WO2011142588A9 - 피부결함의 완화 또는 치료를 위한 자가피부세포치료제의 제조방법 - Google Patents

피부결함의 완화 또는 치료를 위한 자가피부세포치료제의 제조방법 Download PDF

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정효선
이정희
윤천재
손태식
김경식
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an autologous skin cell therapy for alleviating or treating skin defects. More specifically, unlike a conventional cell therapy, a cell therapy can be prepared in a short time by eliminating an enzyme or a culture step. Provide a way.
  • Defects in skin tissues such as burns, cuts, and depigmented skin can lead to scarring, prolonged periods of treatment, and other skin diseases if not properly treated or improperly treated.
  • the conventional method for producing a cell therapeutic agent using autologous cells uses a method of harvesting specific cells by treating an enzyme and culturing the collected cells for several days. Therefore, the conventional cell therapy has a problem in that it is not suitable for a patient who takes a long time to incubate the cell and the degree of skin defect such as burn is serious and urgently needs treatment.
  • an object of the present invention is a method for producing a cell therapy for alleviating or treating skin defects using autologous skin cells that are not isolated by enzymatic treatment, and for preparing cell therapy and cell therapy prepared by the above method. To provide a device.
  • the above object is, according to the present invention, a method for producing a cell therapy for alleviating or treating skin defects, comprising the steps of: obtaining normal skin tissue at one donor site derived from autologous skin tissue; Grinding the obtained normal skin tissue into cells; It can be achieved by providing a method for producing a cell therapy comprising the step of obtaining a skin cell group comprising at least any one of keratinocytes, melanocytes and fibrous cells from the tissue lysate after the grinding.
  • the grinding step may be a step of grinding the normal skin tissue by cell units using a tissue grinder for 10 to 60 seconds per 1 cm 2 of the normal skin tissue size.
  • the grinding step may be a step of grinding the normal skin tissue so that the concentration of the ground cells is 1 to 40 x 10 7 / cm 2 .
  • the obtained keratinocytes may be included in 60 to 90% of the total acquired cells.
  • the obtained melanocytes may be contained in 1 to 5% of the total obtained cells.
  • the obtained fibrous cells may be included in 10 to 40% of the total obtained cells.
  • the acquiring step may be characterized in that the skin cell group including the obtained keratinocytes, melanocytes and fibroblasts is not cultured.
  • the acquiring step may be characterized in that it does not perform any enzyme treatment for acquiring a skin cell group including at least one of the keratinocytes, melanocytes and fibroblasts.
  • the skin defect may include any one selected from the group consisting of skin wounds, wounds, skin scars, depigmented skin wounds due to burns.
  • the above object can be achieved by a cell therapy prepared by the method for producing a cell therapy described above.
  • the cells separated from the cells by enzymatic treatment of autologous skin cells are also isolated. It can be prepared as a cell therapy without performing the culturing step, and has an effect that can be easily and quickly applied to the affected area.
  • the present invention even if the normal skin tissue obtained from the subject is a small amount, it has the effect of producing a cell therapy that can be applied to a wide affected area.
  • FIG. 1 is a flow chart showing a method for producing a cell therapy according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of a hemocytometer
  • 3a to 3b is a view showing the result of confirming the cell size of the cell therapy prepared according to an embodiment of the present invention
  • Figure 4 is a view showing the clinical effect on the burn site of the cell therapy prepared according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 5 is a view showing another clinical effect on the burn site of the cell therapy prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6a is a view showing the electron microscope confirmation results of the cells isolated by the conventional enzyme treatment
  • Figure 6b is a view showing the results of the electron microscope confirmation of the isolated cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a view showing the effect of the animal experiment on the burn of the cell therapy prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8A is a view showing H & E staining results of the image part of FIG. 7;
  • FIG. 8B is a view illustrating MT staining results of the image part of FIG. 7;
  • FIG. 9 is a view showing the effect of animal testing on the wound of the cell therapy prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10a is a view showing the MT staining result after applying the control to the wound of Figure 9,
  • Figure 10b is a diagram showing the MT staining result after applying the cell therapy prepared according to an embodiment of the present invention to the wound site of Figure 9.
  • FIG. 1 is a flowchart of a method for producing a cell therapy agent of the present invention.
  • the method for producing a cell therapy of the present invention comprises the steps of acquiring normal skin tissue at one donor site derived from autologous skin tissue (S11); Grinding the obtained normal skin tissue into cells (S12); And obtaining a skin cell group including at least one of keratinocytes, melanocytes, and fibrous cells from the tissue lysate after the grinding (S13).
  • Method for producing a cell therapy of the present invention is a method for producing a cell therapy for the relief or treatment of skin defects in mammals.
  • the present invention relates to a method for preparing a cell therapy agent for alleviating or treating skin defects in humans.
  • the acquiring step of the normal skin tissue may be obtained from the subject by using a skin extractor (Dermatome).
  • the subject may include a mammal or a human.
  • the normal skin tissue can be obtained by cutting to a size of (1 to 5mm) x (1 to 5mm), the number of tissue having the size can be obtained in consideration of the size of the affected area, for example the size It is possible to obtain 1 to 30 pieces, more preferably 5 to 25 pieces, and even more preferably 10 to 25 pieces.
  • the obtained normal skin tissue can be used by washing with physiological saline or annihilate.
  • the washed tissue can be used by sterilization using conventional methods.
  • the grinding of the normal skin tissue is a step of grinding the obtained normal skin tissue in units of cells.
  • the milling can be carried out using a conventional tissue mill that can typically mill the tissue.
  • tissue When the tissue is pulverized, a small amount of physiological saline or sterile water may be pulverized in consideration of the amount of the tissue to be pulverized, and preferably 1-10 cc, more preferably 1-5 cc of physiological saline or sterile water is added. Can be pulverized.
  • the grinding time can be set in consideration of the amount of the tissue, preferably 1 to 60 seconds per 1 cm 2 of the tissue size, more preferably 10 to 60
  • the tissue can be milled cell-by-cell for seconds.
  • the tissue may be pulverized such that the concentration of the pulverized cells is (1 to 40) x10 7 cells / cm 2 .
