WO2021010596A1 - 산화 그래핀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

산화 그래핀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 Download PDF

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WO2021010596A1
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graphene oxide
cosmetic composition
skin
active ingredient
moisturizing
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PCT/KR2020/007459
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정수경
홍병희
경서연
최용석
김주희
윤석균
여현주
강승현
박명삼
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코스맥스 주식회사
서울대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a cosmetic composition for skin regeneration, wrinkle improvement, moisturizing or antioxidant, and specifically, to a cosmetic composition for skin regeneration, wrinkle improvement, moisturizing or antioxidant containing graphene oxide as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a quasi-drug composition, pharmaceutical composition for skin regeneration, wrinkle improvement, moisturizing or antioxidant containing graphene oxide as an active ingredient.
  • Aging is a phenomenon that naturally progresses as we age, and it refers to a physiologically gradual decline in its normal function as a result of complex human mechanisms. Aging may be accelerated or reduced by various stimuli, but as it enters the modern society, it is accelerating due to internal and external factors such as ultraviolet rays, environmental pollution, and stress.
  • Skin is largely divided into three layers: epidermis, dermis, and hypodermis tissue in order from the outside, and functions to protect the human body from stimulation of physical and chemical external environments.
  • the epidermis is further divided into the stratum corneum, granule layer, play layer, and basal layer.
  • the stratum corneum contains about 10-20% of moisture and exists in the outermost part of the human body to inhibit water evaporation out of the body while excessive penetration of substances from the outside. It serves to block
  • the surface of the stratum corneum is covered with a thin natural protective film made of sebum from the sebaceous glands and sweat from the sweat glands, preventing evaporation of moisture.
  • the dermal layer plays a role in maintaining the elasticity of the skin and supporting the structure by synthesizing proteins such as collagen, which acts as a support for the skin, and fibrillin, which forms elasticity.
  • Skin aging occurs due to lack of moisture in the stratum corneum or abnormality of extracellular matrix proteins in the dermis. As aging progresses, the content and arrangement of substances that make up the skin such as collagen, elastin, hyaluronic acid, and glycoproteins change or decrease. Symptoms appear.
  • the cells that make up the stratum corneum of the epidermis have a high concentration of natural moisturizing factor (NMF), a water-soluble component, and play a central role in maintaining moisture in the stratum corneum.
  • Natural moisturizing factors such as amino acids and sugars act not only to make the skin flexible, but also to help maintain proper moisture.
  • substances such as amino acids are not only water soluble by themselves, but also effectively bind to moisture to inhibit drying of moisture in the skin.
  • moisture in the stratum corneum decreases, the skin becomes dry, the surface becomes rough, and the skin loses its gloss and looks dull. Therefore, the need for a skin moisturizer is increasing.
  • Aquaporin selectively passes only water molecules and is a major intrinsic protein family present in all cell membranes, and increases moisture absorption by the skin. Aquaporins found in mammals are 13 homologous proteins (AQP-1 to AQP-13), of which aquaporin-3 (AQP-3) is abundantly present in human epidermis. Aquaporin-3 is expressed in keratinocytes of the skin, and absorption and movement of water and glycerol through Aquaporin-3 prevents the loss of moisture in the cells, thereby increasing the moisture and elasticity of the skin.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • Graphene is a two-dimensional material with a single layer of carbon atoms formed in a hexagonal lattice structure through sp 2 hybrid bonds. Since the discovery of graphene for the first time, various studies have been conducted using the peculiar physical, chemical, electrical, and mechanical properties of graphene, and recently, research on applying graphene-derived nanomaterials as biomaterials, paying attention to the possibility of application in the bio field. It is being actively reported. Conventionally, as a cosmetic containing graphene, a mask pack composition (CN 105287248B) having a function of removing mites from the skin by containing graphene oxide has been disclosed.
  • An object of the present invention is to provide skin regeneration, wrinkle improvement, moisturizing, and antioxidant effects through a composition containing graphene oxide as an active ingredient.
  • the present invention provides a cosmetic composition comprising graphene oxide as an active ingredient in order to achieve the above object.
  • the present invention also provides a cosmetic composition comprising 1.0 ⁇ 10 -7 to 30% by weight of graphene oxide relative to the total weight of the total cosmetic composition.
  • Graphene oxide of the present invention i) scavenging free radicals, ii) inhibiting the expression of collagenase (MMP-1), iii) promoting the synthesis of type 1 procollagen, iv) fibrillin expression
  • MMP-1 collagenase
  • iii) promoting the synthesis of type 1 procollagen iv) fibrillin expression
  • a cosmetic composition characterized in that it provides at least one effect selected from the group consisting of increasing, v) increasing hyaluronic acid synthase (HAS-3) expression, or vi) increasing aquaporin-3 (AQP-3) expression do.
  • the present invention also provides powders, fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickening agents, gelling agents, softening agents, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents, fragrances, surfactants, water, ionic Or at least one selected from the group consisting of nonionic emulsifiers, fillers, sequestering agents, chelating agents, preservatives, vitamins, blocking agents, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, fragrances, hydrophilic or lipophilic active agents. It provides a cosmetic composition comprising a.
  • the present invention provides a cosmetic composition, characterized in that at least one formulation selected from the group consisting of toners, lotions, and creams.
  • the present invention provides a quasi-drug composition for skin regeneration, wrinkle improvement, moisturizing or antioxidant, comprising graphene oxide as an active ingredient.
  • compositions for skin regeneration, wrinkle improvement, moisturizing or antioxidant comprising graphene oxide as an active ingredient.
  • the cosmetic composition, quasi-drug composition, or pharmaceutical composition containing graphene oxide according to the present invention as an active ingredient exhibits skin regeneration, wrinkle improvement, moisturizing, and antioxidant effects.
