CZ2012678A3

CZ2012678A3 - Způsob zpracování odběrů pupečníkové krve, zpracování a uchování získané odpadní pupečníkové krve a její terapeutické využití

Info

Publication number: CZ2012678A3
Application number: CZ2012-678A
Authority: CZ
Inventors: Michal Votruba; Eva Matějková; Jakub SchĹŻrek; Hynek Piškule; Tomáš Studnička; Barbara Kubešová; Lukáš Schůrek
Original assignee: Primecell A.S.
Priority date: 2012-10-04
Filing date: 2012-10-04
Publication date: 2014-04-16
Also published as: WO2014053105A1

Abstract

Technické řešení se týká způsobu zpracování odběrů pupečníkové krve, zpracování a uchování získané odpadní pupečníkové krve a alogenního použití pupečníkové krve pro zpracování a výrobu léčivých přípravků pro moderní terapii, určených pro klinická hodnocení a následnou léčbu pacientů s vybranými onemocněními, zejména léčení Parkinsonovy nemoci, posttraumatických a ischemických mozkových a míšních lézí, pro léčení autismu a ztráty sluchu u dětí, a dále pro krytí povrchových ran a podpůrných indikací v onkologii.

Description

Způsob zpracování odběrů pupečníkové krve, zpracování a uchování získané odpadní pupečníkové krve a její terapeutické využití

Oblast techniky

Technické řešení se týká způsobu zpracování odběrů pupečníkové krve, zpracování a uchování získané odpadní pupečníkové krve a alogenního použití pupečníkové krve pro zpracování a výrobu léčivých přípravků pro moderní terapii určených pro klinická hodnocení a následnou léčbu pacientů s vybranými onemocněními.

Dosavadní stav techniky

Přes 80% úmrtí na světě je způsobeno v důsledku choroby nebo zdravotního stavu neslučitelného se životem člověka. Téměř 30% z toho způsobují kardiovaskulární onemocnění, které zaujímají první místo. Na druhém místě jsou úmrtí způsobená infekčními onemocněními (23 %), třetí místo zaujímají ischemické choroby (13 %). Rakovina je na čtvrtém místě (12%), mrtvice na pátém místě (10%). V USA, kde existují nejpřesnější statistiky nemocí a metodiky jejich léčby, je počet pacientů trpících jedním nebo více druhy kardiovaskulárních onemocněním 82,6 mil. (AHA / American Heart Association, 2012), což je 26 % populace. Z toho na koronární onemocnění srdce připadá 16,3 mil (5 % populace). Dle AHA do roku 2030 bude přes 40 % obyvatel USA trpět některým z kardiovaskulárních onemocnění. Diabetem trpí téměř 7 % populace, tedy 21,1 mil. osob (CDC / Centers for Disease Control and Prevention) a ročně je provedeno 68 tis. amputací dolních končetin vlivem následků této choroby. V roce 2012 očekává American Cancer Society přírůstek 1,6 mil. nově diagnostikovaných případů rakoviny a 577 tis. úmrtí způsobených rakovinou. Některým typem artrózy je postiženo 50 mil obyvatel (16 % populace) a do roku 2030 se očekává nárůst na 67 mil. S nezdravým životním stylem a postupujícím věkem dochází ke zvyšování četnosti výskytu uvedených onemocnění, 3 jak je patrné z předchozího odstavce, bývají velmi častými příčinami smrti.

Mimo léčbu chronických onemocnění existuje rovněž široká oblast léčby, která se zaměřuje na akutní a traumatologické stavy. Jejich četnost je výrazně nižší než u výše popsaných nemocí, ale nejčastěji jimi trpí občané v produktivním věku a rovněž děti. Rychlá a efektivní léčba je tedy nutná, neboť umožňuje navrátit zdravého jedince zpět do plnohodnotného života a pracovního procesu. V současné době je léčba výše uvedených nemocí a stavů založena na konvenčních léčivech a umělých náhražkách, které jsou kombinovány s již moderními operačními technikami. Dále dochází k rozšiřování aplikace nových léčiv, jejichž výroba je založena na biotechnologických postupech. Historicky nejmladší je však oblast nazývaná Moderní buněčná terapie (Advanced therapies). Zde vznikly první preklinické výsledky v roce 1990. Tato nová oblast medicíny dosud nedisponuje velkým množstvím klinických výsledků ve srovnání s konvenčními metodami léčby. Nicméně stávající výsledky, které Advanced therapies vykazuje, významně převyšují ty výsledky, které jsou dosaženy konvenční medicínou. Kazuistiky a klinické testy potvrzují možnost léčby dosud neléčených diagnóz.

