WO2023085453A1 - 동물 피부 유래의 초미세 무세포 진피 제조 방법 - Google Patents

동물 피부 유래의 초미세 무세포 진피 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2023085453A1
WO2023085453A1 PCT/KR2021/016329 KR2021016329W WO2023085453A1 WO 2023085453 A1 WO2023085453 A1 WO 2023085453A1 KR 2021016329 W KR2021016329 W KR 2021016329W WO 2023085453 A1 WO2023085453 A1 WO 2023085453A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
acellular dermis
fine
ultra
acellular
dermis
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/016329
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
박종호
이은성
이기원
김형구
이원철
Original Assignee
주식회사 엘앤씨바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 엘앤씨바이오 filed Critical 주식회사 엘앤씨바이오
Priority to PCT/KR2021/016329 priority Critical patent/WO2023085453A1/ko
Publication of WO2023085453A1 publication Critical patent/WO2023085453A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ultra-fine acellular dermis.
  • the skin tissue of animals consists of three parts: an epidermal layer, the outermost layer of the skin, a dermal layer below it, and a subcutaneous layer.
  • the epidermal layer containing keratin recognizes changes in the external environment, protects the body from external contamination or infection, and prevents excessive evaporation of body moisture.
  • Blood vessels distributed in the dermal layer supply oxygen and nutrients to epidermal and dermal cells, maintain skin elasticity, and protect the body.
  • the fat distributed in the subcutaneous tissue stores the energy necessary for the body and acts as a buffer against external shocks.
  • skin tissue maintains the body through various roles such as sensory function, protective function, thermoregulation function, and energy storage function (Non-Patent Document 1).
  • Acellulardermal Matrix in which the epidermis layer and subcutaneous tissue are removed from skin tissue and the cells of the dermis are removed, is a dermal layer matrix obtained through acellularization technology from human or animal skin, and is an extracellular matrix composed of pure collagen and elastin ( It means a skin substitute in the form of an Extracellular Matrix). It is known that these biologically derived skin substitutes have a relatively low immune rejection response, unlike organs for transplantation. In addition, human-derived skin substitutes are generally reported to be superior to animal-derived skin substitutes in terms of biological performance and safety. However, since human-derived skin substitutes need to receive skin tissue from a posthumous donor, it may be limited in terms of raw material supply and demand compared to animal-derived skin substitutes.
  • acellular dermis which is a bioderived skin substitute, is generally very similar to skin, and is transplanted into a patient's body or damaged skin in the form of a flat sheet (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 2 In order to use the acellular dermis as a tissue repair material for plastic surgery or as a wound dressing material such as bedsores and foot ulcers, it must be sufficiently passable through a small-diameter passage such as an injection needle.
  • the present invention provides a method for manufacturing ultra-fine acellular dermis that maintains the properties and structure of type 1 collagen, which is the main component of acellular dermis, through a novel ultra-miniaturization process and can be injected into the human body.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing ultra-fine acellular dermis.
  • an ultra-fine acellular dermis of a uniform size can be obtained without changing the properties and structure of type 1 collagen through the ultra-miniaturization process through the steps of primary grinding, secondary grinding and sieve separation,
  • An object of the present invention is to provide a method for producing ultra-fine acellular dermis that can be injected through a fine-diameter injection needle.
  • the present invention comprises a first grinding step of grinding the acellular dermis at 8,000 to 6,000 rpm using a rotating rotor;
  • a method for producing ultra-fine acellular dermis comprising a sieve separation step of sieving the secondary crushed acellular dermis under negative pressure conditions.
  • the present invention is an ultra-fine acellular dermis prepared by the above-described manufacturing method.
  • An injectable acellular dermal composition comprising a solution is provided.
  • the present invention provides a method for preparing an injectable ultra-fine acellular dermis.
  • the yield of ultra-fine acellular dermis is increased compared to the existing process through the primary grinding and secondary grinding steps to ultra-miniaturize acellular dermis, and ultra-fine acellular dermis of uniform size through sieve separation using negative pressure. It is possible to shorten the time required to obtain. In addition, even after ultra-miniaturization, the properties and shape of type 1 collagen, which is the main component of acellular dermis, can be maintained.
  • the ultra-fine acellular dermis according to the present invention can be mixed with a solution and provided as a composition that can be injected into the human body through a fine-diameter injection needle.
  • 1 is a flow chart showing a method for producing ultra-fine acellular dermis.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of particle size analysis of ultra-fine acellular dermis according to the presence or absence of a sieve separation step.
  • Figure 3 is a photograph taken with a scanning electron microscope (SEM) of the ultra-fine acellular dermis.
  • type 1 collagen which is the main component of ultrafine acellular dermis, by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • type 1 collagen which is the main component of ultrafine acellular dermis, by Western blot.
  • FIG. 6 is a graph showing the injection power of a composition comprising ultrafine acellular dermis and a solution.
  • the present invention includes a first grinding step of grinding the acellular dermis at 800 to 6,000 rpm using a rotating rotor;
  • It relates to a method for producing ultra-fine acellular dermis comprising a sieve separation step of sieving the secondly ground acellular dermis under negative pressure conditions.
  • the yield of ultra-fine acellular dermis can be increased compared to the existing process through the primary and secondary crushing steps to ultra-miniaturize the acellular dermis, and the sieve separation step using negative pressure can increase the yield of ultra-fine acellular dermis of uniform size.
  • the time for obtaining cell dermis can be shortened.
  • the ultrafine acellular dermis obtained by the production method of the present invention can maintain the shape and properties of type 1 collagen, which is the main component of the acellular dermis.
  • the prepared ultra-fine acellular dermis can be mixed with a solution and injected into the human body through a fine-diameter injection needle.
  • the numerical value is limited to more than, less than, or more than or less than, but indicates more or less unless otherwise specified.
  • the ultra-fine acellular dermis refers to acellular dermal particles having a uniform particle size distribution prepared through the manufacturing method of the present invention, that is, primary grinding, secondary grinding and sieve separation.
  • the average particle size of the ultrafine acellular dermis may be 120 ⁇ m or less, 110 ⁇ m or less, or 100 ⁇ m or less.
  • the average particle size may be calculated as the average value of D10, D50, and D90 using the wet mode of the particle size analyzer (LS13320XR, BECKMAN COULTER).
  • acellular dermis refers to a dermal layer matrix obtained through acellularization technology, and the dermis may be obtained from allogeneic or heterogeneous skin.
  • ADM acellular dermis
  • the same species refers to humans, and the heterogeneous species may refer to animals other than humans, that is, mammals such as pigs, cows, and horses.
  • acellular dermal products for acellular dermis may be used, or cells may be removed from skin tissue for use.
  • acellular dermis is removed by removing lipid components from dermal tissue.
  • It can be prepared through the step of removing cells from the dermal tissue from which the lipid component has been removed.
  • the dermal tissue may be delipidated.
  • delipidation can be performed using a delipidation solution.
  • the degreasing solution may include a polar solvent, a non-polar solvent, or a mixture thereof.
  • Water, alcohol or a mixed solution thereof may be used as the polar solvent, and methanol, ethanol or isopropyl alcohol may be used as the alcohol.
  • hexane, heptane, octane, or a mixed solution thereof may be used as the non-polar solvent.
