JP7471579B1 - 立体細胞構造体を製造する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕立体細胞構造体を製造する方法であって、
(1)増殖能を有する元細胞と、下面、上面、及び側面により囲われた内部空間を有するキャビティーを含み、かつ培養液が前記内部空間内に循環可能であるように形成された培養チャンバーとを用意する工程と、
(2)前記元細胞を、前記培養チャンバーに供給する工程と、
(3)前記培養チャンバー全体を培養液内に保持する工程と、
(4)前記元細胞を培養して、前記元細胞と、それに由来する培養細胞と、培養中に産生された細胞外マトリックスとが一体となることで構成され、かつ前記キャビティーの外側まで成長した立体細胞構造体を形成させる工程と
を含む、方法。
〔2〕前記元細胞が、線維芽細胞及び/又は線維芽細胞分化能を有する細胞を含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔3〕前記元細胞が、スフェロイドの形態である、前記〔1〕に記載の方法。
〔4〕前記工程2が、前記キャビティーの内部空間を前記元細胞で満たす工程を含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔5〕前記元細胞を、前記立体細胞構造体の破断力が0.08N以上になるまで培養する、前記〔1〕に記載の方法。
〔6〕前記立体細胞構造体のうち前記キャビティーの外側に溢れ出した部分を回収する工程をさらに含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔7〕前記立体細胞構造体が、培養真皮を含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔8〕前記キャビティーの下面及び/又は上面が、櫛形状又は網目形状である、前記〔1〕に記載の方法。
〔9〕前記キャビティーの側面が、複数のフレームを積層して形成されたものである、前記〔1〕に記載の方法。
〔10〕前記〔1〕~〔9〕のいずれか1項に記載の方法で製造された立体細胞構造体を、表皮用部材と積層する工程を含む、人工皮膚の製造方法。
〔11〕内部に培養開始時に使用された元細胞を含み、かつ、前記元細胞と、それに由来する培養細胞と、培養中に産生された細胞外マトリックスとが一体となることで構成されている立体細胞構造体であって、
破断力が0.08N以上である、立体細胞構造体。
〔12〕前記元細胞が、線維芽細胞及び/又は線維芽細胞分化能を有する細胞を含む、前記〔11〕に記載の立体細胞構造体。
〔13〕培養真皮を含む、前記〔11〕に記載の立体細胞構造体。
〔14〕前記〔11〕~〔13〕のいずれか1項に記載の立体細胞構造体と、それに積層された表皮用部材とを含む、人工皮膚。
本発明は立体細胞構造体を製造する方法に関しており、増殖能を有する元細胞(オリジナル細胞)と、下面、上面、及び側面により囲われた内部空間を有するキャビティーを含み、かつ培養液が前記内部空間内に循環可能であるように形成された培養チャンバーとを用意する工程(工程1)を含んでいる。本明細書に記載の「立体細胞構造体」とは、細胞が複数層重なって形成された立体構造体のことをいい、細胞外マトリックスも含む培養組織のことをいう。
(1)細胞培養
通常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF;CC-2509、ロンザ社)を、FKCM培地(フコク社)に10%のウシ胎児血清(Gibco FBS、Thermo Fisher Scientific社)及び1%のペニシリン-ストレプトマイシン(シグマ-アルドリッチ社)を加えた培地で、インキュベーター(37℃、5%CO2)の中で3日間培養した。増殖した細胞を継代し、4~5継代まで培養した細胞を以降の試験に使用した。
スフェロイドをシリコンディンプルプレート(DP10-1、ティシューバイネット社)で調製した。具体的には、NHDFをTrypLE Express(Thermo Fisher Scientific社)を用いて回収し、FKCM培地を用いて1×106個/mLの細胞懸濁液を作製した。20mLの細胞懸濁液を、1プレート当たり4500個のディンプルを有するシリコンディンプルプレート(DP10-1、ティシューバイネット社)に播き、インキュベーター(37℃、5%CO2)の中で12時間培養した。その結果、直径約200μmのスフェロイドが得られた。
ネットモールドNM14-2(ティシューバイネット社)の上面及び下面には、直径100μmのステンレススチールワイヤーが100μm間隔で平行に(櫛状に)配置されており、スフェロイドは通り抜けできないように構成されている。本試験では、ネットモールドNM14-2を使用し、0.1mm厚のサイドネットを10枚重ねることで、6mm×6mm×1mmの内部空間を有するキャビティーを含む培養チャンバーを形成した。この内部空間に、常法により上記スフェロイドを供給し、この培養チャンバーを40mLのFKCM培地(10%ウシ胎児血清及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン添加)を含む120mL容量の滅菌容器(Thermo Fisher Scientific社)の中に配置した。