  • Figure 1 shows that when fibroblasts are treated with graphene oxide (GO) of 100 ng/mL, 1000 ng/mL, 1x10 4 ng/mL, and 1x10 5 ng/mL, respectively, it does not affect cell activity inhibition. It is a graph showing.
  • GO graphene oxide
  • FIG. 2 is a graph showing the ability to remove active oxygen in the cells induced by H 2 O 2 when treated with graphene oxide in fibroblasts, respectively, at 100 ng/mL and 1000 ng/mL.
  • FIG. 3 is a fluorescence image showing the ability to scavenging OH radicals in active oxygen induced by H 2 O 2 when 10 ng/mL, 100 ng/mL, and 1000 ng/mL of graphene oxide were treated in fibroblasts.
  • 4A and 4B are images showing the effect of promoting regeneration of fibroblasts as the concentration increases when 10 ng/mL, 100 ng/mL, and 1000 ng/mL of graphene oxide are treated.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of promoting the expression of collagen synthase COL1A1 upon treatment with graphene oxide.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of promoting fibrillin expression upon treatment with graphene oxide.
  • HAS-3 which is a hyaluronic acid synthase, upon treatment with graphene oxide.
  • FIG. 9 is a graph showing the effect of promoting expression of aquaporin-3 (AQP-3) upon treatment with graphene oxide.
  • the present inventors confirmed that graphene oxide (Graphene Oxides, GO) is not toxic to skin cells, and confirmed the efficacy of promoting the regeneration of skin fibroblasts. In addition, it was confirmed that it has antioxidant and wrinkle-improving effects by showing the ability to remove active oxygen generated in skin cells, inhibiting the expression of collagenase (MMP-1) and promoting the expression of COL1A1 and fibrillin. In addition, the moisturizing effect of graphene oxide was confirmed by increasing the expression of hyaluronic acid synthesis genes HAS-3 (Hyaluronan Synthase-3) and aquaporin-3 (AQP-3), which are skin moisturizing factors. As a result, the present invention provides a cosmetic composition containing graphene oxide having an anti-aging effect through regeneration, antioxidant and moisturizing as an active ingredient.
  • HAS-3 Hyaluronan Synthase-3
  • AQP-3 aquaporin-3
  • aging refers to environmental factors such as chronoaging according to aging, or aging due to exposure to the sun (photoaging), extreme climatic conditions, cigarette smoke, fine dust, chemical pollutants, etc. Refers to any changes the skin experiences through exposure to. Changes in skin due to aging include all external, visible and/or recognizable changes through touch, etc., or histological changes in skin tissue. Aging can be caused by various factors, and the cosmetic composition of the present invention can help anti-aging of the skin through various mechanisms through skin regeneration, wrinkle improvement, moisturizing, and antioxidant.
  • photo aging refers to a phenomenon in which the skin is aging due to exposure to sunlight (ultraviolet rays), and when exposed to the sun (ultraviolet rays) for a long period of time, deep wrinkles on the face and neck are increased, and the skin It causes dryness of the skin and roughening of the skin surface or pigmentation such as spots and freckles.
  • cell refers to a skin cell, for example, keratinocytes and melanocytes present in the epidermis, and present in the dermis and responsible for the biosynthesis of collagen and elastin. And fibroblasts.
  • the skin cells may preferably be fibroblasts.
  • skin wrinkle improvement means maintaining or strengthening the ability of the skin related to wrinkles and elasticity.
  • Collagen a collagen fiber in the dermal layer of the skin, and elastin, a elastic fiber, are the main proteins that play such a role, and are responsible for skin elasticity, and the biosynthesis of collagen is affected by the skin's internal and external effects.
  • thiol group of proteins thiol: -SH
  • regeneration means that the function of the damaged area is restored.
  • the regeneration includes a cell therapy method in which tissues of an organ damaged by a direct supply of cells function normally, and a method of helping to recover the function by supplying an extracellular physiologically active substance.
  • antioxidation means to eliminate reactive oxygen species (ROS) that cause oxidative damage in the human body.
  • ROS reactive oxygen species
  • Reactive oxygen species are generated in large quantities when irradiated with ultraviolet rays and damage DNA, RNA, proteins, cell membranes, and cellular structures, so they are considered as one of the main causes of aging.
  • moistureturizing means to properly maintain the moisture content of skin keratin cells, etc., to prevent elasticity reduction and skin dryness, and to prevent the surface from becoming rough.
  • graphene oxide (Graphene Oxides, GO) refers to an oxide of graphene, and is also used as the abbreviation GO in the present specification.
  • Graphene oxide has many oxygen-containing functional groups, and is more active than graphene, and has properties that can modify its properties through various reactions with functional groups.
  • Graphene-derived nanomaterials are easy to synthesize on a large scale, and the size and surface charge of the material can be modified through post-synthesis treatment. In addition, it has a large surface area and has a lot of potential as a biomaterial because it is easy to attach other materials as needed.
  • the cosmetic composition of the present invention is a cosmetic composition for skin regeneration, moisturizing or antioxidant comprising graphene oxide as an active ingredient.
  • the cosmetic composition of the present invention preferably contains 1.0 ⁇ 10 -7 to 30% by weight of graphene oxide based on the total weight of the composition. This is because if the content of graphene oxide, an active ingredient, is less than 1.0 ⁇ 10 -7 % by weight, the skin regeneration, moisturizing or antioxidant effect is insignificant, and if it exceeds 30% by weight, no apparent increase in the effect due to the increase in the content appears.
  • the cosmetic composition of the present invention containing graphene oxide as an active ingredient has no cytotoxicity and can be provided as a cosmetic composition showing skin regeneration, wrinkle improvement, moisturizing, and antioxidant effects as a result of treatment on skin cells.
