KR102201546B1 - 세포가 적재된 생체 이식용 무세포 진피층 및 이의 제조방법 - Google Patents

세포가 적재된 생체 이식용 무세포 진피층 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 구형의 군체를 이루는 세포 및 상기 구형의 군체가 적재된 무세포 진피 기질을 포함하는 생체 이식용 무세포 진피층 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 생체 이식용 무세포 진피층은, 이식되는 생체조직에 세포를 효과적으로 전달할 수 있다.

Description

세포가 적재된 생체 이식용 무세포 진피층 및 이의 제조방법{ACELLULAR DERMAL MATRIX LAYER FOR LIVING TRANSPLANT LOADED WITH CELLS AND METHOD FOR PREPARING SAME}
본 발명은 세포가 적재된 생체 이식용 무세포 진피층에 관한 것으로 더욱 상세하게는, 구형의 군체를 이루는 세포 및 상기 구형의 군체가 적재된 무세포 진피 기질을 포함하는 생체 이식용 무세포 진피층 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
성체 줄기 세포의 광범위한 분화 잠재력과 상이한 세포 사이의 전환 가능성의 입증 이후, 다양한 연구자들은 공여 세포를 수득하고 조직 재생을 위해 주사함으로써 성체 줄기 세포의 임상 적용에 유망한 결과를 보여주었다. 그러나, 이는 전달된 세포의 생착 및 열악한 생식환경으로 인해 이식된 세포 생존율이 1 % 정도까지 낮게 나타나는 등 제한된 임상적 효과를 나타냈다. 이는 배양 접시에서 세포 분리로 인한 손상, 주사기 및 바늘에 의한 손상, 염증 매개체가 있는 새로운 가혹한 환경 조건, 산소 및 영양의 부족, 세포 부착능의 부족, 유도된 아폽토시스(anoikis), 기계적 손실 등의 원인에 기한 것이다.
연조직의 복구에서 성체 줄기 세포를 임상적으로 적용하기 위해, 상기 문제들은 전달 접근법, 운반체 특성 및 적재된 세포에 의해 해결될 수 있다. 세포는 특히 봉합사로 외과적으로 고정될 수 있는 경우에 보다 정확하게 표적에 외과적으로 전달될 수 있다. 이식수혜부의 적대적인 환경을 개선하기 위해 세포 전달과 동시에 외과적으로 죽은 조직의 절제(또는 변연 절제) 및 재혈관화를 수행하여 신선한 조직에서 세포 생존을 증가시킬 수 있다. 세포운반체(carrier)의 경우, 연조직과 성질(물성 또는 기계적 성질)이 유사해야 한다. 수술 부위는 외부와 통해있는 상처가 있기 때문에, 운반체와 연조직 사이의 기계적 성질의 불일치는 운반체의 이동, 압출 및 조직 손상을 초래할 수 있다. 운반체는 외부 근원 물질 또는 이종물질에서 유래하지 않고 화학적 또는 생물학적 변형으로부터 잔류물이 없는 경우에 더 적합하게 이용될 수 있다. 이러한 적합성은 운반체 자체가 면역 문제를 야기하여 환자 안전에 대한 우려를 발생시킬 수 있으며, 임상 적용에 대한 승인이 요구되고, 전달되는 세포를 손상시킬 수 있기 때문에 반드시 고려되어야 한다. 운반체로서, 물질은 운반되는 세포를 고정시키고, 이를 표적 조직으로 방출해야 한다. 따라서, 운반체는 가능한 많은 세포의 운반 능력을 유지하는 것이 좋다. 세포의 전달 시 효소적 처리를 피하고 세포 외 매트릭스를 보존하는 것은 세포의 생존을 개선하는 데 필수적이다. 줄기 세포 운반체로서 이러한 요건을 동시에 충족시키기는 어렵다.
따라서 세포의 운반을 위한 대체적 이식 방법이 요구된다.
본 발명의 목적은 세포의 형태 및 성질을 잃지 않고 생체조직에 전달할 수 있는 생체 이식용 무세포 진피층을 제공하기 위함이다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 미세포어가 형성된 무세포 진피 기질 및 상기 무세포 진피 기질 상에 적재되는 세포를 포함하고, 상기 세포는 구형의 군체를 이루어 상기 무세포 진피 기질에 적재되는 생체 이식용 무세포 진피층이 제공된다. 바람직하게, 상기 세포는 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 미세포어의 크기는 150 ~ 200 ㎛일 수 있으며, 상기 구형의 군체는 200 ~ 300㎛ 크기로 형성될 수 있다. 또한, 상기 구형의 군체는 상기 미세포어에 안착될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면 무세포 진피 기질의 두께는 176.4 ± 14.9 ㎛인 생체 이식용 무세포 진피층이 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 지방 유래 줄기세포를 삼차원(3D) 세포 배양 접시에 접종 후 배양하여 지방 유래 세포의 구형 군체(Spheroid)를 형성하는 단계, 무세포 진피기질을 제1 커버슬립 상에 배치하는 단계, 상기 구형의 군체를 상기 무세포 진피기질에 접종하는 단계 및 무세포 진피 기질 상에 제2 커버슬립을 덮는 단계를 포함하는, 생체 이식용 무세포 진피층의 제조방법이 제공될 수 있다. 이때, 무세포 진피기질은 박막 절편(thin sectioning)화하여 176.4 ± 14.9 ㎛의 두께로 제조될 수 있다.
본 발명의 생체 이식용 무세포 진피층은, 세포를 적재하여 적재된 세포의 형태 및 성질을 잃지 않고 생체조직에 전달할 수 있다.
또한, 생체 이식용 무세포 진피층은 무세포 진피 기질에 화학적 처리하지 않아 이식 시 면역 반응이 일어나지 않는 이점이 있다.
본 발명에 따른 생체 이식용 무세포 진피층은 적재된 세포의 전달 효과가 우수하다. 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 이식용 무세포 진피층은 지방유래줄기세포를 생체조직에 효과적으로 전달할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 구형 세포 군체(Spheroid)의 적재(loading) 과정을 도식화한 것이다.
도 2의 A, B 및 C는 본 발명의 일 실시예에 따른 무세포 진피기질 박편의 표면을 이미지화한 것이며, 도 2의 D는 마이크로 CT(micro-CT)를 이용하여 무세포 진피기질(ADM) 표면의 미세포어를 이미지화한 것이고, 도 2의 E는 무세포 진피기질 내부 미세포어의 직경의 분포도이며, 도 2의 F는 무세포 진피기질 박편(tsADM)의 표면 미세포어의 이미지다.
도 3의 A는 3 차원 (3D) 세포 배양 접시의 이미지, 도 3의 B 및 C는 3 차원 (3D) 세포 배양 접시에 배양된 구형 군체(Spheroid)의 이미지이다.
