KR20190060491A - 나노크기의 산화 그래핀을 포함하는 항염증용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 나노크기의 산화 그래핀을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 조성물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장품 조성물 또는 사료 조성물, 및 상기 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

나노크기의 산화 그래핀을 포함하는 항염증용 조성물{Anti-inflammatory composition comprising nano-sized graphene oxide}

본 발명은 나노크기의 산화 그래핀을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 조성물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장품 조성물 또는 사료 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

염증(inflammation)은 조직의 손상, 외부의 자극 또는 다양한 감염원에 대한 생체조직의 방어 반응으로, 혈관과 체액 내의 각종 염증 매개 인자와 다양한 면역 세포의 유기적 상호작용으로 인해 발생되는 복합적인 병리 현상이다. 일 예로, 세포에 외부 자극이 가해지면 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha) 또는 IL-6(interleukin-6) 등의 전염증성 사이토카인(cytokine)들이 증가하고, 상기 사이토카인은 iNOS(inducible nitric oxide systhase) 또는 COX-2(cyclooxygenases-2) 등의 유전자의 발현을 자극함으로써 NO(nitric oxide) 또는 PGE2(prostaglandin E2)를 생성시켜 염증반응이 일어나게 된다. 상기 면역반응과 관련 있는 IL-6, IL-8, TNF-α 또는 IFN-α 등의 사이토카인은 대식세포에 의해 합성되고 분비되며, 사이토카인의 종류에 따라 대식세포에 의한 발현이 상향조절 되거나, 또는 하향조절될 수 있다(Cavaillon JM, Biomed. Pharmacother. 1994;48(10):445-53).

NO는 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관확장 등의 다양한 생리활성 기능을 가지고 있으나, 염증 상태에서 iNOS에 의해 과잉 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종, 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발한다. 이에 따라, 상기 NO의 과도한 생성을 억제하는 물질을 개발하기 위한 많은 연구가 수행되었으며, 다양한 천연물로부터 유래된 카페산, 클로로겐 산, 계피산, p-쿠말산, 헤스페리딘, 로스 마린산 등의 페닐프로파노이드 화합물이 피부염증을 억제할 수 있음이 보고된 바 있다(일본공개특허 제2000-319154호). 그러나, 천연물 유래 성분에 대한 연구는 아직 초기 단계에 불과하여, 보다 다양한 성분의 개발이 요구된다.

다양한 염증성 질환 중 크론병(Chron's disease)과 궤양성 대장염(ulcerative colitis)로 대표되는 염증성 장질환(inflammatory bowel disease; IBD)은 위장관을 침범하는 원인이 정확히 밝혀지지 않은 만성적인 염증성 질환을 의미한다. 크게는 상기 크론병과 궤양성 대장염의 두 종류로 구분되지만 우리나라에서 비교적 흔하게 발병하는 장형 베체트병(intestinal Bechet's disease)을 포함시키기도 한다. 흑인이나 동양인보다는 백인이나 유태인에서 많이 발견되지만 동양인에서 발병되는 경우가 점차 증가하고 있다. 호발연령은 15 내지 35세 사이이며, 증상은 궤양성 대장염의 경우 설사(혈변 및 점액변), 뒤무직, 복통, 복부압통, 체중감소 등이 주로 나타나며, 크론병의 경우에는 체중감소, 우하복부 종류, 항문주위 이상, 복부압통 등이 나타난다. 장형 베체트병은 이들과 유사하게 설사와 복통 등의 증상을 나타내며 이외의 베체트병에 준하는 증상을 동반한다. 내과적 치료가 원칙이나 이것이 어렵거나 합병증이 발병한 경우에는 외과적 치료를 한다. 약물치료를 수행하고는 있으나, 원인이 명확히 밝혀지지 못한 만큼 이렇다 할 치료제가 개발되지 못하였고 일반적인 항염증제, 부신피질 호르몬제, 면역억제제, 항생제 및 기타 약품을 적절히 병용하여 복합적으로 사용하는 추세이다. 염증의 종류, 정도, 부위, 합병증 등에 따라 약품의 종류와 양을 조절하여 사용한다. 그러나 이러한 복합요법은 부작용이 발생할 가능성이 높다는 단점이 있다. 따라서, 효과적인 염증성 장질환의 치료를 위한 치료제의 개발은 매우 중요하다.

