CN111263807A - 人工脂肪组织及其制造方法、人工皮肤的制造方法以及脂肪细胞的培养试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种人工脂肪组织,其由含有包含脂肪细胞的细胞和经片段化的细胞外基质的三维组织体形成。
Description
技术领域
本发明涉及人工脂肪组织及其制造方法、人工皮肤的制造方法以及脂肪细胞的培养试剂。
背景技术
成熟脂肪细胞在体外的长期培养维持是化妆品/药品检测或整形手术的领域中特别重要的课题之一。平皿上的现有二维培养的培养时间短,脂肪细胞大部分会在1周后发生去分化。根据现有的报告,单眼成熟脂肪细胞无法维持1周以上(非专利文献1)。另外,在某种程度以上成熟了的脂肪细胞中,由于该细胞内的脂肪滴的影响而有自培养皿漂浮的倾向,因而培养基的更换是困难的。
为了解决这些课题,三维细胞培养技术受到关注。WAQAR HASSAN等人在由以PEG为基底的共聚物和透明质酸构成的水凝胶中将细胞制成胶囊并进行培养(非专利文献2)。但是,该方法由于是将细胞进行分离培养,因此细胞之间的物理接触难,分化效率差。
DAQUINAG等人验证了利用以磁纳米粒子为基础的三维立体结构培养系统,并使用小鼠3T3-L1前脂肪细胞及GFP表达小鼠内皮细胞,同时模拟血管新生和脂质生成。脂肪细胞与内皮细胞的共培养虽然通过免疫染色完美地可见,但14天后的脂肪囊泡非常地小、成熟度低(非专利文献3)。
另一方面,就含有脂肪细胞的皮肤模型而言,报告了使用牛I型胶原水凝胶(3mg/mL)、成纤维细胞及脂肪干细胞的2层结构的皮肤模型,但用于皮肤模型构筑的培养需要56天~63天这样非常长的期间。另外,厚度也比人的皮肤薄(非专利文献4)。
另外,还报告了利用重悬于人冻干血浆水凝胶(1mg/mL纤维蛋白原)而成的成纤维细胞、或间充质干细胞和脂肪细胞的3层结构得到的皮肤模型,但模型构筑不仅需要35天这样长的培养工艺,而且在形态上也无法模拟人的皮肤结构,是非常薄的(非专利文献5)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Toda S,Uchihashi K,Aoki S,et al.,Organogenesis.2009 5(2):50-56
非专利文献2:WAQAR HASSAN ET AL.,STEM CELL RESEARCH&THERAPY 2013,21;4(2):32
非专利文献3:DAQUINAG,ET AL.,TISSUE ENGINEERING.PART C,METHODS,2013May;19(5):336-44.
非专利文献4:TROTTIER ET AL.,STEM CELLS,2008 Oct;26(10):2713-23
非专利文献5:MONFORT ET AL.,J Tissue Eng Regen Med.,2013 Jun;7(6):479-90
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明一实施方式的目的在于提供能够长期间维持的人工脂肪组织及能够在短时间内制造该人工脂肪组织的制造方法。进而,本发明一实施方式的目的还在于提供含有能够长期间维持的人工脂肪组织的人工皮肤以及能够在短时间内制造该人工皮肤的制造方法。本发明一实施方式的目的还在于提供脂肪细胞的培养试剂及使用上述人工皮肤对化合物的皮肤渗透性进行评价的方法。
用于解决技术问题的手段
本发明人们发现,通过将作为悬浮细胞的脂肪细胞与经片段化的细胞外基质一起进行培养而形成三维组织体,脂肪细胞在短时间内进行分化,且由所形成的三维组织体构成的人工脂肪组织能够长期间维持。进而发现,通过使用该人工脂肪组织,能够制造接近于人的皮肤厚度的人工皮肤。
即,本发明例如提供以下的[1]~[29]。
[1]一种人工脂肪组织,其由三维组织体形成,该三维组织体含有包含脂肪细胞的细胞和经片段化的细胞外基质。
[2]上述[1]所述的人工脂肪组织,其中,上述细胞外基质包含胶原。
[3]上述[1]或[2]所述的人工脂肪组织,其中,上述细胞外基质的含有率以上述人工脂肪组织为基准计为10重量%~30重量%。
[4]上述[1]~[3]中任一项所述的人工脂肪组织,其厚度为1mm~10mm。
[5]上述[1]~[4]中任一项所述的人工脂肪组织,其在培养中的收缩率为20%以下。
[6]上述[1]~[5]中任一项所述的人工脂肪组织,其中,上述经片段化的细胞外基质的平均长度为100nm~200μm。
[7]上述[1]~[6]中任一项所述的人工脂肪组织,其中,上述脂肪细胞的脂肪滴大小的平均值为20μm~180μm。
[8]一种人工皮肤,其含有第一层及第二层,第一层由上述[1]~[7]中任一项所述的人工脂肪组织形成。
[9]上述[8]所述的人工皮肤,其中,上述第二层含有成纤维细胞。
[10]上述[8]或[9]所述的人工皮肤,其进一步含有第三层。
[11]上述[10]所述的人工皮肤,其中,上述第三层含有角化细胞。
[12]上述[8]~[11]中任一项所述的人工皮肤,其厚度为0.2mm~10mm。
[13]一种人工脂肪组织的制造方法,其含有以下工序:
(1)在水性介质中使包含脂肪细胞的细胞与经片段化的细胞外基质接触的工序;及
(2)对接触了上述经片段化的细胞外基质的上述细胞进行培养的工序。
[14]上述[13]所述的制造方法,其中,工序(2)中的培养时间为10天~30天。
[15]上述[13]或[14]所述的制造方法,其中,在工序(1)及工序(2)之间进一步含有使水性介质中的上述经片段化的细胞外基质与上述细胞一起沉降的工序。
[16]上述[13]~[15]中任一项所述的制造方法,其中,上述细胞外基质包含胶原。
[17]上述[13]~[16]中任一项所述的制造方法,其中,上述经片段化的细胞外基质的平均长度为100nm~200μm。
[18]一种人工皮肤的制造方法,其含有:
(1)在水性介质中使包含脂肪细胞的第一细胞与第一经片段化的细胞外基质接触的步骤;及
(2)包含对接触了上述第一经片段化的细胞外基质的上述第一细胞进行培养的步骤的形成第一层的工序;和
(3)包含进一步使第二细胞接触于上述第一层、对上述第二细胞进行培养的步骤的形成第二层的工序。
[19]上述[18]所述的人工皮肤的制造方法,其中,上述第一经片段化的细胞外基质的平均长度为100nm~200μm。
[20]上述[18]或[19]所述的人工皮肤的制造方法,其中,工序(2)中的培养时间为10天~60天。
[21]上述[18]~[20]中任一项所述的人工皮肤的制造方法,其中,工序(3)是包含在上述第一层上、在水性介质中使上述第二细胞与经片段化的第二细胞外基质接触、对上述第二细胞进行培养的步骤的工序。
[22]上述[21]所述的人工皮肤的制造方法,其中,上述第二细胞外基质包含胶原。
[23]上述[18]~[22]中任一项所述的人工皮肤的制造方法,其中,上述第二细胞包含成纤维细胞。
[24]上述[18]~[23]中任一项所述的人工皮肤的制造方法,其还含有下述工序:包含进一步使第三细胞接触于上述第二层、对上述第三细胞进行培养的步骤的形成第三层的工序。
[25]上述[24]所述的人工皮肤的制造方法,其中,上述第三细胞包含角化细胞。
[26]一种脂肪细胞的培养试剂,其包含经片段化的细胞外基质。
[27]上述[26]所述的培养试剂,其中,上述经片段化的细胞外基质是平均长度为100nm~200μm的胶原。
[28]上述[26]或[27]所述的培养试剂,其为分化促进剂。
[29]一种对化合物的皮肤渗透性进行评价的方法,其含有以下工序:
准备上述[8]~[12]中任一项所述的人工皮肤的工序;
使受试化合物与人工皮肤接触的工序;
使用接触了上述受试化合物的人工皮肤来测定上述受试化合物的皮肤渗透性的工序;以及
