、全ての他の細胞に比べたベータ細胞のパーセンテージは、小さい天然膵島と類似であると思われる。１つの重要な差異は、再凝集膵島では、アルファ、ベータおよびデルタ細胞は、再凝集膵島全体に分散された細胞と共にランダムに組織化されている点である。ヒト膵島で指摘されたものと同じ構成である（Ｈａｈｎ ｖａｎ Ｄｏｒｓｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８８；Ｂｏｓｃｏ ｅｔ ａｌ．、２０１０）。従って、再凝集膵島は、天然のヒト膵島を想起させるよりランダムな細胞構成であることを示す。

インスリン産生
マイクロモールド中での膵島処理が新しいインスリン分子を産生できることを確認することは重要であった。インスリンは、最初は、プロインシュリンと呼ばれる前駆物質分子として合成される。６日間再凝集膵島に、プロインシュリンレベル用染色を行い、新しいインスリンを作っているか否かを測定した。図２２は、成熟インスリン（緑）およびプロインシュリン分子（赤）に対し染色した再凝集膵島の一例を示す。予想通り、ベータ細胞は二重標識された。画像は、６日間の培養でも、再凝集膵島中で新しいインスリンが合成されていることを示す。

膵島は、摂食後の高グルコース暴露に応答した血液中へのインスリン放出を引き受けている。インスリン分泌の欠乏は、１型糖尿病の人が正常な血液グルコースレベルを維持できない原因である。グルコースに対する細胞応答を測定するために、本マイクロモールド中での再凝集膵島および小さい天然膵島を低グルコース条件（３ｍＭ）に暴露した。両膵島型から培地中に分泌されたインスリンを集めて、定量した（図２３）。低グルコース条件（３０分）では、再凝集膵島は、小さい天然膵島（小さい天然膵島は、大きい天然膵島よりも多いインスリンを産生する）よりも１００倍多いインスリンを放出した。高グルコース（２０ｍＭ）に暴露した場合は、再凝集膵島は、大きいまたは小さい天然膵島よりかなり多いインスリンを分泌し続けた。再凝集膵島が、インスリンを漏出していたのではなく、インスリンを分泌していたことを確認するために、我々は、小さい膜不透過性デキストラン（１０ｋＤａ）を使って追加の実験を行った。分子のこの大きさは、充分小さく、細胞内の核膜上の核膜孔複合体と通過できる。しかし、細胞膜は、この大きさの分子を通過できるタンパク質複合体を含まない。デキストラン（２０ｍＭ）を再凝集膵島を含む培地に添加し、デキストランが暴露４時間後でも、細胞内へ侵入できないことを共焦点像が捉えたことにより、細胞が漏出性ではない、または膜傷害性ではないことが示唆される。さらに、細胞が実際にインスリンを分泌ではなく漏出していた場合には、我々は、図２２に示す再凝集膵島の壊死／アポトーシスアッセイ中により高いレベルの赤または青または緑染色を観察したはずであった。まとめると、これらのデータは、マイクロモールド中での再凝集膵島は、実際にそれらの小さいまたは大きい天然膵島相当物よりも多い量のインスリンを産生することを示唆している。

我々の知る限りでは、天然の、または改変膵島細胞からのこれらのレベルのインスリン分泌は報告がなく、我々の結果が他に例を見ないものとなっている。Ｗｅｉｒのグループは、小さい再凝集膵島を高いグルロン酸含量のアルギン酸塩中にカプセル化しすることを報告した（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ、２０１０）。Ｗｅｉｒは、単純に膵島を単一細胞に分散した後、制約のない状態で再形成させることにより、これらの膵島凝集体を生成した。Ｗｅｉｒの仕事は、正常な酸素レベル下では、小さい膵島は天然の膵島と同じくらい多くのインスリンを放出したが、低酸素下では、Ｗｅｉｒ膵島は、天然の膵島より多いインスリンを放出することを示した。しかし、Ｗｅｉｒの最高性能の膵島は、我々のマイクロモールド中での再凝集膵島より２０倍少ないインスリンを分泌した。高グルコース下での我々の再凝集膵島によるインスリン分泌の相対的減少の理由は、現時点では未解明であり、糖尿病動物に移植される前に決着すべき事項である。相対的減少にも関わらず、天然の膵島に比べて、低および高グルコース両条件下でのインスリン分泌の劇的増加は、マイクロモールド再凝集方法の重要で、比類なき特質である。