  • Graphene oxide, an active ingredient in the cosmetic composition of the present invention provides skin antioxidant effects by effectively scavenging free radicals of fibroblasts, especially OH radicals, promoting the regeneration of fibroblasts, and collagenase, an enzyme that degrades skin collagen It suppresses the expression of MMP-1) and promotes the synthesis of type 1 procollagen and fibrillin, thereby exhibiting an anti-wrinkle effect.
  • it exhibits a moisturizing effect by promoting the expression of HAS-3 and/or AQP-3. Therefore, it can be usefully used as a cosmetic composition for preventing skin aging.
  • the cosmetic composition of the present invention includes powder, fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickeners, gelling agents, softeners, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents, fragrances, surfactants, water, ions At least one selected from the group consisting of type or nonionic emulsifiers, fillers, sequestering agents, chelating agents, preservatives, vitamins, blockers, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, fragrances, hydrophilic or lipophilic active agents, Or it may additionally contain adjuvants commonly used in the field of cosmetics or dermatology, such as any other ingredients commonly used in cosmetics. The adjuvant is introduced in an amount generally used in the field of cosmetics or dermatology.
  • the composition of the present invention may contain a skin absorption promoting material to increase the skin improvement effect.
  • the cosmetic composition of the present invention may also be formulated in one or more forms selected from the group consisting of a toner agent, a lotion agent, and a cream agent, and the formulation is not particularly limited.
  • the present invention provides a quasi-drug composition for skin regeneration, wrinkle improvement, moisturizing or antioxidant containing graphene oxide as an active ingredient.
  • the term "quasi-drug” refers to fibers, rubber products, or the like, which are used for the purpose of treating, alleviating, treating or preventing diseases of humans or animals, have weak effects on the human body or do not directly act on the human body, and Or non-machine or similar, as an article corresponding to one of the preparations used for sterilization, insecticide and similar purposes to prevent infectious diseases, and used for the purpose of diagnosing, treating, alleviating, treating or preventing diseases of humans or animals. It means not an apparatus, machine, or device among the items that are used, and those that are not instruments, machines, or devices among articles used for the purpose of pharmacologically affecting the structure and function of a person or animal.
  • composition of the present invention When used as a quasi-drug additive, the composition may be added as it is or may be used together with other quasi-drug or quasi-drug components, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use.
  • the quasi-drug composition of the present invention is not limited thereto, but preferably a body cleanser, a disinfectant cleaner, a detergent, a kitchen cleaner, a cleaning cleaner, a toothpaste, a gargle, a wet tissue, a detergent, a soap, a hand wash, a hair cleaner, a hair softener, a humidifier filler. , It may be one or more formulations selected from the group consisting of masks, ointments, and filter fillers. The same contents as described for the cosmetic composition may be applied to the quasi-drug composition of the present invention, except for differences depending on the formulation.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for skin regeneration, wrinkle improvement, moisturizing or antioxidant containing graphene oxide as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and the dosage may be appropriately selected according to the age, sex, weight, condition, degree of disease, form of the drug, administration route and duration of the administration target. .
  • a method for producing a skin differentiated cell comprises the steps of subculturing embryoid bodies derived from embryonic stem cells to form differentiated cells; Culturing the differentiated cells while inhibiting the growth of the differentiated cells; And recovering the solution component from the culturing step of the differentiated cells.
  • the graphene oxide (GO) used in this experiment was synthesized in the laboratory of Professor Hong Byung-hee, Seoul National University.
  • the graphene oxide sheet was synthesized by the improved Hummers method using pure graphite powder. Specifically, graphite powder is put into a solution in which H 2 SO 4 /H 3 PO 4 is mixed at 9:1, and KMnO 4 is additionally added. The mixture was then stirred for 24 hours at 60 °C cooled to room temperature, then placed in ice water bath H 2 O 2 Add Thereafter, the final mixed solution is purified through centrifugation and dried to obtain graphene oxide in powder form. In addition, additional ultrasonic treatment can be performed for size adjustment. The average of the obtained graphene oxide particles was 5.09 ⁇ 2.47 ⁇ m.
  • the graphene oxide powder obtained as above was used by dispersing by concentration in Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) for cell efficacy evaluation in each of Experimental Examples 1 to 7.
  • DPBS Dulbecco's phosphate buffered saline
  • Example 1 In order to evaluate the cytotoxicity of the graphene oxide of Example 1, a change in the number of cells in a human dermal fibroblast (Hs68) was measured. Cells treated with Epigallocatechin gallate (EGCG) were used as a positive control.
  • EGCG Epigallocatechin gallate
  • Hs68 fibroblasts were dispensed into a 96 well plate by the number of 2x10 4 , and then cultured for 24 hours in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 . After that, the medium (None) and graphene oxide not containing graphene oxide (GO) were replaced with a medium containing 100 ng/mL, 1000 ng/mL, 1x10 4 ng/mL, and 1x10 5 ng/mL, respectively. Incubated for an additional 24 hours.
  • DCF-DA which reacts with reactive oxygen species (ROS) occurring in the cell, and emits fluorescence
  • ROS reactive oxygen species
  • FIG. 1 shows the results of measuring intracellular ROS (intracellular ROS) by calculating% for the untreated group (None) as shown in Equation 1 below.
  • OH580 probe that selectively binds to OH radicals in living cells and emits fluorescence was added to evaluate the OH radical scavenging ability of graphene oxide (GO).