将上述受试化合物的皮肤渗透性与基准值进行比较的工序。
发明效果
根据本发明,可以提供能够长期间维持的人工脂肪组织及能够在短时间内制造该人工脂肪组织的制造方法。另外,根据本发明,可以提供包含能够长期间维持的人工脂肪组织的人工皮肤及能够在短时间内制造该人工皮肤的制造方法。另外,根据本发明,可以提供脂肪细胞的培养试剂及使用上述人工皮肤对化合物的皮肤渗透性进行评价的方法。
进而,根据本发明,可以提供厚度接近于人的皮肤厚度的人工皮肤及其制造方法。
附图说明
图1为表示由含有片段化胶原、以及成熟脂肪细胞或脂肪干细胞的三维组织体所形成的人工脂肪组织的制造工序的示意图。
图2为表示对培养第14天的实施例1的人工脂肪组织进行评价的结果的照片。A表示苏木素-伊红(HE)染色的结果。箭头表示片段化胶原存在之处的一个例子。虚线表示成熟脂肪细胞的一个例子。B表示尼罗红的脂质染色的结果。白色部分表示核。C表示使用了LIVE/DEAD试剂盒的结果。灰色表示存活的细胞、白色表示死亡的细胞。
图3为表示实施例1的人工脂肪组织及利用以往的二维培养制得的人工脂肪组织的利用抗脂滴包被蛋白抗体进行的免疫染色的结果的照片。白色的部分表示核。照片中,3D表示实施例1的人工脂肪组织的结果、2D表示利用以往的二维培养制得的人工脂肪组织的结果。
图4为表示对培养第7天及第14天时的实施例1的人工脂肪组织及利用以往的二维培养制得的人工脂肪组织的脂肪囊泡大小进行了比较的结果的图表(*p<0.001)。图表中,3D表示实施例1的人工脂肪组织的结果、2D表示利用以往的二维培养制得的人工脂肪组织的结果。图表中,3D表示实施例1的人工脂肪组织的结果、2D表示利用以往的二维培养制得的人工脂肪组织的结果。
图5为表示对分化第17天的实施例2的人工脂肪组织进行了HE染色的结果的照片。上面的照片为将下面的照片的一部分放大的照片,虚线表示成熟脂肪细胞的一个例子,箭头表示片段化胶原存在之处的一个例子。
图6为利用电子显微镜对分化第37天及第72天的利用以往的二维培养制得的人工脂肪组织进行观察的照片。上面的照片表示分化第37天的人工脂肪组织、下面的照片表示分化第72天的人工脂肪组织。箭头表示成熟脂肪细胞的一个例子。
图7为表示实施例2的人工脂肪组织及利用以往的二维培养制得的人工脂肪组织的利用抗脂滴包被蛋白抗体进行的免疫染色的结果的照片。白色的部分表示核。照片中,3D表示实施例2的人工脂肪组织的结果、2D表示利用以往的二维培养制得的人工脂肪组织的结果。
图8为表示对培养第7天及第14天时的实施例2的人工脂肪组织及利用以往的二维培养制得的人工脂肪组织的脂肪囊泡大小进行了比较的结果的图表(*p<0.001)。图表中,3D表示实施例2的人工脂肪组织的结果、2D表示利用以往的二维培养制得的人工脂肪组织的结果。
图9为表示包含由含有片段化胶原及成熟脂肪细胞的人工脂肪组织所形成的第一层、含有成纤维细胞的第二层、以及含有角化细胞的第三层的人工皮肤的制造工序的示意图。
图10为表示培养第9天(角化细胞的分化第7天)时的、对使用脂肪细胞1×106cells及片段化胶原10mg所制得的实施例3的人工皮肤(左)和小鼠的皮下组织的皮肤(右)进行了HE染色的结果的照片。
图11为表示培养第9天(角化细胞的分化第7天)时的、对使用脂肪细胞1×106cells及片段化胶原10mg所制得的实施例3的人工皮肤进行了HE染色的结果的照片。A为对含有角化细胞的层进行了放大的照片、B为对含有成纤维细胞的层进行了放大的照片、C为对含有脂肪细胞的层进行了放大的照片。
图12为表示培养第9天(角化细胞的分化第7天)时的、对使用脂肪细胞5×105cells及片段化胶原10mg所制得的实施例3的人工皮肤进行了HE染色的结果的照片。A为对含有角化细胞的层进行了放大的照片、B为对含有成纤维细胞的层进行了放大的照片、C为对含有脂肪细胞的层进行了放大的照片。
图13为表示培养第9天(角化细胞的分化第7天)时的、对使用脂肪细胞1×106cells及片段化胶原15mg所制得的实施例3的人工皮肤进行了HE染色的结果的照片。A为对含有角化细胞的层进行了放大的照片、B为对含有成纤维细胞的层进行了放大的照片、C为对含有脂肪细胞的层进行了放大的照片。
图14为表示实施例3中制得的3层结构的人工皮肤的角化细胞分化时间与人工皮肤厚度的关系的图表。黑色四方表示使用脂肪细胞5×105cells及片段化胶原10mg所制得的实施例3的人工皮肤的结果,黑色圆表示使用脂肪细胞1×106cells及片段化胶原10mg所制得的实施例3的人工皮肤的结果,白色圆表示使用脂肪细胞1×106cells及片段化胶原15mg所制得的实施例3的人工皮肤的结果。
图15为表示三维人脂肪干细胞组织(3D)及利用以往的二维培养所制得的人工脂肪组织(2D)的至分化21天为止的、使用RT-qPCR并利用管家基因RPII表达水平进行标准化来对脂肪形成基因PPARγ2、FABP4及GLUT4的表达实施评价的结果。星号表示相对于二维组织的显著性差异(*p<0.05、**p<0.01及***p<0.001)。
具体实施方式
(人工脂肪组织)
本实施方式的人工脂肪组织由含有包含脂肪细胞的细胞和经片段化的细胞外基质的三维组织体形成。上述细胞的至少一部分黏附于经片段化的细胞外基质。本实施方式的人工脂肪组织与在平皿上利用以往的二维培养制得的人工脂肪组织相比,分化得到促进、且可长期间维持。
本实施方式的人工脂肪组织是人工制作的脂肪组织,不包括仅是从生物体组织中分离出的脂肪组织本身。
“三维组织体”是指细胞通过胶原等细胞外基质三维地配置的细胞的集合体,是通过细胞培养人工制作的集合体。三维组织体的形状并无特别限定,例如可举出片状、球体状、椭圆体状、长方体状等。这里,本实施方式的人工脂肪组织由于由含有经片段化的细胞外基质的三维组织体形成,因此可以通过经片段化的细胞外基质的有无,来与通过未使用生体组织及经片段化的细胞外基质的其它方法所制造的三维组织体区别开来。
本实施方式中,“脂肪细胞”不仅包含如成熟脂肪细胞那样进行了分化的细胞,还包含如脂肪干细胞那样未分化的细胞。脂肪细胞例如可以使用自皮下脂肪组织、心外膜来源脂肪组织等采集的细胞,还可以对所采集的细胞进行分化诱导后使用。脂肪细胞并无特别限定,在将由脂肪细胞构筑的脂肪组织最终选择利用于生物体的特定位置的组织时,优选使用与该位置的组织相对应的组织来源的细胞。作为成为脂肪细胞来源的动物种类,例如可举出人、小鼠、大鼠、猪等。作为优选的脂肪细胞,可举出成熟脂肪细胞或脂肪干细胞。
“细胞外基质”是指在生物体中存在于细胞外的物质,具体地可举出胶原、弹性蛋白、蛋白聚糖、纤连蛋白、透明质酸等。本实施方式的细胞外基质优选是存在于动物细胞外的物质,即动物的细胞外基质,更优选包含胶原或弹性蛋白,进一步优选为胶原或弹性蛋白,特别优选为胶原。
作为胶原,例如可举出纤维性胶原或非纤维性胶原。纤维性胶原是指成为胶原纤维的主成分的胶原,具体地可举出I型胶原、II型胶原、III型胶原等。作为非纤维性胶原,例如可举出IV型胶原。
以往的三维组织体的胶原等细胞外基质的浓度低、且细胞密度高。因此,具有在培养中或培养后因细胞的牵引力而三维组织体发生收缩、或者在培养中或培养后因细胞产生的酶而容易将三维组织体分解等问题。另外,虽然也例如市售有多孔性的高密度胶原等,但它们不仅无法使胶原与细胞均匀地粘接,而且为了之后的细胞特性评价而对细胞进行回收也是困难的。本实施方式的由三维组织体形成的脂肪组织的细胞外基质含有率高于以往的三维组织体的含有率,不易发生收缩、是稳定的。
三维组织体中的细胞外基质的含有率以上述三维组织体为基准计可以为0.01~90重量%、优选为10~90重量%、优选为1~50重量%、更优选为10~30重量%、特别优选为20~30重量%。这里,“三维组织体中的细胞外基质”是指构成三维组织体的细胞外基质,可以是内源性的细胞外基质、还可以是外源性的细胞外基质。另外,“三维组织体中的细胞外基质”还包括后述的经片段化的细胞外基质。即,三维组织体含有内源性的细胞外基质时,构成上述三维组织体的细胞外基质的浓度是指将内源性的细胞外基质及上述经片段化的细胞外基质加和的浓度。上述细胞外基质的浓度可以由所得三维组织体的体积、及进行了去细胞化的三维组织体的质量来求得。