  • the concentration of the cells may vary depending on the age of the subject or the condition of the tissue.
  • the acquiring of the skin cell group means acquiring a skin cell group including at least one of keratinocytes, melanocytes, and fibrous cells from the tissue lysate after the grinding.
  • the keratinocytes are keratinocytes that produce keratin and create physical barriers to protect individuals from harmful factors from the outside, and produce and secrete various biological response modulators that regulate immunological responses. It is an important component in regulating immune and inflammatory responses.
  • the melanocytes are cells that produce melanin, a brown or black pigment present in animal tissues and skin, and continuously send melanin granules made in the cells to epidermal cells. The higher the amount, the more the skin color becomes yellowish brown to blackish brown, and the smaller the color becomes, the thinner the color becomes.
  • the fibroblasts also called fibroblasts, are cells that form an important component of fibrous connective tissue and are flat and elongated when viewed with tissue sections and often have irregular projections.
  • the acquiring step is to obtain a skin cell group including the keratinocytes, melanocytes, and fibrous cells from the tissue lysate after crushing the tissue.
  • the obtained skin cell group including at least one of keratinocytes, melanocytes, and fibrous cells may include not only cells that have survived but also cells that are destroyed in the grinding step.
  • the obtained keratinocytes may be included in 60 to 90% of the total acquisition cells, the obtained melanocytes may be included in 1 to 5% of the total acquisition cells, the acquisition The fibroblasts can be included in 10 to 40% of the total acquired cells.
  • a method capable of separating keratinocytes, melanocytes, or fibrous cells from the normal skin tissue without treating any enzyme there is provided a cell therapeutic agent which can be directly applied to the affected area without culturing a skin cell group including at least one of the obtained keratinocyte melanocytes and fibrous cells.
  • the cell therapy prepared by the manufacturing method according to the present invention is excluded from the cell separation process by the enzyme treatment, and the culture process of the separated cells is excluded, so that can be prepared in a very short time and immediately after the preparation to the affected area It is very effective to apply.
  • the skin defect may include any one selected from the group consisting of skin wounds, wounds, skin scars, depigmented skin wounds due to burns.
  • Normal skin tissues were obtained by cutting a skin tissue of 4x5mm size from a 47-year-old female and a 36-year-old female, each 20 using a skin extractor, washed with physiological saline, and sterilized. The sterilized tissue was pulverized for about 30 seconds using a tissue grinder with the addition of 2cc of sterile water.
  • a 47-year-old female autologous skin cell was obtained by obtaining a skin cell group including at least one of keratinocytes, melanocytes, and fibrous cells from tissue lysates using a cell strainer. Cell therapy and cell therapy using autologous skin cells of 36 year old women were prepared.
  • the hemocytometer has two chambers, which are divided into regular squares by slide glass with horizontal and vertical hatchings on the surface thereof, and microscopically examine cells existing in a constant volume rectangular section of each chamber. The number of cells can be counted under to determine the concentration of cells present in the entire sample.
  • the concentration of the cells was measured by the following Equation 1.
  • Cell concentration of the cell concentration of the measurement result is a cell concentration of cell therapy using about 1.4x10 8 cells were, 36-year-old female self skin cells per cm2 is 2.4x10 8 cells It was confirmed.
  • the size of the keratinocytes, melanocytes, and fibroblasts of the 47-year-old female autologous skin cells and the 36-year-old autologous skin cells were determined.
  • the procedure of the cell size confirmation experiment followed the general experimental procedure.
  • the size of primary cells that is, normal cells, was confirmed.
  • the cell size was confirmed under a microscope.
  • FIG. 3a is a result of observing primary cells under a microscope as a comparative example
  • FIG. 3b is a result of observing a cell size of a cell therapy prepared using autologous skin cells of the 36-year-old woman
  • FIG. 3c is The cell size of a 47-year-old woman using autologous skin cells was observed under a microscope.
  • the primary cell in the case of the primary cell (comparative example) is the size of 10-25 um
  • the cells included in the cell therapy using autologous skin cells of the 36-year-old The size was 6-15 um
  • the size of the cells included in the cell therapy product using the autologous skin cells of the 47 year old female was also confirmed to be 6-15um. Therefore, it can be seen that the cell size included in each of the 47- and 36-year-old female cell therapy products using autologous skin cells is included in the range of the size of the cells.
  • the survival rate of the cells contained in the 47-year-old female autologous skin cells and 36-year-old autologous skin cells were confirmed. 100 ⁇ l of each cell therapeutic agent 100 ⁇ l trypan blue was added and mixed well, and then slowly injected into a hemocytometer covered with a cover glass (see FIG. 2). After about 1 minute, the cell viability was calculated using the following equations (2) to (4) by measuring the number of cells (dead cells) and cells not dyed (surviving cells) that were stained under a microscope.
  • the cell survival rate of the 47-year-old female cell therapy using autologous skin cells was 72%, 36-year-old female was 72.5%, showing a high cell viability.
  • the burn affected tissue tissue adhesive (fibrin) first, and then sprayed and bandaged the cell therapy using the autologous skin cells. After applying the cell therapy, the state after 7 days was examined.
  • the method for producing a cell therapeutic agent of the present invention can be prepared without undergoing a step such as enzyme treatment and / or cell culture, and can be prepared in a fairly simple and fast time and immediately applied to the affected area, requiring urgent need. It can have a significant effect on the application of patients with skin defects.
  • Experimental Example 2 affected part 2 of the cell therapy prepared according to an embodiment of the present invention
  • Normal skin tissue from a 49-year-old male was obtained by cutting 20 pieces of skin tissue using a skin extractor, washed with physiological saline, and sterilized. The sterilized tissue was pulverized for about 30 seconds using a tissue grinder with the addition of 2cc of sterile water.
  • cell strainer cell strainer
  • the 49-year-old male was first sprayed with a biotissue adhesive (fibrin), and sprayed and bandaged with a cell therapy including autologous skin cells. After applying the cell therapy, the state after 10 days, 30 days, and 155 days was examined.