膵島への添加物
マイクロモールド中での再凝集膵島プロセスを利用可能な別の方法および材料は、ほとんど無限に存在する。第１に、凝集時に処理膵島中に組み込むことができる多くの分子がある。これらには、限定されないが、増殖因子、免疫調節物質、免疫抑制剤、サイトカイン、ケモカイン、ＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、抗炎症薬、および抗生物質、が含まれる。特に、移植可能なマイクロモールド基材が使われる場合は、移植部位で酸素
分圧を高める分子または小型装置を再凝集膵島中に組み込むことが可能である。他の再凝集時に添加可能な種類の非制限的分子には、インスリン放出を誘導する薬剤、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体（例えば、ＣＤ１ｌａ、ＣＤ１ｌｂ、ＣＤ１ｌｃ、ＣＤ１８に対する）、および核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、が含まれる。

考察
我々のくぼみ形成マイクロモールドは、当技術分野で使われている細胞の再凝集用の他の足場と異なる。以前、他の研究者が懸滴法を使って膵島を形成することを試みたことがあった（例えば、Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、２００７）。懸滴法では、溶液中細胞が、ペトリ皿の蓋の上の液滴中に置かれ、その後、ひっくり返されて、細胞は溶液懸滴の底に落ち、そこで膵島が形成される。しかし、懸適法は、時間がかかり、汚染される傾向がある。理由は、「滴］中の培地を交換できないためである。

マイクロモールドのインビトロでの有用性
本マイクロモールドは、他の適用の中でも特に、その後の移植または薬剤もしくは装置試験のためにインビトロで細胞凝集体を形成するように設計できる。

移植用細胞の生成。（理論実験例（Ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ Ｅｘａｍｐｌｅ））移植用細胞を生成するために作られる好ましいマイクロモールドは、充填される場合に、滅菌可能で、再使用可能な、また、培地または細胞を漏出しない単一装置である（図２４）。第１に、膵島は、膵臓から分離される必要がある。小さい健康な膵島が大きい膵島から分離できる。大きい膵島は、単一細胞またはダブレット細胞に分散でき、これらは、マイクロモールドに充填できる。３〜６日培養後、細胞は取り出され、小さい天然膵島と混合され、糖尿病レシピエントに移植される。

直径１００μｍ、深さ６０μｍのくぼみを含むマイクロモールドＡ（図１７Ａ）が、膵島再凝集用に設計される。われわれは、再凝集膵島のくぼみからの容易な取り出しを可能とする、６０μｍ深さが最適であることを見出した。くぼみは、くぼみ間に最小限の空隙が存在するように交互に配置される（図１７Ａ）。くぼみ間の平均距離は、３０μｍ未満である。

図１５で見られるくぼみが形成されていない表面は、移植細胞生成用に想定されるマイクロモールドでは、全体がくぼみで覆われるであろう。この配置は、マイクロモールド上の最大空き領域がくぼみ用に使用されるのを可能とし、モールド当たり作られる最大数の再凝集体、および最大効率をもたらし、モールドの表面に浮上する全ての細胞をくぼみ中に分配でき、その結果、再凝集用に生存可能な細胞の損失がおさえられる。

１つのモールドで得られるくぼみの数は、モールドの大きさで変わる。マイクロモールドＡデザイン（図１７Ａ）による直径約１．５インチのモールドは、モールド当たり１０，０００〜１２，０００個のくぼみを含む。また、くぼみの間隔は、モールドニーズによる。移植用組織の再凝集のためには、再凝集膵島の数に対する元の組織の利用率が重要である。くぼみに分配される細胞の割合が大きければ大きいほど、新しい膵島を作る上での利用率は高くなる。従って膵島移植用に設計された我々のモールドは、２０〜３０μｍのくぼみ間隔である。

薬剤選別。（マイクロモールドを使った理論実験例）マイクロモールドを使った薬剤選別は、ミニ腫瘍または小さい膵島などの３Ｄ構造に配列された細胞は、皿の中で扁平に成長または再凝集した細胞とは異なるそれらの環境に影響を受けるであろうという考えに基づいている。例えば、ミニ腫瘍または膵島が、マイクロモールドのくぼみ中で形成され、その際、有望な治療薬、例えば、抗癌剤、が個別に各くぼみに加えられるか、または全体
プレートに添加できるであろう。次いで、３Ｄ構造の形成について調査され、試験化学薬品の望ましくない影響を示すと思われる細胞生存率またはクラスター大きさの低減、などの変化が注目されるであろう。最初の例では、多くの異なる薬剤が長さ約３５ｍｍの１枚のガラス上で試験される。第２の手法では、単一の薬剤が試験されるが、１つのモールドで、定量可能な多くの個別反応が存在可能である。