Obor Advanced therapies si klade za cíl léčbu akutních a chronických stavů člověka nebo náhradu tkání. Zásadním dlouhodobým vědeckým cílem je prodloužení životnosti a funkce lidských orgánů, léčba rakoviny a chronických či degenerativních onemocnění. Cílem je tedy postupné prodloužení lidského života s využitím buněk.

Léčba s využitím vlastních (autologních) anebo cizích (alogenních) buněk a podpůrných regenerativních prostředků při léčbě traumat, vývojových vad, onkologických resekcí a nemocí pohybového aparátu je založena na dostupnosti nových funkčních biomateriálů a jejich klinicky relevantních forem. Nejperspektivnější skupinou budoucích biomateriálů pro regeneraci tkání, náhrady orgánů jsou syntetické biokompatibilní polymery (PLA, PGA, PEG, PHB, atd.), přírodní polymery (kolagen typu I, fibrin, chitosan, celulóza, škrob, HA, atd.) a jejich hierarchické, funkční kompozity s resorbovatelnými vrstevnatými nanočásticemi. Využití syntetických polymerů s možností řídit jejich molekulární strukturu a morfologii buněčných nosičů přímo výrobní technologií je vázáno na dosažení biokompatibility při klinické aplikaci a minimalizace dopadů produktů biodegradace na živé buňky (pH, CO2, atd.). Tyto problémy sice u přírodních polymerů odpadají, vzniká však zásadní problém v neexistenci technologií reprodukovatelné výroby nosičů z přírodních polymerů a v nedostatečných mechanických vlastnostech takových nosičů. Nanovákenné nosiče pro buněčnou terapii se začaly vyvíjet v polovině devadesátých let dvacátého století technikou zvanou elektrospinning a během té doby se podařilo vyrobit nanovlákna z většiny známých biomateriálů. Největší motivací, proč tento vývoj tak rapidně odstartoval, byla zřejmá morfologická podobnost přirozené extracelulární matrice (ECM, Extra Cellular Matrix) a nanovlákenného nosiče produkovaného elektrospinningem. ECM musí mimikovat každý nosič tkáňového inženýrství. Nosič poskytuje buňkám přechodnou mechanickou oporu, je pro buňky dostatečně „chemicky přitažlivý a je pro ně co nejméně toxický a po definovaném čase se rozpadne. Aplikace, ve kterých mají nanovlákna uplatnění jsou především kryty ran, popáleniny, umělé kůže, chrupavky, kosti, šlachy, nervy aj. Buněčné nosiče nemají jenom pasivní podpůrnou roli růstových vektorů a mechanické ochrany buněk v procesu růstu, ale jejich mechanické vlastnosti určují jak snadnost chirurgické manipulace tak, v součinnosti s řízenou adhezí buněk k nosiči, proliferaci a diferenciaci osazených buněk a morfologii jimi sekretované do ECM, a tím celé připravované tkáně / orgány. Kromě biomechanických stimulů jsou pro regeneraci a růst nových tkání podstatné i prostorové a časové biochemické stimulátory (TGF, BMP, cytokiny, chemokiny, atd.), jejichž řízené uvolňování do objemu buněčných nosičů v biologicky aktivní formě a dostatečném množství nebylo dosud dosaženo a angiogenní faktory stimulující vaskularizaci vznikajících tkání nutnou pro přežití, růst a diferenciaci buněk ve 3D nosičích.