  • IPA isopropyl alcohol
  • hexane a mixed solution of isopropyl alcohol
  • the mixing ratio (wt%) of isopropyl alcohol and hexane may be 20:80 to 80:20.
  • the dermal tissue may be decellularized.
  • Decellularization refers to removing other cellular components, such as nuclei, cell membranes, and nucleic acids, except for the extracellular matrix, from dermal tissue.
  • decellularization can be performed using a decellularization solution.
  • a surfactant and/or a basic solution may be used as the decellularization solution.
  • an ionic surfactant such as sodium dodecyl sulfate (SDS), or Triton X-100, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Nonidet P-10 (NP-10), Noni Nonionic surfactants such as detpi-40 (NP-40) and the like can be used.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • NP-10 Nonidet P-10
  • NP-40 Noni Nonionic surfactants
  • at least one selected from the group consisting of sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, calcium carbonate, magnesium hydroxide, calcium hydroxide and ammonia may be used as the basic solution.
  • the acellular dermis may be composed of an extracellular matrix composed of collagen and elastin.
  • the first grinding step is a step of grinding the acellular dermis at 800 to 6,000 rpm using a rotating rotor.
  • the step may be performed using a rotary grinder.
  • a rotary grinder IKA's MF-10 product can be used.
  • the acellular dermis can be cut to a size applicable to a rotating rotor and then used for primary crushing.
  • the size of the acellular dermis may be 0.5 to 2 mm in width and length, respectively.
  • the primary grinding may be performed at 1,000 to 5,000 rpm, 2,500 to 5,500 rpm, 2,500 to 4,500 rpm, or 3,000 to 4,000 rpm.
  • the primary grinding time may be 10 to 50 minutes, 10 to 30 minutes, or 20 to 25 minutes.
  • the average particle size of the primary ground acellular dermis may be 600 to 900 ⁇ m, 600 to 850 ⁇ m, or 600 to 750 ⁇ m. It is possible to efficiently manufacture acellular dermis suitable for human body injection in the above particle size range, and it is applicable to a grinding device for secondary grinding.
  • the secondary crushing is a step of secondary crushing the acellular dermis primarily crushed in the above step.
  • the secondary crushing may be performed by freezing the primary crushed acellular dermis, putting the frozen acellular dermis and metal rod into a crushing container, and then freeze-pulverizing through impact.
  • freeze-drying of acellular dermis may be performed through a method common in the art.
  • the secondary grinding may be performed using a freeze mill.
  • a freeze mill SPEX Sample Prep's 6875D product can be used.
  • the material of the metal rod may be stainless steel or titanium.
  • the size of the metal rod may vary depending on the size of the grinding container, and may be, for example, 5 to 8 cm in width and 1 to 3 cm in length.
  • a process of putting the frozen acellular dermis and metal rod into a crushing container and then freezing for 10 to 60 minutes may be further performed.
  • the secondary grinding may be performed for 1 to 60 cycles, 1 to 45 cycles, 10 to 40 cycles, or 16 to 30 cycles. In addition, the secondary grinding may be performed for 20 to 100 minutes, 20 to 80 minutes, or 20 to 60 minutes.
  • the sample that is, the acellular dermis
  • the metal rod in the grinding vessel moves rapidly. In excess of 60 cycles, since a significant particle size reduction effect is not obtained, it is recommended to adjust the cycle within the above range.
  • the average particle size of the secondly ground acellular dermis may be 350 ⁇ m or less, 300 ⁇ m or less, 250 ⁇ m or less, or 100 to 250 ⁇ m. In the above particle size range, acellular dermis suitable for human body injection can be efficiently prepared.
  • the sieving step is a step of sieving the acellular dermis secondaryly pulverized in the above-mentioned secondary pulverizing step under negative pressure conditions.
  • the screen size of the sieve may be 100 to 300 ⁇ m, 150 to 250 ⁇ m or 200 ⁇ m.
  • the sieve separation step may be performed by placing the acellular dermis on a sieve, sealing the upper end of the sieve, and suctioning the lower end with negative pressure.
  • This negative pressure may be a pressure of 500 to 5000 mmAq or 1000 to 3000 mmAq.
  • the sieving time may be 1 to 20 minutes, or 1 to 10 minutes.
  • the average particle size of the ultrafine acellular dermis prepared by the manufacturing method according to the present invention may be 120 ⁇ m or less, 110 ⁇ m or less, or 100 ⁇ m or less.
  • the lower limit of the average particle size may be 30 ⁇ m or more.
  • the yield of ultrafine acellular dermis may be 60% or more, 70% or more, or 80% or more. That is, through the manufacturing method according to the present invention, ultrafine acellular dermis can be obtained with a short process time and high yield compared to conventional methods.
  • the present invention relates to an ultra-fine acellular dermis prepared by the method for producing ultra-fine acellular dermis described above.
  • the ultra-fine acellular dermis according to the present invention is composed of an extracellular matrix composed of collagen and elastin, and can maintain the properties and structure of type 1 collagen, the main component of acellular dermis, even after undergoing a grinding process. there is.
  • the ultrafine acellular dermis has an average particle size of 120 ⁇ m or less, 110 ⁇ m or less, or 100 ⁇ m or less, and through this, it can be applied for injection into the human body through injection.
  • the present invention is the above-mentioned ultra-fine acellular dermis.
  • It relates to an injectable acellular dermal composition comprising a solution.
  • sterile physiological saline or sterile distilled water may be used as the solution.
  • the content of the ultrafine acellular dermis may be 5 to 70 parts by weight or 10 to 50 parts by weight based on the total weight of the composition (100 parts by weight).
  • the acellular dermal composition is used for injection, and the injection pressure may be 40 N or less.
  • the injection force may be measured according to the method of Experimental Example 4 of the present invention.
  • the acellular dermal composition can be used as a tissue repair material for plastic surgery or a wound covering material such as bedsores and foot ulcers.
  • the animal's dermal tissue was washed with sterile distilled water. Fascia and fat were removed from the washed animal's dermal tissue using a scrapper or the like.
  • the dermal tissue was treated with 0.1M to 15M sodium chloride for 6 to 12 hours to remove the epidermis.
  • the dermal tissue from which the epidermis was removed was washed with sterile distilled water. After washing, it was treated for 1 to 6 hours using 10% to 50% isopropyl alcohol and 10% to 50% hexane to remove fat. Then, cells were removed by treatment with 0.1% to 10% SDS solution.
  • the decellularized dermal tissue was frozen for 2 to 6 hours at a temperature of -70°C or lower. The frozen dermal tissue was dried for 12 to 24 hours to prepare acellular dermis.
  • micronization of the acellular dermis proceeded in the order of primary crushing, secondary crushing, and sieve (Fig. 1).
  • the primary crushing was performed by crushing the acellular dermis having a horizontal and vertical size of 10 mm x 10 mm using a rotor (MF-10, IKA Co.) rotating at 1000 rpm to 5000 rpm.
  • the acellular dermis pulverized through the primary and secondary crushing was placed on a separator having a size of 200 ⁇ m, the upper end of the separator was sealed, and the lower end was suctioned at a pressure of 1000 to 3000 mmAq to obtain an ultra-fine acellular dermis.