癌薬剤試験のための１つの行いうる定量化は、生存率（生死染色）であり、これは、各腫瘍に対し実行可能である。マイクロモールドデザインを使った有望な癌薬剤の試験が魅力的である一方で、このモールドは、３Ｄ配置にある細胞で最良の結果が出せる全薬剤試験に有用であろう。

マイクロモールドＢ（図１７Ｂ）は、個別介入を各ウエルに行うように設計されている。従って、薬剤試験用に適用可能であることが理解されよう。このデザインにでは、くぼみは、直径が約１８０μｍ、各くぼみ間の間隔が１２０μｍであった。間隔は、必要に応じ増減できる。図１１は、個別の空のくぼみを有するマイクロモールドＢの底の画像を示す。マイクロモールドＢは、モールド当たり２，７００〜３，０００個のくぼみを含み、デザインＡのくぼみよりはるかに少ない。デザインＢのくぼみの間隔は、１つのくぼみに限定して正確に薬剤送達するのを補償するために、より大きい。くぼみ様式および間隔の仕様は、ユーザーにより設定され、使用される薬剤デリバリーシステムに依存する。モールドを使って数千の化合物を各くぼみ中の細胞に対し試験することは、ユーザーが、直径２インチ未満のモールド（図２４）中で２０００〜３０００種の異なる薬剤の薬剤選別を行うことを可能とするであろう。各モールドを別々の薬剤に対し利用した高処理薬剤選別は、数千の個別細胞クラスターが、平均応答ではなく、個別反応として応答し、測定されるのを可能とするであろう。ナノデリバリーシステムと組み合わせた高処理薬剤選別は、各くぼみが異なる試験薬剤を含むように利用可能である。あるいは、同じ処理および培養条件に暴露された数千の試料からデータ点を収集可能である（図２４）。

非膵島細胞の生成。（理論実験例）モールドは、限定されないが、長いニューロン細胞の経路、糸球体様フィルター、血管、補充肺胞、などの種々の細胞凝集形状用に設計できる。また、マイクロモールド、などの小さい、明確な形状中での幹細胞または再プログラムされた細胞の凝集は、本発明の使用に適するであろう。

１つの典型的な適用は、培養細胞株のモールド中への増殖と凝集であろう。この場合では、懸濁液中の細胞が、１〜５０細胞／くぼみの範囲（ユーザーのニーズによる）の極めて低い密度でモールド中に充填される。培養された細胞株は、分裂している細胞を含み、この細胞は、ユーザーのニーズに応じた時間の間、くぼみ中で増殖可能である。他の細胞供給源には、動物またはヒト由来の新しく分散された細胞が含まれる。新しく分散された細胞を装填するプロセスは、膵島に対し記載された一般的方法に類似である。選択組織、例えば、血管は、単一細胞またはダブレット細胞が浮遊するまで、消化酵素に暴露される。細胞は、ユーザーにより選択された密度および培地でモールド中に装填される。最後に、幹細胞が種々の成体細胞型を産生するようにプログラムされうる。また、これらの細胞は、マイクロモールドに装填され、３Ｄ構造形成が強化されうる。

インビボでのマイクロモールドの有用性。（マイクロモールドを使った理論実験例）本明細書で記載のマイクロモールドは、インビトロ適用に有用である。

モールド中の移植用再凝集膵島。（理論実験例）生体高分子から構築されたマイクロモールドを使って移植可能な生成物を生成可能である（図２３）。このような場合では、モールドの微小環境が変えられ、それにより、再凝集膵島が生体高分子に付着し、全体「パッチ」がレシピエントに移植される。上述の生体高分子は、このような移植可能なマイク
ロモールドの生成に適する。モールド中のくぼみを使って、ウエルを形成し、最初に細胞をくぼみ中に沈殿させ、それらの再凝集がくぼみの寸法に誘導され、次に、生体高分子のくぼみに付着する。