도 4의 A는 압축이 풀린 구형 군체(Spheroid)의 이미지이며, 도 4의 B는 압축된 구형 군체(Spheroid)의 이미지, 도 4의 C는 구형 군체(Spheroid)를 커버슬립 사이에서 48시간 동안 배양한 후, 공초점 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 5의 A는 유리 커버슬립 상에서 48시간 동안 배양된 구형 군체(Spheroid)를, 도 5의 B는 유리 커버슬립 사이에서 48 시간 동안 배양된 구형 군체(Spheroid)를, 도 5의 C는 유리 커버슬립 사이의 무세포 진피기질 박편(tsADM) 상에 배양된 구형 군체(Spheroid)를 관찰한 이미지이다.
도 6은 무세포 진피기질 박편(tsADM)에 적재(loading)된 구형 군체(Spheroid)를 관찰한 이미지이며, 도6의 상단은 상부 커버슬립 없이 배양한 구형 군체(Spheroid), 도6의 b는 상부 커버슬립을 이용하여 배양한 구형 군체(Spheroid), 도6의 C는 배양 7일 차에 상부 커버슬립을 제거한 구형 군체(Spheroid)의 이미지이다.
도 7의 A는 상부 커버슬립 없이 배양된 구형 군체(Spheroid)를, 도 7의 B는 상부 커버슬립이 존재하는 상태에서 배양된 구형 군체(Spheroid)를, 도 7의 C는 콜라겐 다발에 형태를 유지하며 부착되어 있는 구형 군체(Spheroid)를 공초점 현미경으로 관찰한 이미지다.
도 8은 구형 군체(Spheroid)가 적재(loading)된 무세포 진피기질 박편(tsADM)을 3일, 6일동안 배양한 뒤 각각 120, 150, 200rpm 속도로 회전 진탕하였을 때 무세포 진피층 박편에서 분리된 구형 군체(Spheroid)의 백분율을 평가한 도표이다.
도 9의 A는 누드 마우스(nude mice)의 피부 및 피하층을, 도 9의 B 및 D는 세포 시딩(seeding)된 무세포 진피기질 박편(tsADM)을 이식한 누드 마우스(nude mice)의 피부 및 피하층을, 도 9의 C 및 E는 구형 군체(Spheroid)가 적재(loading)된 무세포 진피기질 박편(tsADM)을 이식한 누드 마우스(nude mice)의 피부 및 피하층의 이미지이다.
도 10의 A는 세포가 시딩(seeding)된 무세포 진피기질 박편(tsADM) 및 구형 군체(Spheroid)가 적재(loading)된 무세포 진피기질 박편(tsADM)의 이식 후 전체 세포의 수를 비교한 도표이며, 도 10의 B는 전체 세포당 인간-핵 양성 세포(human nuclei-positive cells)의 평균 백분율을 비교한 도표이다.
이하, 본 발명의 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.
본 발명의 "생체 이식용 무세포 진피층"은 미세포어가 형성된 무세포 진피 기질 및 상기 무세포 진피 기질 상에 적재되는 세포를 포함하고, 상기 세포(본 발명의 일 실시예에 따르면 지방 유래 줄기세포)는, 구형의 군체를 이루어 상기 무세포 진피 기질에 적재될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포는 지방유래 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 상기 세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell), 내피세포(endothelial cell)일 수 있다. 또한, 상기 무세포 진피 기질은 박편화된 무세포 진피기질 박편일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "무세포 진피기질(Acellular Dermal Matrix, 이하 ADM)"이란, 생체 조직(바람직하게는 피부 조직)으로부터 분리된 진피 기질에서 면역거부반응을 일으킬 수 있는 세포를 제거한 진피 기질을 의미하며, 콜라겐과 엘라스틴이 주성분을 이룬다.
본 명세서에서 사용된 용어 "지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell, 이하 ASC)"는 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포 등 대부분의 중간엽 세포로 분화할 수 있는 지방조직으로부터 분리된 줄기세포로서, 지방전구세포, 기질세포, 다분화능 지방유래세포(multipotent adipose-derived cells) 또는 지방유래 성체줄기세포(adipose derived adult stem cells) 등의 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "미세포어"는, 무세포 진피기질(또는 무세포 진피기질 박편)에 형성되는 공극, 즉 작은 구멍을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "구형 군체(Spheroid)"는 다수개의 세포(본 발명의 일 실시예에 따르면 지방유래 세포)가 구형으로 군집을 이룬 형태를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 미세포어의 크기는 150 ~ 200 ㎛일 수 있으며, 상기 구형의 군체는 200 ~ 300 ㎛ 크기로 형성될 수 있다. 이에 따라 상기 구형의 군체는 상기 미세포어에 안착될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면 무세포 진피 기질의 두께는 176.4 ± 14.9 ㎛인 생체 이식용 무세포 진피층이 제공된다. 본 발명에서 무세포 진피 기질 박편(이하, tsADM이라 한다)은, 박막 절편화(thin sectioning)한 무세포 진피기질을 의미한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 지방 유래 줄기세포를 3D 세포 배양 접시에접종 후 배양하여 지방 유래 세포의 구형 군체(Spheroid)를 형성하는 단계, 무세포 진피 기질을 제1 커버슬립 상에 배치하는 단계, 상기 구형의 군체를 상기 무세포 진피 기질에 접종하는 단계 및 무세포 진피 기질 상에 제2 커버슬립을 덮는 단계를 포함하는, 생체 이식용 무세포 진피층의 제조방법이 제공될 수 있다. 이때, 상기 구형의 군체 접종 전 무세포 진피 기질을 박막 절편화하여 무세포 진피 기질 박편을 제조하는 단계가 더 포함될 수 있다. 상기 무세포 진피기질 박편(tsADM)은 176.4 ± 14.9 ㎛의 두께로 절편화될 수 있다.
다량의 세포를 체내에 전달할 때, 가장 가까운 모세관으로부터 100 ~ 200 ㎛내의 세포만이 생존할 수 있어 확산이 제한된다. 가공한 혈관 조직 구성체에 대한 다수의 연구가 있지만, 이들을 임상적으로 적용하기 위해서는 추가적인 연구가 필요하다. 그러나 직경이 200 내지 300㎛인 구형의 세포 군체(spheroid)는 혈관 구조없이 생존할 수 있기 때문에, 세포 전달에 용이하게 이용될 수 있다. 구형의 세포 군체(spheroid)는 배양 접시에서 세포의 효소적 분리로 인한 세포의 손상을 방지하고, 세포 전달 능력을 높이며, 저산소증에 대해 전처리될 수 있으며, 세포외 기질 (ECM) 및 세포의 기능을 보존할 수 있다. 더 나아가 구형의 세포 군체(spheroid)는 구성을 이루는 세포의 능력이 유지되어 소형의 조직 구조물로서 큰 잠재력을 나타내며, 기존의 2 차원 (2D) 배양 조건으로는 연구할 수 없는 암 분화, 약물 스크리닝, 오가노이드(organoids)등 기능 연구에 널리 사용될 수 있다. 그러나 구형의 세포 군체(spheroid)의 취급은 쉽지 않다. 구형의 세포 군체(spheroid)의 형성은 세포간 상호 작용이 세포-기질간 상호 작용보다 우세한 환경에서 자발적으로 일어난다. 따라서, 구형의 세포 군체(spheroid)가 서로간 또는 조직 배양 플라스틱 또는 ECM과 같은 세포 접착 표면과 접촉할 때, 구형의 세포 군체(spheroid)는 서로 융합되어 세포 접착 표면에 퍼진 세포 덩어리를 형성하여 구형의 입체(3D) 구조를 잃는다. 이러한 특성으로 인해, 구형의 세포 군체(spheroid)는 수집, 운반을 위해 하이드로 겔 운반체 기질에 적재(loading)된다. 상기 하이드로 겔 구조물은 외력으로 인해 쉽게 변형되고 움직이게 되는 문제가 있다. 이러한 이유로 구형의 세포 군체(spheroid)는 주로 생체 내 적용에 사용되지 않고 체외 기능 연구에 사용되었다.