Stejně významná je i identifikace nejvhodnějších zdrojů regeneračních buněk (autogenní, allogenní, MSM, PLSC, DPSC, zralé, embryonální, atd.) či jejich kombinací pro danou klinickou situaci. Růst tkání in vitro s následnou implantací se prosazuje především u špatně se regenerujících tkání (chrupavka, šlacha, dentin) nebo velkých tkáňových segmentů, kdežto u dobře se hojících tkání (kosti) a malých defektů se preferuje in vivo přímá implantace nosiče s buněčnými kulturami nebo i bez nich. Postup in vitro má dosud mnohem více legislativních překážek než způsob in vivo. Neexistence ověřených postupů rychlé generace vaskulárních systémů zajišťujících výživu a dýchání buněk ve větších 3D nosičích zatím omezuje jejich využití na tenké plošné struktury.

Mezi největší výzvy oboru patří vývoj reprodukovatelného způsobu přípravy větších vaskularizovatelných 3D implantátů, kombinace typů osazovaných buněk a komponent nosičů s řízeným uvolňováním léčiv a biochemických stimulantů.

Pupečníkovou krví se rozumí krev obsažená v pupeční šňůře a placentě. Pupečníková krev je zdrojem různých typů kmenových buněk, zejména hematopoetických kmenových buněk a progenitorů krvinek, ale i mezenchymálních kmenových buněk a dalších somatických kmenových buněk.

Pupečníková krev se odebírá během porodu, a dále se zpracovává. Lze ji uchovávat zmrazenou po několik let a následně využít k alogenním i autologním transplantacím.

Nejširší využití je u alogenních transplantací. Ty se uplatňují zejména u onemocnění, jako je geneticky daný typ leukémie.

Autologní transplantace se provádí u diagnóz, které vyžadují obnovu krvetvorby např. maligní aplastické anémie nebo k obnově krvetvorby po chemoterapii. Toto využití je zatím omezené tím, že se jedná o metodu relativně novou, kdy počet potenciálních příjemců, tj. těch, kteří mají uloženu vlastní autologní pupečníkovou krev, je nízký s ohledem na četnost výskytu onemocnění v této věkové skupině.

Pupečníková krev má výhodu, že je odebraná na začátku života, kdy jsou kmenové buňky ještě nezatížené aktuálně probíhajícím onemocněním.

Kmenové buňky z pupečníkové krve se také mohou uplatnit v rámci regenerativní medicíny a buněčné terapie, kdy probíhá řada experimentů a klinických studií.

Pupečníková krev se odebírá během porodu, z cévy pupeční šňůry v případě kombinovaného odběru po porodu placenty i z povrchových cév placenty. Krev je umístěna do odběrového setu a je dále zpracována. Podstatným kritériem pro další využití k alogenním transplantacím je objem odebrané krve a celkových obsah jaderných buněk.

Za vhodný se považuje odebraný objem vyšší než 100 ml, a počet jaderných buněk (TNC) více než 150 x 10⁷ buněk, a též dostatečné množství CD34+ buněk pro zajištění dobrého uchycení štěpu, kde vyšší než běžné množství zmírňuje odmítnutí štěpu organismem příjemce (GVHD, graft versus host disease).

Pupečníková krev, která nesplňuje kritéria pro alogenní neboli dárcovské transplantace, se v současnosti většinou likviduje, a tím přichází nazmar zdroj kvalitních kmenových buněk.

Předkládaný vynález řeší problematiku těchto dosud obtížně využitelných odběrů pupečníkové krve, které nevyhovují některým z kritérií pro transplantaci, popisuje způsob jejich dalšího zpracování a výrobu produktů určených pro klinická hodnocení a následnou léčbu pacientů vybraných onemocnění.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká způsobu zpracování odběrů pupečníkové krve (PK), při kterém

a) odběry pupečníkové krve se podrobí alespoň jednomu testu kvality;

b) pupečníková krev splňující kritéria alespoň jednoho z testů kvality použitého v bodu a) se zpracuje jako autologní, popř. dárcovská pupečníková krev;

c) pupečníková krev nesplňující kritéria testů kvality použitá v bodu b) pro autologní, popř. dárcovskou pupečníkovou krev, se zpracuje jako odpadní krev.

S výhodou je test kvality použitý v bodu a) zvolen ze skupiny stanovení počtu jaderných buněk TNC; stanovení množství CD34+ buněk; stanovení objemu pupečníkové krve; stanovení HLA fenotypu; stanovení krevní skupiny a Rh faktoru; stanovení krevního obrazu a vitality; sérologické vyšetření krve; a hemokultura.