“内源性的细胞外基质”是指细胞外基质产生细胞所产生的细胞外基质,“内源性胶原”是指构成三维组织体的胶原产生细胞所产生的胶原。内源性胶原可以是纤维性胶原,还可以是非纤维性胶原。
“外源性的细胞外基质”是指由外部供给的细胞外基质。本实施方式的人工脂肪组织由三维组织体形成,该三维组织体含有经片段化的细胞外基质。外源性的细胞外基质的成为来源的动物种类可以与内源性的细胞外基质相同,也可以不同。作为成为来源的动物种类,例如可举出人、猪、牛等。另外,外源性的细胞外基质还可以是人工的细胞外基质。经片段化的细胞外基质是外源性的细胞外基质。细胞外基质为胶原时,也被称作“外源性胶原”,是指从外部供给的胶原,具体地可举出纤维性胶原、非纤维性胶原等。外源性胶原优选是纤维性胶原。作为上述纤维性胶原,例如可举出I型胶原、II型胶原、III型胶原,优选为I型胶原。上述纤维性胶原还可以使用市售的胶原,作为其具体例子,可举出Nippon Ham株式会社制的猪皮来源I型胶原冷冻干燥体。作为外源性的非纤维性胶原,例如可举出IV型胶原。
外源性的细胞外基质中,来源的动物种类也可以与细胞不同。另外,细胞包含细胞外基质产生细胞时,对于外源性的细胞外基质,来源的动物种类也可以与细胞外基质产生细胞不同。即,外源性的细胞外基质也可以是异种细胞外基质。
上述三维组织体含有经片段化的细胞外基质。“经片段化的细胞外基质”是指对胶原等细胞外基质进行了片段化的产物。成为经片段化的细胞外基质来源的细胞外基质可以是一种,还可以将多种细胞外基质并用。以往,胶原等细胞外基质虽然溶于酸性水溶液等中,但浓度为0.1~0.3重量%左右,无法更多地溶解。因此,根据以往的方法,难以增多三维组织体中的胶原等细胞外基质的量。本实施方式的经片段化的细胞外基质几乎不溶于水,但推测通过分散于后述的水性介质中,在水性介质中变得易于与包含脂肪细胞的细胞接触,从而促进三维组织体的形成。经片段化的细胞外基质的平均长度优选为100nm~200μm、更优选为22μm~200μm、进一步优选为100μm~200μm。经片段化的细胞外基质的平均直径优选为50nm~30μm、更优选为4μm~30μm、进一步优选为20μm~30μm。
细胞外基质为胶原时,也将经片段化的细胞外基质称作“片段化胶原”。“片段化胶原”是将纤维性胶原等胶原进行片段化的产物,其维持着三螺旋结构。片段化胶原的平均长度优选为100nm~200μm、更优选为22μm~200μm、进一步优选为100μm~200μm。片段化胶原的平均直径优选为50nm~30μm、更优选为4μm~30μm、进一步优选为20μm~30μm。
对胶原等细胞外基质进行片段化的方法并无特别限定,例如可以使用超声波式匀浆机、搅拌式匀浆机及高压式匀浆机等匀浆机将细胞外基质进行片段化。使用搅拌式匀浆机时,可以直接地将细胞外基质均质化,也可以在生理盐水等水性介质中进行均质化。另外,通过调整进行均质化的时间、次数等,也可获得毫米尺寸、纳米尺寸的经片段化的细胞外基质。
经片段化的细胞外基质的直径及长度可以通过利用电子显微镜对各个经片段化的细胞外基质进行解析来求得。
根据本实施方式的制造方法,能够以较少的细胞数制造厚度为1mm以上、尺寸较大的三维组织体所形成的人工脂肪组织。
由上述三维组织体所形成的人工脂肪组织优选厚度为10μm~20mm、更优选为100μm~15mm、特别优选为1mm~10mm。厚度的下限并无特别限定,例如可以为10μm、50μm、100μm、200μm、500μm、800μm、1mm、3mm或5mm。厚度的上限并无特别限定,例如可以为20mm、15mm、10mm、5mm、3mm、2mm、1.5mm或1mm。这种三维组织体是接近于生物体组织的结构,适合作为实验动物的代替品及移植材料。
这里,“三维组织体的厚度”在三维组织体为片状或长方体状时,是指垂直于主面的方向上的两端的距离。上述主面具有凹凸时,厚度是指上述主面的最薄部分处的距离。另外,当三维组织体为球体状时,是指其直径。进而,当三维组织体为椭圆体状时,是指其短径。三维组织体为大致球体状或大致椭圆体状且表面具有凹凸时,厚度是通过三维组织体重心的直线与上述表面交叉的2点间的距离中最短的距离。
上述三维组织体所形成的人工脂肪组织优选培养中的收缩率为20%以下、更优选为15%以下、进一步优选为10%以下。上述收缩率例如可以用以下公式求出。式中L1表示培养后第1天的三维组织体所形成的人工脂肪组织的最长部分的长度、L3表示培养后第3天的三维组织体所形成的人工脂肪组织中对应部分的长度。
收缩率(%)={(L1-L3)/L1}×100
上述例子中是由培养后第1天的人工脂肪组织和培养第3天的人工脂肪组织求出收缩率,但例如也可由培养后第1天的人工脂肪组织和培养第2天的人工脂肪组织求出,也可以由培养后第1天的人工脂肪组织和培养第5天的人工脂肪组织求出,还可以由培养后第1天的人工脂肪组织和培养第8天的人工脂肪组织求出。
作为表示所培养了的脂肪细胞的成熟度的指标,可以使用脂肪滴的大小。脂肪滴是指储存甘油三酯(中性脂肪)、胆固醇等脂质的细胞内小器官,上述脂质类通过被磷脂的单层膜覆盖而具有液滴样形状。另外,在上述磷脂的表面可见脂肪组织特有的蛋白质(脂滴包被蛋白等)的表达。成熟了的脂肪细胞的脂肪滴大小虽有不均,但当例如脂肪滴的大小的平均值为20μm以上时,可以说脂肪细胞某种程度地成熟,即为成熟脂肪细胞。
本实施方式的人工脂肪组织中,脂肪细胞的脂肪滴大小的平均值优选为20μm~180μm、更优选为100μm~180μm。上述脂肪滴的大小可以是250μm以下、200μm以下、180μm以下或150μm以下。另外,上述脂肪滴的大小可以是15μm以上、30μm以上、50μm以上或80μm以上。另外,上述脂肪滴的大小可以是培养第7天、培养第10天、培养第14天、或培养第21天时的数值。
另外,作为表示所培养了的脂肪细胞的成熟度的指标,可以使用脂肪形成标记物及脂肪分解标记物等基因标记物的表达谱。作为脂肪形成标记物,例如可举出PeroxisomeProliferator-Activated Receptorγ2(PPARγ2,过氧化物酶增殖物激活受体γ2)、FattyAcid Binding Protein 4(FABP4,脂肪酸结合蛋白4)及Glucose transporter type 4(GLUT-4,葡萄糖转运蛋白4型)等。PPARγ2及FABP4可作为脂肪形成的初期标记物进行利用,GLUT-4可作为脂肪形成的后期标记物进行利用。作为脂肪分解标记物,例如可举出hormone-sensitive lipase(HSL,激素敏感性脂解酶)及Adipocyte Triglyceride Lipase(ATGL,脂肪细胞甘油三酯脂肪酶)等。
PPARγ2是在脂肪细胞的分化中最重要的转录因子之一。有报告指出,在脂肪形成的期间,PPARγ2表达会增加,接着保持恒定或减少(B.Galateanu et al.,Int.J.Mol.Sci.2012(13)15881-15900及A.Soukas et al.,J.Biol.Chem.2001(276)34167-34174)。因此可以认为,例如与PPARγ2处于增加的阶段的组织体相比,在PPARγ2处于恒定表达的阶段的组织体中,脂肪形成进一步进行。FABP4是将脂肪酸输送至用于使其流出的膜所需的另一个初期标记物。因此可以认为,例如显示更典型的直线性增加的FABP4表达谱的组织体更处于脂肪形成的初期阶段。对于典型的直线性增加的FABP4表达谱而言,例如可以参照E.C.M.Mariman et al.,Cell.Mol.Life Sci.2010(67)1277-1292。