生体高分子中にくぼみを生成するために、ワックスネガティブが当技術分野で既知のプロトコルを使って設計される（例えば、Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．、２００７）。移植可能なモールドに対しては、膵島がモールド中に残され、レシピエント中に外科的に配置される。移植可能なモールドは、膵島中への神経および血管の浸潤を可能とする、くぼみの間に開口部を有するモールドデザインである。さらに、移植可能な材料は、例えば、ニューロン細胞および血管増殖因子を含浸してもよく、また、モールドは免疫抑制剤を含んで膵島を免疫拒絶から保護してもよい。

膵島を含むモールドの移植は、いくつかの報告された方法を使って行うことができる。マイクロモールドは、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．、２０１０、に記載のように、腹膜腔中に配置できる。腹腔が麻酔下切開され、モールドを筋膜下の空隙中に静かに置く。別のマイクロモールド移植部位には、Ｖｅｒｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１０、による記載のように、特に、その領域への血管供給を増やすための条件付け後の皮下挿入が含まれる。ヒト移植では、膵島は、門脈を経由して肝臓中に配置される（Ｋｏｈｅｔａｌ．、２０１０）。門脈を通るマイクロモールド注入は、可能ではないと思われるが、モールドを、より侵襲性の高い手術を使って肝臓または腎被膜下に配置できそうである（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ ｅｔ ａｌ．、２００６）。

実施例６：生物活性により化合物を選別する方法と装置
この実施例では、壁改良マイクロモールドを使った開発、デザインおよび方法が記載される。この実施例で記載の壁改良マイクロモールドは、特に、薬剤および毒性試験の高処理選別に好適する。下記で考察のように、「壁に囲まれたマイクロモールド」で再凝集および選別された膵島細胞は、最適大きさで、生存可能であり、高パーセンテージ生存率および高レベルのインスリン分泌を特徴とし、さらに、高処理薬剤試験および長期間維持に適する。さらに、壁に囲まれたマイクロモールドは、薬剤および毒性試験などの高処理選別に有用であるとわかっている設備およびコンピュータシステムと適合性がある。

壁に囲まれたマイクロモールドの開発
図３４は、マイクロモールド基材１１０の頂面１０８および壁１０２の面１１２で画定されるウエル１０６を効率的に形成するために、単一くぼみ１０４を取り囲む壁１０２を使用する壁に囲まれたマイクロモールド１００を示す。くぼみ１０４は、ウエル１０６の底面１１４に配置され、この底面は、基材１１０の頂面１０８に相当する。壁１０２をマイクロモールドの頂面１０８への追加により、取り囲まれたくぼみ１０４の、隣接くぼみ開口部または複数の一連のくぼみ開口部からの液体分離が可能となる。本明細書の他のところに記載のものと同様に、マイクロモールド１００の各くぼみ１０４は、基材１１０の頂面１０８（ウエル１１４の底面に相当）の開口部１１６、凹面形または丸い底面１１８および内壁面１２０により画定される（図は、弾丸型の底を示しているが、これは、描画ソフトウェアのアーチファクトであり、実際のモールドは、弾丸型よりさらに凹面形および／または丸い形であるのが好ましい）。

これらのプレートの１つの好ましい態様は、高処理薬剤選別に使われるものと同じプレートで３Ｄ再凝集細胞クラスターをユーザーが生成できることである。標準的３８４−ウエルプレートデザイン（８５．５Ｘ１２７．８ｍｍ寸法）を使って、プレートの各単一ウエル内に１〜１４個のくぼみが生成できる（図３４と３５）。１４個のくぼみ／ウエルを有する１５３６ウエルプレートは、単一プレート上に２１、５０４細胞クラスターを生成する場所を持つことになる。高処理薬剤試験では、一度に数十万種の化学化合物が選別さ
れる。当業者なら、この大規模生産は、医薬品産業にとって大きな強みであることを理解するであろう。

図３５は、壁に囲まれたマイクロモールド１００の別の実施形態を示す。ここでは、マイクロモールド１００は、複数のくぼみ１０４に外接する、またはこれを取り囲む壁１０２を含む。従って、各生成ウエル１０６は、くぼみ１０４のセット１２２を隣接くぼみセットから隔離する。