Ve výhodném provedení je test kvality použitý v bodu a) zvolen ze skupiny počet jaderných buněk TNC; množství CD34+ buněk; a stanovení objemu pupečníkové krve.

Na rozdíl od použití pupečníkové krve pro transplantaci nemusí specifická další použití vyžadovat splnění všech testů kvality pro transplantaci, například odpovídajícího HLA fenotypu, shodné krevní skupiny a Rh faktoru.

Další specifické použití odpadní krve však může vyžadovat splnění jednoho nebo více dalších kritérií odlišných od kritérií, jejichž splnění vede k zařazení krve jako autologní, popřípadě dárcovské pupečníkové krve.

Testy na tato další kritéria se mohou provádět současně s testy z bodu a) výše, což je výhodné z hlediska rychlosti zpracování krve, nebo na krvi z bodu c) zařazené již do kategorie odpadní krve, což je výhodné z hlediska úspory nákladů na nevyužité testy, popřípadě kombinací obou přístupů. Vzhledem k nákladnosti testů je toto rozhodnutí velmi důležité.

V dalším provedení se tedy odpadní krev z bodu c) dále třídí na základě splnění kritérií alespoň jednoho testu kvality použitého v bodu a) odlišného od testů kvality použitých v bodu b) pro autologní, popř. dárcovskou pupečníkovou krev.

V jiném provedení se odpadní krev z bodu c) dále třídí v dalším bodu d) na základě splnění kritérií alespoň jednoho dalšího testu kvality odlišného od testů kvality použitých v bodu a).

V jednom provedení je test kvality použitý v bodu d) zvolen ze skupiny stanovení počtu jaderných buněk TNC; stanovení množství CD34+ buněk; stanovení objemu pupečníkové krve; stanovení HLA fenotypu; stanovení krevní skupiny a Rh faktoru; stanovení krevního obrazu a vitality; sérologické vyšetření krve; a hemokultura.

Další důležité provedení vynálezu se týká způsobu zpracování odběrů pupečníkové krve popsaného výše, při kterém se navíc dále provede frakcionace odpadní krve.

Frakcionace se s výhodou provádí metodami frakcionace známými v oboru, např. různými modifikacemi centrifugace jako je gradientova centrifugace, a v dalším provedení se použije odpovídající způsob frakcionace pro získání mezenchymálních kmenových buněk.

Velmi důležitým aspektem předkládaného vynálezu je možnost míchání jednotlivých odběrů pupečníkové krve. Podmínkou pro takové úspěšné míchání odpadní krve může být splnění jednoho nebo více dalších kritérií odlišných od kritérií, jejichž splnění vede k zařazení krve jako autologní, popřípadě dárcovské pupečníkové krve, a může umožnit využití i malých množství pupečníkové krve nevhodných pro transplantaci.

Další provedení způsobu zpracování odběrů pupečníkové krve popisovaného výše se tedy týká způsobu, při kterém se dále míchá odpadní krev, popř. její frakce z alespoň dvou odběrů pupečníkové krve.

Pro řadu důležitých aplikací, jako je krytí ran, se odpadní krev, popř. její frakce dále vážou na nosič.

S výhodou se jako nosiče se použije nanovláken, nanonosičů, kolagenových nosičů, hydrogelů, textilní síťky, tkáňové matrice a jejich kombinace, zejména nanovláken uchycených na mřížce z biologicky kompatibilního materiálu.

Odpadní krev a/nebo její frakce, popř. ve formě vázané na nosič, případně i smíchané z více odběrů, získané způsobem popsaným výše, jsou vhodné pro výrobu léčivých přípravků pro kardiologii a neurologii, zejména pro léčení Parkinsonovy nemoci, posttraumatických a ischemických mozkových a míšních lézí, pro léčení autismu a ztráty sluchu u dětí.

Další využití je pro krytí povrchových ran, u velkých operací a podpůrných indikací v onkologii.

Odpadní krev a/nebo její frakce, popř. ve formě vázané na nosič, případně i smíchané z více odběrů, získané způsobem popsaným výše, jsou dále například vhodné jako zdroj indukovaných pluripotentních kmenových buněk.