상기 문제를 극복하기 위해 본 발명의 연구자들은 계란 상자에 놓인 계란과 비슷한 방식으로 여러 개의 구형 군체(spheroid)를 무세포 진피기질 박편(tsADM)의 미세포어(구멍)와 그루브에 삽입했다. 연결 섬유가 있는 진피의 콜라겐 다발은 랭거라인(Langer lines)에 정렬되기 때문에, 본 발명의 연구자들은 건조된 ADM를 얇게 절편(thin sectioning)화하여 구형 군체(spheroid)를 안착시켰다. 미세구조의 분석에서도 구형의 세포 군체(spheroid)의 반구가 안착되는 무세포 진피기질 박편(tsADM)에서 미세포어는 더 큰 직경 분포를 나타냈다. 확산 거리를 최소화하고 지지물질에 대한 결합을 줄이기 위해, 구형 군체(spheroid)의 반구 부분은 주변 환경에 노출되는 반면, 반대의 반구는 구상 구조를 지지하는 무세포 진피기질 박편(tsADM)에 안착되어 최소한의 면역원성을 갖는다. 이러한 방식으로, 다수의 구형 군체(spheroid)가 혈관 구조 없이 표적 조직에 전달되고, 봉합사로 고정될 수 있다. 이러한 무세포 진피기질 박편(tsADM)은 수용부위에 예비혈관화(pre-vascularization)없이 부분층- 피부 이식되는 것을 임상적으로 입증했다.
또한, 무세포 진피기질 박편(tsADM)은 자연적으로 얽힌 콜라겐 다발 구조를 가지며 봉합사 고정을 유지하기에 충분히 견고하다. 그러나, 구형 군체(spheroid)가 무세포 진피기질 박편(tsADM) 표면으로 이동할 때, 구형 군체(spheroid)의 특성으로 인해 입체구조를 잃을 수 있다. 이는 구형 군체(spheroid)의 세포가 확산이동하여 무세포 진피기질 박편(tsADM)의 콜라겐 다발에 부착되기 때문이다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 본 연구자들은 약한 세포 부착력을 갖는 표면(본 발명의 일 실시예에 따르면 커버 슬립)을 제공하여 구형 군체(spheroid) 상단의 세포가 약하게 부착되도록 유도하여 하방의 콜라겐으로 확산이동(spread out)하지 않도록 하고, 구형 군체(spheroid) 하단의 세포는 콜라겐 다발과 부착되도록 하는 새로운 접근법을 개발했다. 본 발명의 연구자는 구형 군체(spheroid)의 가소성(plasticity)을 시험하기 위해, 커버슬립(coverslip) 사이에서 압축 및 생존에 대한 실험을 실시하였으며, 그 결과 구형 군체(spheroid)는 뛰어난 적응성(생존력 및 가소성)을 보였다. 즉, 상기와 같은 방식으로 구형 군체(spheroid)를 약한 세포 부착력을 갖는 표면에 적재하는 경우, 구형 군체(spheroid)는 확산이동(spread out)하지 않고, 그 모양을 유지하면서 무세포 진피기질 박편(tsADM)에 단단히 부착될 수 있음을 알 수 있다. 약한 접착성 표면(커버 슬립)에 대한 구형 군체(spheroid) 상단의 부착은 배양 2주 동안 구형 군체(spheroid)의 형태를 유지할 수 있도록 한다. 배양 일주일 후에 상단 커버슬립(coverslip)를 제거하면, 구형 군체(spheroid)의 세포는 예상대로 퍼진다. 이는 본 발명에서 구형 군체(spheroid)의 형태를 유지하기 위한 커버슬립(coverslip)의 역할을 나타낸다.
반면, 회전 진탕기(orbital shaker)를 이용하여 전단 응력을 시험한 결과, 구형 군체(spheroid)의 무세포 진피기질 박편(tsADM)에 대한 부착은 배양 3일 후 보다 6일 후에 더 안정적이었다. 상기 무세포 진피기질 박편(tsADM) 구조물은 외과적으로 이식되어 상처 치유가 될 때까지 절개면 사이의 전단 응력을 견뎌낸다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 액체상 또는 하이드로 겔 기반의 이식과 달리, 구형 군체(spheroid)가 견고하게 전달될 수 있음을 의미한다. 누드 마우스의 옆구리 피부에 이식된 상기 무세포 진피기질 박편(tsADM) 구조물은 이동되거나 접히지 않았다. 본 발명의 생체 이식용 무세포 진피층을 이용하는 경우, 세포-시딩(seeding)된 무세포 진피기질 박편(tsADM)의 이식 방법보다 이식되는 세포(본 발명의 일 실시예에 따르면 ASC) 양이 2.95배 더 많은 것으로 나타났으며, 종래 기술보다 세포(바람직하게는 ASC)의 이식 후 생존율이 더 좋음을 알 수 있다. 세포 현탁액 또는 구형 군체(spheroid)로 누드 마우스에 주사된 인간의 ASC는 이식한 후 3주 시점에서 검출되지 않았다. ASC가 시딩(seeding)된 무세포 진피기질은 쥐 피부 손상 모델에서 줄기 세포 생착과 국소 부분에서의 차이가 나타난다. 그러나 상기 모델에서, 전달된 세포의 수는 측정되지 않으며 단지 몇몇의 생착된 세포가 나타난다. 본 발명에서 세포의 입체(3D) 배열은 세포간 상호 작용의 증가를 보여주었으며, 생체 내 환경에서 더 나은 적응력을 나타냈다. 구형의 ASC 군체(spheroid)의 배양은 혈관 신생, 아폽토시스 억제, 항염증성 분자의 분비, 저산소증-내성 단백질 및 ECM 성분 보존의 발현을 향상시킬 수 있다. 즉, 구형의 ASC 군체(spheroid)는 세포 증식을 촉진하고 치료 효과를 증대시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 구형의 ASC 군체(spheroid)의 형태를 유지하면서 구형의 ASC 군체(spheroid)를 무세포 진피기질 박편(tsADM)에 단단히 적재할 수 있다. 본 발명의 구형 ASC 군체(spheroid)는 형태를 유지하여 생체 이식 시 ASC의 생존능을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 구형의 ASC 군체(spheroid)가 무세포 진피기질 박편(tsADM) 운반체와 대량으로 이식되는 경우, 구형의 ASC 군체(spheroid) 특성을 매개하거나 세포 생존을 개선시키는 분자의 시그널링(signaling)은 단일 구형의 ASC 군체(spheroid)의 시그널링(signaling)과 상이할 수 있다.