  • FIG. 5A is a photograph photographing a state immediately after an image of a 49-year-old male. 10 days after spraying the cell therapeutic agent containing the autologous skin cells to the burn site of (A) is in Figure 5 (B), 30 days after spraying is in Figure 5 (C), The state after 100 days after spraying is as shown in FIG. For this reason, it was confirmed that the skin cell regeneration of the burned site was well performed by only one spray of the cell therapeutic agent including autologous skin cells prepared according to the method of the present invention.
  • the use of the cell therapy according to the present invention can be expected to have a preventive effect on the skin pigmentation abnormality often occurs due to burn pigment due to a small difference in pigmentation between the burn and normal skin. Is so soft that fewer graft scars remain than those implanted.
  • the cell therapy agent according to the production method of the present invention includes physically separated cells. Accordingly, the physically separated cells and the enzyme-separated cells were identified by electron microscopy.
  • Figure 6a is an electron micrograph of the cells separated by the enzyme
  • Figure 6b is an electron micrograph of the autogenous skin cells of 49-year-old male prepared in Experimental Example 2.
  • cells are attached to each other by binding molecules.
  • the enzyme will cut the cell adhesion molecules, so that the shape of each cell can be very clean.
  • the cells included in the cell therapy according to the present invention are not separated by enzymatic treatment but physically separated, it is confirmed that the cell adhesion molecule is not cut but is still attached to the separated cells as shown in FIG. 6B.
  • the cell therapy agent of the present invention is sprayed on the affected area, it is determined that the cell adhesion molecule is well attached to the affected tissue of the affected area to help skin regeneration.
  • control site and the test group were first applied to the burn site of the nude let, and the burn site was subjected to general dressing for 7 days, and the biopsy was performed at the expense of the nude hat after 14 days.
  • a tissue block using paraffin was prepared as the animal tissue of the burn site, and the tissue was cut into thin sections and attached to the slide to allow staining.
  • the slides were observed by H & E (Haematoxylin and eosin stain) staining for observation of new tissues and cells, and then read and read.
  • collagen staining was observed and read by MT stain (Masson's trichrome) staining method.
  • Fig. 7 shows an example of application of the cell therapy agent of the present invention to a burn site of a nude rat.
  • FIG. 7 is a photograph showing the image portion of the nude let.
  • (B) is a picture taken 14 days after spraying the control to the burn site of the nude let
  • (D) is a picture taken 14 days after spraying the experimental group on the burn site of the nude let.
  • Figure 8a is a view showing the results of the haematoxylin and eosin stain (H & E) staining.
  • H & E haematoxylin and eosin stain stain stain staining.
  • A is a photograph obtained by performing normal skin cells H & E staining for comparison of the control group and the experimental group.
  • B shows the results of H & E staining when the control group was applied to the burn site, and it was confirmed that the photographs of the normal cells and the test group were significantly different from the photograph (C) of the H & E staining results.
  • 8b is a diagram showing the results of MT stain (Masson's trichrome) staining.
  • test group to which the cell therapy of the present invention was applied as compared to the control group was found to be remarkably superior in epithelialization, skin appendage and regeneration of collagen.
  • control site and the test group were first sprayed onto the wound site of the nude let, and the wound site was subjected to a general dressing for 3 days, and the biopsy was performed at the expense of the nude let after 7 days.
  • the wound was observed by staining collagen with MT satin staining, and the staining was performed in the same manner as in the above Experiment 4-1.
  • FIG. 9 is a view showing an application of the cell therapy of the present invention to the wound site of the nude rat.
  • FIG. 9 is a photograph showing the wound portion of the nude let.
  • (B) is a picture taken 7 days after spraying the control to the wound site of the nude let
  • (D) is a picture taken 7 days after spraying the experimental group to the wound site of the nude let.
  • the control group using saline epithelial cells were not regenerated at the wound site, but in the experimental group to which the cell therapy product of the present invention was applied for 7 days, the wound area was pale red. However, the epithelial cells have been shown to be regenerated, and the skin regeneration at the wound site was remarkably superior.
  • 10A is a result of MT staining when the control group was applied to the wound site, immediately after the wound (A), 7 days after the control application (B), and 200-fold magnification (C) of the a site.
  • Figure 9a only in the control group using physiological saline, the formation of epithelialization at the wound site was low (B), very little of the MT stained collagen (C).
  • 10b is a result of MT staining when the experimental group is applied to the wound site, immediately after the wound (A), 7 days after the experimental group is applied (B), and 200-fold magnification (C) of the b site.

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Abstract

본 발명은 피부 결함의 완화 또는 치료를 위한 자가피부세포치료제의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 자가피부세포를 이용한, 피부 결함의 완화 또는 치료하기 위한 세포치료제의 제조방법은 주체로부터 정상 피부 조직을 획득하는 단계와; 상기 획득한 조직을 세포단위로 분쇄하는 단계와; 상기 분쇄 후 조직 파쇄물로부터 각질형성세포, 멜라닌색소세포 및 섬유세포를 포함하는 피부세포군을 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포치료제의 제조방법을 제공한다. 이에 의하여, 기존 세포치료제 제조방법과는 달리, 효소처리 및/또는 배양 단계가 배제되어 상당히 간편하고 빠른 시간 내에 제조하여 바로 환부에 적용할 수 있는 효과를 갖는다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 06.07.2011]　피부결함의 완화 또는 치료를 위한 자가피부세포치료제의 제조방법
본 발명은 피부 결함의 완화 또는 치료를 위한 자가피부세포치료제의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 기존 세포치료제 제조방법과는 달리, 효소 또는 배양 단계가 배제되어 단시간에 세포치료제를 제조할 수 있는 방법을 제공한다.
화상, 창상, 탈색소된 피부 등과 같이 피부조직에 결함이 발생한 경우 제대로 치료를 하지 않거나 잘못된 응급처치를 하게 되면 피부에 흉터가 남거나 치료기간이 길어지기도 하며, 기타 다른 피부질환이 동반될 수 있다.
일반적으로 화상 또는 창상의 경우 종래에는 바셀린이 주성분으로 된 연고를 적신 가제로 피부를 감싸서 치료하였으며, 2차 감염을 막기 위해서 페니실린, 설파민제 등 항생제를 추가로 복용하였다. 또한 통증을 경감시키기 위하여 별도의 진통제를 투여하였다. 그러나, 상처치료에 소요되는 기간이 짧게는 2-3주에서 길게는 3달 정도의 장기간의 치료가 필요하며, 그에 따른 비용도 상당하였다.