Odpadní PK může být ukládána v několika variantách:

i) samostatně dle jednotlivých frakcí, ii) celý štěp, iii) pouze vybrané separované frakce.

Věcně se ukládají následující materiály: i) pupečníková šňůra jako celek, ii) jednotlivé cévy, Whartonův rosol, obal pupečníku a odebraná pupečníková krev, iii) z výše uvedených složek extrahovaná specifické buňky nebo mesenchymální kmenové buňky.

Různý způsob skladování znamená i různé použití samotné PK a různé produkty.

Prioritní oblasti použití odpadní krve podle vynálezu v oblasti moderní terapie: jsou zejména: a) hojení ran, popálenin kůže (včetně hlubokých popálenin třetího stupně se ztrátou kůže v celé tloušťce), náhrada a augmentace měkkých tkání (rekonstrukční a plastická chirurgie), léčba pohybového ústrojí; banka pupečníkové krve; b) kompenzace diabetů a léčbě následků diabetů, kardiologie, mrtvice; c) oblasti onkologické a neurologické.

Jako nosičů pro terapeutické využití odpadní krve lze použít nanonosiče, kolagenové nosiče, hydrogely, textilní síťku, tkáňový matrix a kombinaci výše uvedených.

Terapeutické využití kmenových buněk z odpadní krve s nosičem se uplatňuje zejména v hojení ran a popálenin, ke krytí povrchových ran a u velkých operací, v kardiologii a neurologii. V neurologii se jedná zejména o neurální poškození, Parkinsonovu nemoc, mozkové a míšní léze posttraumatické a ischemické, ale i léčbu autismu a ztráty sluchu u dětí.

Terapeutické využití bez použití nosiče je pak např. pro autoimunitní aplikace např. cukrovku (diabetes mellitus) I a II typu, amyotrofickou laterální sklerózu, ale i alopecii (ztrátu vlasů) a lupénku.

Kmenové buňky získané z odpadní PK lze používat v řadě podpůrných indikací v onkologii,.

Odpadní PK lze použít jako zdroj indukovaných pluripotentních kmenových buněk.

Příklady provedení vynálezu

Obecné zásady zpracování pupečníkové krve

Odběr vzorků z PK, případná úprava objemu (viz dále) a další manipulace jsou prováděny v uzavřeném systému, dimethylsulfoxid při přípravě kryokonzervačního roztoku je přidáván přes bakteriologický filtr. Rozplnění vzorků pro zmrazení se provádí v boxu s laminárním prouděním vzduchu třídy čistoty A za dodržení zásad aseptického způsobu práce.

Zpracování pupečníkové krve podle potřeby dále zahrnuje frakcionaci krve metodami jako je centrifugace.

Odběr vzorků a testy

Provede se odběr vzorků a jeden nebo více z následujících testů a stanovení postupy známými v oboru:

- počet jaderných buněk TNC

- množství CD34+ buněk

- stanovení objemu pupečníkové krve

- stanovení HLA fenotypu

- krevní skupina a Rh faktor

- krevní obraz a vitalita metodou barvení buněk trypanovou modří

- sérologické vyšetření krve matky

- hemokultura

Oddělení odpadní krve na základě kritéria počtu buněk TNC

Je-li počet buněk TNC vyšší než 150 x 10⁷ buněk, krev se použije pro další zpracování jako odpadní krve.

Oddělení odpadní krve na základě kritéria počtu buněk CD34+

Neobsahuje-li odebraná pupečníková krev dostatečné množství CD34+ buněk pro zajištění dobrého uchycení, krev se použije pro další zpracování jako odpadní krve.

Oddělení odpadní krve na základě kritéria objemu odebrané krve

Je-li objem odebrané pupečníkové krve spolu s antikoagulačním roztokem 100 ml až 134 ml, toto množství suspenze můžete zpracovat přímo, bez předchozí úpravy objemu. Úprava nadměrného objemu odebrané krve se provede odsátím přebytečného množství plazmy

Je-li objem odebrané pupečníkové krve spolu s antikoagulačním roztokem menší než 100 ml, není doporučeno tuto krev uchovávat. Taková krev se použije pro další zpracování jako odpadní krve.