胰岛素刺激性GLUT-4是脂肪细胞中主要的葡萄糖运输体。在脂肪形成的分化处于初期阶段的组织体中,GLUT-4的表达较弱(S.-W.Qian et al.,BMC Dev.Biol.2010(10)47)。因此可以认为,例如GLUT-4的表达更快增加的组织体的脂肪形成的分化进一步进行。
本实施方式的人工脂肪组织还可以含有除脂肪细胞以外的细胞,还可以含有细胞外基质产生细胞。“细胞外基质产生细胞”是指分泌胶原等细胞外基质的细胞。即,该人工脂肪组织还可以含有内生的细胞外基质。作为细胞外基质产生细胞,可举出成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞等间充质细胞,优选成纤维细胞。作为优选的成纤维细胞,例如可举出人皮肤来源成纤维细胞(NHDF)、人心脏成纤维细胞(NHCF)及人牙龈成纤维细胞(HGF)。作为其它的除脂肪细胞以外的细胞,例如可举出血管内皮细胞(例如人脐带静脉来源血管内皮细胞(HUVEC))、结肠直肠癌细胞(例如人结肠直肠癌细胞(HT29))、肝癌细胞等癌细胞、心肌细胞(例如人iPS细胞来源心肌细胞(iPS-CM))、上皮细胞(例如人牙龈上皮细胞)、淋巴管内皮细胞、神经细胞、肝细胞、组织干细胞、胚胎干细胞、人工多功能干细胞、黏附性细胞(例如免疫细胞)、平滑肌细胞(例如大动脉平滑肌细胞(Arota-SMC))、角化细胞(例如人表皮角化细胞)等。
上述三维组织体所形成的脂肪组织可作为实验动物的代替品、移植材料等进行应用。具体地说,例如可以应用于针对橘皮组织、肥胖等的化妆品的分析筛选,针对糖尿病、肥胖等的药品的筛选,与脂肪组织有关的炎症性疾病等其它病理学的体外模型,因外伤或肿瘤摘除所导致的软组织缺损或乳房切除等之后的组织再构筑。
(人工皮肤)
本实施方式的人工皮肤含有多个层,其中的一个层是由上述人工脂肪组织所形成的层。即,本实施方式的人工皮肤含有第一层及第二层,作为第一层,含有上述人工脂肪组织。该人工皮肤只要至少含有第一层及第二层即可,还可以进一步含有第三层、第四层或第五层,还可以含有更多的层。各层的顺序没有关系,但优选以第一层、第二层、第三层的顺序将它们层叠。但是,此时只要是第一层、第二层、第三层为此顺序即可,例如并不限制在第一层之下、第一层与第二层之间、第二层与第三层之间、或者第三层之上含有其它的层。
本实施方式的人工皮肤的各层可以根据所含细胞的种类及细胞分布的差异等来进行区分。例如通过将人工皮肤按每种细胞种类地染色成不同的颜色,由此各层以不同的颜色显示,因此可以通过截面照片等将各层进行区分。另外,例如可以对人工皮肤中所含的全部细胞进行染色,由截面照片等中经染色的细胞的密度差异来将各层进行区分。
除第一层以外的层(第二层、第三层、第四层及第五层等)含有细胞。该细胞可以包含上述的脂肪细胞、也可以包含除脂肪细胞以外的细胞。第二层优选含有成纤维细胞或角化细胞,更优选含有成纤维细胞,进一步优选含有人皮肤来源成纤维细胞或人心脏成纤维细胞。第三层优选含有成纤维细胞或角化细胞,更优选含有角化细胞,进一步优选含有人表皮角化细胞。在使第一层为最下层时,优选第二层含有成纤维细胞、第三层含有角化细胞。其原因在于,通过如此地进行层叠,可以获得更接近人生物体内的皮肤结构的人工皮肤。
另外,除第一层以外的层(第二层、第三层、第四层及第五层等)还可以含有细胞外基质,还可以含有经片段化的细胞外基质。优选第二层含有经片段化的细胞外基质。对于细胞外基质及经片段化的细胞外基质而言,可以使用与上述相同者。通过含有经片段化的细胞外基质,可以形成细胞之间的间隔适当的层。
本实施方式的人工皮肤优选厚度为10μm~20mm、更优选为100μm~15mm、进一步优选为200μm~10mm、特别优选为1mm~10mm。厚度的下限并无特别限定,例如可以为10μm、50μm、100μm、200μm、500μm、800μm、1mm、3mm或5mm。厚度的上限并无特别限定,例如可以为20mm、15mm、10mm、5mm、3mm、2mm、1.5mm或1mm。这种人工皮肤是更接近于生物体组织的结构,适合作为实验动物的代替品及移植材料。
“人工皮肤的厚度”是指自最上层的组织表面至最下层的组织底面的距离。例如在为包含上皮组织、真皮组织、皮下组织的3层组织时,是指自上皮组织的表面至最下层的皮下组织的底面为止的距离(3层组织的总厚)。
构成本实施方式的人工皮肤的细胞数可以为1×106个以上。
本实施方式的人工皮肤的第一层由上述人工脂肪组织形成。人工脂肪组织中,脂肪细胞的脂肪滴大小的平均值优选为20μm~180μm、更优选为100μm~180μm。上述脂肪滴的大小可以为250μm以下、200μm以下、180μm以下或150μm以下。另外,上述脂肪滴的大小可以为15μm以上、30μm以上、50μm以上或80μm以上。另外,上述脂肪滴的大小可以是培养第7天、培养第10天、培养第14天或培养第21天时的数值。
上述人工皮肤可作为生物体的皮肤的代用品,作为实验动物的代替品、移植材料等进行应用。具体地说,例如可以应用于对化合物的皮肤渗透性、皮肤安全性、皮肤腐蚀性及皮肤刺激性等进行评价的试验,化妆品的分析筛选,药品的筛选,病理学的体外模型,用于整形外科手术或烧伤手术的移植材料。
(人工脂肪组织的制造方法)
本实施方式的人工脂肪组织的制造方法含有以下工序:
(1)在水性介质中使包含脂肪细胞的细胞与经片段化的细胞外基质接触的工序(以下也称作工序(1))、及
(2)对接触了上述经片段化的细胞外基质的上述细胞进行培养的工序(以下也称作工序(2))。
对于“脂肪细胞”、“经片段化的细胞外基质”等,如上所述。
本实施方式的工序(1)的“包含脂肪细胞的细胞”可以包含除脂肪细胞以外的细胞,还可以包含细胞外基质产生细胞。“细胞外基质产生细胞”是指分泌胶原等细胞外基质的细胞。作为细胞外基质产生细胞,可举出成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞等间充质细胞,优选成纤维细胞。作为优选的成纤维细胞,例如可举出人皮肤来源成纤维细胞(NHDF)、人心脏成纤维细胞(NHCF)及人牙龈成纤维细胞(HGF)。作为其它的除脂肪细胞以外的细胞,例如可举出血管内皮细胞(例如人脐带静脉来源血管内皮细胞(HUVEC))、结肠直肠癌细胞(例如人结肠直肠癌细胞(HT29))、肝癌细胞等癌细胞、心肌细胞(例如人iPS细胞来源心肌细胞(iPS-CM))、上皮细胞(例如人牙龈上皮细胞)、淋巴管内皮细胞、神经细胞、肝细胞、组织干细胞、胚胎干细胞、人工多功能性干细胞、黏附性细胞(例如免疫细胞)、平滑肌细胞(例如大动脉平滑肌细胞(Arota-SMC))、角化细胞(例如人表皮角化细胞)等。
“水性介质”是指以水为必须构成成分的液体。作为水性介质,只要是片段化胶原及细胞能够稳定地存在,则无特别限定。例如可举出磷酸缓冲生理盐水(PBS)等生理盐水、Dulbecco’s ModifiedEagle培养基(DMEM)、血管内皮细胞专用培养基(EGM2)等液体培养基。液体培养基还可以是混合有两种培养基的混合培养基。从减轻对细胞的负荷的观点出发,水性介质优选为液体培养基。
作为在水性介质中使经片段化的细胞外基质与包含脂肪细胞的细胞接触的方法,并无特别限定。例如可举出在含有细胞的培养液中添加经片段化的细胞外基质的分散液的方法;在经片段化的细胞外基质的培养基分散液中加入细胞的方法;或者在预先准备的水性介质中分别添加经片段化的细胞外基质及细胞的方法。
工序(1)中的水性介质中的经片段化的细胞外基质的浓度可以根据目标的三维组织体所形成的人工脂肪组织的形状、厚度、培养器的尺寸等适当决定。例如工序(1)中的水性介质中的经片段化的细胞外基质的浓度可以为0.1~90重量%、还可以为1~30重量%。