또한, 화상의 경우 자가세포를 이용한 세포치료제를 이용하여 치료하는 방법이 많이 이용되어 오고 있다. 그러나 종래 자가세포를 이용한 세포치료제를 제조하는 방법은 효소를 처리하여 특정 세포를 채취하고, 상기 채취한 세포를 수일 동안 배양하여 생산하는 방법을 사용하고 있다. 따라서 종래 세포치료제는 세포의 배양 시간이 오래 걸려, 화상 등 피부 결함의 정도가 심각하고 긴급하게 치료를 요하는 환자의 경우에는 적합하지 않은 문제점이 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 효소 처리에 의하여 분리되지 않고, 배양되지 않은 자가피부세포를 이용하여 피부결함의 완화 또는 치료를 위한 세포치료제의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 세포치료제 및 세포치료제 제조장치를 제공하는 것이다.
상기 목적은, 본 발명에 따라, 피부 결함의 완화 또는 치료하기 위한 세포치료제의 제조방법으로서, 자가 피부조직에서 유래된 하나의 공여부위에서 정상 피부 조직을 획득하는 단계와; 상기 획득한 정상피부조직을 세포단위로 분쇄하는 단계와; 상기 분쇄 후 조직 파쇄물로부터 각질형성세포, 멜라닌색소세포 및 섬유세포 중 적어도 어느 하나를 포함하는 피부세포군을 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포치료제의 제조방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.
여기에서, 상기 분쇄단계는, 상기 정상피부조직 크기의 1 cm2 당 10 내지 60초 동안 조직분쇄기를 이용하여 상기 정상피부조직을 세포단위로 분쇄하는 단계일 수 있다.
여기에서, 상기 분쇄단계는, 상기 분쇄된 세포의 농도가 1 내지 40 x107 개/cm2가 되도록 상기 정상피부조직을 분쇄하는 단계일 수 있다.
여기에서, 상기 획득단계는, 상기 획득된 상기 각질형성세포는 전체 획득 세포의 60 내지 90%로 포함되도록 할 수 있다.
여기에서, 상기 획득단계는, 상기 획득된 멜라닌색소세포는 전체 획득 세포의 1 내지 5%로 포함되도록 할 수 있다.
여기에서, 상기 획득단계는, 상기 획득된 섬유세포는 전체 획득 세포의 10 내지 40%로 포함되도록 할 수 있다.
여기에서, 상기 획득단계는, 상기 획득한 각질형성세포, 멜라닌색소세포 및 섬유세포를 포함하는 피부세포군을 배양하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
여기에서, 상기 획득단계는, 상기 각질형성세포, 멜라닌색소세포 및 섬유세포 중 적어도 어느 하나를 포함하는 피부세포군을 획득하기 위한 어떠한 효소 처리를 수행하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
여기에서, 상기 피부 결함은, 화상으로 인한 피부상처, 창상, 피부 흉터, 탈색소된 피부상처로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 목적은 본 발명에 따라, 상기 기재한 세포치료제의 제조방법에 의하여 제조된 세포치료제에 의하여 달성될 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 자가피부세포를 이용하여, 피부 결함의 완화 또는 치료를 위한 세포치료제의 제조방법으로서, 자가피부세포를 효소처리에 의하여 세포를 분리하지 않고 또한 분리된 세포를 배양단계를 수행하지 않고도 세포치료제로 제조할 수 있어 손쉽고, 빠른 시간 안에 환부에 적용할 수 있는 효과를 가진다. 또한, 본 발명에 의하면, 주체로부터 획득한 정상피부조직이 적은 양이라 하더라도, 넓은 환부에 적용할 수 있는 세포치료제를 제조할 수 있는 효과를 가진다. 또한, 상기 세포치료제를 제조할 수 있는 제조장치를 제공하는 효과를 갖는다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포치료제 제조방법을 보여주는 플로우차트이고,
도 2는 혈구계산기의 예시를 보여주는 도면이고,
도 3a 내지 도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포치료제의 세포크기확인 결과를 나타내는 도면이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포치료제의 화상 부위에 대한 임상효과를 보여주는 도면이고,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포치료제의 화상 부위에 대한 또 다른 임상효과를 보여주는 도면이고,
도 6a 는 종래의 효소 처리에 의하여 분리된 세포의 전자현미경 확인 결과를 나타내는 도면이고,
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 세포의 전자현미경 확인 결과를 나타내는 도면이고,
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포치료제의 화상에 대한 동물실험효과를 보여주는 도면이고,
도 8a 는 상기 도 7의 화상부위의 H&E 염색 결과를 보여주는 도면이고,
도 8b는 상기 도 7의 화상부위의 MT 염색 결과를 보여주는 도면이고,
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포치료제의 창상에 대한 동물실험효과를 보여주는 도면이고,
도 10a는 도 9의 창상부위에 대조군 적용한 후 MT 염색결과를 보여주는 도면이고,
도 10b는 도 9의 창상부위에 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포치료제 적용한 후 MT 염색결과를 보여주는 도면이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예들에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예들에 한정되지 않는다.
도 1은 본 발명의 세포치료제의 제조방법의 플로우차트이다.
도 1에서 보는 바와 같이, 본 발명의 세포치료제의 제조방법은, 자가 피부조직에서 유래된 하나의 공여부위에서 정상 피부 조직을 획득하는 단계(S11)와; 상기 획득한 정상피부조직을 세포단위로 분쇄하는 단계(S12)와; 상기 분쇄 후 조직 파쇄물로부터 각질형성세포, 멜라닌색소세포 및 섬유세포 중 적어도 어느 하나를 포함하는 피부세포군을 획득하는 단계(S13)를 포함한다.
본 발명의 세포치료제의 제조방법은 포유동물의 피부 결함의 완화 또는 치료를 위한 세포치료제를 제조하기 위한 방법이다. 바람직하게는 인간의 피부 결함의 완화 또는 치료를 위한 세포치료제의 제조방법에 대한 것이다.