壁に囲まれたマイクロモールド１００を使って、単一ウエル１０６中の各薬剤を１４以上までの異なる細胞クラスターと接触させ、平均応答／ウエルを得ることができる。ウエル当たり生成される細胞クラスターの数は、最終ユーザーの目的に応じて変更可能である。壁に囲まれたマイクロモールドデザインは、アッセイされる試験化合物に対する細胞応答の信頼性を改善する。理由は、ユーザーは、応答の測定を単一未処理膵島または単一細胞クラスターに依存していないからである。むしろ、各ウエルでアッセイされる応答は、３〜１４細胞クラスターの平均応答であってよい。

壁に囲まれたマイクロモールドの高処理選別のための有用性
ペトリ皿で単層として成長させた細胞を使った薬剤選別が最も頻繁に行われる。しかし、単層成長環境は、化学刺激に対し、それらがインビボ環境にある場合とは異なった応答を培養細胞にさせる可能性がある。例えば、インスリン分泌ベータ細胞は、ペトリ皿中で扁平に展開される場合、それらのインビボでの構造に類似している３Ｄ球状体で認められる場合と同じようにインスリンを分泌しない。要するに、３Ｄ球状体の使用の方が、化学薬品に対するインビボでの細胞応答をより良く示すということである。しかし、化合物選別において、３Ｄ球状体の使用は、困難であることが明らかになった。例えば、同じドナーからの膵島内で起こる変動が、選別には問題となる場合がある。小さい膵島は、高グルコース濃度に応答して大きい膵島より多くのインスリンを放出する（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ
ｅｔ ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２００６；２９０（５）：Ｅ７７１−７７９）。この実施例では、同じドナーラットから採取された膵島を大きいおよび小さい大きさに分け、時間０で高グルコースに暴露した（図３０）。小さい膵島は、正常および高グルコース濃度でかなり多いインスリン放出を行った。このように、同じドナー由来の膵島が、標準的刺劇薬に対する応答で変動を示す。

薬剤選別における平均応答のための多重くぼみマイクロモールド
実施例５で記述されたマイクロモールドは、得られる細胞クラスターが研究または移植目的のためにモールドから取り出される予定の場合、特に有用である。実施例５で記載のモールドは、自立型であっても、または他の標準的プレートの境界内に適合するように設計されてもよい（図３２）。各くぼみのウエル内の深さは、個別に変わってもよい。実施例５のモールドは、６０〜７０μｍのくぼみ深さを使用するが、この深さは、大抵の３Ｄ細胞クラスター形成に対し充分なものである。しかし、一部の細胞、特に癌細胞に対しては、より深いくぼみを与えることが好都合な場合がある。我々の技術を使って、ウエル深さを３００μｍまで拡大できる（図３３）。

請求発明の好ましい実施形態は、壁に囲まれたマイクロモールドである。これらのプレートは、図３４に示すように、それぞれ単一くぼみまたは複数のくぼみを含むウエルを含む。壁に囲まれたマイクロモールドは、以下のように、３Ｄ組織の高処理薬剤選別および毒性試験が直面する現在の課題に取り組む。

第１の課題：器官型細胞クラスターの均一性
実施例５で考察したように、マイクロモールド中で形成された細胞クラスターは、薬剤試験に際し、モールドから取り出しても、またはモールド中に残してもよい。マイクロモ
ールド中で膵臓由来の膵島細胞をモールドに播種して作られた細胞クラスターは、通常、ＫＡＮＳＬＥＴＳ（登録商標）と呼ばれる。しかし、この実施例の目的のためには、ＫＡＮＳＬＥＴＳ（登録商標）は、マイクロモールド由来膵島細胞クラスターと称される。マイクロモールド由来膵島細胞クラスターは、天然の膵島に比較して、さらに均一な大きさおよび細胞組成を有し、それらを薬剤選別および診断試験にとって好都合にしている。図３６は、マイクロモールド由来膵島細胞クラスター（黒色バー）に比較して、天然の膵島（灰色のバー）の大きさの変動を示す。マイクロモールド中で処理後、膵島の大きさが減少し、全てのマイクロモールド由来膵島細胞クラスターの直径が１００μｍ以下になることに留意されたい。

さらに、マイクロモールド由来膵島細胞クラスターは、薬剤試験および診断のために好都合な細胞クラスターである。理由は、それらが天然の膵島と同じ一般的細胞組成を有するからである。天然の膵島およびマイクロモールド由来膵島細胞クラスターの両方で、細胞中のベータ細胞のパーセンテージは、約７０〜７５％である。さらに、この組成は、マイクロモールド由来膵島細胞クラスター毎に劇的に変動することはない。