  • the primary grinding was performed at 1000 rpm or more to less than 2000 rpm, 2000 rpm or more to less than 3000 rpm, 3000 rpm or more to less than 4000 rpm, After proceeding at 4000 rpm or more to less than 5000 rpm, the particle size and required time of the sample were checked.
  • the second grinding was performed from 1 cycle to 15 cycle, 16 cycle to 30 cycle, and 31 cycle to 45 cycle, and then the sample The particle size and required time were confirmed.
  • the particle size was measured using the wet mode of the particle size analyzer (LS13320XR, BECKMAN COULTER) as an average particle size.
  • Table 1 shows the particle size and total grinding time of acellular dermis according to the first and second grinding steps.
  • the particle size decreases as the rpm increases during the primary grinding, but the particle size of the sample (sample 3) and the sample (sample 4) performed at 3000 rpm to 4000 rpm and 4000 rpm to 5000 rpm It can be confirmed that it is within the margin of error.
  • the required time was about 1 to 7 minutes shorter than the samples performed at 3000 rpm to 4000 rpm than the samples performed at 4000 rpm to 5000 rpm. Through this, it can be confirmed that a significant particle size reduction effect is not obtained at 4000 rpm or more, and it is preferable to perform the primary grinding at less than 4000 rpm in terms of process efficiency.
  • the particle size of samples 8 to 10 in which the first grinding was performed at 3000 rpm to 4000 rpm and then the second grinding was performed was 93 ⁇ m to 247 ⁇ m smaller than the sample in which only the second grinding was performed, and about 300 ⁇ m or less As a result, it can be confirmed that acellular dermis having a fine particle size can be obtained.
  • sample 9 with 16 to 30 cycles of secondary grinding along with the primary grinding and the sample with 31 to 45 cycles (sample 10) had particle sizes within the error range, and the time required for sample 9 was It is about 28 minutes to 50 minutes shorter than 10, and it can be confirmed that it is preferable in terms of process efficiency to proceed with the secondary grinding at 30 cycles or less.
  • the first grinding was performed at 3000 rpm to 4000 rpm, and the second grinding was performed at 1 to 15 cycles, 16 to 30 cycles, and 31 to 45 cycles.
  • the particle size, yield, and required time were confirmed according to the presence or absence of sieving.
  • Table 2 shows the particle size, yield, and total required time of ultrafine acellular dermis according to the first grinding, second grinding, and sieve separation steps.
  • the particle size of the sample subjected to sieving was about 154 to 279 ⁇ m smaller than that of the sample not subjected to sieving.
  • the particle size decreased as the cycle of secondary grinding increased after the primary grinding, but the secondary grinding was performed at 16 to 30 cycles.
  • the sample (Sample 16) and the sample (Sample 17) with 31 to 45 cycles are within the error range.
  • the required time for sample 16 is about 31 to 53 minutes shorter than that for sample 17. Through this, it can be confirmed that it is preferable in terms of process efficiency to perform the secondary grinding at 30 cycles or less.
  • the acquisition time according to the presence or absence of negative pressure in the sieving step was confirmed.
  • the average yield of 82% of sample 16 in Table 2 was set as the maximum yield of acellular dermis, and the time required for obtaining was confirmed.
  • Table 3 is a table showing the sifting time required for obtaining according to the presence or absence of negative pressure in the sieving step.
  • the time required for the sieving step with negative pressure was 5 minutes, while the time obtained for the sieving step without negative pressure was 90 minutes.
  • the coefficient of variation is a value obtained by dividing the standard deviation by the arithmetic mean, and was calculated from values measured using LS13320XR (BECKMAN COULTER) for samples 9 and 16.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of particle size analysis of ultra-fine acellular dermis with and without a sieve separation step.
  • the coefficient of variation of the sample without sieving was 141%
  • the coefficient of variation of the sample (sample 16) that was sieved was 96%, which was the sample subjected to sieving. It can be seen that the coefficient of variation of
  • the particle size of the sample subjected to sieving is more uniform than that of the sample not subjected to sieving.
  • Figure 3 is a photograph taken with a scanning electron microscope (SEM) of the ultra-fine acellular dermis.
  • FIG. 4 is a photograph showing type 1 collagen, which is the main component of ultrafine acellular dermis, by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • Figure 5 is a photograph showing type 1 collagen, which is the main component of ultrafine acellular dermis, by Western blot.
  • Example 2 Mixture of ultrafine acellular dermis and solution manufacturing
  • the ultrafine acellular dermis corresponding to Sample 3, Sample 6, Sample 9, Sample 11, Sample 13, and Sample 16 were contained in 5% to 50% respectively in a photophoresis bottle, and a solution (sterile physiological saline or sterile distilled water) was added to each bottle. 50% to 95% of the mixture was mounted on a three-dimensionally rotating rotor and mixed at 10 to 150 rpm for 30 minutes to 2 hours to prepare a mixed solution.
  • acellular dermis with only 1st grinding (sample 3, sample 11), acellular dermis with only 2nd grinding (sample 6, sample 13), and 1st and 2nd grinding were sequentially performed.
  • Each of the acellular dermis (sample 9 and sample 16) was mixed with the solution and a mixture was put into a syringe and a 30G injection needle was attached. Then, after mounting the syringe on a UTM (universal testing machine), the injection force was checked by operating at a speed of 12 mm/min.
  • FIG. 6 is a graph showing the injection force for a mixture of ultrafine acellular dermis and a solution.
  • FIG. 6a shows sample 3
  • FIG. 6b shows sample 11
  • FIG. 6c shows sample 6
  • FIG. 6d shows sample 13
  • FIG. 6e shows sample 9
  • FIG. 6f shows the injection force of the mixed solution using acellular dermis.
  • the ultra-fine acellular dermis according to the present invention can be mixed with a solution and provided as a composition that can be injected into the human body through a fine-diameter injection needle.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)

Abstract

본 발명은 초미세 무세포 진피 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 무세포 진피를 초미세화하는 1차 분쇄 및 2차 분쇄 단계로 초미세 무세포 진피의 수득률을 증가시키며, 음압을 이용한 체분리 단계를 통해 균일한 크기의 초미세 무세포 진피의 수득에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다. 또한, 초미세화 이후에도 무세포 진피의 주성분인 제1형 콜라겐의 성상 및 형태를 유지할 수 있다.

Description

동물 피부 유래의 초미세 무세포 진피 제조 방법
본 발명은 초미세 무세포 진피의 제조 방법에 관한 것이다.
사람을 비롯한 동물의 피부 조직은 피부의 가장 바깥쪽을 이루는 표피층(epithermal layer)과 그 아래의 진피층(dermal layer), 및 피하조직(subcutaneous layer)의 3 부분으로 이루어진다. 각질을 포함하고 있는 표피층은 외부환경의 변화를 인지하고 외부 오염이나 감염으로부터 몸을 보호하며 몸의 수분이 과도하게 증발되는 것을 막아준다. 진피층에 분포한 혈관들은 표피세포 및 진피세포들에 산소와 영양분을 공급하고 피부의 탄력을 유지하고 몸을 보호한다. 또한, 피하조직에 분포한 지방은 몸에 필요한 에너지를 저장하며 외부 충격에 완충작용을 한다. 이상과 같이 피부 조직은 감각기능, 보호기능, 체온조절기능 및 에너지저장기능 등의 다양한 역할을 통해 몸을 유지시킨다(비특허문헌 1).