直径3mmに切り出した立体細胞構造体(6か月間培養したもの)を、常法によりホルマリンで固定してパラフィン包埋し、当該立体細胞構造体の中央で厚さ5μmの切片を作製した。この切片をヘマトキシリン・エオジン(HE)染色、エラスチカ・ワンギーソン(EVG)染色、又はアルシアンブルー染色に供し、あるいは、抗タイプIコラーゲン抗体又は抗タイプIIコラーゲン抗体を用いて常法により免疫染色した。
(1)破断力の測定
立体細胞構造体を6mm平方の大きさにカットし、その下から2.5mmの中央部にポリプロピレン縫合糸(糸サイズ5-0)を通し、糸の長さが5cmとなるように糸の末端を結んだ。この上側3mmの部分を破断力測定装置(EZ Test、島津製作所)の上のクランプではさみ、結んだ糸の下端を下のクランプではさんで、100mm/分の速度で培養真皮が破けるまで引っ張った。
6mmの立体細胞構造体を凍結乾燥機VD-250R(タイテック社)を用いて3日間乾燥させ、その乾燥重量を電子天秤で測定した。
コラーゲン定量アッセイキット(QuickZyme Biosciences社)を用いて、直径3mmの立体細胞構造体サンプル中のコラーゲン量を測定した。取扱説明書に従って操作し、反応試薬の570nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、コラーゲン量を算出した。
Blyscanグリコサミノグリカンアッセイキット(Biocolor社)を用いて、直径3mmの立体細胞構造体サンプル中の硫酸化グリコサミノグリカン(sGAG)量を測定した。取扱説明書に従って操作し、反応試薬の656nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、sGAG量を算出した。
WST-8による生細胞数測定試薬Cell Count Reagent SF(ナカライテスク社)を用いて、直径3mmの立体細胞構造体サンプル中の生細胞数を測定した。取扱説明書に従って操作し、試験波長450nm及び参照波長650nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定して、それらの吸光度の差を生細胞数の指標とし、立体細胞構造体中の細胞の生存状態を比較した。
(1)実験設計及び手術方法
試験例1に記載の方法で4か月培養して作製した立体細胞構造体(培養真皮)を、直径6mmの生検用パンチ(カイインダストリーズ社)で切り出し、鑷子を用いて水平方向で上下2つの立体細胞構造体に分けて動物実験に使用した。24匹のBALB/cAJcl-nu/nuマウス(オス、7週齢)(日本クレア社)を常法により飼育し、対照群、培養真皮群、及び市販人工真皮群の3群に分けた。なお、すべての苦痛を伴う作業はイソフラレン麻酔下で行った。
術後7日目及び14日目に、創傷治癒状態を評価した。各評価時点で、各群のマウス4匹ずつを二酸化炭素ガス吸入により犠牲死させ、創傷部位の肉眼観察画像をデジタルカメラで取得した。また、創傷部位のサンプルを周辺組織とともに回収して、10%ホルマリン液にて固定し、パラフィン包埋して各創傷部位の中央を軸方向に切片化した。そして、切片をHE染色、アゾカルミン-アニリンブルー(AZAN)染色、及びCD31の免疫染色に供した。
統計学的有意性は、Tukey-Kramer多重比較法を用いて評価した。データはすべて平均値±標準偏差で表されており、P<0.05のときに統計学的に有意であるとした。
図4に、手術直後、術後7日目、及び術後14日目の、創傷部位の写真を示す。創傷は痂皮で覆われていた。明らかな感染兆候は認められず、施術は適切に行われたことが確認できた。また、創傷部位をHE染色した切片の写真を図5示す。移植した培養真皮(破線で囲われた部分)の生着が確認できた。
本発明の方法に従って製造した立体細胞構造体は、創傷部位に生着し、培養真皮として機能した。線維芽細胞は血管新生を促進するサイトカインを算出することが知られており、そのため、当該立体細胞構造体を培養真皮として移植すると、その内部に血管上皮細胞や線維芽細胞などが入り込み、新生毛細血管の形成や新生上皮細胞の形成が促されたと考えられる。
試験例1に記載の方法で4か月培養して作製した立体細胞構造体を直径6mmの生検用パンチ(カイインダストリーズ社)で切り出し、鑷子を用いて水平方向で上下2つの立体細胞構造体に分けて移植用培養真皮として使用した。24ウェル細胞インサートを24ウェルプレートにセットし、その細胞インサート内に、移植用培養真皮を立体細胞構造体の最外層だった部分が上になるように入れ、その上に同じサイズで切り出した表皮細胞シート(ジェイス(R)、ジャパン・ティッシュエンジニアリング社)を重ね、10%ウシ胎児血清を加えた線維芽細胞無血清培地(FKCM)を各ウェルに0.9mLずつ添加し、37℃、5%CO2の条件で気液界面培養を行った。
試験例1の(2)と同様にしてスフェロイド形態のNHDFを調製し、大きな凝集塊(直径1000μm以上のもの)になっているものを選択した。培養チャンバーとしてネットモールドNM14-2(ティシューバイネット社)を用意し、そのステンレススチールワイヤーの間隔を縦横共に1mmに調整して、キャビティーの上にスフェロイドを等間隔に配置した(図6のa)。常法により培養チャンバーの上面をセットしてスフェロイドをキャビティーの内部空間内に押し込み、試験例1の(3)と同様にして培養した。