第２の課題：低い拡散障壁
天然の膵島は、大きな拡散障壁を有する。蛍光標識グルコース分子で３時間灌流された大きいラット天然膵島は、固有の拡散障壁に起因して、グルコースに対し不透過性のままである（図３７）。同じ蛍光のグルコースに暴露されたマイクロモールド由来膵島細胞クラスターは、グルコースに対し透過性である（図２６）。マイクロモールド由来膵島細胞クラスターは、２スキャン／秒の画像処理スキャン速度による我々の解像能力を超えた拡散速度を示す。グルコース含有培地が処理マイクロモールド由来膵島細胞クラスターに接触するとすぐに、グルコースがクラスターの芯部に侵入した。表２は、ヒトまたはラットのマイクロモールド由来膵島細胞クラスターに比較して、蛍光グルコースが未処理のヒトまたはラット膵島に侵入する平均拡散速度である。

第３の課題：試験化合物に対する一貫した応答
新規糖尿病薬を見つけるために未処理の天然の膵島を使って薬剤選別作業を行う場合、大きい変動が存在する（図３０）。マイクロモールド由来膵島細胞クラスターは、試験とドナーの間の一定の応答を与えることによりこの問題を克服する。図３８は、高グルコース刺激に対するマイクロモールド由来膵島細胞クラスターの応答を示す（図３０に示すものと同じプロトコルを使って）。マイクロモールド由来膵島細胞クラスターは、ほとんど変動もなく、予測されたように高グルコースに対し応答したことが明らかである。応答は、容量、または細胞数のいずれで計算しても同じであった。異なる大きさの天然の膵島で作業した場合は、同じ結果ではない。応答の一貫性の大部分は、マイクロモールド由来膵島細胞クラスターは、全てほぼ同じ大きさおよび細胞高次構造であるという事実からきている。

ネガティブ化合物、すなわち、インスリンの放出を刺激してはいけない薬剤も、マイク
ロモールド由来膵島細胞クラスターを使って成功裏に試験された。あらゆる場合で、マイクロモールド由来膵島細胞クラスターは、これらの化合物からのヒトの既知の応答を適切に予測した（データは示さず）。

第４の課題：高処理薬剤選別機器との適合性
我々は、現在の医薬品産業機器を使って一次薬剤選別として天然の膵島を使用することを試みた。天然の膵島は、ＰｌａｔｅＭａｔｅ（登録商標）またはＷｅｌｌＭａｔｅ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＨ）分散機器（小さい膵島を使用するだけの場合でも）を使って均一に分散できない（図３９）。膵島数／ウエルは、１〜１４個膵島／ウエルまで変動し、これは薬剤選別には許容可能ではない。天然の膵島を考慮すると、このレベルの膵島数の変動が事態を悪化させる。例えば、天然の膵島は、１０代の細胞数／膵島〜１０００代の細胞数／膵島まで変動し、ウエル当たり１〜１４膵島の差異は、別のウエルに比較して、１つのウエルで、１０００倍を超える細胞数の差異に達する可能性がある。しかし、医薬品産業界の標準的習慣は、各薬剤用量を１つのウエルでのみ試験することである。ウエル毎に応答細胞数のこのような変動があると、産業界では、一次選別に天然の膵島を使うことができない。理由は、結果を解釈できないからである。

マイクロモールド由来膵島細胞クラスターは、小さく、ほぼ同じ数のマイクロモールド由来膵島細胞クラスターが各ウエルに播種されるように標準的産業機器を使って分散することを可能とする。従って、膵島細胞／ウエルを計算すると、より狭い範囲の値が達成できる。さらに、マイクロモールド由来膵島細胞クラスターは全て同じ大きさであるので、細胞数／ウエルを計算すると、存在する変動は、天然の膵島に比べ、かなり少ない。

さらに、壁に囲まれたマイクロモールドは、再凝集プレートおよび試験プレートの両方として使用可能である。この形式では、膵島細胞（または他の細胞型）が時間細胞をクラスター再凝集させるのに充分な時間のあいだ、壁に囲まれたマイクロモールド中に播種される。次に、壁に囲まれたマイクロモールドは、化合物の添加および試験のために、産業機器に装填される。図３４と３５は、同じモールド中での細胞クラスター形成および薬剤試験に最適化されたマイクロモールドデザインを示す。１４個のくぼみ／ウエルがある場合には、化学者は、薬剤用量当たり１４個の均一なマイクロモールド由来膵島細胞クラスターの試験を行い、高度に再現性のあるアッセイプラットフォームが得られる。