이에, 본 발명자들은 생물의학적 치료제로서의 활성을 갖는 그래핀 유도체를 발굴하고자 예의 연구 노력한 결과, 산화 그래핀, 특히 입자 크기가 나노 수준으로 조절된 나노크기의 산화 그래핀이 염증성 인자의 발현 및/또는 염증성 사이토카인의 분비를 억제하며, 대식세포의 특정 아류형으로의 분화를 유도하는 항염증 활성을 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 나노크기의 산화 그래핀(nano-sized graphene oxide; nano-GO)을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 나노크기의 산화 그래핀(nano-sized graphene oxide; nano-GO)을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.

본 발명은 산화 그래핀, 특히 그 입자 크기가 나노 수준으로 조절된 산화 그래핀이 염증성 인자의 발현 및/또는 염증성 사이토카인의 분비를 억제하며, 대식세포의 특정 아류형으로의 분화를 유도하므로 항염증성을 나타내며, 동물실험을 통해 특히 염증성 장질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 발견한 것에 기초한다.

본 발명의 용어, "나노크기의 산화 그래핀(nano-sized graphene oxide; nano-GO)"이란, 산화 그래핀에 소정의 자극을 가하여 나노미터 수준의 크기를 갖는 입자의 형태로 제조된 물질을 지칭하는 것으로, 상기 나노크기의 산화 그래핀은 12 nm 이하의 소정의 두께 갖고 약 15 내지 50 nm의 평균 직경을 갖는 판상형의 입자를 의미할 수 있다. 예컨대, 상기 나노크기의 산화 그래핀은 산화 그래핀에 초음파를 가하여(예컨대, tip-sonification에 의해) 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 나노크기의 산화 그래핀은 15 내지 45 nm, 15 내지 27 nm, 25 내지 35 nm, 35 내지 45 nm 또는 25 내지 45 nm의 평균 직경을 가질 수 있다. 나아가, 상기 나노입자는 5 내지 12 nm, 3 내지 9 nm, 3 내지 7 nm, 5 내지 9 nm, 또는 5 내지 7 nm의 두께를 갖는 입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어, "항염증"이란, 염증을 억제하거나 감소시키는 작용을 의미하며, 상기 용어, "염증"은 생체 조직이 손상을 입었을 때에 체내에서 일어나는 방어적 반응으로, 염증성 질환을 유발하는 원인이다.

본 발명에서, 상기 항염증용 조성물은 염증을 억제하거나 감소시키는 활성을 나타냄으로써 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선에 이용될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 나노 크기의 산화 그래핀을 포함하는 상기 조성물은 전염증성 사이토카인의 발현 또는 분비 저해, 미엘로퍼옥시다아제(myeloperoxidase; MPO) 활성 저해, Th1 증식, 분화 또는 반응 억제, 억제성 T 세포 활성 촉진 또는 M2b 대식세포 상향조절함으로써 염증을 억제하거나 감소시킬 수 있다.

예컨대, 본 발명의 조성물을 처리함으로써 대표적인 전염증성 사이토카인인 IFNγ, TNF, IL-6 및/또는 MCP-1의 후속 사이토카인의 분비 또는 발현을 감소시킬 수 있다. 또는 MPO 활성을 감소시킬 수 있으며, 이는 호중구의 이동 및 염증을 억제할 수 있음을 나타낸다. 나아가, 장염에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Th1 세포로의 분화 및/또는 이의 증식을 억제하며, 이에 특이적인 유전자 발현 역시 감소시킬 수 있다. 나아가, 염증반응 동안 M1 대식세포를 M2 타입으로 전환함으로써 염증을 해소할 수 있다. 특히, M2 아류형 중 M2b 대식세포를 상향조절함으로써 염증성 반응을 약화할 수 있다.

상기 "발현"은 유전자 발현 또는 단백질 발현을 모두 포함한다.