工序(1)中的经片段化的细胞外基质的量相对于1×105cells的细胞可以为0.1~100mg、还可以为1~50mg。
工序(1)中的经片段化的细胞外基质与细胞的质量比优选为1000:1~1:1、更优选为900:1~9:1、进一步优选为500:1~10:1。
将脂肪细胞和其它细胞一起使用时,工序(1)中的脂肪细胞:其它细胞的比率(细胞数)可以为99:1~9:1、还可以为80:20~50:50。
还可以在工序(1)及工序(2)之间进一步含有使包含脂肪细胞的细胞与水性介质中的经片段化的细胞外基质一起沉降的工序。通过进行这种工序,由三维组织体形成的人工脂肪组织中的经片段化的细胞外基质及细胞的分布变得更为均匀。作为具体的方法并无特别限定,例如可举出将含有经片段化的细胞外基质和细胞的培养液进行离心操作的方法。
工序(1)的工序还可以通过在水性介质中形成细胞的层之后、使上述经片段化的细胞外基质接触来进行。通过在与经片段化的细胞外基质接触之前形成细胞的层,可以制作由下层部的细胞密度高的三维组织体所形成的人工脂肪组织。例如通过在与经片段化的细胞外基质接触之前形成包含细胞外基质产生细胞的细胞的层,可以制作由包含细胞外基质产生细胞的细胞的下层部的细胞密度高的三维组织体所形成的人工脂肪组织。根据所使用的细胞的种类,可以利用该方法制作更接近生物体的人工脂肪组织。
本实施方式中,三维组织体的制造方法可以在工序(2)之后含有进一步接触细胞、对细胞进行培养的工序作为工序(3)。上述细胞可以与工序(1)中所用的细胞相同、也可以不同。例如工序(1)中使用的细胞含有除细胞外基质产生细胞以外的细胞时,工序(3)中使用的细胞可以包含细胞外基质产生细胞。另外,例如工序(1)中使用的细胞包含细胞外基质产生细胞时,工序(3)中使用的细胞可以包含除细胞外基质产生细胞以外的细胞。可以工序(1)中使用的细胞及工序(3)中使用的细胞这两者包含细胞外基质产生细胞,还可以工序(1)中使用的细胞及工序(3)中使用的细胞这两者包含除细胞外基质产生细胞以外的细胞。通过上述工序(3),可以制作2层结构的由三维组织体所形成的人工脂肪组织。还可以利用相同的方法制造含有多个层的人工皮肤。对该人工皮肤的制造方法在后叙述。
工序(2)中,对接触了经片段化的细胞外基质的细胞进行培养的方法并无特别限定,可以根据所培养的细胞的种类,利用适合的培养方法进行。例如,培养温度可以为20℃~40℃、还可以为30℃~37℃。培养基的pH可以为6~8、还可以为7.2~7.4。本实施方式的制造方法不需要以往的二维培养及三维组织的制造中使用的复杂组成的培养用培养基,可以使用DMEM等能简单制备的培养基。培养基并无特别限定,可以根据所培养的细胞的种类来选择适合的培养基。作为培养基,例如可举出Eagle’s MEM培养基、DMEM、Modified Eagle培养基(MEM)、Minimum Essential培养基、RPMI及GlutaMax培养基等。培养基可以是添加有血清的培养基,还可以是无血清培养基。培养基还可以是混合有2种培养基的混合培养基。另外,根据本实施方式的制造方法,与以往的二维培养相比,可以在相当短的培养时间内即获得充分地分化了的人工脂肪组织。因此,工序(2)中的培养时间例如可以为10天~60天、还可以为10天~30天、还可以为13天~25天、还可以为14天~17天。但是,上述培养时间只不过是表示获得充分地分化了的脂肪组织所需的时间,并不妨碍更长时间的培养。
工序(2)中的培养基中的细胞密度可以根据目标的三维组织体的形状、厚度、培养器的尺寸等适当决定。例如工序(2)中的培养基中的细胞密度可以为1~108cells/mL、还可以为103~107cells/mL。另外,工序(2)中的培养基中的细胞密度也可以与工序(1)中的水性介质中的细胞密度相同。
通过本实施方式的制造方法制造的由三维组织体所形成的人工脂肪组织优选培养中的收缩率为20%以下、更优选为15%以下、进一步优选为10%以下。上述收缩率例如可以用以下公式求得。式中L1表示培养后第1天的三维组织体的最长部分的长度,L3表示培养后第3天的三维组织体中的相应部分的长度。
收缩率(%)={(L1-L3)/L1}×100
上述例子中是由培养后第1天的人工脂肪组织和培养第3天的人工脂肪组织求得收缩率,但也可以由包括培养结束时间点在内的培养期间的任意时间点下的人工脂肪组织求得。例如可以由培养后第1天的人工脂肪组织和培养第2天的人工脂肪组织求得,还可以由培养后第1天的人工脂肪组织和培养第5天的人工脂肪组织求得,还可以由培养后第1天的人工脂肪组织和培养第8天的人工脂肪组织求得。
通过本实施方式的制造方法制造的由三维组织体所形成的人工脂肪组织优选在胰蛋白酶的浓度为0.25%、温度为37℃、pH为7.4、反应时间为15分钟的条件下进行了胰蛋白酶处理后的残存率为70%以上、更优选为80%以上、进一步优选为90%以上。这种三维组织体不易发生在培养中或培养后因酶所导致的分解,是稳定的。上述残存率例如可以由胰蛋白酶处理前后的三维组织体的质量求得。
通过本实施方式的制造方法制造的由三维组织体所形成的人工脂肪组织优选在胶原蛋白酶的浓度为0.25%、温度为37℃、pH为7.4、反应时间为15分钟的条件下进行胶原蛋白酶处理后的残存率为70%以上、更优选为80%以上、进一步优选为90%以上。这种三维组织体不易发生在培养中或培养后因酶所导致的分解,是稳定的。
另外,根据本实施方式的制造方法,可以稳定地制造由细胞均匀地分布的三维组织体所形成的人工脂肪组织。进而,通过本实施方式的制造方法制得的人工脂肪组织与以往的二维培养相比,可更长期间地维持成熟脂肪细胞。另外,根据本实施方式的制造方法,能够以较少的细胞数来制造厚度为1mm以上、尺寸较大的三维组织体所形成的人工脂肪组织。
(人工皮肤的制造方法)
本实施方式的人工皮肤的制造方法含有:
(1)在水性介质中使包含脂肪细胞的第一细胞与第一经片段化的细胞外基质接触的步骤(以下也称作工序(1)’);及
(2)包含对接触了上述第一经片段化的细胞外基质的上述第一细胞进行培养的步骤的形成第一层的工序(以下也称作工序(2)’);和
(3)包含进一步使第二细胞接触于上述第一层、对上述第二细胞进行培养的步骤的形成第二层的工序(以下也称作工序(3)’)。
对于工序(1)’及(2)’,可举出与上述(人工脂肪组织的制造方法)中所述方法相同的方法。对于水性介质、包含脂肪细胞的第一细胞、第二细胞、第一经片段化的细胞外基质,也可举出与上述的水性介质、包含脂肪细胞的细胞、经片段化的细胞外基质相同的物质。
工序(2)’中的形成第一层的方法并无特别限定,只要所培养的细胞的厚度达到所希望的厚度,则可看做已经形成了层。工序(2)’中并无必要在第一层的形成结束后再开始工序(3)’,可以在工序(2)’的培养中开始工序(3)’。
第一经片段化的细胞外基质的平均长度优选为100nm~200μm、更优选为22μm~200μm、进一步优选为100μm~200μm。经片段化的细胞外基质的平均直径优选为50nm~30μm、更优选为4μm~30μm、进一步优选为20μm~30μm。
另外,根据本实施方式的制造方法,与以往的二维培养相比,可以以相当短的培养时间获得充分地分化了的脂肪组织(第一层)。因此,工序(2)’中的培养时间例如可以为10天~60天,还可以为10天~30天,还可以为13天~25天,还可以为14天~17天。但是,上述的培养时间只不过是表示获得充分地分化了的脂肪组织所需的时间,并不妨碍更多时间的培养。
第二细胞可以与第一细胞相同、也可以不同。另外,对于接触细胞的方法及培养方法,也可举出与上述(人工脂肪组织的制造方法)中所述方法相同的方法。
作为用作第二细胞的细胞,可以举出与上述(人工脂肪组织)中所述者相同的细胞,但优选第二细胞包含成纤维细胞。通过使第二层为成纤维细胞进行了分化的层,可以制成更接近生物体皮肤的结构。