피부 조직에서 표피층과 피하조직을 제거하고 진피의 세포를 제거한 무세포 진피(Acellulardermal Matrix)는 사람 내지 동물 피부로부터 무세포화 기술을 통해 얻어지는 진피층 기질로서, 순수한 콜라겐 및 엘라스틴 등으로 구성되는 세포외기질(Extracellular Matrix) 형태의 피부 대체재를 의미한다. 이러한 생체유래의 피부 대체재는 이식용 장기와는 달리 면역거부반응이 상대적으로 낮은 것으로 알려져 있다. 또한, 사람유래 피부 대체재는 일반적으로 생물학적 성능 및 안전성에 대해서 동물 유래 피부 대체재 보다 우수한 것으로 보고되어 있다. 다만, 사람유래 피부 대체재는 사후 기증자로부터 피부 조직을 기증받아야 하므로, 동물 유래 피부 대체재와 비교하여 원료 수급 면에서 제한될 수 있다.
생체유래 피부 대체재인 무세포 진피의 형태는 일반적으로 피부와 매우 유사하며, 평면 시트(sheet) 형태로 환자의 체내 또는 손상된 피부에 이식된다(비특허문헌 2). 그러나, 무세포 진피를 성형용 조직수복용 재료 내지 욕창, 족부 궤양과 같은 창상 피복재료로 사용하기 위해서는 주사 바늘과 같은 작은 직경의 통로로 충분히 통과가 가능하여야 한다.
이에, 본 발명에서는 새로운 초미세화 공정을 통해 무세포 진피의 주성분인 제1형 콜라겐의 성상 및 구조를 유지하고, 또한 인체에 주입 가능한 초미세 무세포 진피의 제조 방법을 제공 한다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
1. MCGRATH, J. A.; EADY, R. A. J.; POPE, F. M. Anatomy and organization of human skin. Rook's textbook of dermatology, 2004, 1: 3.2-3.80.
2. SPEAR, S. L., et al. Acellular dermis-assisted breast reconstruction. Aesthetic plastic surgery, 2008, 32.3: 418-425.
본 발명은 초미세 무세포 진피의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
구체적으로, 본 발명은 1차 분쇄, 2차 분쇄 및 체분리 단계를 통한 초미세화 공정으로, 제1형 콜라겐의 성상 및 구조의 변화 없이 균일한 크기의 초미세 무세포 진피를 수득할 수 있고, 미세 직경의 주사 바늘을 통해서 주입 가능한 초미세 무세포 진피의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 무세포 진피를 회전 로터를 이용하여 8,000 내지 6,000 rpm으로 분쇄하는 1차 분쇄 단계;
상기 1차 분쇄된 무세포 진피를 동결하고, 상기 동결된 무세포 진피 및 금속 막대를 분쇄 용기에 넣은 다음 충격을 통해 동결 분쇄하는 2차 분쇄 단계; 및
상기 2차 분쇄된 무세포 진피를 음압 조건하에서 체분리하는 체분리 단계를 포함하는 초미세 무세포 진피의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 초미세 무세포 진피; 및
용액을 포함하는 주사용 무세포 진피 조성물을 제공한다.
본 발명은 주입 가능한 초미세 무세포 진피의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서는 무세포 진피를 초미세화하는 1차 분쇄 및 2차 분쇄 단계로 기존 공정 대비 초미세 무세포 진피의 수득률을 증가시키며, 음압을 이용한 체분리 단계를 통해 균일한 크기의 초미세 무세포 진피의 수득에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다. 또한, 초미세화 이후에도 무세포 진피의 주성분인 제1형 콜라겐의 성상 및 형태를 유지할 수 있다.
본 발명에 따른 초미세 무세포 진피는 용액과 혼합하여 미세 직경의 주사바늘을 통해 인체에 주입 가능한 조성물로 제공될 수 있다.
도 1은 초미세 무세포 진피의 제조 방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 체분리 단계의 유무에 따른 초미세 무세포 진피의 입도 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 초미세 무세포 진피를 Scanning electron microscope (SEM)으로 촬영한 사진이다.
도 4는 초미세 무세포 진피의 주성분인 제1형 콜라겐을 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 나타낸 사진이다.
도 5는 초미세 무세포 진피의 주성분인 제1형 콜라겐을 Western blot으로 나타낸 사진이다.
도 6은 초미세 무세포 진피 및 용액을 포함하는 조성물의 주입력을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 무세포 진피를 회전 로터를 이용하여 800 내지 6,000 rpm으로 분쇄하는 1차 분쇄 단계;
상기 1차 분쇄된 무세포 진피를 동결하고, 상기 동결된 무세포 진피 및 금속 막대를 분쇄 용기에 넣은 다음 충격을 통해 동결 분쇄하는 2차 분쇄 단계; 및
상기 2차 분쇄된 무세포 진피를 음압 조건하에서 체분리하는 체분리 단계를 포함하는 초미세 무세포 진피의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 무세포 진피를 초미세화하는 1차 및 2차 분쇄 단계를 통해 기존 공정 대비 초미세 무세포 진피의 수득률을 증가시킬 수 있고, 음압을 이용한 체분리 단계를 통해 균일한 크기의 초미세 무세포 진피의 수득 시간을 단축시킬 수 있다. 본 발명의 제조 방법에 수득된 초미세 무세포 진피는 상기 무세포 진피의 주성분인 제1형 콜라겐의 형태와 성상을 유지할 수 있다. 또한, 제조된 초미세 무세포 진피는 용액과 혼합하여 미세 직경의 주사 바늘을 통해 인체에 주입 가능하다.
본 발명에서 수치는 이상, 이하 또는 초과, 미만으로 한정하였으나, 별도의 기재가 없으면 이상 또는 이하를 나타낸다.
이하, 본 발명에 따른 초미세 무세포 진피의 제조 방법을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 초미세 무세포 진피는 본 발명의 제조 방법, 즉, 1차 분쇄, 2차 분쇄 및 체분리 단계를 통해 제조된 균일한 입도 분포를 가지는 무세포 진피 입자를 의미한다. 이러한 초미세 무세포 진피의 평균 입도는 120 ㎛ 이하, 110 ㎛ 이하 또는 100 ㎛ 이하일 수 있다.
본 발명에서 평균 입도는 입도 분석장비(LS13320XR, BECKMAN COULTER)의 습식 모드를 이용하여 D10, D50, D90의 평균값으로 계산될 수 있다.
본 발명에서 무세포 진피(ADM)는 무세포화 기술을 통해 얻어지는 진피층 기질을 의미하며, 상기 진피는 동종 또는 이종의 피부로부터 얻어질 수 있다. 상기 동종은 인간을 의미하며, 이종은 인간 이외의 동물, 즉, 돼지, 소, 말 등의 포유류를 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 무세포 진피로 시판되는 무세포 진피 제품을 사용할 수 있으며, 또는 피부 조직에서 세포를 제거하여 사용할 수도 있다.