상기 정상피부조직의 획득단계는 주체로부터 정상 피부 조직을 피부채취기(Dermatome)를 이용하여 획득할 수 있다. 상기 주체는 포유동물 또는 인간을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 어느 일부 피부에 피부 결함을 갖는 인간의 정상피부조직을 획득하는 것이다.
상기 정상 피부 조직은 (1 내지 5mm)x(1 내지 5mm)의 크기로 커팅하여 획득할 수 있으며, 상기 크기를 가진 조직의 개수는 환부의 크기를 고려하여 획득할 수 있으며, 일 예로서 상기 크기를 가진 조각 1 내지 30개, 더욱 바람직하게는 5 내지 25개, 더더욱 바람직하게는 10 내지 25개의 조각을 획득할 수 있다.
상기 획득한 정상 피부 조직은 생리식염수 또는 멸군수를 이용하여 세척하여 이용할 수 있다.
또한 상기 세척된 조직을 통상의 방법을 이용하여 멸균하여 이용할 수 있다.
상기 정상피부조직의 분쇄단계는, 상기 획득한 정상 피부 조직을 세포 단위로 분쇄하는 단계이다. 상기 분쇄는 통상적으로 조직을 분쇄할 수 있는 일반적인 조직 분쇄기를 이용하여 수행할 수 있다. 상기 조직 분쇄 시에는 상기 분쇄할 조직의 양을 고려하여 생리식염수 또는 멸균수를 소량 첨가하여 분쇄할 수 있으며, 바람직하게는 1-10cc, 더욱 바람직하게는 1-5cc의 생리식염수 또는 멸균수를 첨가하여 분쇄할 수 있다.
상기 조직분쇄기를 이용하여 조직을 분쇄할 때, 분쇄 시간은 상기 조직의 양을 고려하여 설정할 수 있으며, 바람직하게는 상기 조직 크기의 1 cm2 당 1 내지 60초 동안, 더욱 바람직하게는 10 내지 60초 동안 상기 조직을 세포단위로 분쇄할 수 있다. 상기 분쇄된 세포의 농도는 (1 내지 40) x107 개/cm2가 되도록 상기 조직을 분쇄할 수 있다. 상기 세포의 농도는 상기 주체의 나이 또는 조직의 상태에 따라 다양할 수 있다.
상기 피부세포군의 획득단계는, 상기 분쇄 후 조직 파쇄물로부터 각질형성세포, 멜라닌색소세포 및 섬유세포 중 적어도 어느 하나를 포함하는 피부세포군을 획득하는 것을 의미한다.
상기 각질형성세포(keratinocyte)는 각질을 생산하며 물리적 장벽을 만들어 외부로부터 들어오는 해로운 인자들에서 개체를 보호하는 역할을 하는 표피세포이며, 면역학적 반응을 조절하는 다양한 생물학적 반응 조절물질을 생성 및 분비하여 면역반응과 염증반응을 조절하는 중요한 구성 요소이다.
상기 멜라닌색소세포(melanocyte)는 동물 조직 및 피부에 존재하는 갈색 또는 흑색의 색소인 멜라닌을 생성하는 세포로서, 세포 내에서 만들어진 멜라닌 과립을 계속적으로 표피세포에 보낸다. 그 양이 많으면 피부색이 황갈색에서 흑갈색을 띠고, 적을수록 색이 엷어지게 되는 것이다.
상기 섬유세포(fibroblast)는 섬유아세포라고도 하며, 섬유성 결합조직의 중요한 성분을 이루는 세포로 조직절편으로 관찰하면 편평하고 길쭉한 외형을 가지며 흔히 불규칙한 돌기를 보이고 있는 세포이다.
따라서, 상기 획득단계는 상기 조직을 분쇄한 후의 조직 파쇄물로부터 상기 각질형성세포, 멜라닌색소세포, 및 섬유세포를 포함하는 피부세포군을 획득하는 것이다.
이 때 상기 획득된 각질형성세포, 멜라닌색소세포, 및 섬유세포 중 적어도 어느 하나를 포함하는 피부세포군은 생존한 세포뿐만 아니라 분쇄 단계에서 파괴된 세포를 포함할 수도 있다.
여기에서, 상기 획득된 상기 각질형성세포는 전체 획득 세포의 60 내지 90%로 포함되도록 할 수 있으며, 상기 획득된 멜라닌색소세포는 전체 획득 세포의 1 내지 5%로 포함되도록 할 수 있으며, 상기 획득된 섬유세포는 전체 획득 세포의 10 내지 40%로 포함되도록 할 수 있다.
따라서, 상기 기재한 바와 같이, 본원에 따르면, 정상피부조직으로부터 어떠한 효소를 처리하지 않고도 각질형성세포, 멜라닌색소세포, 또는 섬유세포를 분리할 수 있는 방법이 제공된다. 또한, 또한, 상기 획득한 각질형성세포 멜라닌색소세포 및 섬유세포 중 적어도 어느 하나를 포함하는 피부세포군을 배양하지 않고, 바로 환부에 적용할 수 있는 세포치료제가 제공된다. 이에 의하여, 본원에 따른 제조방법에 의하여 제조된 세포치료제는 효소처리에 의한 세포분리과정이 배제되고, 분리된 세포의 배양과정이 배제되므로, 아주 단시간에 제조될 수 있고 제조된 후 즉시에 환부에 적용할 수 있어 아주 효과적이다.
여기에서, 상기 피부 결함은, 화상으로 인한 피부상처, 창상, 피부 흉터, 탈색소된 피부상처로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.
이하 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
실험예 1. 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포치료제에 포함되어 있는 세포 시험 및 환부 적용례
47세 여성 및 36세 여성으로부터 정상 피부 조직을 4x5mm의 크기로, 각각 20개를 피부채취기를 이용하여 커팅하여 획득하고, 생리식염수로 세척한 후 멸균하였다. 상기 멸균된 조직을 2cc의 멸균수를 첨가하여 조직분쇄기를 이용하여 약 30초 동안 분쇄하였다.