상기 염증성 질환은 염증에 의해 야기되는 질환을 의미하므로, 본 발명의 항염증 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

상기 염증성 질환은, 본 발명의 약학 조성물에 의하여 증상이 완화, 경감, 개선 또는 치료될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적인 예로, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증, 또는 전신성 경피증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 본 발명에 따른 나노크기의 산화 그래핀을 포함하는 약학적 조성물에 의해 치료 가능한 염증성 질환은 염증성 장질환일 수 있다. 상기 염증성 장질환은 장에 발생하는 원인불명의 만성적인 염증을 뜻하는 것으로, 통상적으로 특발성 염증성 장질환인 궤양성 대장염(ulcerative colitis)과 크론병(Chron's disease)을 지칭하지만, 우리나라에서 비교적 흔하게 발병하는 장형 베체트병(intestinal Bechet's disease)도 이에 포함될 수 있다. 보다 넓은 의미로는 세균성, 바이러스성, 아메바성, 결핵성 장염 등의 감염성 장염과 허혈성 장질환, 방사선 장염 등 모든 장에서 발생하는 염증성 질환을 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기 넓은 의미의 염증성 장질환, 예컨대, 세균성, 바이러스성, 아메바성, 결핵성 장염 등의 감염성 장염과 허혈성 장질환, 방사선 장염 등 모든 장에서 발생하는 염증성 질환의 예방 또는 치료에 제한 없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크론병, 궤양성 대장염 및 장형 베체트병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 상기한 바와 같이 염증성 장질환의 원인은 아직까지 규명되지 못하고 있으나, 유전적 및 환경적 영향을 받으며, 면역학적 이상에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다. 원인이 명확히 규명되지 못하였으므로 뚜렷한 치료제도 개발되지 못하였다. 따라서, 현재로서는 약물을 이용한 염증성 장질환의 치료를 위하여 일반적인 항염증제, 부신피질 호르몬제, 면역억제제 또는 항생제 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용함으로 치료효과는 극대화하고 부작용은 최소화할 수 있는 범위에서 치료제의 종류 및 용량 등을 선택하는 방법을 택하고 있다.

상기 염증성 장질환의 증상은 구체적인 질병에 따라 차이는 있으나, 일반적으로 복통, 하복부 불쾌감, 결장의 단축(shortening of colon), 탈모, 활동성 저하, 체중감소, 출혈지수 상승(출혈) 또는 배변지수 상승(설사)의 증상을 나타낼 수 있다. 동일한 질병이라도 병변의 범위나 위치 또는 중증도에 따라 다른 양상을 나타낼 수 있다.

상기 염증성 장질환의 예방 또는 치료는 염증성 사이토카인 IL-23 또는 TGF-β의 분비 및/또는 이와 관련된 유전자의 발현 증가를 감소시킴으로써 수행될 수 있다.

상기 IL-23은 이형이합체의 사이토카인으로 면역반응에서 중요한 역할을 한다. 수지상세포(dendritic cell), 대식세포(macrophage) 및 기타 면역세포에서 생산되는 것으로 장에서 내성과 면역 간의 균형에 영향을 주는 주요한 요소로 여겨지며, 결장에서 염증을 매개하는 것이 확인되었다. 상기 TGF-β는 다양한 조직에서 합성되는 요소로 TGF-α와 상승적으로 작용한다. 배아발달, 세포분화, 호르몬분비 및 면역기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 용어, "예방"이란, 상기 조성물의 투여로 염증성 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "치료"란, 상기 조성물의 투여로 염증성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용 가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 사용가능한 계면활성제로는 스테로이드에서 유도된 것이나, N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드](DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트 등이 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 용어 "개체"란 염증성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 염증성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 염증성 질환 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물 이외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스, 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 그러나 경구 투여시, 펩티드는 소화가 되기 쉽기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61. 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 펩티드의 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스, 덱스트란 등의 카보하이드레이트, 아스코르빅산, 글루타치온 등의 항산화제, 킬레이팅 물질, 저분자 단백질 또는 다른 안정화제들을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 활성물질을 약 0.01 mg/kg/일 내지 1000 mg/kg/일의 용량으로 투여할 수 있다. 경구 투여하는 경우, 50 내지 500 mg/kg의 범위가 적합할 수 있으며, 1일 1회 이상 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명에서, 상기 항염증용 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장품 조성물일 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물은 총 조성물의 중량 대비 본 발명의 나노크기의 산화 그래핀을 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 0.01 중량% 내지 10 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 범위 내에서 본 발명의 우수한 효과를 나타내는 이점이 있으며, 조성물의 제형이 안정화되는 이점이 있다.