일 구체예에서, 무세포 진피는 진피 조직에서 지질 성분을 제거하는 단계; 및
상기 지질 성분이 제거된 진피 조직에서 세포를 제거하는 단계를 통해 제조될 수 있다.
상기 진피 조직에서 지질 성분을 제거하는 단계에서는 진피 조직을 탈지방화(delipidation)할 수 있다.
일 구체예에서, 탈지방화는 탈지질 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 탈지질 용액은 극성 용매, 비극성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 포함할 수 있다. 상기 극성 용매로는 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있으며, 알코올로는 메탄올, 에탄올 또는 이소프로필 알코올을 사용할 수 있다. 또한, 비극성 용매로는 헥산, 헵탄, 옥탄, 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 구체적으로, 탈지질 용액으로 이소프로필 알코올(IPA) 및 헥산(Hexane)의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 이때, 이소프로필 알코올 및 헥산의 혼합 비율(중량%)은 20:80 내지 80:20일 수 있다.
상기 지질 성분이 제거된 진피 조직에서 세포를 제거하는 단계에서는 진피 조직을 탈세포화(decellularization)할 수 있다. 탈세포화는 진피 조직으로부터 세포외기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들면 핵, 세포막, 핵산 등을 제거하는 것을 의미한다.
일 구체예에서, 탈세포화는 탈세포 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 탈세포 용액으로 계면활성제 및/또는 염기성 용액을 사용할 수 있다. 구체적으로, 계면활성제로 소듐도데실 설페이트(SDS)와 같은 이온성 계면활성제, 또는 트리톤 엑스-100, 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 80, 노니데트 피-10(NP-10), 노니데트 피-40(NP-40) 등과 같은 비이온성 계면활성제 등을 사용할 수 있다. 또한, 염기성 용액으로 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 무세포 진피는 콜라겐 및 엘라스틴 등으로 구성되는 세포외기질(Extracellular Matrix)로 구성될 수 있다.
본 발명에서 1차 분쇄 단계는 무세포 진피를 회전 로터를 이용하여 800 내지 6,000 rpm으로 분쇄하는 단계이다.
일 구체예에서, 상기 단계는 회전분쇄기를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 회전분쇄기로, IKA사의 MF-10 제품을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 무세포 진피는 회전 로터에 적용 가능한 크기로 절단된 다음 1차 분쇄에 이용될 수 있다. 이때 상기 무세포 진피의 크기는 가로 및 세로가 각각 0.5 내지 2 mm일 수 있다.
일 구체예에서, 1차 분쇄는 1,000 내지 5,000 rpm, 2,500 내지 5,500 rpm, 2,500 내지 4,500 rpm 또는 3,000 내지 4,000 rpm으로 수행할 수 있다. 또한, 1차 분쇄 시간은 10 내지 50 분, 10 내지 30 분 또는 20 내지 25 분일 수 있다. rpm이 증가함에 따라 무세포 진피의 입도가 작아지나, 6,000 rpm 초과에서는 유의미한 입도 감소 효과를 얻지 못하므로 rpm을 상기 범위로 조절하는 것이 좋다. 즉, 전술한 rpm 및 시간 범위가 공정 효율상 바람직하다.
일 구체예에서, 1차 분쇄된 무세포 진피의 평균 입도는 600 내지 900 ㎛, 600 내지 850 ㎛ 또는 600 내지 750 ㎛일 수 있다. 상기 입도 범위에서 인체 주입에 적합한 무세포 진피를 효율적으로 제조할 수 있으며, 2차 분쇄를 위한 분쇄 장치에 적용 가능하다.
본 발명에서 2차 분쇄는 전술한 단계에서 1차 분쇄된 무세포 진피를 2차 분쇄하는 단계이다.
상기 2차 분쇄는 1차 분쇄된 무세포 진피를 동결하고, 상기 동결된 무세포 진피 및 금속 막대를 분쇄 용기에 넣은 다음 충격을 통해 동결 분쇄할 수 있다.
일 구체예에서, 무세포 진피의 동결 건조는 당업계의 일반적인 방법을 통해 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 2차 분쇄는 동결분쇄기를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 동결분쇄기로, SPEX Sample Prep사의 6875D 제품을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 금속 막대의 재질은 스테인리스 스틸 또는 티타늄일 수 있다. 또한, 금속 막대의 크기는 분쇄 용기의 크기에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어, 가로 5 내지 8cm 및 세로 1 내지 3 cm일 수 있다.
일 구체예에서, 동결된 무세포 진피 및 금속 막대를 분쇄 용기에 넣은 다음 10 내지 60 분 동안 동결하는 공정을 추가로 수행할 수 있다.
일 구체예에서, 2차 분쇄는 1 내지 60 사이클(cycle), 1 내지 45 사이클, 10 내지 40 사이클 또는 16 내지 30 사이클 동안 수행할 수 있다. 또한, 2차 분쇄는 20 내지 100 분, 20 내지 80 분 또는 20 내지 60 분 동안 수행할 수 있다. 상기 사이클 및 시간 범위에서 분쇄 용기 내의 금속 막대가 빠르게 움직이면서 시료, 즉, 무세포 진피를 미세하게 분쇄할 수 있다. 60 사이클 초과에서는 유의미한 입도 감소 효과를 얻지 못하므로 사이클을 상기 범위로 조절하는 것이 좋다
일 구체예에서, 2차 분쇄된 무세포 진피의 평균 입도는 350 ㎛ 이하, 300 ㎛ 이하, 250 ㎛ 이하, 또는 100 내지 250 ㎛일 수 있다. 상기 입도 범위에서 인체 주입에 적합한 무세포 진피를 효율적으로 제조할 수 있다.
본 발명에서 체분리 단계는 전술한 2차 분쇄 단계에서 2차 분쇄된 무세포 진피를 음압 조건하에서 체분리하는 단계이다.
일 구체예에서, 체의 눈금 크기는 100 내지 300 ㎛, 150 내지 250 ㎛ 또는 200 ㎛일 수 있다.
일 구체예에서, 체분리 단계는 무세포 진피를 체에 올려둔 다음 상기 체 상단을 밀봉하고 하단을 음압으로 흡입하는 방법으로 수행할 수 있다. 이러한 음압은 500 내지 5000 mmAq 또는 1000 내지 3000 mmAq의 압력일 수 있다.
일 구체예에서, 체분리 시간은 1 내지 20 분, 또는 1 내지 10 분일 수 있다.
상기 체분리 단계를 통해 균일한 입도 분포를 가지는 초미세 무세포 진피를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에 의해 제조된 초미세 무세포 진피의 평균 입도는 120 ㎛ 이하, 110 ㎛ 이하 또는 100 ㎛ 이하일 수 있다. 상기 평균 입도의 하한은 30 ㎛ 이상일 수 있다.
또한, 초미세 무세포 진피의 수득률은 60% 이상, 70% 이상, 또는 80% 이상일 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 제조 방법을 통해 기존 방법 대비 초미세 무세포 진피를 짧은 공정 시간 및 높은 수득률로 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 초미세 무세포 진피의 제조 방법에 의해 제조된 초미세 무세포 진피에 관한 것이다.
본 발명에 따른 초미세 무세포 진피는 콜라겐 및 엘라스틴 등으로 구성되는 세포외기질(Extracellular Matrix)로 구성되며, 분쇄 과정을 거침에도 무세포 진피의 주성분인 제1형 콜라겐의 성상 및 구조를 유지할 수 있다.