11 培養チャンバーのキャビティーの内部空間
2 元細胞
3 培養液
4 キャビティーの内部空間で形成された立体細胞構造体
41 キャビティーから溢れるまで成長した立体細胞構造体
411 立体細胞構造体の最外層
412 立体細胞構造体の中間層
413 立体細胞構造体の中央部分
Claims (11)
- 立体細胞構造体を製造する方法であって、
(1)増殖能を有する元細胞と、下面、上面、及び側面により囲われた内部空間を有するキャビティーを含み、かつ培養液が前記内部空間内に循環可能であるように形成された培養チャンバーとを用意する工程と、
(2)前記元細胞を、前記培養チャンバーに供給する工程と、
(3)前記培養チャンバー全体を培養液内に保持する工程と、
(4)前記元細胞を培養して、前記元細胞と、それに由来する培養細胞と、培養中に産生された細胞外マトリックスとが一体となることで構成され、かつ前記キャビティーの側面を超えて外側まで成長した立体細胞構造体を形成させる工程と
を含み、
前記元細胞が、培養中に細胞外マトリックスを産生する細胞を含む、方法。 - 立体細胞構造体を製造する方法であって、
(1)増殖能を有する元細胞と、下面、上面、及び側面により囲われた内部空間を有するキャビティーを含み、かつ培養液が前記内部空間内に循環可能であるように形成された培養チャンバーとを用意する工程と、
(2)前記元細胞を、前記培養チャンバーに供給する工程と、
(3)前記培養チャンバー全体を培養液内に保持する工程と、
(4)前記元細胞を培養して、前記元細胞と、それに由来する培養細胞と、培養中に産生された細胞外マトリックスとが一体となることで構成され、かつ前記キャビティーの外側まで成長した立体細胞構造体を形成させる工程と
を含み、
前記元細胞が、培養中に細胞外マトリックスを産生する細胞を含み、
前記工程(4)が、前記元細胞を前記立体細胞構造体の破断力が0.08N以上になるまで培養を続ける工程を含む、方法。 - 立体細胞構造体を製造する方法であって、
(1)増殖能を有する元細胞と、下面、上面、及び側面により囲われた内部空間を有するキャビティーを含み、かつ培養液が前記内部空間内に循環可能であるように形成された培養チャンバーとを用意する工程と、
(2)前記元細胞を、前記培養チャンバーに供給する工程と、
(3)前記培養チャンバー全体を培養液内に保持する工程と、
(4)前記元細胞を培養して、前記元細胞と、それに由来する培養細胞と、培養中に産生された細胞外マトリックスとが一体となることで構成され、かつ前記キャビティーの外側まで成長した立体細胞構造体を形成させる工程と
を含み、
前記元細胞が、培養中に細胞外マトリックスを産生する細胞を含み、
前記工程(4)が、前記元細胞を2か月以上培養する工程を含む、方法。 - 立体細胞構造体を製造する方法であって、
(1)増殖能を有する元細胞と、下面、上面、及び側面により囲われた内部空間を有するキャビティーを含み、かつ培養液が前記内部空間内に循環可能であるように形成された培養チャンバーとを用意する工程と、
(2)前記元細胞を、前記培養チャンバーに供給する工程と、
(3)前記培養チャンバー全体を培養液内に保持する工程と、
(4)前記元細胞を培養して、前記元細胞と、それに由来する培養細胞と、培養中に産生された細胞外マトリックスとが一体となることで構成され、かつ前記キャビティーの外側まで成長した立体細胞構造体を形成させる工程と
を含み、
前記元細胞が、培養中に細胞外マトリックスを産生する細胞を含み、
前記元細胞が、前記チャンバー内のキャビティーの内部空間よりも大きなスフェロイドの形態である、方法。 - 前記元細胞が、線維芽細胞及び/又は線維芽細胞分化能を有する細胞を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記元細胞が、スフェロイドの形態である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(2)が、前記キャビティーの内部空間を前記元細胞で満たす工程を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記立体細胞構造体のうち前記キャビティーの外側に溢れ出した部分を回収する工程をさらに含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記立体細胞構造体が、培養真皮を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キャビティーの下面及び/又は上面が、櫛形状又は網目形状であり、及び/又は、
前記キャビティーの側面が、複数のフレームを積層して形成されたものである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。 - 請求項1~4のいずれか1項に記載の方法で製造された立体細胞構造体を、表皮用部材と積層する工程を含む、人工皮膚の製造方法。
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