본 발명에 따르면, 무세포 진피기질 박편(tsADM)의 독특한 콜라겐 다발 구조는 구형의 ASC 군체(spheroid)를 무세포 진피기질 박편(tsADM) 에 단단히 적재하는 역할을 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 수술용 세포 전달을 위한 구형의 군체(spheroid)가 적재(loading)된 무세포 진피기질 박편(tsADM) 운반체가 제공된다. 또한 본 발명은 무세포 진피기질 박편(tsADM)에 다수 개의 구형의 군체(spheroid)를 적재(loading)할 때 세포 부착성 표면(본 발명의 일 실시예에 따르면 커버 슬립)을 이용하여 구형의 군체(spheroid) 형태를 유지하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 무세포 진피층(본 발명의 일 실시예에 따르면 지방 유래 줄기세포가 적재된 생체 이식용 무세포 진피기질 박편)은 이식 부위에서 이동되지 않으며, 세포를 시딩(seeding)한 무세포 진피기질 박편(tsADM)보다 이식 부위에 생존된 세포를 더 많이 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 무세포 진피층(본 발명의 일 실시예에 따르면 지방 유래 줄기세포가 적재된 생체 이식용 무세포 진피기질 박편)의 제조방법은 간단하며, 수많은 세포 조합이 가능하므로 다양한 세포 전달 패치에 용이하게 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 무세포 진피층을 이용하여 세포가 전달되는 생체조직은 신체의 피부, 연조직, 뼈, 장기를 의미하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명은 심근 경색 후 심근 복원에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 제조된 무세포 진피층은 화상, 궤양 등에 의한 피부 복원제, 전층 피부 재건제, 비중격 재건제, 뇌척수 경막결손창의 재건제, 함몰교정제, 반흔교정제, 반안면 위축 교정제 등 피부과, 성형외과, 흉부외과, 부인과, 외과, 신경외과, 비뇨기과, 이비인후과 영역의 치료용으로 사용될 수 있으나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 “피부 외용제 조성물”은 일반적으로 피부 외용에 사용하는 조성물 전반을 포괄하는 개념이며, 예를 들어 약학 조성물 또는 화장료 조성물일 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예에 따라 본 발명을 자세히 설명하도록 한다.
<실시예 1>
무세포 진피기질 박편(tsADM)의 제조
두꺼운 형태의 인간 무세포 진피 기질(Acellular dermal matrix, 이하 ADM, 대한민국 경기도, CGBio, CGDerm Implant)을 사용하여 구형 군체의 담체를 생성한다. 상기 ADM은 세포를 함유하지 않으며, 멸균 및 동결 건조된 직경 12mm, 두께 3-4mm의 인간의 진피를 이용한다. 상기 ADM을 크라이오스탯(cryostat, CM3050S, Leica, Wetzlar, Germany)에서 OCT(optimal cutting temperature)화합물(Tissue-Tek, CA, USA)로 sample stub의 한쪽 면에 고정시킨다. 팽윤 또는 표면 불규칙성에 의한 ADM 두께 변동성을 고려하여, 120㎛ 두께로 섹션(Thin dermal matrix section)을 제조하였다. 각각의 무세포 진피기질 박편(Thinsection acellular dermal matrix, 이하 tsADM)을 멸균 파우치에 넣고 밀봉한 후 에틸렌옥시드(EtO) 멸균(인천, 한신 메디칼 (주))하였다. 상기 tsADM을 건조 상태에서 디지털 현미경(AM7915MZT, 대만 신 베이시, 디노라이트(Dino-Lite))으로 관찰 및 측정하였다(도 2의 A 내지 C 참조). 공초점 현미경 (LSM 800, 칼 자이스, 독일 오베르코헨 소재)으로 콜라겐 자가형광의 시작점인 Z-position 부터 말단 Z-position을 측정하여 배지-팽창된(media-swollen) tsADM의 두께를 측정하였다. ADM 마이크로 구조는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (micro-CT, Skyscan 1272, Bruker, Karlsruhe, Germany)으로 평가되었다. 광역 임계화 및 125 voxels 미만의 speckle을 제거한 후, ADM의 서브 볼륨 레벨(직경 2 mm, 높이 1 mm)에서 Morphometric 분석을 수행하였다. 픽셀 크기는 8㎛이다. 정량적, 형태학적 분석을 위한 평가 지표는 ADM 다공성, ADM 표면 밀도, 표면적, 기공 수, 기공 직경 및 기공 직경의 분포이다(도 2의 D 내지 F 참조).
본 발명에 따라 제조된 무세포 진피기질 박편은 제조 시 화학적 처리하지 않아 생체 이식용 무세포 진피층의 이식 시 화학적 처리에 따른 면역 반응이 일어나지 않는다.
<실시예 2>
세포 배양 및 구형 군체(Spheroid)의 형성
인간의 지방 유래 줄기세포(Adipose-derived stem cell, 이하ASC, Lonza, Basel, Sweitzerland)를 이용하였다. 상기 ASC를 10 % 소 태아 혈청 (Lonza), 1 % 2mM L- 글루타민 (Lonza) 및 0.1 % 젠타 마이신 설페이트(gentamicin sulfate)/암포테리신(amphotericin) -B (Lonza)와 함께 ASC 기초 배지 (Lonza)에서 배양하였다. 37℃, 5% CO2의 가습된 표준 배양 조건하에서 세포를 배양하였다. 여기에 트립신(trypsin)/에틸렌디아민테트라 아세트산(EDTA) 처리 후 210g에서 5 분 동안 원심 분리하여 ASC를 수확하였다. 구형 군체(spheroid)를 생성하기 위해, 3D 세포 배양 접시 (한국 경기도 스템핏 3D®)를 사용하였다. 이러한 유형의 배양 접시를 사용하면 배양 접시 당 389개의 구형 군체(spheroid)가 생성될 수 있다. 이후 미세 기포를 제거하고 1 ml의 배지 당 1.2 x 106개의 세포를 3D 세포 배양 접시에 접종하였다. 배양 2일 후, 균일한 구형 군체(spheroid)를 피펫팅하여 Lo-bind 튜브(독일 함부르크의 에펜도르프)로 수거하고 tsADM에 접종하였다.