  • the fibroblast line HS68 was dispensed into a 96 well plate at 2 ⁇ 10 4 portions , and then cultured for 24 hours in an incubator at 37° C. 5% CO 2 . After that, the plate was centrifuged at 800 rpm for 2 minutes, the medium was removed, and 100 ul of each well was treated with OH580 stain working solution (abcam, Massachusetts, USA), and wrapped in foil at 37°C and 5% CO 2 for 1 hour. React.
  • DPBS was treated with graphene oxide including H 2 O 2 (100uM) for each of 10, 100, and 1000 ng/ml, and then reacted at 37° C. and 5% CO 2 for 2 hours. After removing the solution and washing 2-3 times with DPBS, put 100 uL of Assay Buffer into each well and observe at 594 nm wavelength with a fluorescence microscope.
  • Hs68 fibroblasts After dispensing Hs68 fibroblasts at a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells/well into a 6 well plate, they were cultured for 24 hours in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 to make 100% confluent. Afterwards, using a pipette tip, scrape randomly across the center of the well and wound, and replaced with a medium containing GO and a medium containing 10 ng/mL, 100 ng/mL, and 1000 ng/mL GO respectively. It was further incubated for the next 24 hours. After 24 hours, it was photographed under a microscope to see how much of the wounds arbitrarily wound on the cells had recovered in the case of not containing GO and in the case of containing GO.
  • the expression level of MMP-1 was measured using the human fibroblast line Hs68. After dispensing the fibroblast line Hs68 into a 6 well plate by the number of 3 ⁇ 10 5 , it was cultured for 24 hours in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 . After removing the medium, adding DPBS, UVB irradiation of 12 mJ/cm 2 to the remaining cell groups excluding the UVB-irradiated group, and then the extract was added and cultured for an additional 24 hours.
  • SYBR Green supermis SYBR Green supermis, Applied Biosystems, USA
  • the degree of expression of the MMP-1 gene was evaluated. Primer sequence and reaction conditions were as shown in Table 1 below, and the expression level of the gene was finally analyzed through correction for the ⁇ -actin gene.
  • a cosmetic composition containing graphene oxide was prepared as a toner through a conventional method according to the ingredients and contents shown in Table 2 below.
  • a cosmetic composition containing graphene oxide was prepared as a lotion through a conventional method according to the ingredients and contents shown in Table 3 below.
  • a cosmetic composition containing graphene oxide was prepared as a cream through a conventional method according to the ingredients and contents shown in Table 4 below.

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Abstract

본 발명은 산화 그래핀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물, 의약외품 조성물, 약학 조성물에 관한 것으로, 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화 효과를 제공하여 피부 노화를 방지하는 조성물을 제공한다.

Description

산화 그래핀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물
본 발명은 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 산화 그래핀을 유효성분으로 함유하는 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 산화 그래핀을 유효성분으로 함유하는 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 의약외품 조성물, 약학 조성물에 관한 것이다.
우리 몸에 있어서 피부는 외부 환경과 직접 접하면서 다양한 유해 인자로부터 우리 몸을 보호하는 기능을 담당하고 있다. 노화는 나이가 들면서 자연스럽게 진행되는 현상으로, 복잡한 인체 메커니즘에 의한 결과로서 본래 가지고 있는 정상적인 기능이 생리학적으로 점차 쇠퇴하는 것을 일컫는다. 노화는 다양한 자극에 의해서 촉진되거나 감소될 수 있으나, 현대 사회에 접어들면서 자외선, 환경 오염, 스트레스 등의 내외부적 요인으로 인해 가속화되고 있다.
피부는 외부에서부터 순서대로 표피(Epidermis), 진피(Dermis), 피하지방(Hypodermis) 조직의 3개 층으로 크게 구분되며, 물리적, 화학적인 외부 환경의 자극으로부터 인체를 보호하는 기능을 한다. 이 중 표피는 다시 각질층, 과립층, 유극층, 기저층으로 나뉘는데, 각질층은 약 10~20%의 수분을 함유하며 인체의 최외곽에 존재함으로써 체외로의 수분 증발을 억제하는 한편 외부로부터의 물질 과잉 침투를 차단하는 역할을 한다. 각질층 표면은 피지선에서 나온 피지와 땀샘에서 나온 땀으로 만들어진 얇은 천연 보호막으로 감싸져 있어 수분의 증발을 예방한다. 한편, 진피층은 피부의 지지대 역할을 하는 콜라겐(Collagen)과 탄력을 형성하는 피브릴린(Fibrillin) 등의 단백질 등을 합성하여, 피부의 탄력을 유지하고 구조를 지지하는 역할을 한다.
피부의 노화는 각질층의 수분 부족이나 진피층의 세포외 기질 단백질의 이상으로 인해 발생하며, 노화가 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산 및 당단백질 등의 함유량 및 배열이 변하거나 감소하는 증상들이 나타난다. 표피의 각질층을 구성하고 있는 세포에는 수용성 성분인 고농도의 천연보습인자(Natural Moisturizing Factor; NMF)가 존재하여 각질층의 수분 유지에 중심적인 역할을 한다. 아미노산, 당류와 같은 천연보습인자는 피부가 유연성을 나타내도록 작용함은 물론 적절한 수분을 유지할 수 있도록 돕는다. 특히 아미노산과 같은 물질은 그 자체로 수용성일 뿐만 아니라 효과적으로 수분과 결합하여 피부에서 수분이 건조되는 것을 억제한다. 이러한 각질층의 수분이 감소하면, 피부가 건조해지고 표면이 거칠어지며 피부가 윤기를 잃어 칙칙하게 보이는 등의 현상이 발생하기 때문에 피부 보습제의 필요가 증가하고 있다.