Oddělení odpadní krve na základě nesplnění jiných kritérií

Není-li splněno některé vybrané kritérium zvýše uvedených, popř. dalších kritérií, popř. jejich kombinace, krev se použije pro další zpracování jako odpadní krve.

Likvidace pupečníkové krve

V případě pozitivního sérologického vyšetření pupečníkové krve např na HBsAg nebo HIV je po zpracování a zamražení provedena likvidace.

Kryokonzervace

Pupečníkové krev (= buněčná suspenze) je smíchána s kryoprotektivním roztokem a řízené zmrazená na teplotu -175 °C. Tímto postupem je zachována viabilita buněk v suspenzi.

Kryoprotektivním roztokem je DMSO o výsledné koncentraci 10%. Výchozím materiálem je 100% roztok DMSO dodávaný v lékovkách s propichovací pryžovou zátkou po 10 ml. Z tohoto koncentrátu je připraven 30% roztok DMSO v 5% albuminu, a tento je pak smíchán se zmrazovanou suspenzí v poměru 2/3 suspenze, 1/3 DMSO (30%), což poskytne výslednou koncentraci 10% DMSO ve zmrazované suspenzi. DMSO je pro buňky toxický a jeho toxicita se zvyšuje s rostoucí teplotou, proto je míchání DMSO s buněčnou suspenzí prováděno při teplotě 04°C. Bezprostředně poté je směs zmrazená.

Míchání pupečníkové krve

Bylo smícháno 6 odběrů pupečníkové krve 20 ml, 33 ml, 51 ml a 89 ml, které nesplňovaly kritérium objemu pupečníkové krve, ale splňovaly kritéria testu na vitalitu metodou barvení buněk trypanovou modří a byly negativní na protilátky proti hepatitidě, HIV a syfilidě při sérologickém vyšetření krve za využití např. RR testu a TPHA testu.

Ze smíchané krve byly izolovány kmenové buňky metodou gradientově centrifugace a izolát byl přímo použit pro přichycení na nanovlákennou mřížku.

Terapeutické použití s nosičem

Mezenchymální kmenové buňky z PK podle vynálezu byly použity ve vrstvě nanovláken pro krytí povrchových ran. K tomuto účelu byla použita mřížka z biologicky kompatibilního materiálu, jejíž vnitřní prostor byl vyplněn vrstvou nanovláken. Jako nosná mřížka byla použita monofilamentární osnovní pletenina z nebarveného hedvábí a jako vrstva biologicky kompatibilních polymerních nanovláken byl použit zvláknitelný polymer na bázi želatiny.

Tato vrstva obsahovala růstový faktor, jako aktivní látku pro stimulaci kultivace, a antiseptikum k zabránění zanesení nežádoucích mikroorganismů.

Před aplikací mezenchymálních kmenových buněk byl nosič sterilizován gama zářením. Mezenchymální kmenové buňky z odpadní pupečníkové krve podle vynálezu byly pak naneseny na sterilizovaný nanonosič pipetou ve formě suspenze v živném roztoku.

Po uložení tyto buňky přilnuly k polymerním nanovláknům a v průběhu pětidenní kultivace vytvořily více vrstev. Kultivační médium bylo měněno jedenkrát denně. Po ukončení kultivace byl nanonosič vyjmut z kultivačního média a přebytek tohoto média z něj byl odstraněn okapáním.

Průmyslová využitelnost

Způsob zpracování a uchování odpadní pupečníkové krve podle předmětného řešení je možno využít ke zpracování a uchování odpadní pupečníkové krve a alogenní použití pupečníkové krve pro zpracování a výrobu léčivých přípravků pro moderní terapii určených pro klinická hodnocení a následnou léčbu pacientů vybraných onemocnění.

Prioritní oblasti zájmu v oblasti moderní terapie jsou zejména: a) hojení ran, popálenin kůže (včetně hlubokých popálenin třetího stupně se ztrátou kůže v celé tloušťce), náhrada a augmentace měkkých tkání (rekonstrukční a plastická chirurgie); léčba pohybového ústrojí; banka pupečníkové krve; b) kompenzace diabetů a léčbě následků diabetů, kardiologie, mrtvice; c) oblasti onkologické a neurologické.