另外,工序(3)’优选是包含在上述第一层上、在水性介质中使上述第二细胞与经片段化的第二细胞外基质接触、对上述第二细胞进行培养的步骤的工序。作为第二细胞外基质,可举出与上述(人工脂肪组织)中所述者相同的细胞外基质。通过包含经片段化的细胞外基质,可以形成细胞之间的间隔适当的层。第二细胞外基质优选包含胶原,第二细胞外基质更优选为胶原。
本实施方式的人工皮肤的制造方法可以进一步含有下述工序:包含进一步使第三细胞接触于上述第二层、对上述第三细胞进行培养的步骤的形成第三层的工序。
作为用作第三细胞的细胞,可以举出与上述(人工脂肪组织)中所述者相同的细胞,优选第三细胞包含角化细胞。通过使第三层为角化细胞进行了分化的层,可以制成更接近生物体皮肤的结构。
根据本实施方式的人工皮肤的制造方法,与上述(人工皮肤)中所述者同样地,可以以与以往的二维培养相比相当短的培养时间获得接近于生物体皮肤的厚度的人工皮肤。
另外,根据本实施方式的人工皮肤的制造方法,可以稳定地制造含有由细胞稳定地分布的三维组织体所形成的人工脂肪组织作为第一层的人工皮肤。进而,通过本实施方式的制造方法制得的人工皮肤中的人工脂肪组织与以往的二维培养相比,成熟脂肪细胞得以更长期间地维持。另外,根据本实施方式的制造方法,能够以较少的细胞数制造厚度为1mm以上的、接近于生物体皮肤的厚度的人工皮肤。
(脂肪细胞的培养试剂)
本实施方式的脂肪细胞的培养试剂包含经片段化的细胞外基质。本实施方式的脂肪细胞的培养试剂中,上述经片段化的细胞外基质的平均长度可以为100nm~200μm、上述经片段化的细胞外基质的平均直径可以为50nm~30μm。另外,对于经片段化的细胞外基质的长度,可以是经片段化的细胞外基质整体中的95%为100nm~200μm的范围。进而,对于经片段化的细胞外基质的直径,可以是经片段化的细胞外基质整体中的95%为50nm~30μm的范围。
“脂肪细胞的培养试剂”是指用于培养脂肪细胞的试剂。脂肪细胞的培养试剂可以是粉末的状态,也可以是经片段化的细胞外基质分散于水性介质中的分散液的状态。作为经片段化的细胞外基质的种类、大小、制造方法及上述培养试剂的使用方法,可以举出与在上述(人工脂肪组织)及(人工脂肪组织的制造方法)中所示相同的方法。通过包含经片段化的细胞外基质,脂肪细胞的分化得以促进。因此,脂肪细胞的培养试剂也可看做是分化促进剂。另外,通过包含经片段化的细胞外基质,成熟脂肪细胞的去分化不易发生。因此,脂肪细胞的培养试剂也可看做成熟脂肪细胞的去分化抑制剂(成熟脂肪细胞的维持剂)。进而,根据本实施方式的培养试剂,例如在形成了具有1mm以上厚度的组织时,由于能够形成因长期培养导致的组织收缩少的组织,因此也可以在发挥分化促进效果和去分化抑制效果的同时、形成长期间形态稳定的组织。
(评价化合物的皮肤渗透性的方法)
本实施方式的评价化合物的皮肤渗透性的方法含有以下工序:
准备人工皮肤的工序;
使受试化合物接触于人工皮肤的工序;
使用接触了上述受试化合物的人工皮肤来测定上述受试化合物的皮肤渗透性的工序;以及
将上述受试化合物的皮肤渗透性与基准值进行比较的工序。
人工皮肤使用上述(人工皮肤)中所记载的本实施方式的人工皮肤、或者通过上述(人工皮肤的制造方法)中所记载的本实施方式的制造方法所制造的人工皮肤。如上所述,该人工皮肤由于具有与生物体皮肤类似的构成及厚度,因此可作为生物体的皮肤代用品、用于化合物的皮肤渗透性试验。
作为受试化合物并无特别限定,只要是通常用于皮肤渗透性试验的化合物,则可以使用任何物质。
作为使受试化合物接触于人工皮肤的接触方法,并无特别限定,当受试化合物为液体时,例如可举出直接涂布或散布在人工皮肤的表面上,当受试化合物为固体时,可举出使用使其溶解于溶剂的溶液、同样地涂布或散布于人工皮肤的表面。
受试化合物的皮肤渗透性的测定可以根据本领域技术人员所周知的皮肤渗透性试验法进行。例如对于以化妆品-非药用品为对象的安全性评价,可以根据日本厚生劳动省-医药食品卫生局审查管理处颁发的1115第1号(平成28年11月15日)的指导进行试验。
基准值可以根据受试化合物的种类及浓度等适当设定。例如基准值为一个点值时,与基准值相比更高时,可以评价为皮肤渗透性高,与基准值相比更低时,可以评价为皮肤渗透性低。另外,例如基准值也可作为用于阶段性评价皮肤渗透性的范围进行设定。
以下示出实施例,对本发明更为详细且具体地进行说明,但实施例并不限定本发明的范围。
实施例
(实施例1:使用了小鼠成熟脂肪细胞的人工脂肪组织的制造)
发明人们为了增加组织中的胶原密度,开发了使用胶原微纤维得到的三维组织体的制造方法(图1)。使用了成熟脂肪细胞的人工脂肪组织如图1所示的示意图那样如下制造。
将Nippon Ham株式会社制的猪皮来源I型胶原冷冻干燥体分散于10倍浓度的磷酸缓冲生理盐水(×10PBS)中,使用匀浆机进行均质化5分钟,从而获得直径约为4.4μm、长度约为22.5μm的片段化胶原。利用无血清培养基(DMEM)对所得片段化胶原进行洗涤,获得片段化胶原的培养基分散液。
使用含有血清的培养基(DMEM),按照浓度达到10mg/mL的方式将片段化胶原分散。在24孔板Transwell(IWAKI公司制)中将所得分散液1mL(片段化胶原、相当于约10mg)和DMEM中的1×106cells的原代成熟小鼠脂肪细胞混合。接种24小时后,将上述的Transwell放在含有6mL培养基(DMEM培养基、NacalaiTesque公司制)的6孔板(IWAKI公司制)中。成熟脂肪细胞每4天进行培养基更换,培养至14天。在培养开始的同时,仅进行含有细胞及片段化胶原的混合物的堆积,未进行离心,因此随着培养的经过,自重方向上的厚度减少,变得稳定,在培养14天后获得厚度约为2mm的三维组织体。利用苏木素-伊红(HE)染色及利用抗脂滴包被蛋白抗体进行的免疫染色对由所得三维组织体形成的人工脂肪组织进行染色,进行组织学评价。另外,使用尼罗红对脂质进行染色。存活率使用LIVE/DEAD试剂盒(ThermoFisher Scientific公司制)进行评价,脂肪囊泡的存活/死亡及分析的测定使用ImageJ软件(美国国立卫生研究所制)进行。另外,使用电子显微镜测定培养第7天及第14天时的脂肪囊泡100个的脂肪囊泡直径,与通过以往的二维培养制得的人工脂肪组织的脂肪细胞进行比较。
如下地进行通过以往的二维培养制造人工脂肪组织的方法。在6孔板(IWAKI公司制)中接种3×105(cells/孔)的原代成熟小鼠脂肪细胞并进行培养。利用2mL的培养基(DMEM培养基、NacalaiTesque公司制)继续培养。培养基每3天进行更换。此外,成熟脂肪细胞由于脂肪滴的浮力的影响而不会黏附在容器底面,因此在培养基中悬浮市售的盖玻片,使细胞黏附在其下进行培养。
HE染色中显示了在包围成熟脂肪细胞的三维组织体中存在高密度的经片段化的胶原(图2A的箭头)。成熟脂肪细胞显示具有较小的细胞质及核的典型的圆形的单眼形状(图2A)。
尼罗红的脂质染色中确认到了细胞质内的脂肪滴。确认到显示成熟脂肪细胞的单眼形状的脂肪滴,表示三维组织体内的成熟脂肪细胞的均质且高度的再分级(图2B)。即便进行了14天以上的长时间培养时,人工脂肪组织也以自第2天的98.5%至第14天的94.6%(图2C中,灰色表示存活的细胞、白色表示死亡的细胞)的高存活率将成熟脂肪细胞良好地维持。由利用抗脂滴包被蛋白抗体进行的免疫染色结果确认到,培养第14天的三维组织体的成熟了的脂肪细胞与通过以往的二维培养制得的人工脂肪组织的脂肪细胞相比,维持了更大的单眼形状(第0天为54±8μm的脂肪囊泡)(图3)。另一方面,通过以往的二维培养制得的人工脂肪组织中,成熟脂肪细胞去分化成成纤维细胞样细胞形态,与培养第14天的三维组织体内的成熟脂肪细胞相比,显示了显著性意义上地小3.7倍的囊泡(图4、计数n>100个的脂肪囊泡、t检验)。另外,由含有片段化胶原的三维组织体所形成的人工脂肪组织自第7天至第14天维持了脂肪囊泡的大小,但通过以往的二维培养制得的人工脂肪组织自第7天至第14天、脂肪囊泡的大小发生了减小。这表明,含有片段化胶原的三维组织体与通过以往的二维培养制造的人工脂肪组织相比,至被去分化的时间更长,因此能够长期间的维持,将成熟脂肪细胞的培养时间延长了至少1周以上。