<실시예 3>
유리 커버슬립 사이 구형 군체(spheroid)의 가소성 및 생존력
구형 군체(Spheroid)는 원래의 구조를 잃지 않으면서 무세포 진피기질 박편(tsADM)의 표면 미세포어(pore) 홈에 맞아야 한다. 구형 군체(Spheroid)의 가소성을 평가하기 위해, 둥근 유리 커버슬립 (# 1.5 (0.16~0.19mm 두께), World Precision Instruments, FL, USA) 사이에 여러 구형 군체(Spheroid)를 접종하였다. 그 후, 배지를 제거하면 상기 구형 군체(Spheroid)는 배지의 표면 장력과 라플라스(Laplace) 압력에 의해 커버 슬립 사이에서 압축된다. 이후 배지를 재충전함으로써 압축을 풀었고 5 번의 압축 감압 사이클을 거쳤다. 이러한 변형은 EVOS FL 이미징 시스템 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 사용하여 관찰하였다. 상기 구형 군체(Spheroid)는 압축 상태에서 48 시간 배양 후 구형 군체(Spheroid)의 형태 변화를 평가하기 위해 actin green (R37110, Thermo Fisher) 및 DRAQ5 (62251, Thermo Fisher) 염료로 염색하고 공초점 현미경을 사용하여 Z-stack 이미지에서 관찰하였다.
상기 구형 군체(Spheroid)가 커버슬립 사이에서 압축될 때 세포 생존을 평가하였다. 커버슬립(coverslip) 위에 접종된 구형 군체(Spheroid), 커버 슬립(coverslip) 사이에 접종된 구형 군체(Spheroid), 및 커버슬립 사이에 존재하는 tsADM 상에 적재된 구형 군체(Spheroid)를 비교하였다. 압축 상태에서 48 시간 배양 후 LIVE / DEAD Cell Imaging Kit (Thermo Fisher Scientific)로 염색 한 후 공초점 현미경으로 관찰하였다.
<실시예 4>
무세포 진피기질 박편(tsADM) 상에 구형 군체(Spheroid)의 적재
둥근 커버슬립(직경 8 mm)을 비조직 배양 처리된 48-well plate의 well에 넣었다 (도 1의 A). 이후 8 mm 직경의 둥근 tsADM을 커버슬립 위에 놓았다 (도 1의 B). tsADM은 배지 침지 피펫(media-dipped pipet) 팁으로 초점 습윤시켜 커버슬립의 중앙에 고정한다. 피펫팅(pipetting) 중 피펫 팁의 전단 응력(shear stress)으로 인한 구형 군체(Spheroid)의 손상을 방지하기 위해 1000㎕의 로우 리텐션(low retention)피펫 팁을 사용하여 구형 군체(Spheroid)를 이동시키거나 취급하였다. 이후 2 개의 3D 세포 배양 디쉬(2.4 X 106 세포)로부터 수확된 구형 군체(Spheroid)를 Lo- bind 튜브로 흡인, 이동하였다. Lo- bind 튜브에서 구형 군체(Spheroid)를 피펫으로 흡인한 뒤 상기 구형 군체가 팁 근처에 고정될 때까지 기다린 후 tsADM에 조심스럽게 분배하였다(도 1의 C). tsADM에 대한 적절한 구형 군체(Spheroid)의 분포를 확인한 후, 둥근 형태의 커버슬립(상단 커버슬립)을 구형 군체(Spheroid)가 접종된 tsADM 위에 덮었다(도 1의 D). 상단 커버슬립이 구형 군체(Spheroid) 위로 약간 떠 다니는 것을 방지하기 위해 상단 커버슬립 바깥 쪽 경계선과 중앙을 피펫 팁으로 상단 커버슬립이 tsADM에 닿을 때까지 부드럽게 눌렀다. 이어서, well을 완전 배지로 채우고 매일 교환하며 표준 배양 조건 하에서 배양하였다. 전체 형태는 디지털 현미경 (AM7915MZT, Dino-Lite)으로 관찰하였다. 배양 1주 후, 상단 커버슬립을 족집게로 제거하였다. 상기 구형 군체(Spheroid)가 적재(loading)된 tsADM은 접힘을 방지하기 위해 바닥 부분의 커버슬립과 함께 수확 및 이송되었다. 대조군의 경우, 상부 커버슬립의 적용 및 압축 단계를 생략하였다.
<실시예 5>
구형 군체(Spheroid)가 적재된 무세포 진피기질 박편(tsADM)의 이미징화
구형 군체(Spheroid)가 적재된 tsADM을 25 분 동안 1X 포스페이트-완충 식염수 (phosphate-buffered saline, PBS) 중 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정한 다음 차단 용액 (1X PBS 중 1 % 소 혈청 알부민)으로 2 회 세척하였다. 이후, 1X PBS 중의 0.1 % Triton X-100으로 5 분간 투과시킨 후 2 회 세척하였다. 실온(Room temperature)에서 tsADM을 차단 용액에 40분 동안 적용한 후 3회 세척 하였다. tsADM에 actin green (R37110, Thermo Fisher) 및 DRAQ5(62251, Thermo Fisher) 시약을 실온에서 30분 동안 적용 한 후, PBS로 3회 세척하였다. 그 후, 커버슬립에 의해 구형 군체(Spheroid)가 적재된 tsADM이 찌그러지는 것을 방지하기 위해, 매니큐어(nail polish)로 4개의 모서리 지지대를 만들었다. 이어서, 염색된 구형 군체(Spheroid) 적재-tsADM을 슬라이드 글라스의 중앙에 놓았다. 여기에 안티페이드마운팅(antifade mounting)용액(ProLong Diamond, P36965, Thermo Fisher)을 떨어뜨린 후 커버슬립을 지지대 위에 덮었다. 염색된 구형 군체(Spheroid) 적재-tsADM을 공초점 현미경으로 관찰하였다. tsADM의 피부 콜라겐 다발은 자가형광을 나타내기 때문에 4', 6'-diamidino-2-phenylindole(DAPI) 채널을 통해 관찰하였다.
<실시예 6>
무세포 진피기질 박편(tsADM)에 대한 구형 군체(Spheroid)의 접착 안정성
tsADM에 적재된 구형 군체(Spheroid)의 전단 응력 안정성을 평가하기 위해, 3일 및 6일 배양된 구형 군체(Spheroid) 적재-tsADM에 회전 진탕기로 전단 응력을 가하였다. 즉, 구형 군체(Spheroid)가 적재된 tsADM을 상부 커버슬립 없이 2 mL의 완전 배지를 갖는 6-well plate에 두었다. 이후, 6- well plate를 회전 진탕기로 120, 150 및 200 rpm에서 5분 동안 순차적으로 진탕시켰다. 각각의 진탕 기간 후에, 분리된 구형 군체(Spheroid)를 관찰하고 현미경 (EVOS FL, Thermo Fisher)으로 계수하였다. 추가적인 진탕을 위하여 상기 tsADM을 새로운 well로 옮겼다. 적재된 구형 군체(Spheroid)의 전체 수 당 분리된 구형 군체(Spheroid)의 백분율을 평가하였다.