第５の課題：高処理ニーズに対応できる拡張性
マイクロモールド由来膵島細胞クラスター（またはマイクロモールド中で生成された他の処理細胞クラスター）は、標準的機器を使って分散でき、モールドは、標準的１５３６ウエルフォーマットに適合するように設計できるという事実により、壁に囲まれたマイクロモールドは、現在の高処理ニーズに対し容易に拡張可能である（図４０）。天然の膵島は、単一細胞に分散され、次に、これは、複数のくぼみ／ウエルを有する壁に囲まれたマイクロモールド中に充填される。３〜５日後、細胞は、一定の大きさ、形、および細胞組成の細胞クラスターに再凝集する。その後、同じ壁に囲まれたマイクロモールドは、同じプレート中での薬剤分注および引き続くｔ検定のために、標準的産業機器に装填される。マイクロモールドのベースは、ガラスであるため、高含量選別が容易に行える。

第６の課題：長期間実験を維持できる能力
天然の膵島および他のヒト組織は、一旦、身体から取り出されると、それらが培養株に形質転換されない限り、通常、長い期間生存しない。この形質転換は、それらの宿主組織に関連する表現型の特徴を細胞から失わせる場合が多い。複数の実験にわたる、マイクロモールド由来膵島細胞クラスターの生存率は、常に天然の膵島よりも高い（図４１）。このことは、細胞が１週間を越えて維持されなければならない長期間実験に関して、特に言
えることである。

マイクロモールド由来膵島細胞クラスターは、他の３Ｄ技術における重要な改善を提供する。理由は、それらが、同じモールド中で産生、および試験ができるからである。産生および試験手続きで省かれたそれぞれの移動ステップは、効率（組織の損失が少ない）を改善し、汚染のリスクを減らす。未処理の天然の膵島を使って、薬剤選別に使用することを試みた場合、試験のために３回の移動ステップが必要であったために、それらは、数時間の間に汚染された。壁に囲まれたマイクロモールドからの移動を必要としないことにより、マイクロモールド由来膵島細胞クラスターは、その課題を克服する。

マイクロモールド中で生成できる他の細胞クラスター
膵島以外の細胞型も、薬剤および毒性選別のために、壁に囲まれたマイクロモールド中で再凝集させられる。癌性の腫瘍は、３次元環境下では原位置に存在する。大抵の薬剤試験が細胞単層で行われることを考慮すると、インビトロ実験および最終的インビボ使用の間の相関が、問題を提起する。図４２は、本明細書記載のマイクロモールド中で産生された均一３Ｄ肺癌球状体を示す。また、我々は、他の癌細胞株からも開示マイクロモールドを使って球状体を形成した（データは示さず）。

要約
この実施例で記載のマイクロモールドは、細胞クラスター移植に目標を絞った薬剤発見および再生医療におけるマルチセル型３Ｄ細胞クラスターの使用能力を大きく前進させる。本明細書記載のマイクロモールドから回収された細胞クラスターは、冷凍保存により長期間貯蔵できる均一細胞３Ｄ球状体を提供する。試験では、これらの均一細胞３Ｄ球状体は、さらに正確な予測に基づくより均一性の高い化合物に対するインビボ応答を提供する。このことは、レシピエント自身の細胞と混合された保存組織からの細胞移植を考慮すれば、新しい扉を開くことにもなる。

前出の内容から、本発明にとって明らかであり、また固有である他の利点と共に本明細書で記述された全ての目的と目標を達成するように本発明がうまく適合されていることが明らかであろう。本発明の範囲を逸脱することなく多くの変更が可能であることから、本明細書記載の全ての事項は、例示的なものと解釈されるべきであり、限定する意図はないことを理解されたい。具体的実施形態が示され、考察されてきたが、様々な修正が可能であり、本発明は、本明細書記載の部分およびステップの特定の形式または配置に限定されるものではない。

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Claims (17)