(实施例2:使用了人脂肪干细胞的人工脂肪组织的制造)
使用了脂肪干细胞的人工脂肪组织如图1所示的示意图那样如下地进行制造。
将Nippon Ham株式会社制的猪皮来源I型胶原冷冻干燥体分散于10倍浓度的磷酸缓冲生理盐水(×10PBS)中,使用匀浆机进行均质化5分钟,从而获得直径约为4.4μm、长度约为22.5μm的片段化胶原。利用无血清培养基(DMEM)对所得片段化胶原进行洗涤,获得片段化胶原的培养基分散液。
使用含有血清的培养基(DMEM),按照浓度达到10mg/mL的方式将片段化胶原分散。在96孔培养小室(ACEA Bioscience公司制)中将所得分散液300μL(片段化胶原、相当于约3mg)和DMEM中的5×105cells的人脂肪干细胞混合。接种24小时后,加入200μL的培养基(DMEM培养基、NacalaiTesque公司制)。培养基每2天进行更换,培养19天。在19天中,2天的时间相当于增殖期间,之后的17天的时间相当于分化期间。在培养开始的同时,仅进行含有细胞及片段化胶原的混合物的堆积,未进行离心,因此随着培养的经过、自重方向上的厚度减少、变得稳定,在培养14天后获得厚度约为2mm的三维组织体。利用苏木素-伊红(HE)染色及利用抗脂滴包被蛋白抗体进行的免疫染色对分化第17天(培养第19天)的三维组织体所形成的人工脂肪组织进行染色,进行组织学评价。
HE染色中,显示了在三维组织体中存在高密度的经片段化的胶原(图5中的箭头)。另外,确认到了表示成熟脂肪细胞的大的圆形的单眼形状的脂肪滴(图5放大图)。其中,还确认到了超过100μm大小的成熟脂肪细胞。
通过以往的二维培养制造人工脂肪组织的方法如下地进行。在24孔板(IWAKI公司制)中接种1×104(cells/孔)的人脂肪干细胞并进行培养。接种后的2天的时间使用500μL的D-MEM进行培养,使其增殖后,培养基更换为分化促进用的培养基。分化促进用的培养基是在D-MEM中添加有PGM-2Singlequot KitPT-9502(LONZA制)的培养基,其中含有生长辅助剂(Indomethacin、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素)。在500μL中进行培养,培养基每周更换1次。
通过以往的二维培养制得的人工脂肪组织在分化第37天的时间点散见液滴状态的脂肪囊泡(图6)。另外,利用尼罗红的脂质染色进行确认时,仅确认到小的脂肪滴,未确认到如含有片段化胶原的三维组织体那样的超过100μm大小的成熟脂肪细胞。
进而,通过以往的二维培养制得的人工脂肪组织在分化第72天的时间点也散见液滴状态的脂肪囊泡,所有的脂肪细胞均未分化(图6)。另外,当脂肪进一步增加时,脂肪细胞离开,在培养液中漂浮,更换培养液变得困难。
由利用抗脂滴包被蛋白抗体进行的免疫染色的结果确认到,培养第7天的三维组织体的脂肪干细胞与通过以往的二维培养制得的人工脂肪组织的脂肪干细胞相比,形成了更大的单眼形状(第7天为4μm±2μm的脂肪囊泡)(图7)。另一方面,对于通过以往的二维培养制得的人工脂肪组织,与培养第7天的三维组织体内的脂肪细胞相比,显示了显著性意义上地小2倍的囊泡(图8、计数n>100个的脂肪囊泡,t检验)。另外,含有片段化胶原的三维组织体所形成的人工脂肪组织从第7天至第14天、脂肪囊泡的大小变为2倍以上(10μm±4μm),但通过以往的二维培养制得的人工脂肪组织从第7天到第14天、脂肪囊泡的大小几乎没有变化。
由以上表明,含有片段化胶原的三维组织体所形成的人工脂肪组织与通过以往的二维培养制得的人工脂肪组织相比,分化更快地进行。
(实施例3:使用了成熟脂肪细胞的人工皮肤的制造)
使用了成熟脂肪细胞的人工皮肤如图9所示的示意图那样如下地制造。
将Nippon Ham株式会社制的猪皮来源I型胶原冷冻干燥体分散于10倍浓度的磷酸缓冲生理盐水(×10PBS)中,使用匀浆机进行均质化5分钟,从而获得直径约为4.4μm、长度约为22.5μm的片段化胶原。利用无血清培养基(DMEM)对所得片段化胶原进行洗涤,获得片段化胶原的培养基分散液。
使用含有血清的培养基(DMEM),按照浓度达到10mg/mL的方式将片段化胶原分散。在24孔板Transwell(IWAKI公司制)中将所得分散液1mL(片段化胶原、相当于约10mg)和从大鼠皮下组织采集的DMEM中的1×106cells的成熟大鼠脂肪细胞混合。将培养板放到孵育箱中,培养24小时。
接着,用PBS(0.04μL/培养小室(insert))中的0.04mg/mL纤连蛋白溶液(#F2006-5G、Sigma公司制)将24孔的培养小室包被,在37℃下孵育20分钟。之后,将上述片段化胶原的培养基分散液1mL(片段化胶原、相当于约10mg)和5×105cells的人皮肤来源成纤维细胞(NHDF)混合,将100μL分配到24孔的培养小室中。将培养板放到孵育箱中,培养24小时。
接着,在上述NHDF的胶原凝胶上,抽吸培养小室中的培养基,利用PBS(0.04μL/培养小室)中的0.04mg/mL胶原IV溶液进行包被,在37℃下孵育至少20分钟。将加至NHDF的胶原凝胶上的胶原IV溶液抽吸,将2×106cells的正常人表皮角化细胞(#KK-4009、1试剂瓶=500000细胞、KURABO公司制)加至NHDF的胶原凝胶上。将1mL的DMEM 5%FBS:EpiLife(#C-2517A、Invitrogen公司制)(1:1)培养基加至培养小室的外侧,1小时后再次将1mL加至培养小室的外侧。
慢慢地将内侧和外侧的培养基抽吸,在DMEM 5%FBS:EpiLife(1:1)培养基中将抗坏血酸稀释至100倍,作为500μL的分化培养基加至培养小室的外侧。在培养小室的内侧未添加培养基。至分化第7天为止,每天更换培养小室外的培养基。
根据上述方法,从脂肪组织的培养开始仅9天的时间(脂肪组织培养24小时+成纤维细胞培养24小时+角化细胞分化7天),即可制造下部为脂肪组织的层、中间为成纤维细胞的层、上部为角化细胞的层的3层结构的人工皮肤(图9)。
对如上制造的角化细胞分化第7天的人工皮肤进行苏木素-伊红(HE)染色,进行组织学评价。上述人工皮肤显示了在下部含有脂肪细胞的层(皮下组织)、中间含有成纤维细胞的层(真皮组织)、上部含有角化细胞的层(表皮组织)的任一个层中细胞间的距离均适当,是接近生物体内的皮肤组织的结构(图10及图11)。角化细胞形成了上皮样层,还观察到作为角化细胞分化形态指标之一的去核(图11)。另外,角化细胞分化第7天的人工皮肤显示了厚度(从上皮组织的表面至最下层皮下组织的底面为止的距离)约为4.3mm,在厚度方面也重现了接近生物体内皮肤组织的厚度。
当将脂肪组织的制造中使用的脂肪细胞从1×106cells变至5×105cells时、以及将所用片段化胶原的量从10mg变至15mg时,也均显示了与上述相同的结果(图12、图13)。将角化细胞的分化时间与3层结构的人工皮肤的厚度的关系示于图14。到角化细胞的分化第3~7天,皮肤的厚度减少有所收敛,显示了停滞。
(实施例4:三维组织中的脂肪干细胞的脂肪形成促进)
利用实时定量的聚合酶链式反应(RT-qPCR)确认与实施例2同样地使用人脂肪干细胞制造的含有片段化胶原的三维组织体及通过以往的二维培养制得的人工脂肪组织体中的脂肪形成基因的表达(图15)。