상기 본 발명의 화장품 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 화장품 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는, 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시테이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

나아가, 본 발명에서, 상기 항염증용 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 첨가물 또는 건강기능식품일 수 있다. 본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 나노크기의 산화 그래핀을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 용어 "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 펩티드 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 화합물을 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.

나아가, 본 발명에서, 상기 항염증용 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물일 수 있다.

본 발명의 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분으로, 본 발명의 나노크기의 산화 그래핀을 유효성분으로 포함하는 사료는 당업계의 공지된 다양한 형태의 사료로 제조가능하며, 구체적으로 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에 포함되는 본 발명의 나노크기의 산화 그래핀은 사료의 사용목적 및 사용조건에 따라 달라질 수 있으며, 일 예로 가축 사료 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 구체적으로는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 조성물은 나노 수준으로 조절된 크기를 갖는 산화 그래핀을 포함함으로써 전염증성 사이토카인의 분비 및/또는 발현을 억제하고 염증성 반응에 관여하는 세포의 분화를 조절함으로써 염증성 질환 특히, 염증성 장질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 나노-GOs의 합성방법 및 특성을 나타낸 도이다. (A)는 본 발명에 따른 나노-GOs의 합성 방법을 개략적으로 나타낸다. (B)는 본 발명에 따른 나노-GOs의 대표적인 TEM 이미지와 이로부터 산출한 입자 크기 분포를 나타낸다. (C)는 본 발명에 따른 나노-GOs의 대표적인 AFM 이미지 및 라인 프로파일 분석 결과를 나타낸다. (D)는 본 발명에 따른 나노-GOs의 대표적인 라만 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 그래핀 유도체, 나노-GOs의 복강 내 주사에 의한 DSS-유도 대장염 마우스에서의 보호 효과를 나타낸 도이다. (A 내지 D)는 마우스에 3% DSS 함유 식수를 7일 동안 투여하여 대장염을 유도한 마우스에 대한 실험 결과를 나타낸다. DSS 투여 후 1일차에 나노-GOs를 복강 내 투여하였다(300 μg/head). 임상 평가를 위하여 (A) 생존율, (B) 체중 감소율 및 (C) 대장염 중증도에 대한 질병활성지수(disease activity index; DAI)를 모니터하였다. (D)에는, 장 손상을 결정하기 위하여, DSS로 대장염 유도 후 10일에 치사한 마우스로부터 적출한 결장의 형태 및 길이를 나타내었다. n=17 내지 20 마우스/군. *P<0.05, **P<0.01, **P<0.001. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다.
도 3은 복강(abdominal cavity)에서 나노-GOs의 축적을 나타낸 도이다. DSS로 대장염 유도 및 나노-GOs 투여 후 14일에 마우스를 치사하였다. 나노-GOs는 비장 및 결장 근처에서 관찰되었다.