상기 분쇄가 완료되면, 세포 여과체(cell strainer)를 이용하여 조직 파쇄물로부터 각질형성세포, 멜라닌색소세포 및 섬유세포 중 적어도 어느 하나를 포함하는 피부세포군을 획득함으로써, 47세 여성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제 및 36세 여성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제를 제조하였다.
1-1. 세포의 농도 측정
상기 제조한 상기 47세 여성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제 및 36세 여성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제 각각의 세포 농도를 혈구계산기(Hemocytometer)를 이용하여 측정하였다.
도 3에는 혈구계산기의 일 실시예를 보여주고 있다. 도 2에서 보는 바와 같이, 혈구계산기는 표면에 가로, 세로 빗금이 그어져 있는 슬라이드 글라스로 규칙적인 사각형으로 분획된 두 개의 챔버를 가지고 있고, 각 챔버의 일정한 부피로 된 사각형 구획 내에 존재하는 세포를 현미경 하에서 수를 세어 전체 시료 내에 존재하는 세포의 농도를 측정할 수 있다.
상기 제조된 세포치료제 100μl에 트립판 블루 100 μl을 첨가하여 잘 혼합한 후, 커버 글래스로 덮여 있는 혈구계산기에 천천히 주입하였다. 약 1분 정도 후에, 현미경 하에서 염색이 된 세포(죽은 세포)와 염색이 되지 않은 세포(생존 세포)의 수를 측정하였다.
하기의 수학식 1으로 세포의 농도를 측정하였다.
수학식 1
Figure PCTKR2011003474-appb-M000001
(1, 3, 7, 9 block의 합)
상기 세포 농도 측정의 결과, 47세 여성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제의 세포 농도는 ㎠당 약 1.4x108 cells 였고, 36세 여성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제의 세포 농도는 2.4x108 cells으로 확인되었다.
1-2. 세포 크기 확인
상기 47세 여성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제 및 36세 여성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제 각각의 포함된 각질형성세포, 멜라닌색소세포 및 섬유아세포의 크기를 확인하였다. 세포 크기 확인 실험의 절차는 일반적인 실험절차를 따랐다. 비교예로서 Primary 세포, 즉 일반 세포의 크기를 확인하였다. 상기 세포크기는 현미경으로 확인하였다.
상기 세포크기실험의 결과는 도 3a 내지 도 3c에서 보는 바와 같다.
도 3a는 상기 비교예로서 Primary 세포를 현미경으로 관찰한 결과이고, 도 3b는 상기 36세 여성의 자가피부세포를 이용하여 제조한 세포치료제의 세포 크기를 현미경으로 관찰한 결과이고, 도 3c는 상기 47세 여성의 자가피부세포를 이용하여 제조한 세포치료제의 세포 크기를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3a에 도시된 바와 같이, Primary 세포(비교예)의 경우에는 그 크기가 10-25 um이며, 도 3b에 도시된 바와 같이, 상기 36세 여성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제에 포함된 세포 크기는 6-15 um으로 확인하였고, 도 3c에 도시된 바와 같이, 상기 47세 여성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제에 포함된 세포의 크기 역시 6-15um으로 확인하였다. 따라서, 상기 47세 및 36세 여성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제 각각에 포함된 세포 크기는 세포의 크기의 범주 내에 포함됨을 알 수 있다.
1-3. 세포 생존률 확인 실험
상기 47세 여성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제 및 36세 여성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제 각각에 포함된 세포의 생존율을 확인하였다. 상기 각각의 세포치료제100μl 트립판 블루 100 μl을 첨가하여 잘 혼합한 후, 커버 글래스로 덮여 있는 혈구계산기(도 2 참조)에 천천히 주입하였다. 약 1분 정도 후에, 현미경 하에서 염색이 된 세 포(죽은 세포)와 염색이 되지 않은 세포(생존 세포)의 수를 측정하여 하기 수학식 2 내지 수학식 4를 이용하여 세포생존율을 계산하였다.
수학식 2
Figure PCTKR2011003474-appb-M000002
수학식 3
Figure PCTKR2011003474-appb-M000003
수학식 4
Figure PCTKR2011003474-appb-M000004
상기 실험의 결과, 상기 47세 여성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제의 세포 생존율은 72%였고, 36세 여성의 경우는 72.5% 로서 모두 높은 세포 생존율을 보여주고 있었다.
1-4. 환부 적용례
상기 47세 여성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제는 그 47세 여성의 화상 부위에 적용하였다.
상기 화상 환부에 먼저 생체 조직접착제(피브린제제)를 살포하고, 상기 자가피부세포를 이용한 세포치료제를 분무하고 붕대를 감아주었다. 상기 세포치료제를 적용한 후 7일 이후의 상태를 살펴보았다.
상기 결과는 도 4에서 보는 바와 같다. 도 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 세포치료제를 화상 부위에 분무한 결과, 화상부위의 세포 재생이 육안으로 확인될 수 있을 만큼 확연한 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 세포치료제의 제조방법은, 효소처리 및/또는 세포배양 등의 단계를 거치지 않고 제조할 수 있어, 상당히 간편하고 빠른 시간 내에 제조하여 바로 환부에 적용할 수 있는 것으로서, 긴급을 요하는 피부 결함을 가진 환자의 적용에 현저한 효과를 가질 수 있다.
실험예 2. 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포치료제의 환부 적용예 2
49세 남성으로부터 정상피부조직을 3x4mm의 크기로, 20개를 피부채취기를 이용하여 커팅하여 획득하고, 생리식염수로 세척한 후 멸균하였다. 상기 멸균된 조직을 2cc의 멸균수를 첨가하여 조직분쇄기를 이용하여 약 30초 동안 분쇄하였다.
상기 분쇄가 완료된 후, 세포 여과체(cell strainer)를 이용하여 조직 파쇄물로부터 각질형성세포, 멜라닌색소세포 및 섬유세포 중 적어도 어느 하나를 포함하는 피부세포군을 획득함으로써, 49세 남성의 자가피부세포를 이용한 세포치료제를 제조하였다.
상기 49세 남성의 화상 부위(뺨과 목 부위)에 먼저 생체 조직접착제(피브린제제)를 살포하고, 상기 자가피부세포를 포함한 세포치료제를 분무하고 붕대를 감아주었다. 상기 세포치료제를 적용한 후 10일, 30일, 155일 이후의 상태를 살펴보았다.