Claims

Patentové nároky

1. Způsob zpracování odběrů pupečníkové krve, vyznačující se tím, že

a) odběry pupečníkové krve se podrobí alespoň jednomu testu kvality;

b) pupečníkové krev s splňující kritéria alespoň jednoho z testů kvality použitého v bodu a) se zpracuje jako autologní, popř. dárcovská pupečníkové krev;

c) pupečníkové krev nesplňující kritéria testů kvality pro autologní, popř. dárcovskou pupečníkovou krev, použitá v bodu b), se zpracuje jako odpadní krev.
2. Způsob zpracování odběrů pupečníkové krve podle nároku 1, vyznačující se tím, že test kvality použitý v bodu a) je zvolen ze skupiny stanovení počtu jaderných buněk TNC; stanovení množství CD34+ buněk; stanovení objemu pupečníkové krve; stanovení HLA fenotypu; stanovení krevní skupiny a Rh faktoru; stanovení krevního obrazu a vitality; sérologické vyšetření krve; a hemokultura.
3. Způsob zpracování odběrů pupečníkové krve podle nároku 1, vyznačující se tím, že test kvality použitý v bodu a) je zvolen ze skupiny počet jaderných buněk TNC; množství CD34+ buněk; a stanovení objemu pupečníkové krve.
4. Způsob zpracování odběrů pupečníkové krve podle nároku 1, vyznačující se tím, že odpadní krev z bodu c) se dále třídí na základě splnění kritérií alespoň jednoho testu kvality použitého v bodu a) odlišného od testů kvality pro autologní, popř. dárcovskou pupečníkovou krev, použitých v bodu b).
5. Způsob zpracování odběrů pupečníkové krve podle nároku 1, vyznačující se tím, že odpadní krev z bodu c) se dále třídí d) na základě splnění kritérií alespoň jednoho dalšího testu kvality odlišného od testů kvality použitých v bodu a).
6. Způsob zpracování odběrů pupečníkové krve podle nároku 5, vyznačující se tím, že test kvality použitý v bodu d) je zvolen ze skupiny stanovení počtu jaderných buněk TNC; stanovení množství CD34+ buněk; stanovení objemu pupečníkové krve; stanovení HLA fenotypu; stanovení krevní skupiny a Rh faktoru; stanovení krevního obrazu a vitality; sérologické vyšetření krve; a hemokultura.
7. Způsob zpracování odběrů pupečníkové krve podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se dále provede frakcionace odpadní krve.
8. Způsob zpracování odběrů pupečníkové krve podle nároku 7, vyznačující se tím, že se použije odpovídající způsob frakcionace pro získání mezenchymálních kmenových buněk.
9. Způsob zpracování odběrů pupečníkové krve podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se dále míchá odpadní krev, popř. její frakce z alespoň dvou odběrů pupečníkové krve.
10. Způsob zpracování odběrů pupečníková krve podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že odpadní krev, popř. její frakce se dále vážou na nosič.
11. Způsob zpracování odběrů pupečníkové krve podle nároku 9, vyznačující se tím, že jako nosiče se použije nanovláken, nanonosičů, kolagenových nosičů, hydrogelů, textilní síťky, tkáňové matrice a jejich kombinace, zejména nanovláken uchycených na mřížce z biologicky kompatibilního materiálu.
12. Použití odpadní krve a/nebo její frakce, popř. ve formě vázané na nosič, získaných způsobem podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, pro výrobu léčivých přípravků pro kardiologii a neurologii, zejména pro léčení Parkinsonovy nemoci, posttraumatických a ischemických mozkových a míšních lézí, pro léčení autismu a ztráty sluchu u dětí.
13. Použití odpadní krve a/nebo její frakce, popř. ve formě vázané na nosič, získaných způsobem podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, pro krytí povrchových ran, u velkých operací a podpůrných indikací v onkologii.
14. Použití odpadní krve a/nebo její frakce, popř. ve formě vázané na nosič, získaných způsobem podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, jako zdroj indukovaných pluripotentních kmenových buněk.