일 구체예에서, 초미세 무세포 진피는 120 ㎛ 이하, 110 ㎛ 이하 또는 100 ㎛ 이하의 평균 입도를 가지며, 이를 통해 주사를 통한 인체에 주입용으로 적용 가능하다.
또한, 본 발명은 전술한 초미세 무세포 진피; 및
용액을 포함하는 주사용 무세포 진피 조성물에 관한 것이다.
일 구체예에서, 용액으로 멸균생리식염수 또는 멸균증류수를 사용할 수 있다.
상기 무세포 진피 조성물에서 초미세 무세포 진피의 함량은 전체 조성물 중량(100 중량부) 대비 5 내지 70 중량부 또는 10 내지 50 중량부일 수 있다.
일 구체예에서, 무세포 진피 조성물은 주사용으로 사용되며, 주입 압력은 40 N 이하일 수 있다. 상기 주입력은 본 발명의 실험예 4의 방법에 따라 측정될 수 있다.
일 구체예에서, 무세포 진피 조성물은 성형용 조직수복용 재료 또는 욕창, 족부 궤양과 같은 창상 피복재로 사용될 수 있다.
하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범주는 하기 실시예에 한정되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항에 의해 도출되는 기술적 사항을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형, 수정 또는 응용이 가능하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다.
실시예
실시예 1. 무세포 진피의 초미세화
(1) 무세포 진피 제조
멸균증류수로 동물의 진피 조직을 세척하였다. 세척된 동물의 진피 조직을 scrapper 등을 이용하여 근막 및 지방을 제거하였다. 상기 진피 조직은 표피를 제거하기 위해 0.1M 내지 15M 염화나트륨을 6 내지 12 시간 동안 처리하였다. 표피가 제거된 진피 조직을 멸균증류수로 세척하였다. 세척 후, 지방을 제거하기 위해 10% 내지 50% 아이소프로필 알코올과 10% 내지 50% 헥산을 이용하여 1 내지 6 시간 동안 처리하였다. 그리고 0.1% 내지 10% SDS 용액을 처리하여 세포를 제거하였다. 세포가 제거된 진피 조직을 -70℃ 이하의 온도에서 2 내지 6 시간 동결하였다. 동결이 완료된 진피 조직을 12 내지 24 시간 건조하여 무세포 진피를 제조하였다.
(2) 무세포 진피의 1차 분쇄 및 2차 분쇄
무세포 진피의 초미세화는 1차 분쇄 및 2차 분쇄 및 체분리 순으로 진행되었다(도1).
1차 분쇄는 가로, 세로 10 mm x 10 mm 크기의 무세포 진피를 1000 rpm 내지 5000 rpm으로 회전하는 로터(MF-10, IKA 사)를 이용하여 분쇄하는 방식으로 진행하였다.
2차 분쇄는 6875D(SPEX Sample Prep 사)의 기기를 사용하여 진행하였다. 구체적으로, -70℃에서 12 내지 24 시간 동안 동결된 무세포 진피와 금속 막대를 분쇄 용기에 담아 밀봉하고, 액체질소가 채워진 용기 내부에 장착하여 10 분 내지 1 시간 동결한 다음, 무세포 진피가 들어있는 분쇄 용기를 1 내지 60 cycle 반복해서 움직이는 방식으로 진행하였다.
(3) 분쇄된 무세포 진피의 체분리
1차 및 2차 분쇄를 통해 분쇄된 무세포 진피를 200 ㎛ 크기의 분리체에 올려둔 뒤 분리체 상단을 밀봉하고 하단을 1000 내지 3000 mmAq의 압력으로 흡입하여 초미세 무세포 진피를 수득하였다.
실험예 1. 무세포 진피의 1차 분쇄 및 2차 분쇄 효과 검증
1차 분쇄에서 rpm 차이에 따른 무세포 진피의 입도 및 분쇄 소요 시간을 확인하기 위해서, 1차 분쇄를 1000 rpm 이상 내지 2000 rpm 미만, 2000 rpm 이상 내지 3000 rpm 미만, 3000 rpm 이상 내지 4000 rpm 미만, 4000 rpm 이상 내지 5000 rpm 미만으로 진행한 다음, 시료의 입도 및 소요 시간을 확인하였다.
또한, 2차 분쇄에서 cycle 차이에 따른 무세포 진피의 입도 및 분쇄 소요 시간을 확인하기 위해서, 2차 분쇄를 1 cycle 내지 15 cycle, 16 cycle 내지 30 cycle, 31 cycle 내지 45 cycle으로 진행한 다음 시료의 입도 및 소요 시간을 확인하였다.
이때, 입도는 평균 입도로 입도 분석장비(LS13320XR, BECKMAN COULTER)의 습식 모드를 이용하여 측정하였다.
하기 표 1은 1차 및 2차 분쇄 단계에 따른 무세포 진피의 입도 및 총 분쇄 소요 시간을 나타낸다.
Figure PCTKR2021016329-appb-img-000001
표 1에 나타난 바와 같이, 1차 분쇄 시 rpm이 증가함에 따라 입도가 작아지나, 3000 rpm 내지 4000 rpm로 진행한 시료(시료 3)와 4000 rpm 내지 5000 rpm 진행한 시료(시료 4)의 입도가 오차범위 내에 있는 것을 확인할 있다. 또한, 소요 시간은 3000 rpm 내지 4000 rpm으로 진행한 시료가 4000 rpm 내지 5000 rpm으로 진행한 시료보다 약 1 분 내지 7 분 정도 짧았다. 이를 통해, 4000 rpm 이상에서는 유의미한 입도 감소 효과를 얻지 못하며, 1차 분쇄를 4000 rpm 미만으로 진행하는 것이 공정 효율상 바람직함을 확인할 수 있다.
또한, 2차 분쇄 시, cycle이 증가함에 따라 입도가 작아지나, 2차 분쇄를 16 cycle 내지 30 cycle로 진행한 시료(시료 6)와 31 cycle 내지 45 cycle로 진행한 시료(시료 7)가 오차범위 내에 있는 것을 확인할 수 있다. 또한, 소요 시간은 16 cycle 내지 30 cycle로 진행한 시료가 31 cycle 내지 45 cycle로 진행한 시료보다 약 41 분 내지 47 분 정도 짧았다. 이를 통해, 30 cycle 초과에서는 유의미한 입도 감소 효과를 얻지 못함을 확인할 수 있다.
특히, 1차 분쇄를 3000 rpm 내지 4000 rpm으로 진행한 다음 2차 분쇄를 진행한 시료 8 내지 10의 입자의 입도는 2차 분쇄만 진행한 시료보다 93 ㎛ 내지 247 ㎛ 작았으며, 약 300 ㎛ 이하로 미세한 입도를 가지는 무세포 진피를 수득할 수 있음을 확인할 수 있다.
1차 분쇄와 함께 2차 분쇄를 16 cycle 내지 30 cycle로 진행한 시료(시료 9)와 31 cycle 내지 45cycle로 진행한 시료(시료 10)는 입도가 오차범위 내에 있고, 소요 시간도 시료 9가 시료 10 보다 약 28 분 내지 50 분 정도 짧아, 2차 분쇄를 30 cycle 이하에서 진행하는 것이 공정 효율상 바람직함을 확인할 수 있다.