상기 적용예의 결과는 도 5에서 보는 바와 같다. 도 5의 (A)는 49세 남성의 화상 직후의 모습을 촬영한 사진이다. 상기 (A)의 화상 부위에 상기 자가피부세포를 포함한 세포치료제를 분무한 후 10일 이후의 상태는 도 5의 (B)에서, 분무한 후 30일 후의 상태는 도 5의 (C)에서, 분무한 후 100일 후의 상태는 도 5의(D)에서 보는 바와 같다. 이로 인하여, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 자가피부세포를 포함하는 세포치료제의 한 번 분무만으로도 화상 부위의 피부 세포 재생이 잘 이루어졌음을 확인할 수 있었다. (D)의 사진에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 세포치료제를 이용할 경우 화상과 정상 피부 사이의 경계의 색소차이가 적어 화상휴우증으로 자주 생기는 피부색소 이상증에 예방효과 있을 것을 기대할 수 있다. 가 아주 연하여 조직을 이식한 경우보다 이식 흉터가 거의 남지 않음을 알 수 있다.
실험예 3. 세포치료제의 포함되어 있는 세포의 전자현미경 사진
본 발명의 제조방법에 따른 세포치료제는 물리적으로 분리된 세포를 포함한다. 이에 따라, 물리적으로 분리된 세포와 대조군으로서 효소로 분리된 세포를 전자현미경으로 확인하였다.
확인 결과는 도 6a 및 도 6b에서 보는 바와 같다. 도 6a는 효소로 분리된 세포의 전자현미경 사진이며, 도 6b는 상기 실험예 2에서 제조된 49세 남성의 자가피부세포의 전자현미경 사진이다.
일반적으로 세포들은 세포부착분자(binding molecular)에 의하여 서로 부착되어 있다. 그러나 도 6a에서 보는 바와 같이, 효소 처리에 의하여 세포가 분리된 경우, 효소가 상기 세포부착분자를 커팅하게 되므로 세포 각각의 모양을 아주 깨끗하게 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 세포치료제에 포함된 세포는 효소 처리에 의하여 분리되지 않고, 물리적으로 분리되었기 때문에, 도 6b에서 보는 바와 같이 상기 세포부착분자가 커팅되어 있지 않고 여전히 분리된 세포에 부착되어 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 세포치료제를 환부에 분무할 경우 상기 세포부착분자로 인하여 환부의 조직에 잘 부착되어 피부재생에 도움을 주는 것으로 판단된다.
실험예 4. 동물실험
4-1. 화상 부위 적용예
본 발명에 따라 제조된 세포치료제의 화상 부위에 대한 효과를 확인하기 위하여 동물실험을 수행하였다. 6주령의 수컷 누드레트의 피부의 일부에 화상을 유도하였다. 상기 실험예 1 또는 실험예 2에서의 방법과 동일한 방법으로 상기 6주령의 수컷 누드레트의 정상피부조직을 이용하여 자가피부세포를 포함한 세포치료제를 제조하여 시험군으로 사용하였다. 대조군으로는 생리식염수를 사용하였다.
상기 누드레트의 화상 부위에 대조군 및 시험군을 최초 1회 분무하여 적용하고, 화상 부위는 7일동안 일반 드레싱을 수행하고, 14일 후에 상기 누드레트를 희생하여 조직검사를 수행하였다.
상기 화상 부위의 동물조직으로 파라핀을 이용한 조직 블록을 제작하고, 조직을 얇은 절편으로 잘라 염색이 가능하게 슬라이드에 붙였다. 상기 슬라이드를 신생조직과 세포 등의 관찰을 위하여 H&E(Haematoxylin and eosin stain) 염색을 수행한 후 관찰하고 판독하였다. 또한, MT stain (Masson’s trichrome) 염색법으로 콜라겐을 염색하여 관찰 및 판독하였다.
상기 실험 수행의 결과는 도 7 및 도 8에서 보는 바와 같다.
도 7은 누드레트의 화상 부위에의 본 발명의 세포치료제 적용예를 보여주는 도면이다.
도 7에 도시된 바와 같이 (A)와 (C)는 상기 누드레트의 화상부위를 보여주는 사진이다. (B)는 상기 누드레트의 화상부위에 대조군을 분무한 후 14일째 상태를 찍은 사진이고, (D)는 상기 누드레트의 화상부위에 실험군을 분무한 후 14일째 상태를 찍은 사진이다.
(B)의 경우 상처 부위가 여전히 붉은 색을 띄고 있으나, (D)의 경우 상처 부위가 붉은 색이 아니라 다른 부위의 건강한 피부와 동일한 색을 띄어 상처 부위의 피부재생력이 현저히 뛰어남을 확인할 수 있었다.
도 8a 는 H&E(Haematoxylin and eosin stain) 염색의 결과를 보여주는 도면이다. 도 8a에서 보는 바와 같이, (A)는 정상피부세포를 H&E염색을 수행하여 획득한 사진으로써 대조군 및 실험군의 비교를 위한 것이다. (B)는 화상부위에 대조군을 적용한 경우의 H&E 염색한 결과로서, 정상세포의 사진 및 시험군을 적용하여 H&E 염색한 결과의 사진(C)과 현저히 상이함을 확인할 수 있었다. 즉, 대조군(B)의 경우에는 상피화가 거의 이루어지지 않고(B의 화살표) 피부부속기(땀샘, 지방샘, 모낭 등)의 형성이 전혀 이루어지지 않음을 확인할 수 있었다. 이에 반하여, 시험군(C)의 경우에는 상피화가 정상조직과 거의 유사하게 이루어지고, 피부부속기의 형성 또한 정상세포와 거의 유사할 정도로 형성되어 있음을 확인할 수 있었다.
도 8b는 MT stain (Masson’s trichrome) 염색의 결과를 보여주는 도면이다.