1. 細胞培養装置であって、
   ほぼ平らな頂面、および
   前記頂面内に配置された複数のくぼみであって、前記頂面中の開口部、前記開口部から距離をあけて配置された丸い底面、および前記丸い底面と前記開口部の間をつなぐ内壁面によりそれぞれ画定され、５０〜３００μｍ（±２０％）の深さ、および１００〜１０００μｍ（±２０％）の直径をそれぞれ有する複数のくぼみ、
   を含む基材を含み；
   少なくとも１つのウエルが、前記頂面上に配置され、前記ウエルが、前記頂面から前記頂面により画定される平面にほぼ垂直の方向に上方向に伸び、前記ウエル内に内部空間を形成する周囲側壁を含み、
   前記周囲側壁が、少なくとも１つのくぼみの前記開口部を取り囲み、前記ウエルの外縁内側にある前記少なくとも１つのくぼみおよび隣接する前記ウエルの外側のくぼみの間の液体連通を防ぐ、
   装置。
2. 複数のウエルをさらに含む請求項１に記載の装置。
3. 各ウエルが、１〜１４個のくぼみを含む請求項２に記載の装置。
4. 膵島細胞をさらに含む請求項１に記載の装置。
5. 前記膵島細胞が、１２５μｍ未満の直径の小さい膵島細胞クラスターを形成する請求項４に記載の装置。
6. 再凝集３次元細胞クラスターをさらに含む請求項１に記載の装置。
7. 細胞を培養する装置であって、
   ほぼ平らな頂面を有する基材；
   前記表面から前記頂面により画定される平面にほぼ垂直な方向に上方向に伸び、前記表面の一部を取り囲む側壁であって、前記側壁と頂面が、液体不透過性ウエルを共同的に形成し、前記ウエルが、前記側壁により取り囲まれた前記頂面の一部に相当する底面を有する側壁；および
   前記ウエルの底面に配置されたくぼみ、
   を含み、
   前記くぼみが、前記ウエルの底面内の開口部、前記開口部から距離をあけて配置された丸い底面、および前記丸い底面および前記開口部の間をつなぐ内壁面により画定される、
   装置。
8. 前記くぼみが、３００μｍ（±２０％）未満の深さ、および５０〜３００μｍ（±２０％）の直径を有する請求項７に記載の装置。
9. 複数のウエルをさらに含み、各ウエルが、１〜１４個のくぼみを含む請求項７に記載の装置。
10. 各くぼみが、３次元細胞球状体を含む請求項９に記載の装置。
11. 生体異物の生物活性を評価する方法であって、前記方法が、
    複数のウエルを含み、各ウエルが１つまたは複数のくぼみを含む請求項１５に記載の装置
    を提供すること；
    各くぼみ中で３次元細胞クラスターを形成するために前記くぼみ中の細胞を培養すること；
    第１の生体異物を少なくとも第１のウエルに加え、前記第１の生体異物が、前記第１のウエル中の少なくとも第１の細胞クラスターと接触すること；および
    前記第１の生体異物の前記第１の細胞クラスターに与える効果を評価すること、
    を含む方法。
12. 前記第１のウエルが複数のくぼみを含み、前記第１の生体異物が第１の複数の細胞クラスターと接触し、各細胞クラスターが前記第１のウエル中のそれぞれのくぼみ中に存在し、前記第１の生体異物の前記第１の複数の細胞クラスターに与える平均効果を測定することをさらに含む請求項１１に記載の方法。
13. 第２の生体異物を少なくとも第２のウエルに加え、前記第２の生体異物が、前記第２のウエル中の少なくとも第２の細胞クラスターと接触すること；および
    前記第２の生体異物の前記第２の細胞クラスターに与える効果を評価すること、
    をさらに含む請求項１１に記載の方法。
14. 前記第２のウエルが複数のくぼみを含み、前記第２の生体異物が第２の複数の細胞クラスターと接触し、各細胞クラスターが前記第２のウエル中のそれぞれのくぼみ中に存在し、前記方法が前記第２の生体異物の前記第２の複数の細胞クラスターに与える平均効果を測定することをさらに含む請求項１３に記載の方法。
15. 前記第１および第２の生体異物が、前記装置にほぼ同時に加えられる請求項１３に記載の方法。
16. 各くぼみが、単一の３次元細胞クラスターを含む請求項１１に記載の方法。
17. 前記３次元細胞クラスターが膵島である請求項１１に記載の方法。