아쿠아포린(Aquaporin)은 물 분자만을 선택적으로 통과시키며 모든 세포막에 존재하는 막관통단백질(Major Intrinsic Protein Family)로, 피부의 수분 흡수를 증가시킨다. 포유동물에서 발견되는 아쿠아포린은 13개의 동종 단백질(AQP-1 내지 AQP-13)이고, 이들 중 아쿠아포린-3(Aquaporin-3, AQP-3)은 사람의 표피에 풍부하게 존재한다. 아쿠아포린-3은 피부의 각질형성세포에서 발현하며, 아쿠아포린-3을 통한 물 및 글리세롤의 흡수와 이동은 세포의 수분 손실을 방지해 피부의 보습 및 탄력을 증가시킨다.
또한, 노화된 피부에서 나타나는 주름살과 피부의 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등은 대부분 진피에 존재하는 기질단백질의 변화 때문이다. 진피는 피부 내에서 피부의 강도와 형태를 지지하는 역할을 하고 있기 때문에 노화가 진행될 때 진피에 형태적인 변화가 일어나게 되면 주름 생성 및 피부 쳐짐에 결정적인 역할을 하게 된다. 이러한 기질단백질을 분해하는 효소로서 대표적인 것이 매트릭스 메탈로프로테아제(Matrix metalloproteinase, MMP)이다. 자외선 조사 시 피부 내의 MMPs 활성이 증가되고, 피부 내의 콜라겐 및 기타 기질단백질을 현저하게 분해시켜 피부 노화를 촉진하는데 주요한 요인으로 작용한다. 그 중 콜라게나아제(Collagenase)로 알려진 MMP-1은 피부 콜라겐 쇠퇴에 가장 영향을 끼치는 효소 중 하나이다. 따라서 MMP-1을 억제하는 활성 성분은 피부 노화 방지에 좋은 효과를 갖는다.
이에, 본 발명자들은 바이오 분야에 적용 가능한 그래핀에 주목하여, 본 발명을 완성하게 되었다. 그래핀은 탄소 원자가 sp2 혼성 결합을 통해 육각형 격자구조를 이루어 만들어진 원자 한 층의 2차원 물질이다. 그래핀이 처음 발견된 후 그래핀의 특이한 물리적, 화학적, 전기적 그리고 기계적 특성을 이용한 다양한 연구가 진행되어 왔으며, 최근에는 그래핀 유래 나노 물질들의 바이오 분야 응용 가능성에 주목하면서 바이오 소재로 적용시키는 연구가 활발히 보고 되고 있다. 종래 그래핀을 함유한 화장료로서, 산화 그래핀을 함유하여 피부의 진드기를 제거할 수 있는 기능을 갖는 마스크팩 조성물(CN 105287248B)이 개시된 바 있다.
본 발명은 산화 그래핀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 통해 피부 재생, 주름 개선, 보습, 항산화 효과를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여, 산화 그래핀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 전체 화장료 조성물 총 중량 대비 산화 그래핀을 1.0 × 10-7 내지 30 중량%로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 산화 그래핀은 i) 활성산소 소거, ii) 콜라게나아제(MMP-1)의 발현 억제, iii) 타입 1 프로콜라겐(type 1 procollagen) 합성 촉진, iv) 피브릴린(fibrillin) 발현 증가, v) 히알루론산 합성 효소(HAS-3) 발현 증가, 또는 vi) 아쿠아포린-3(AQP-3) 발현 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효과를 제공하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 분체(powder), 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 향료, 친수성 또는 친유성 활성제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 토너제, 로션제, 및 크림제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현 예로서, 산화 그래핀을 유효성분으로 포함하는, 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현 예로서, 산화 그래핀을 유효성분으로 포함하는, 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 산화 그래핀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물, 의약외품 조성물 또는 약학 조성물은 피부 재생, 주름 개선, 보습, 항산화 효과를 나타낸다.
도 1은 섬유아세포에 산화 그래핀(Graphene Oxide, GO)을 각각 100 ng/mL, 1000 ng/mL, 1x104 ng/mL, 1x105 ng/mL 처리 시, 세포 활성 저해에 영향을 미치지 않음을 나타내는 그래프이다.
도 2는 섬유아세포에 산화 그래핀을 각각 100 ng/mL, 1000 ng/mL 처리 시, H2O2로 유발된 세포 내 활성 산소 제거능을 나타내는 그래프이다.
도 3은 섬유아세포에 산화 그래핀을 10 ng/mL, 100 ng/mL, 1000 ng/mL 처리 시, H2O2로 유발된 활성 산소 중 OH 라디칼 소거능을 나타내는 형광 이미지이다.
도 4a, 4b는 산화 그래핀을 10 ng/mL, 100 ng/mL, 1000 ng/mL 처리 시, 농도가 증가함에 따른 섬유아세포의 재생 촉진 효과를 나타내는 이미지이다.
도 5는 산화 그래핀의 UV 조사로 인해 증가한 MMP-1 발현 억제 효과를 측정한 그래프이다.