콜라겐의 형성 정도를 확인할 수 있는 MT 염색을 수행한 결과, 정상세포의 경우(A)에는 미성숙 섬유화 전층은 아주 얇은 반면 성숙 콜라겐(푸른색)이 거의 대부분을 차지함을 알 수 있다. 대조군(B)의 경우에는 상처 내 미성숙 섬유화 전층(d)이 상당히 넓은 반면 성숙 콜라겐의 양이 극히 미미하였으나, 시험군(C)의 경우 미성숙 섬유화 전층(d’)은 아주 얇고 성숙 콜라겐의 양은 정상세포와 거의 유사할 정도로 많이 형성되어 있음을 확인할 수 있었다.
상기 실험의 결과, 대조군에 비하여 본 발명의 세포치료제를 적용한 시험군의 경우 상피화, 피부 부속기 및 콜라겐의 재생에 있어서 현저히 뛰어남을 확인할 수 있었다.
4-2. 창상 부위 적용예
본 발명에 따라 제조된 세포치료제의 창상 부위에 대한 효과를 확인하기 위하여 동물실험을 수행하였다. 6주령의 수컷 누드레트의 피부의 일부에 창상을 유도하고, 상기 실험예 1 또는 실험예 2에서의 방법과 동일한 방법으로 상기 6주령의 수컷 누드레트의 정상피부조직을 이용하여 자가피부세포를 포함한 세포치료제를 제조하여 시험군으로 사용하였다. 대조군으로는 생리식염수를 사용하였다.
상기 누드레트의 창상 부위에 대조군 및 시험군을 최초 1회 분무하여 적용하고, 창상 부위는 3일 동안 일반 드레싱을 수행하고, 7일 후에 상기 누드레트를 희생하여 조직검사를 수행하였다. 상기 창상 부위를 MT satin 염색법으로 콜라겐을 염색하여 관찰하였으며, 상기 염색방법은 상기 4-1 실험예에서 수행한 방법과 동일하게 수행하였다.
도 9는 누드레트의 창상 부위에의 본 발명의 세포치료제 적용예를 보여주는 도면이다.
도 9에서 보는 바와 같이, (A)와 (C)는 상기 누드레트의 창상부위를 보여주는 사진이다. (B)는 상기 누드레트의 창상부위에 대조군을 분무한 후 7일째 상태를 찍은 사진이고, (D)는 상기 누드레트의 창상부위에 실험군을 분무한 후 7일째 상태를 찍은 사진이다. 생리식염수를 사용한 대조군의 경우에는 상처 부위에 상피 세포의 재생이 전혀 이루어 지지 않은 모습을 보이고 있으나, 본 발명의 세포치료제를 7일 동안 적용한 실험군의 경우에는, 상처 부위는 옅은 붉은 색을 띄고 있기는 하지만 상피 세포가 재생이 된 모습을 보여주고 있어, 상처 부위의 피부재생력이 현저히 뛰어남을 확인할 수 있었다.
도 10a는 창상 부위에 대조군을 적용한 경우의 MT 염색 결과로서, 창상 직후(A), 대조군 적용 후 7일(B), a 부위의 200배 확대 (C)를 보여주는 도면이다. 도 9a에서 보는 바와 같이, 생리식염수를 사용한 대조군의 겨우에는 상처 부위에 상피화 형성이 저조하며(B), MT 염색된 콜라겐의 아주 미미하게 확인되었다(C).
도 10b는 창상 부위에 실험군을 적용한 경우의 MT 염색 결과로서, 창상 직후(A), 실험군 적용 후 7일(B), b 부위의 200배 확대 (C)를 보여주는 도면이다.
도 10b에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 세포치료제를 사용한 실험군의 경우, 상피화 형성이 대조군에 비하여 더욱 왕성히 일어나고(B), 콜라겐(푸른색)의 양이 상대적으로 많은 것을 확인할 수 있었다(C). 따라서, 대조군에 비하여 본 발명의 세포치료제를 적용한 시험군의 경우 상피화 및 콜라겐의 재생에 있어서 현저히 뛰어남을 확인할 수 있었다.
비록 본 발명의 몇몇 실시예들이 도시되고 설명되었지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 본 발명의 원칙이나 정신에서 벗어나지 않으면서 본 실시예를 변형할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그 균등물에 의해 정해질 것이다.

Claims (10)

  1. 피부 결함의 완화 또는 치료용 세포치료제의 제조방법으로서,
    자가 피부조직에서 유래된 하나의 공여부위에서 정상피부조직을 획득하는 단계와;
    상기 획득한 정상피부조직을 세포단위로 분쇄하는 단계와;
    상기 분쇄 후 조직 파쇄물로부터 각질형성세포, 멜라닌색소세포 및 섬유세포 중 적어도 어느 하나를 포함하는 피부세포군을 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포치료제의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분쇄단계는, 상기 정상피부조직 크기의 1 cm2 당 10 내지 60초 동안 조직분쇄기를 이용하여 상기 정상피부조직을 세포단위로 분쇄하는 것을 특징으로 하는 세포치료제의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 분쇄단계는, 상기 분쇄된 세포의 농도가 1내지 40x107 개/cm2가 되도록 상기 정상피부조직을 분쇄하는 것을 특징으로 하는 세포치료제의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 획득단계는, 상기 획득된 각질형성세포는 전체 획득 세포의 60 내지 90%로 포함되는 것을 특징으로 하는 세포치료제의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 획득단계는, 상기 획득된 멜라닌색소세포는 전체 획득 세포의 1 내지 5%로 포함되는 것을 특징으로 하는 세포치료제의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 획득단계는, 상기 획득된 섬유세포는 전체 획득 세포의 10 내지 40%로 포함되는 것을 특징으로 하는 세포치료제의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 획득단계는, 상기 획득한 각질형성세포 멜라닌색소세포 및 섬유세포 중 적어도 어느 하나를 포함하는 피부세포군을 배양하지 않는 것을 특징으로 하는 세포치료제의 제조방법.
  8. 상기 획득단계는, 상기 각질형성세포, 멜라닌색소세포 및 섬유세포 중 적어도 어느 하나를 포함하는 피부세포군을 획득하기 위하여 효소 처리를 수행하지 않는 것을 특징으로 하는 세포치료제의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 피부 결함은, 화상, 창상, 피부 흉터, 탈색소된 피부상처로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포치료제의 제조방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 세포치료제.
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