<실시예 7> 세포가 시딩(seeding)된 무세포 진피기질 박편(tsADM)과 구형 군체(Spheroid)가 적재(loading)된 tsADM의 생체 내 이식에 의한 세포 전달 효능의 비교
세포가 시딩(seeding)된 tsADM을 생성하기 위해, 본 발명과 동일한 지방 유래 줄기세포(ASC)를 T175 플라스크에서 약 80%의 컨플루언스(confluency)에 도달할 때까지 배양하고, 트립신/EDTA 처리 후 수확, 이후 210g에서 5분 동안 원심 분리하여 수집하였다. 비-조직 배양 처리된 48- well plate에 둥근 커버슬립을 넣고 tsADM을 그 위에 놓은 후, 지방 유래 줄기세포(ASC) 2.4 x 106cell/ml를 동일한 tsADM에 시딩(seeding)하였다. 이후 12시간 동안 침전시키고, 유리 커버슬립을 세포-시딩(seeding)된 tsADM 상에 덮은 후 압축시켰다. 이어서, well을 완전 배지(full medium)로 채우고 매일 교환하며 표준 배양 조건 하에서 7일 동안 배양하였다.
본 실험에서는 6 주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스 (그룹당 n = 5, Orientbio, 경기도, 대한민국)를 사용하였다. 실험에서 상기 암컷 마우스는 개별적으로 사육하였다. 모든 실험은 isoflurane(Foran, Choongwae Pharmaceutical Corporation, 화성시, 대한민국)에 의한 전신 마취 하에서 진행되었다. 상기 마우스는 클리퍼(clipper) 및 제모크림 (Niclean, Ildong Pharmaceutical Corporation, 서울, 대한민국)으로 털을 제거하였다. 상기 털이 제거된 피부를 베타딘(betadine)과 70% 에탄올로 세척한 다음 멸균 수술용 드레이프로 드레이프(drape)하였다. 상기 마우스의 옆구리 피부에 tsADM을 이식하기 위해, Metzenbaum가위를 이용하여 1.5cm 길이로 중간선 절개한 다음, 근육층(panniculus carnosus)의 아래를 해부하였다. 상기 tsADM의 이식 전에, 세포가 시딩(seeding)되거나 구형 군체(Spheroid)가 적재(loading)된 tsADM을 멸균된 PBS로 3회 세척하고 tsADM의 접힘을 방지하기 위해 둥근 커버슬립의 뒷면을 이용하여 이식하였다. tsADM의 이식 후, 둥근 커버슬립을 제거하였다.수술 부위는 6-0 나일론 (미국 뉴저지 주 에티콘)의 봉합사로 봉합하였다. 수술 2주 후, 실험에 사용된 마우스를 CO2 챔버에서 안락사시킨 다음, 표피, 이식된 tsADM 및 환부 아래의 근육을 함께 수확하였다.
수확된 조직을 RT에서 12시간 동안 4% 농도의 파라 포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시킨 다음, 통상적인 방법을 사용하여 파라핀에 고정하고, 두께 4㎛로 절단한 후 크실렌(xylene) 및 알코올로 탈수시켰다. 항원의 복구를 위해 슬라이드를 0.1M 시트레이트(citrate) 완충액 (pH 6.0)으로 10 분 동안 처리하고 0.1M PBS (pH 7.4)에서 10 % 정상 염소 혈청(Jackson ImmunoResearch, PA, USA)으로 1시간 동안 차단(blocking)하였다. 상기 슬라이드를 항-인간 핵 Ab (Anti-human nuclei Antibody, Abcam, Cambridge, United Kingdom)와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션 한 후, PBS로 세척하고 다시 RT에서 30분 동안 Dako REALTM EnVisionTM / HRP (Dako)와 함께 인큐베이션하였다. 다음으로, 3,3'-diaminobenzidine(DAB) 색원체(chromogen)를 사용하여 면역 조직의 화학 반응을 시각화한 다음, PBS로 세척하고, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대비 염색 후 5분 동안 배양하였다. 염색 후, 슬라이드를 알코올에서 탈수시키고, 자일렌(xylene)으로 세척한 다음, 중성의 balsam에 고정한 후 광학 현미경으로 관찰하였다.
세포 전달 효능을 평가하기 위해, DAB 염색된 세포의 수와 염색되지 않은 세포의 수를 QuPath을 이용하여 계수하였다. 결과는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표시된다. 세 개의 HPF (high-power field) 계수를 슬라이드 당 평균으로 수치화 한 뒤(n = 4 그룹) SPSS (IBM, NY, USA)의 Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 분석하였다.p- 값 <0.05는 그룹 사이의 통계적 유의성을 나타냈다.
<실험예 1>
무세포 진피기질 박편(tsADM)
ADM는 박막 절편(thin sectioning)화하여 176.4 ± 14.9 ㎛의 두께의 무세포 진피기질 박편(tsADM)으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 tsADM은 복잡한 물리화학적 처리 없이 박막 절편(thin sectioning)화하여 제조될 수 있으며, 이에 따라 직경이 큰 미세포어를 형성할 수 있다. 무세포 진피기질 박편(tsADM)은 관통되는 미세포어와 홈이 존재하여 거친 질감의 표면을 갖는다(도 2의 A 참조, scale bar: 1mm). 더 높은 배율에서, 표면이 거칠고 평평하지 않은 콜라겐 다발 섬유를 볼 수 있다(도 2의 B 참조, 220X, scale bar: 200㎛). 상기와 같은 거친 표면은 사시도에서 더욱 분명하게 나타난다(도 2의 C 참조, 70X). 이러한 tsADM은 피부 콜라겐 섬유와 짜여진 형태로, 건조한 상태나 젖은 상태에서도 쉽게 부서지거나 찢어지지 않는다. 건조된 tsADM의 평균 두께는 176.4 ± 14.9 ㎛이고, 배지-팽창된 tsADM은 200.43 ± 35.87 ㎛(n = 5)였다. micro-CT를 이용한 ADM의 미세구조(Micro-architecture)분석 결과, 열린 형태의 미세포어(open pore를 의미함, 다공성 구조이며 닫힌 형태의 미세포어(closed pore) 부존재함)가 전체 ADM의 56.71%로 나타났으며, 표면의 밀도 및 표면적은 각각 44.84 /mm 및 566.04 mm2였다. 심층 분석 결과 ADM 내 분포된 다양한 직경을 가진 324개의 미세포어가 나타났다(도 2의 D 참조). 평균 미세포어의 직경은 53.47±33.24㎛로 나타났으며, 미세포어 직경 크기의 중앙값은 104 ㎛였다. 도 2의 E에는 기공의 직경 분포를 나타낸다. 도2의 E를 참조하면 상기 ADM의 미세포어의 직경의 크기 분포는 일반적으로 구형 군체(Spheroid)의 평균 직경보다 작은 것을 알 수 있다. 그러나, 무세포 진피기질 박편(tsADM)에서 분석했을 때, 직경이 약 200㎛인 더 큰 미세포어의 분포가 관찰되었다(도 2의 F 참조). 구형 군체(Spheroid)의 반구체 부분은 직경이 큰 미세포어를 갖는 tsADM에 더 효과적으로 안착될 수 있다. ADM의 박막 절편(thin sectioning)화 과정은 상호 연결된 미세포어의 상단과 하단을 개방하여 전체 미세포어의 직경을 증가시킬 수 있다.