실험예 2. 초미세 무세포 진피의 체분리 효과 검증
초미세 무세포 진피의 체분리 효과를 확인하기 위해, 1차 분쇄를 3000 rpm 내지 4000 rpm으로 진행하고, 2차 분쇄를 1 내지 15 cycle, 16 내지 30 cycle 및 31 내지 45 cycle로 진행한 시료에 대하여 체분리 유무에 따른 입도, 수득률 및 소요 시간을 확인하였다.
하기 표 2는 1차 분쇄, 2차 분쇄 및 체분리 단계에 따른 초미세 무세포 진피의 입도, 수득률 및 전체 소요 시간을 나타낸다.
Figure PCTKR2021016329-appb-img-000002
표 2에 나타난 바와 같이, 체분리를 수행한 시료의 입도는 체분리를 하지 않은 시료보다 약 154 내지 279 ㎛ 정도 작은 것을 확인할 수 있다. 또한, 체분리를 수행한 시료의 입도, 수득률 및 소요 시간을 비교 하였을 때, 1차 분쇄 이후에 2차 분쇄의 cycle이 증가함에 따라 입도가 작아지나, 2차 분쇄를 16 내지 30 cycle로 진행한 시료(시료 16)와 31 내지 45 cycle로 진행한 시료(시료 17)는 오차범위 내에 있는 것을 확인할 수 있다. 또한, 소요 시간도 시료 16은 시료 17 보다 약 31 내지 53 분 정도 짧은 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 2차 분쇄를 30 cycle 이하에서 진행하는 것이 공정 효율상 바람직함을 확인할 수 있다.
또한, 체분리 단계에서 음압 유무에 따른 수득 시간을 확인하였다. 구체적으로 표 2의 시료 16의 평균 수득률 82%를 무세포 진피의 최대 수득률로 설정하고 수득에 소요되는 시간을 확인하였다.
하기 표 3은 체분리 단계의 음압 유무에 따른 수득에 소요되는 체분리 시간을 나타낸 표이다.
Figure PCTKR2021016329-appb-img-000003
표 3에 나타난 바와 같이, 음압이 있는 체분리 단계의 수득 시간은 5 분인 반면, 음압이 없는 체분리 단계의 수득 시간은 90 분으로 음압에 의해 체분리 단계의 시간이 크게 단축됨을 확인할 수 있다.
또한, 1차 및 2차 분쇄를 연쇄적으로 진행한 시료의 체분리 유무에 따른 변동계수를 확인하였다.
상기 변동계수는 표준편차를 산술평균으로 나눈 값으로서, 시료 9 및 시료 16을 LS13320XR(BECKMAN COULTER 사)를 사용하여 측정된 값으로부터 계산하였다.
도 2는 체분리 단계 유무에 따른 초미세 무세포 진피의 입도 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
상기 도 2에 나타난 바와 같이, 체분리를 진행하지 않은 시료(시료 9)의 변동계수는 141%이고 체분리를 진행한 시료(시료 16)의 변동계수는 96%로, 체분리를 진행한 시료의 변동계수가 더 낮은 것을 확인할 수 있다.
이를 통해 체분리를 진행한 시료의 입도가 체분리를 진행하지 않은 시료의 비해 균일한 것을 확인할 수 있다.
실험예 3. 초미세 무세포 진피의 성분 검증
초미세 무세포 진피의 성분 검증을 위해서 균일한 크기의 초미세 무세포 진피(시료 16)와 초미세화 공정(즉, 분쇄 공정 및 체분리 공정)을 진행하지 않은 무세포 진피를 사용하여 SEM 촬영, SDS-PAGE 및 Western blot을 진행하였다.
도 3은 초미세 무세포 진피를 Scanning electron microscope (SEM)으로 촬영한 사진이다.
도 3에 나타난 바와 같이, 콜라겐 섬유의 형태와 성상이 초미세화 공정 이후에도 유지됨을 확인할 수 있다.
또한, 도 4는 초미세 무세포 진피의 주성분인 제1형 콜라겐을 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 나타낸 사진이다. 그리고, 도 5는 초미세 무세포 진피의 주성분인 제1형 콜라겐을 Western blot으로 나타낸 사진이다.
도 4 및 5에 나타난 바와 같이, SDS-PAGE 및 Western blot 결과, 초미세화 공정 이후에도 제1형 콜라겐이 유지됨을 확인할 수 있다.
실시예 2. 초미세 무세포 진피와 용액의 혼합액 제조
광구병에 전술한 시료 3, 시료 6, 시료 9, 시료 11, 시료 13 및 시료 16에 해당하는 초미세 무세포 진피를 각각 5% 내지 50% 담고, 용액(멸균생리식염수 또는 멸균증류수)을 각각 50% 내지 95% 담아 삼차원으로 회전하는 로터에 장착하여 10 내지 150 rpm으로 30 분 내지 2 시간 동안 혼합하여 혼합액을 제조하였다.
실험예 4. 혼합액의 주입력 측정
초미세 무세포 진피와 용액의 혼합액에 대한 주입력을 확인하였다.
체분리 유무에 따라 1차 분쇄만 진행한 무세포 진피(시료 3, 시료 11), 2차 분쇄만 진행한 무세포 진피(시료 6, 시료 13) 및 1차 및 2차 분쇄를 연쇄적으로 진행한 무세포 진피(시료 9, 시료 16) 각각을 용액과 혼합한 혼합액을 주사기에 담고 30G 주사 바늘을 장착하였다. 그리고 UTM(universal testing machine)에 주사기를 장착한 뒤 12 mm/min 속도로 작동하여 주입력을 확인하였다.
도 6은 초미세 무세포 진피와 용액의 혼합물에 대한 주입력을 나타낸 그래프이다.
구체적으로 도 6a는 시료 3, 도 6b는 시료 11, 도 6c는 시료 6, 도 6d는 시료 13, 도 6e는 시료 9 및 도 6f는 시료 16의 무세포 진피를 사용한 혼합액의 주입력을 나타낸다.
도 6에 나타난 바와 같이, 1차 분쇄, 2차 분쇄 및 체분리를 함께 진행한 초미세 무세포 진피를 혼합한 혼합액만이 40 N 이하의 주입력을 가지는 것을 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 초미세 무세포 진피는 용액과 혼합하여 미세 직경의 주사바늘을 통해 인체에 주입 가능한 조성물로 제공될 수 있다.