도 4는 DSS 유도 후 마우스에서 나노-GOs에 의한 결장 및 전신 염증 감소 효과를 나타낸 도이다. DSS로의 대장암 유도 후 나노-GOs를 복강 내 투여한 마우스를 10일차에 치사시켜 실험에 사용하였다. (A)의 좌측은 결장 단면의 대표적인 H&E 염색된 이미지를 나타낸며, 우측은 림프구 침윤(lymphocyte infiltration) 및 장 손상에 의해 수행된 조직병리학적 평가 결과를 나타낸다. 스케일 바=1 mm(상단) 및 500 μm(하단). (B)의 좌측은 섬유화를 평가하기 위한 결장의 마송삼색 염색 결과를, 우측은 섬유증 영역(fibrotic area)의 정량적 분석 결과를 나타낸다. 스케일 바=1 mm(상단) 및 500 μm(하단). 대장염 마우스로부터 혈청을 수집하고 사이토메트릭 비드 어레이(cytometric bead array; CBA) 분석을 이용하여 표시한 사이토카인의 분비 수준을 측정하여 (C)에 나타내었다. (D)는 결장 조직에서 측정한 미엘로퍼옥시다아제(myeloperoxidase; MPO)를 나타낸다.
도 5는 대장염 유도 후 결장 조직의 CBA 분석 결과를 나타낸 도이다. CBA 분석을 수행하여 결장 조직에서 표시한 사이토카인의 분비 수준을 측정하였다.
도 6은 나노-GOs의 최적 시험관 내 농도를 결정하기 위한 실험 결과를 나타낸 도이다. (A)의 좌측은 인간 제대혈(human umbilical cord blood; hUCB)로부터 분리하여 표시한 농도의 나노-GOs 존재 하에 콘카나발린 A(concanavalin A)에 의해 활성화한 단핵구 세포(mononuclear cells; MNCs)를, 우측은 hUCB로부터 정제하고 표시한 농도의 나노-GOs 존재 하에 배양한 CD4+ T 세포를 나타낸다. (B 및 C)는 20 μg/ml의 GOs를 2일 동안 Th1 세포에 첨가하여 얻은 결과로, (B)는 BrdU 어세이에 의한 증식을, (C)는 각 군으로부터의 Th1 세포의 대표적인 이미지를 나타낸다.
도 7은 나노-GOs의 Th1 분화된 세포의 활성에 대한 억제 효과를 나타낸 도이다. CD4⁺ T 세포를 hUCB로부터 분리하여 나노-GOs 존재 하에 재조합 IL-12 및 IFN-γ와 조합으로 항-CD3 및 CD28 비드를 사용하여 Th1 세포로의 분화를 유도하였다. (A)는 비오틴 표지된 나노-GOs 처리하여 Th1 분화된 세포에서의 국지화(localization)을 나타낸다. 비오틴 표지된 나노-GOs를 검출하기 위하여 항 GFP-비오틴를 사용하였다. 우측은 나노-GOs 처리된 Th1 세포의 Z-스택 이미지를 나타낸다. 스케일 바=10μm. (B)는 hUCB로부터 분리하여 나노-GOs와 함께 콘카나발린 A로 자극한 MNCs를 나타낸다. MNCs를 2일 동안 배양하고 BrdU 어세이로 측정하였다. (C)는 나노-GOs 존재 하에 2일 동안 배양된 Th1 세포의 증식을 BrdU 어세이로 평가한 결과이다. (D)는 Th1 세포의 세포사멸을 Annexin V 세포사멸 검출 키트로 분석한 결과이다. (E)는 P.I.(Propidium iodide) 염색을 이용하여 Th1 세포에서 수행한 세포 주기 분석 결과이다. (F)는 IFN-γ 발현 CD4⁺ T 세포의 백분율을 유동세포분석법으로 분석한 결과이다. (G)는 표시한 Th1 특이적 마커에 대한 각군 Th1 세포의 mRNA 발현을 확인한 결과이다. (H)는 CBA 분석에 의해 Th1 세포 상층액 중의 표시한 Th1 특이적 사이토카인을 분석한 결과이다.
도 8은 생체 내 CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ 조절 T 세포 비율의 나노-GOs에 의한 간접적인 증가를 나타낸 도이다. 나노-GOs 투여한 마우스를 15일차에 치사시켜 이후 생체 외 실험을 위해 결장과 비장을 수집하였다. 결과는 각 군 당 5 내지 6마리 마우스로부터 획득하였다. CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ 조절 T 세포의 (A) 결장 침윤 및 (B) 비장 침윤을 유동세포분석법으로 측정하였다. (C)는 FoxP3(녹색)에 대한 면역염색에 의해 결장 내에서 관찰되는 조절 T 세포를 나타낸다, 스케일 바=50 μm. FoxP3⁺ 세포를 ▼로 표시하였다. 결장 용해물의 IL-10 발현을 (D) 웨스턴 블롯과 (E) CBA 분석으로 확인하였다. (F)는 결장에서 TGF-β1의 분비 수준을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸다. (G)는 유동세포분석법에 의한 Treg 세포의 편향화 및 CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ 세포를 분석한 결과를 나타낸다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다.