<실험예 2>
세포 배양 및 구형 군체(Spheroid) 생성
본 발명에 따르면, 3 차원 (3D) 세포 배양 접시에서 구형 군체(Spheroid)가 생성될 수 있다. 상기 제조된 구형 군체(Spheroid)의 평균 직경은 255.91 ± 16.87 ㎛(n = 7)이다. 배양 접시(도 3의 A 참조, scale bar: 1000 ㎛)에 세포(120 만)를 접종한 이틀 후, 이들 세포는 함께 압축되어 3D 세포 배양 접시의 비부착성 well에서 구형 군체(Spheroid)가 제조되었다(도 3의 B 참조). 도 3의 C는 구형 군체(Spheroid)의 확대도이다(scale bar:200 ㎛).
<실험예 3>
유리 커버슬립 사이의 구형 군체(Spheroid)의 가소성 및 생존력
2 개의 유리 커버슬립 사이의 구형 군체(Spheroid)는 배지를 채우고 제거함으로써 압축이 풀리거나 압축된다(도 4의 A 및 B 참조). 도 4의 A를 참조하면 상기 웰(well)에 배지를 채우는 경우 구형 군체(Spheroid)의 압축이 풀리는 것을 알 수 있다. 반면, 도 4의 B(scale bar: 500μm)를 참조하면, 배지가 제거되는 경우 구형 군체(Spheroid)는 배지의 표면 장력과 라플라스 압력에 의해 압축되어 2 차원 (2D) 표면적이 증가함을 알 수 있다. 압입 또는 결함이 없는 구형 군체(Spheroid)는 5 회의 압축 및 압축 해제 후 원래의 형태를 유지하여 압축 응력 동안 가소성이 있음을 암시한다. 구형 군체(Spheroid)를 커버슬립 사이에서 48 시간 동안 배양 한 후, 구형 군체(Spheroid)는 50 배율 공초점(confocal) Z-stack으로 관찰한 이미지(도 4의 C 참조)에 도시된 바와 같이 인접한 구형 군체(Spheroid)와 융합하지 않고 유리 커버 슬립 사이에서 3D 형상을 유지하였다. 구형 군체(Spheroid)의 배양조건에 따른 생존력 평가 시험결과 유리 커버슬립상에서 48시간 동안 배양된 구형 군체(Spheroid)는 세포가 커버슬립상에 확산이동되었으며, 구형 군체(Spheroid)의 코어 및 확산이동된 세포 주변에서 사멸된 세포(적색)가 나타났다(도 5의 A 참조, Scale bar: 500μm). 구형 군체(Spheroid)가 유리 커버슬립 사이에서 48 시간 동안 배양되었을 때, 커버슬립 상에 사멸된 세포로 확산이동되는 구형 군체(Spheroid)세포가 관찰되었으나, 사멸된 세포의 수는 구형 군체(Spheroid) 코어에서 감소하였다(도 5의 B 참조, Scale bar: 500μm). 유리 커버슬립 사이의 tsADM 상에 배양된 구형 군체(Spheroid)는 주변으로 확산이동되는 세포가 거의 관찰되지 않았으며, tsADM의 미세포어를 통과한 유리 커버슬립 상의 세포를 제외하고는 구형 군체(Spheroid) 코어에서 사멸된 세포가 거의 관찰되지 않았다(도 5의 C 참조, Scale bar: 500μm).
<실험예 4>
무세포 진피기질 박편(tsADM) 상에 구형 군체(Spheroid)의 적재(loading)
상부 커버슬립없이 구형 군체(Spheroid)를 tsADM에 적재(loading)할 때, 구형 군체(Spheroid)에 포함된 세포가 다공성 tsADM으로 확산이동되어 며칠 내에 구형 군체(Spheroid)의 3D 구조를 잃었다(도 6의 상단열 참조). 이러한 확산이동은 세포-세포 상호 작용이 세포-기질(substrate) 상호 작용보다 우세한 환경에서 구형 군체(Spheroid)가 자발적으로 형성되었기 때문에 발생한다. 도 6은 tsADM에 적재(loading)된 구형 군체(Spheroid)를 관찰한 이미지이며, 도 6의 상단열은 상부 커버슬립 없이 배양한 구형 군체(Spheroid), 도6의 중단열은 상부 커버슬립을 이용하여 배양한 구형 군체(Spheroid), 도6의 하단열은 배양 7일 차에 상부 커버슬립을 제거한 구형 군체(Spheroid)의 이미지이다. 상부 커버슬립 없이 배양한 구형 군체(Spheroid)는 배양 2주 후, 세포 집단의 수가 증가하였으며 일부 수축됨에 따라 tsADM은 불투명해졌다(도 6의 상단열 참조). 반면에, 상단 유리 커버 슬립과 함께 tsADM에 적재(loading)된 구형 군체(Spheroid)는 구형 군체(Spheroid)의 입체(3D) 구조를 유지하였으며, 배양 후 8일 및 14 일차에 잔존하는 구형 군체(Spheroid)로부터 펠렛(pellet)형상이 관찰되었다(도 6의 중단열 참조). 상부 커버슬립을 배양 7일 차에 제거하였을 때, 구형 군체(Spheroid) 형태는 8일 차의 형태와 비교하여 14일 차에 더 모호해졌으며, 이에 따라 구형 군체(Spheroid)의 확산을 방지하는 데 커버슬립의 역할을 알 수 있다(도 6의 하단열 참조).
<실험예 5>
구형 군체(Spheroid)-적재(loading)된 무세포 진피기질 박편(tsADM)의 이미지
상부 커버슬립이 존재하지 않거나 존재하는 상태의 구형 군체(Spheroid)-적재(loading) tsADM을 배양 14일 후 공초점 현미경으로 타일 스캔(tile scan) 하였다. 상부 커버슬립 없이 배양된 구형 군체(Spheroid)는 불분명한 세포 클러스터의 형태로 관찰되어 tsADM에 ASC가 퍼져 있음을 보여주었다 (도 7의 A 참조). 그러나, 상부 커버슬립이 존재하는 상태로 배양된 구형 군체(Spheroid)는, 구형 군체(Spheroid)의 입체 구조가 보존되며 콜라겐 다발을 따라 분포하는 것이 관찰되었다 (도 7의 B 참조, Scale bar: 500μm). 이를 통하여 구형 군체(Spheroid)의 입체 형태를 유지하는 데 커버슬립의 역할을 알 수 있다. 높은 배율의 z-stack 뷰에서, tsADM의 기저에서 세포 접착성을 갖는 콜라겐 다발에 구형 군체(Spheroid)가 고정되며 3D 형상을 유지하는 것이 관찰되었다(도 7의 C 참조, Scale bar: 200μm).