도 6은 산화 그래핀 처리 시, 콜라겐 합성 효소 COL1A1 발현 촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 산화 그래핀 처리 시, 피브릴린(Fibrillin) 발현 촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 산화 그래핀 처리 시, 히알루론산 합성 효소인 HAS-3 발현 촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 산화 그래핀 처리 시, 아쿠아포린-3(AQP-3) 발현 촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
본 발명자들은 산화 그래핀(Graphene Oxides, GO)이 피부 세포에 독성이 없는 것을 확인하였고, 피부 섬유아세포의 재생을 촉진시키는 효능을 확인하였다. 또한, 피부 세포 내 생성된 활성산소 제거능을 보이며, 콜라게나아제(MMP-1) 발현을 억제하고 COL1A1 및 피브릴린(Fibrillin) 발현을 촉진하는 것을 통해 항산화 및 주름 개선 효과가 있는 것을 확인하였다. 또한, 피부 보습 인자인 히알루론산 합성 유전자 HAS-3(Hyaluronan Synthase-3)과 아쿠아포린-3(Aquaporin-3, AQP-3) 발현 증가를 통해 산화 그래핀의 보습 효과를 확인하였다. 결과적으로 본 발명은 재생, 항산화 및 보습을 통해 항노화 효과를 갖는 산화 그래핀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 명세서 내에서, "노화"는 나이가 듦에 따른 노화(chronoaging), 또는 태양에의 노출에 따른 노화(광노화), 극한 기후 조건, 담배 연기, 미세먼지, 화학적 오염 물질 등으로 인한 환경 요인에의 노출을 통해 피부가 경험하는 모든 변화를 의미한다. 노화로 인한 피부의 변화는 촉감 등을 통한 외적인, 가시적인 및/또는 인식가능한 모든 변화, 또는 피부 조직의 조직학적 변화를 포함한다. 노화는 다양한 요인에 의해 발생할 수 있는 것으로, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 재생, 주름 개선, 보습, 및 항산화를 통해 다양한 기작으로 피부의 항노화에 도움을 줄 수 있다.
본 명세서 내 "피부 광노화(Photo aging)"는 일광노출(자외선)에 의해 피부가 노화되는 현상을 의미하는 것으로서, 장기간동안 태양(자외선)에 노출되면, 얼굴, 목에 깊은 주름을 증가시키고 또 피부의 건조 및 피부 표면이 거칠어지거나 반점, 주근깨 등의 색소침착을 일으킨다.
본 명세서 내에서 "세포"는 피부 세포를 의미하며, 예로서 표피에 존재하는 각질 형성 세포(Keratinocyte) 및 멜라닌 세포 (Melanocyte), 진피에 존재하며 콜라겐(Collagen) 및 엘라스틴(Elastin)의 생합성을 담당하는 섬유아세포(Fibroblast)를 들 수 있다. 상기 피부 세포는 바람직하게는 섬유아세포일 수 있다.
본 명세서 내 "피부 주름 개선"은 피부의 주름 및 탄력과 관련된 능력을 유지 또는 강화시키는 것을 의미한다. 피부 진피층의 교원섬유인 콜라겐(collagen)과 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)이 그러한 역할을 하는 주요 단백질로서 피부 탄력을 주관하는데, 콜라겐의 생합성은 피부의 내, 외적 영향을 받게 된다. 구체적으로, 피부 세포는 자연 노화로 인하여 세포 활성이 감소되면 콜라겐 섬유의 감소가 일어나거나, 또는 외적 요인으로서 자외선이 과량 조사되거나 스트레스 등에 의해 생성된 활성 산소가 단백질의 티올기(thiol: -SH)와 반응하여 효소 활성을 저해하거나, 콜라겐, 엘라스틴 등의 분해 효소의 발현을 증가시켜 피부의 주름을 증가시키고 탄력을 감소시켜 피부 노화가 진행된다.
본 명세서에 있어서, "재생"은 손상된 부위의 기능이 회복되는 것을 의미한다. 일 예로, 상기 재생은 세포의 직접적인 공급으로 훼손된 기관의 조직이 정상적인 기능을 하게 하는 세포 치료 방법과 세포외 생리활성물질의 공급으로 기능회복을 돕는 방법을 포함한다.
본 명세서 내에서 "항산화"는 인체 내 산화적 손상을 일으키는 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)을 소거하는 것을 의미한다. 활성산소종은 자외선 조사 시 다량 발생되어 DNA, RNA, 단백질, 세포막 및 세포 구조에 손상을 입히므로 노화의 주원인 중 하나로 고려된다.
본 명세서의 "보습"은 피부 각질 세포 등의 수분 함량을 적절히 유지하도록 하여, 탄력 감소 및 피부 건조화를 막고 표면이 거칠게 되는 것을 방지하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "산화 그래핀(Graphene Oxides, GO)"은 그래핀의 산화물을 의미하며, 본 명세서 내에서 약어 GO로 사용되기도 한다. 산화 그래핀은 산소 함유 작용기가 많아 그래핀보다 활성이 높고 작용기와의 다양한 반응을 통해 그 성질을 변형시킬 수 있는 특성을 갖는다. 그래핀 유래 나노 물질들은 대량합성이 용이 하고, 합성 후 처리를 통해 물질의 크기, 표면 전하 등을 변형시킬 수 있다. 또한 넓은 표면적을 가지고 있으며, 필요에 따라 다른 물질을 부착 하기에도 용이하기 때문에 바이오 소재로의 많은 잠재력을 가지고 있다.
이하, 상기 화장료 조성물에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 화장료 조성물은, 산화 그래핀을 유효성분으로 포함하는 피부 재생, 보습 또는 항산화용 화장료 조성물이다.
본 발명의 화장료 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 산화 그래핀이 1.0 × 10-7 내지 30 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 유효성분인 산화 그래핀의 함량이 1.0 × 10-7 중량% 미만이면 피부 재생, 보습 또는 항산화 효과가 미미하고, 30 중량%를 초과하면 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않기 때문이다.