Claims (13)

  1. 무세포 진피를 회전 로터를 이용하여 800 내지 6,000 rpm으로 분쇄하는 1차 분쇄 단계;
    상기 1차 분쇄된 무세포 진피를 동결하고, 상기 동결된 무세포 진피 및 금속 막대를 분쇄 용기에 넣은 다음 충격을 통해 동결 분쇄하는 2차 분쇄 단계; 및
    상기 2차 분쇄된 무세포 진피를 음압 조건하에서 체분리하는 체분리 단계를 포함하는 초미세 무세포 진피의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    진피은 동종 또는 이종의 진피인 것인 초미세 무세포 진피의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    무세포 진피는 피부 조직에서 세포를 제거하는 단계를 통해 제조된 것인 초미세 무세포 진피의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    1차 분쇄 단계는 10 내지 50 분 동안 수행되는 것인 초미세 무세포 진피의 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    1차 분쇄된 무세포 진피의 평균 입도는 600 내지 900 ㎛인 초미세 무세포 진피의 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    2차 분쇄는 동결분쇄기를 사용하여 수행되는 것인 초미세 무세포 진피의 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    2차 분쇄 단계에서 금속 막대의 재질은 스테인리스 스틸 또는 티타늄인 초미세 무세포 진피의 제조 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    2차 분쇄는 1 내지 60 사이클 동안 수행되며,
    2차 분쇄 시간은 20 내지 100 분인 초미세 무세포 진피의 제조 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    체분리 단계에서 체의 눈금 크기는 100 내지 300 ㎛인 초미세 무세포 진피의 제조 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    체분리 단계는 500 내지 5000 mmAq의 압력에서 수행되며,
    체분리 시간은 1 내지 20 분인 초미세 무세포 진피의 제조 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    제조된 초미세 무세포 진피의 평균 입도는 120 ㎛ 이하인 초미세 무세포 진피의 제조 방법.
  12. 제 1 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된 초미세 무세포 진피; 및
    용액을 포함하는 주사용 무세포 진피 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    주입력은 40 N 이하인 무세포 진피 조성물.
PCT/KR2021/016329 2021-11-10 2021-11-10 동물 피부 유래의 초미세 무세포 진피 제조 방법 WO2023085453A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2021/016329 WO2023085453A1 (ko) 2021-11-10 2021-11-10 동물 피부 유래의 초미세 무세포 진피 제조 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2021/016329 WO2023085453A1 (ko) 2021-11-10 2021-11-10 동물 피부 유래의 초미세 무세포 진피 제조 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023085453A1 true WO2023085453A1 (ko) 2023-05-19

Family

ID=86335947

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/016329 WO2023085453A1 (ko) 2021-11-10 2021-11-10 동물 피부 유래의 초미세 무세포 진피 제조 방법

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023085453A1 (ko)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100514582B1 (ko) * 2001-09-05 2005-09-13 한스바이오메드 주식회사 생체복원물질의 제조방법
KR101579233B1 (ko) * 2012-09-24 2016-01-04 메디칸(주) 면역성이 제거된 생체지방소재 및 이의 제조방법
KR20180028229A (ko) * 2016-09-08 2018-03-16 주식회사 엘앤씨바이오 고농도, 고순도의 동종 콜라겐 제조 방법 및 동종 콜라겐 지지체의 제조방법
KR102201546B1 (ko) * 2020-03-27 2021-01-11 가톨릭대학교 산학협력단 세포가 적재된 생체 이식용 무세포 진피층 및 이의 제조방법
KR102232847B1 (ko) * 2017-04-28 2021-03-26 (주)시지바이오 섬유화 무세포 진피 기질 및 생체적합성 고분자를 포함하는 조성물 및 이의 제조 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100514582B1 (ko) * 2001-09-05 2005-09-13 한스바이오메드 주식회사 생체복원물질의 제조방법
KR101579233B1 (ko) * 2012-09-24 2016-01-04 메디칸(주) 면역성이 제거된 생체지방소재 및 이의 제조방법
KR20180028229A (ko) * 2016-09-08 2018-03-16 주식회사 엘앤씨바이오 고농도, 고순도의 동종 콜라겐 제조 방법 및 동종 콜라겐 지지체의 제조방법
KR102232847B1 (ko) * 2017-04-28 2021-03-26 (주)시지바이오 섬유화 무세포 진피 기질 및 생체적합성 고분자를 포함하는 조성물 및 이의 제조 방법
KR102201546B1 (ko) * 2020-03-27 2021-01-11 가톨릭대학교 산학협력단 세포가 적재된 생체 이식용 무세포 진피층 및 이의 제조방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016167527A1 (ko) 백미 추출물의 지표성분인 시나프산 또는 이를 함유하는 백미 추출물을 함유하는 피부재생용 화장료 조성물 및 상처 치료용 약학 조성물
WO2011105663A1 (ko) 무세포 진피 기질의 제조 방법 및 그로부터 제조된 무세포 진피 기질
WO2016072821A1 (ko) 줄기세포 유래 엑소좀을 함유하는 지방세포 분화유도, 지방조직 재생, 피부 미백 또는 주름개선용 조성물
WO2019203556A1 (ko) 키토산 섬유성 스폰지 구조의 의료용 드레싱재 및 그 제조 방법
WO2014092239A1 (ko) 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 및 그 제조방법
WO2018199698A1 (ko) 섬유화 무세포 진피 기질 및 생체적합성 고분자를 포함하는 조성물 및 이의 제조 방법
WO2011059292A2 (ko) 피부세포증식 촉진, 항산화 및 항알러지 효과가 우수한 알로에 베라 새순 농축물 또는 추출물
WO2017074093A1 (ko) 섬유화 무세포 진피 기질 및 생체적합성 고분자를 포함하는 창상 피복재 및 이의 제조 방법
WO2021230487A1 (ko) 양막상피세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 안구질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2023085453A1 (ko) 동물 피부 유래의 초미세 무세포 진피 제조 방법
WO2020218669A1 (ko) 보습력이 향상된 마스크팩 조성물
WO2021125373A1 (ko) 지방조직 유래 세포외기질을 포함하는 의료용 조성물 및 그 제조방법
WO2018151560A1 (ko) 항주름 효능을 가지는 저분자 말태반 효소가수분해물의 제조방법
WO2020218670A1 (ko) 주름개선력이 향상된 마스크팩 조성물
WO2012081944A2 (en) Dental membrane and method of manufacturing the same
WO2019245332A1 (ko) 베타글루칸, 글리시틴 및 4',6,7-트리메톡시이소플라본을 포함하는 창상 치료 또는 피부 활성용 약학적 조성물
WO2022164277A1 (ko) 금속-유기 골격체 및 실리콘 조성물을 포함하는 실리콘 패치
WO2022158816A1 (ko) 줄기세포 유래 엑소좀, 히알루론산, 및 bdde를 포함하는 피부 주름개선용 필러 조성물 및 이의 제조 방법
WO2022138993A1 (ko) 진피조직 유래 세포외기질을 포함하는 창상 치료용 조성물 및 그 제조방법
WO2013042868A1 (en) Method of obtaining silkworm gland-derived hydrolysate
WO2020246781A1 (ko) 연질 생체 조직을 미립자화하는 방법 및 이의 방법으로 제조된 연질 생체 조직 미립자 이식편
WO2021040141A1 (ko) 동물지방 유래 세포외기질 및 동물지방 유래 세포외기질 보존액
WO2011142588A9 (ko) 피부결함의 완화 또는 치료를 위한 자가피부세포치료제의 제조방법
WO2022131407A1 (ko) 기저막층을 포함하는 진피 기반 인공 피부 및 그 제조방법
WO2019190010A1 (ko) 피부 주름 개선, 보습, 항산화 및 염증 완화 효과가 증가된 진피, 후박, 현호색, 아선약의 에탄올 추출 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21964163

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1