<실험예 6>
무세포 진피기질 박편(tsADM)에 대한 구형 군체(Spheroid)의 접착 안정성
상부 커버슬립(n = 4) 존재 하에 3일, 6일 동안 각각 배양한 구형 군체(Spheroid)가 적재(loading)된 tsADM을 120, 150 및 200 rpm에서 각각 회전 진탕한 후, 분리된 구형 군체(Spheroid)의 백분율을 평가하였다. 배양 3일 후, 분리된 구형 군체(Spheroid)의 평균적인 백분율은 120, 150 및 200 rpm 에서 각각 10.82 %(배양 6일 후 0.99%), 1.91% (배양 6일 후 1.98%) 및 6.36% (배양 6일 후 7.92%)로 나타난다(도 8 참조). 배양 3 일 후에 비하여 배양 6일 후에는 구형 군체(Spheroid)의 분리가 42.98 % 감소(10.89 % : 19.1 %)된 것이 나타난다. 배양 3 일째에 120 rpm의 회전 진탕 시, 구형 군체(Spheroid)의 10.82 %가 tsADM으로부터 분리되었으며 배양 6 일째에 0.99 %로 현저히 감소했다. 이러한 구형 군체(Spheroid)의 분리 백분율은 더 높은 rpm일수록 양 그룹간 유사하게 나타났다. 이에 따라 배양 3일 후보다 배양 6일 후에 구형 군체(Spheroid)의 부착이 더 안정적임을 알 수 있다.
<실험예 7>
세포가 시딩(seeding)된 무세포 진피기질 박편(tsADM)과 구형 군체(Spheroid)가 적재(loading)된 무세포 진피기질 박편(tsADM)의 생체 내 이식에 의한 세포 전달 효능의 비교
누드 마우스(nude mice)에서의 이식 14일 후(그룹당 n=5), 본 발명자들은 무세포 진피기질 박편(tsADM)에서 ASC의 생체 국소 부위 이식 효능을 판단하기 위해 인간 핵-양성 세포(human nuclei-positive cells)를 관찰하였다. 세포가 시딩(seeding)된 무세포 진피기질 박편(tsADM) 및 구형 군체(Spheroid)가 적재(loading)된 무세포 진피기질 박편(tsADM)의 비교를 위하여 인간 핵-양성(human nuclei-positive) ASC를 피부 밑 근육층(panniculus carnosus)과 기저 근육 사이에서 관찰하였다(도 9 참조).
도 9의 A는 누드 마우스(nude mice)의 피부 및 피하층을, 도 9의 B 및 D는 세포 시딩(seeding)된 tsADM를 이식한 누드 마우스(nude mice)의 피부 및 피하층을, 도9의 C 및 E는 구형 군체(Spheroid)가 적재(loading)된 tsADM를 이식한 누드 마우스(nude mice)의 피부 및 피하층을 나타낸 이미지이다. 대조군은 피부 밑 근육층과 기저 근육층 사이에서 3', 3'-diaminobenzidine(DAB) 신호가 없는 온전한 층을 보여준다(도 9의 A, Scale bar: 500μm). 세포가 시딩(seeding)된 tsADM의 이식 후 항 인간-핵 Ab(anti-human nuclei antibody)에 대한 DAB-양성 염색을 갖는 전이된 세포층이 관찰되었고, 이는 피부 밑 근육층에서의 ASC 생존을 시사한다(도 9의 B, D 참조). 구형 군체(Spheroid)가 적재(loading)된 tsADM의 이식 후 세포 시딩(seeding)된 tsADM보다 훨씬 더 두꺼운 세포층이 관찰되었다(도 9의 C 참조). 도 9의 E를 참조하면 구형 군체(Spheroid)가 적재(loading)된 tsADM이 DAB- 양성 세포 밀도가 더 높은 것을 알 수 있으며, 이는 세포 시딩(seeding)된 tsADM(도 9의 D 참조)보다 ASC의 생존률 및 이식 효능이 더 높음을 알 수 있다.
구형 군체(Spheroid)가 적재(loading)된 tsADM은 세포 시딩(seeding)된 tsADM과 비교하여 인간 핵-양성 세포(human nuclei-positive cells)의 이식 수가 크게 증가한다. 세포 시딩(seeding)된 그룹과 군체(Spheroid)가 적재(loading)된 그룹 사이의 총 카운트 된 세포의 평균 수의 차이는 없었다(그룹당 n=4, 293.33 ±77.6 대 280.58 ± 42.34, 도 10의 A). 이식 2주 후 구형 군체(Spheroid)가 적재(loading)된 tsADM의 총 세포 계수 비 당 인간 핵-양성 세포(human nuclei-positive cells)는 세포 시딩(seeding)된 tsADM 보다 통계적으로 유의하게 약 2.96배 더 높았다(55.02%±5.33% : 18.60%±6.64%, 도 10의 B 참조). 따라서, 세포가 시딩(seeding)된 tsADM보다 구형 군체(Spheroid)를 적재(loading)한 tsADM가 세포 이식에 대해 더 큰 효능을 나타냄을 알 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였다. 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 예일 뿐이며, 기술된 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (11)

  1. 미세포어가 형성된 무세포 진피 기질; 및
    상기 무세포 진피 기질상에 적재되는 세포;를 포함하고,
    상기 세포는, 구형의 군체(Spheroid)를 이루어 상기 무세포 진피 기질의 미세포어에 안착되어 적재되는, 생체 이식용 무세포 진피층.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 무세포 진피 기질상에 적재되는 세포는 지방유래 줄기세포인, 생체 이식용 무세포 진피층.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 미세포어의 크기는 150 ~ 200 ㎛인, 생체 이식용 무세포 진피층.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 구형의 군체는 200 ~ 300 ㎛ 크기인, 생체 이식용 무세포 진피층.
  5. 삭제
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 무세포 진피 기질의 두께는 176.4 ± 14.9 ㎛인, 생체 이식용 무세포 진피층.
  7. 제1 항 내지 제4 항 및 제6 항 중 어느 한 항의 무세포 진피층을 포함하는, 피부 외용제 조성물.
  8. a) 지방 유래 줄기세포를 3D 세포 배양 접시에 접종 후 배양하여 지방 유래 세포의 구형 군체(Spheroid)를 형성하는 단계;
    b) 무세포 진피 기질을 제1 커버슬립 상에 배치하는 단계;
    c) 상기 구형 군체를 상기 무세포 진피 기질에 접종하는 단계; 및
    d) 상기 c)단계의 무세포 진피 기질 상에 제2 커버슬립을 덮고 세포를 배양하는 단계;를 포함하는, 생체 이식용 무세포 진피층의 제조방법.
  9. 제8 항에 있어서, 상기 c) 단계는
    상기 구형 군체의 접종 전 무세포 진피 기질을 박막 절편화하여 무세포 진피 기질 박편을 제조하는 단계;를 포함하는, 무세포 진피층의 제조방법.
  10. 제9 항에 있어서,
    상기 무세포 진피기질 박편의 두께는 176.4 ± 14.9 ㎛인, 생체 이식용 무세포 진피층의 제조방법.
  11. 제8 항 내지 제10 항 중 어느 하나의 제조방법으로 제조된 무세포 진피층.
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