산화 그래핀을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은, 세포 독성이 없으며, 피부 세포에 처리한 결과 피부 재생, 주름 개선, 보습, 항산화 효과를 보이는 화장료 조성물로써 제공 가능하다. 본 발명 화장료 조성물의 유효성분인 산화 그래핀은 섬유아세포의 활성산소, 그 중에서도 특히 OH 라디칼을 효과적으로 소거함으로써 피부 항산화 효과를 제공하며, 섬유아세포의 재생을 촉진하고 피부 콜라겐 분해 효소인 콜라게나아제(MMP-1)의 발현을 억제하며, 타입 1 프로콜라겐 및 피브릴린 합성을 촉진함으로써 주름 개선 효과를 나타낸다. 또한, HAS-3 및/또는 AQP-3의 발현을 촉진함으로써 보습 효과를 나타낸다. 따라서 피부 노화를 방지하는 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 분체(Powder), 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(Foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 향료, 친수성 또는 친유성 활성제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상, 또는 화장품에 통상적으로 사용 되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 또는 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품 또는 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다. 또한, 본 발명의 조성물은 피부 개선 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 또한, 토너제, 로션제 및 크림제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 형태로 제형화될 수 있으며, 그 제형이 특별히 한정되는 것은 아니다.
다른 양상으로서 본 발명은, 산화 그래핀을 유효성분으로 함유하는 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 의약외품 조성물을 제공한다. 본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 의미한다.
본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 바디 클렌저, 소독 청결제, 세정제, 주방용 세정제, 청소용 세정제, 치약, 가글제, 물티슈, 세제, 비누, 핸드 워시, 헤어 세정제, 헤어 유연제, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 및 필터충진제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 제형일 수 있다. 본 발명의 의약외품 조성물에는 제형에 따른 차이점을 제외하고는, 상기 화장료 조성물에 대하여 설명한 바와 동일한 내용이 적용될 수 있다.
또 다른 양상으로서 본 발명은, 산화 그래핀을 유효성분으로 함유하는 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 투여량은 투여 대상의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 적절히 선택될 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 분화 세포를 제조하는 방법은, 배아줄기세포로부터 유래된 배상체를 계대 배양하여 분화 세포를 형성하는 단계; 상기 분화 세포의 성장을 억제시키면서 상기 분화 세포를 배양하는 단계; 및 상기 분화 세포의 배양 단계로부터 용액 성분을 회수하는 단계를 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
< 실시예 1>
제조예 1: 산화 그래핀의 제조
본 실험에 사용된 산화 그래핀(Graphene Oxide, GO)은 서울대학교 홍병희 교수 실험실에서 합성한 것을 사용했다. 산화 그래핀 시트는 순수 그라파이트 파우더를 이용하여 improved Hummers method 방법으로 합성 되었다. 구체적으로, 그라파이트 파우더를 H2SO4/H3PO4가 9:1로 혼합된 용액에 넣고, 추가적으로 KMnO4 첨가한다. 혼합물을 60 ℃ 에서 24시간 교반한 후 상온으로 냉각시키고, 이어서 얼음 수조 안에 두고 H2O2 를 첨가한다. 이후 최종 혼합 용액을 원심분리를 통해 정제하고, 건조를 하여 분말 상태의 산화 그래핀을 얻는다. 또한 사이즈 조절을 위해 추가적으로 초음파 처리를 할 수 있다. 수득한 산화 그래핀 입자의 평균은 5.09±2.47 μm 이었다.
위와 같이 얻은 산화 그래핀 분말은 각 실험예 1~7에서 세포 효능 평가를 위해 Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS)에 농도별로 분산시켜 사용하였다.
실험예 1 : 세포 독성 평가
실시예 1의 산화 그래핀의 세포 독성 평가를 위해 사람의 섬유아세포 세포주(Human dermal fibroblast, Hs68)에서의 세포수 변화를 측정하였다. Epigallocatechin gallate(EGCG)를 처리한 세포를 양성 대조군으로 사용하였다.
먼저 Hs68 섬유아세포를 96 well plate에 2x104의 수만큼 분주한 후, 37 ℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 산화 그래핀(GO)을 포함하지 않은 배지(None)와 산화 그래핀을 각각 100 ng/mL, 1000 ng/mL, 1x104 ng/mL, 1x105 ng/mL 포함하는 배지로 교체해 준 다음, 24시간 동안 추가로 배양하였다. 24시간 후 각 well의 배지를 제거하고 Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS)을 이용한 washing 과정을 1회 거친 다음 각 well당 10 ㎕의 CCK-8(Cell counting kit-8, Dojindo, 일본) 시약을 포함하는 배지로 교체하여 37 ℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 이후 UV-Vis spectrophotometer를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(Cell viability)은 GO를 포함하지 않은 배지를 처리한 경우를 대조군으로 하여 이의 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타내었다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 GO를 처리한 경우 세포증식을 저해시키지 않았고, 세포증식 촉진 효과가 있는 것을 확인하였다. 이를 통해 피부 세포에 1x105 ng/mL 이상으로 처리 시에도 세포 독성이 없다는 것을 확인하였다.
실험예 2 : 항산화 효능 평가
세포 내에서 발생하는 활성산소종(ROS)과 반응하여 형광을 띠는 DCF-DA를 사용하여, ROS 생성량을 확인함으로써 항산화력을 측정하였다. 섬유아세포주 Hs68을 6 well plate에 3.5x105의 수만큼 분주한 후, 37 ℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 후, Control을 제외한 나머지 세포군에 H2O2를 첨가한 뒤 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후 빛을 차단한 상태에서 DCF-DA(10 μM)를 넣고, 37 ℃에서 1시간 염색하였다. 그 다음으로 배지를 제거한 후에 DPBS로 2회 washing한 후, well마다 1 ml DPBS를 넣고 cell scrapper로 긁어서 EP tube에 담았다. 이렇게 모은 cell 용액을 200ul씩 96 well black plate에 3회 반복하여 넣은 후, Ex/Em=485/535nm로 하여 Victor 3로 plate reading하였다. 하기 수학식 1과 같이 무처리군(None)에 대한 %를 계산하여 세포 내 ROS(intracellular ROS)를 측정한 결과를 도 2에 나타내었다.