使用PureLink RNA Micro Kit(Invitrogen公司制),按照试剂盒的流程,从上述三维组织体及通过以往的二维培养制得的人工脂肪组织体中抽提总RNA。使用Nanodrop(注册商标)N1000(Thermo Fisher Scientific公司制)对所抽提的RNA进行定量。使用HighCapacity RNA-to-cDNA试剂盒(Applied Biosystems公司制),按照试剂盒的流程,将1μg的RNA转换成cDNA。PCR使用iTaq(注册商标)Universal SYBR Green Supermix(BioRAD公司制)将70ng的cDNA与0.3μM的正向引物及反向引物一起扩增。所使用的各引物的序列、RT-PCR的最佳扩增循环数及温度条件示于表1。cDNA合成及RT-qPCR反应使用StepOnePlus(注册商标)实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific公司制)进行。
脂肪形成是在前脂肪细胞变成未成熟脂肪细胞时表达最初的初期脂肪形成基因(例如FABP4、PPARγ2),之后按照一边进行脂肪囊泡的脂质蓄积一边表达后期基因(例如GLUT4)的方式,从增殖阶段切换到分化阶段。初期标记物及后期标记物的表达可见在整个培养期间内逐渐地增加,但在三维组织体和通过二维培养制造的人工脂肪组织体中,发现了表达上的差异。上述含有片段化胶原的三维组织体中的mRNA量具有与通过二维培养制得的人工脂肪组织体相比更多的倾向,第7天的初期基因FABP4的表达最大为5.5倍,第21天的后期基因GLUT4的表达为8.3倍(图15)。
PPARγ2基因的表达在通过二维培养制得的人工脂肪组织体中持续地增加,但在上述三维组织体中,从第7天至第21天虽然显示了稍微增强的表达谱,但基本恒定。认为三维组织中已经处于PPARγ2恒定地表达的阶段,脂肪形成进一步进行。对于另一个初期标记物FABP4,三维组织体中从第7天至第21天大致恒定。另一方面,通过二维培养制得的人工脂肪组织体中,从第7天至第21天可见表达的增加。作为后期标记物的胰岛素刺激性GLUT-4的表达在三维组织体中从第14天开始急剧地增加,但观察到通过二维培养制得的人工脂肪组织体中的GLUT-4的表达是非常弱的。由这些结果表明,上述三维组织体与通过二维培养制得的人工脂肪组织体相比,显示了更符合分化状态的基因表达。
序列表
<110> 凸版印刷株式会社
国立大学法人大阪大学
<120> 人工脂肪组织及其制造方法、人工皮肤的制造方法以及脂肪细胞的培养试剂
<130> FP18-1021-00
<150> JP2017-217804
<151> 2017-11-10
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PPAR-γ-2 正向引物
<400> 1
gcgattcctt cactgatac 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PPAR-γ-2 反向引物
<400> 2
gcattatgag acatccccac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FABP4 (aP2) 正向引物
<400> 3
aaccttagat gggggtgtcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FABP4 (aP2) 反向引物
<400> 4
atgcgaactt cagtccaggt 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GLUT-4 正向引物
<400> 5
ttccaacaga taggctccga ag 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GLUT-4 反向引物
<400> 6
aagcaccgca gagaacacag 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RPII 正向引物
<400> 7
cttcacggtg ctgggcatt 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RPII 反向引物
<400> 8
gtgcggctgc ttccataa 18
Claims (19)
1.一种人工脂肪组织,其由三维组织体形成,该三维组织体含有包含脂肪细胞的细胞和经片段化的细胞外基质。
2.根据权利要求1所述的人工脂肪组织,其中,所述细胞外基质包含胶原。
3.根据权利要求1或2所述的人工脂肪组织,其厚度为1mm~10mm。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的人工脂肪组织,其中,所述经片段化的细胞外基质的平均长度为100nm~200μm。
5.一种人工皮肤,其含有第一层及第二层,第一层由权利要求1~4中任一项所述的人工脂肪组织形成。
6.根据权利要求5所述的人工皮肤,其中,所述第二层含有成纤维细胞。
7.根据权利要求5或6所述的人工皮肤,其进一步含有第三层,所述第三层含有角化细胞。
8.根据权利要求5~7中任一项所述的人工皮肤,其厚度为200μm~10mm。
9.一种人工脂肪的制造方法,其含有以下工序:
(1)在水性介质中使包含脂肪细胞的细胞与经片段化的细胞外基质接触的工序;及
(2)对接触了所述经片段化的细胞外基质的所述细胞进行培养的工序。
10.根据权利要求9所述的制造方法,其中,所述细胞外基质包含胶原。
11.根据权利要求9或10所述的制造方法,其中,所述经片段化的细胞外基质的平均长度为100nm~200μm。
12.一种人工皮肤的制造方法,其含有:
(1)在水性介质中使包含脂肪细胞的第一细胞与第一经片段化的细胞外基质接触的步骤;及
(2)包含对接触了所述第一经片段化的细胞外基质的所述第一细胞进行培养的步骤的形成第一层的工序;和
(3)包含进一步使第二细胞接触于所述第一层、对所述第二细胞进行培养的步骤的形成第二层的工序。
13.根据权利要求12所述的人工皮肤的制造方法,其中,所述第一经片段化的细胞外基质的平均长度为100nm~200μm。
14.根据权利要求12或13所述的人工皮肤的制造方法,其中,工序(3)是包含在所述第一层上、在水性介质中使所述第二细胞与经片段化的第二细胞外基质接触、对所述第二细胞进行培养的步骤的工序,所述第二细胞外基质包含胶原。
15.根据权利要求12~13中任一项所述的人工皮肤的制造方法,其中,所述第二细胞包含成纤维细胞。
16.根据权利要求12~15中任一项所述的人工皮肤的制造方法,其进一步含有下述工序:
包含进一步使第三细胞接触于所述第二层、对所述第三细胞进行培养的步骤的形成第三层的工序,
所述第三细胞包含角化细胞。
17.一种脂肪细胞的培养试剂,其包含经片段化的细胞外基质。
18.根据权利要求17所述的培养试剂,其中,所述经片段化的细胞外基质是平均长度为100nm~200μm的胶原。
19.一种对化合物的皮肤渗透性进行评价的方法,其含有以下工序:
准备权利要求5~8中任一项所述的人工皮肤的工序;
使受试化合物与人工皮肤接触的工序;
使用接触了所述受试化合物的人工皮肤来测定所述受试化合物的皮肤渗透性的工序;以及
将所述受试化合物的皮肤渗透性与基准值进行比较的工序。
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CN111760072A (zh) * | 2020-08-24 | 2020-10-13 | 鲁峰 | 脂肪来源的真皮内填充物及其制备和应用 |
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