Figure PCTKR2020007459-appb-M000001
그 결과, 100 ng/mL와 1000 ng/mL GO 처리 농도에서 DCF-DA assay에 의한 GO의 세포 내 ROS에 대한 항산화 효능이 있음을 확인하였다.
실험예 3 : 세포 내 OH 라디칼 소거능 평가
살아있는 세포 내의 OH 라디칼에 선택적으로 결합하여 형광을 띠는 OH580 probe를 첨가하여, 산화 그래핀(GO)의 OH 라디칼 소거능을 평가하였다. 섬유아세포주 HS68을 96 well plate에 2x104씩 분주한 후, 37 ℃ 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 plate를 800 rpm에서 2분간 원심분리한 후 배지를 제거하고 OH580 stain working solution(abcam, Massachusetts, USA)을 well마다 100 ul씩 처리한 후 호일로 싸서 37 ℃, 5% CO2에서 1시간 동안 반응시킨다. 이후 DPBS에 H2O2(100uM)를 비롯한 산화 그래핀을 각 10, 100, 1000 ng/ml에 맞게 처리 후, 2시간 동안 37 ℃, 5% CO2에서 반응시킨다. 이후 Solution을 제거하고 DPBS로 2~3회 washing한 후, 100 uL의 Assay Buffer를 각 well에 넣고 형광 현미경으로 594 nm 파장에서 관찰한다.
섬유아세포 세포 내 H2O2 유도로 생성된 OH 라디칼 소거능을 형광 현미경으로 확인한 결과, 도 3과 같이 GO를 10 ng/mL, 100 ng/mL, 1000 ng/mL 농도에서 처리한 경우 대조군과 비교 시 유의한 항산화 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
실험예 4 : 세포 재생 촉진능 평가
산화 그래핀(GO)의 세포 재생 촉진 효과를 평가하기 위해 실험예 1, 2에서와 동일 세포를 사용하여 실험을 진행하였다. Ascorbic acid 처리 세포를 양성 대조군으로 사용하였다.
Hs68 섬유아세포를 5x105 cells/well의 농도로 6 well plate에 분주한 후, 37 ℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24 시간 동안 배양하여 100% confluent한 상태를 만들어 주었다. 이후 pipette tip을 이용하여 well의 가운데를 가로지르도록 임의로 긁어 상처를 내고, GO를 포함하지 않은 배지와 각각 10 ng/mL, 100 ng/mL, 1000 ng/mL의 GO를 포함하는 배지로 교체해 준 다음 24시간 동안 추가로 배양하였다. 24시간 후, GO를 포함하지 않은 경우와 포함한 경우에서 세포에 임의로 낸 상처가 어느 정도 회복되었는지를 현미경으로 촬영하였다.
그 결과, 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이 GO를 처리하지 않은 경우에 비해 처리한 경우에서 세포 재생이 더욱 촉진됨을 확인하였다.
실험예 5 : MMP-1 저해능 평가
자외선에 의해 증가하는 콜라게나아제(MMP-1)에 대한 산화 그래핀(GO)의 저해능을 비교하기 위해 인간 섬유아세포주 Hs68을 이용하여 MMP-1 발현량 측정을 진행하였다. 섬유아세포주 Hs68을 6 well plate에 3x105의 수만큼 분주한 후, 37 ℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 후 UVB 비조사군을 제외한 나머지 세포군에 12 mJ/cm2의 UVB를 조사한 뒤 상기 추출물을 첨가하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후 각 샘플을 처리한 세포에서 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop을 이용하여 260 nm에서 RNA를 정량한 후, 각각 2 ㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA에 타겟 단백질인 MMP-1 primer와 시아닌 염료인 사이버그린(SYBR Green supermis, Applied Biosystems, 미국)을 첨가한 혼합물을 이용하여 real-time PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 MMP-1 유전자의 발현 정도를 평가하였다. Primer의 서열과 반응 조건은 하기 표 1와 같았으며, 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.
Figure PCTKR2020007459-appb-T000001
< 실시예 2>
제조예 2: 산화 그래핀을 포함하는 화장료 조성물의 제조
(1) 토너제의 제조
산화 그래핀을 포함하는 화장료 조성물을, 하기 표 2에 나타낸 성분 및 함량에 따라 통상적인 방법을 통해 토너제로 제조하였다.
Figure PCTKR2020007459-appb-T000002
(2) 로션제의 제조
산화 그래핀을 포함하는 화장료 조성물을, 하기 표 3에 나타낸 성분 및 함량에 따라 통상적인 방법을 통해 로션제로 제조하였다.
Figure PCTKR2020007459-appb-T000003
(3) 크림제의 제조
산화 그래핀을 포함하는 화장료 조성물을, 하기 표 4에 나타낸 성분 및 함량에 따라 통상적인 방법을 통해 크림제로 제조하였다.
Figure PCTKR2020007459-appb-T000004

Claims (7)

  1. 산화 그래핀을 유효성분으로 포함하는, 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 산화 그래핀은 화장료 조성물 총 중량 대비 1.0 × 10-7 내지 30 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 산화 그래핀은,
    i) 활성산소 소거, ii) 콜라게나아제(MMP-1)의 발현 억제, iii) 타입 1 프로콜라겐(type 1 procollagen) 합성 촉진, iv) 피브릴린(fibrillin) 발현 증가, v) 히알루론산 합성 효소-3(HAS-3) 발현 증가, 또는 vi) 아쿠아포린-3(AQP-3) 발현 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효과를 제공하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 분체(powder), 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 향료, 친수성 또는 친유성 활성제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 토너제, 로션제, 및 크림제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  6. 산화 그래핀을 유효성분으로 포함하는, 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 의약외품 조성물.
  7. 산화 그래핀을 유효성분으로 포함하는, 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 약학 조성물.
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