도 9는 M1 대식세포의 대안적으로 활성화된 M2 유형 세포로의 전환에서 나노-GOs의 역할을 나타낸 도이다. CD14⁺ 세포를 hUCB로부터 분리하여 나노-GOs 존재 하에 배양하였다. (A)는 CD14⁺ 대식세포 유사 세포를 비오틴 표지된 나노-GOs로 처리하여 국부화를 관찰한 결과이다. 우측은: 나노-GOs 처리된 CD14⁺ 세포의 Z-스택 이미지이다. 스케일 바=10 μm. 분리된 CD14⁺ 세포를 나노-GOs 존재 하에 유형-특이적 유도 사이토카인(inducer cytokines)으로 M0, M1 및 M2 유형 세포로 편향화하였다. 배양 7일 후, (B)는 CCK-8 어세이에 의해 세포의 증식을 확인하였다. 유형-특이적 세포 표면 CD 마커를 (C) 유동세포분석법과 (D) 면역세포화학법으로 분석하였다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다.
도 10은 나노-GOs에 의한 대식세포의 분화 능력은 물론 세포 형태 및 생존율 변화를 나타낸 도이다. (A)의 상단은 나노-GOs와 함께 배양한 Raw264.7 세포의 위상차(phase-contrast) 이미지를 나타낸다. 스케일 바=100 μm. 하단은 MTT 어세이로 결정한 세포 생존율을 나타낸다. 분리된 CD14⁺ 세포를 나노-GOs 존재 하에 유형-특이적 유도 사이토카인으로 M0, M1 및 M2 유형 세포로 편향화하였다. (B)는 위상차 이미지(스케일 바=200 μm)를, (C)는 유동세포분석법에 의한 도트 플롯 이미지를 나타낸다. *** P<0.001. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다.
도 11은 나노-GOs 매개된 M2 편향화된 세포 중 M2b 대식세포가 주된 아류형임을 나타낸 도이다. 분리된 CD14⁺ 세포를 GM-CSF과 함께 2일 동안 배양하고 다음 5일 동안 IFN-γ 및 LPS와 배양하여 M1 유형 대식세포로 분화시켰다. 7일 동안 배양한 후, 세포와 배양된 배지를 회수하여 추가로 분석하였다. (A)는 유동세포분석법으로 확인한 CD163의 발현을 나타낸다. (B)는 CBA 분석법으로 측정한 TNF, IFN-γ 및 IL-6 분비 수준을 나타낸다. (C)는 M1 및 M2 유형-특이적 유전자 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과이다. M2 아류형 편향화를 위해, CD14⁺ 세포를 M-CSF와 함께 2일 동안 배양하고 특이적 사이토카인 조합(M2a, IL-4 및 IL-13; M2b, Poly I:C, IL-1β 및 LPS; M2c, IL-10 및 TGF-β1)과 함께 다음 5일 동안 배양하였다. (D)는 M2 아류형 특이적 CD 마커의 발현을 유동세포분석법으로 검출한 결과를 나타낸다. (E)는 CBA 분석법에 의해 측정한 TNF 및 IL-6 분비 수준을 나타낸다. (F)는 IL-1β 및 IL-10의 유전자 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다. *P<0.05, **P<0.005, ***P<0.001. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다.
도 12는 나노-GOs 처리에 대한 M2 아류형 대식세포의 반응을 나타낸 도이다. CD14⁺ 세포를 M-CSF와 함께 2일 동안 배양하고 특이적 사이토카인 조합과 함께 다음 5일 동안 배양하였다. (A)는 유동세포분석법에 따른 도트 플롯 이미지를 나타낸다. (B)는 M2a 아류형 특이적 유전자 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다. *P<0.05, **P<0.005, ***P<0.001. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 나노크기의 산화 그래핀(GO)의 제조

개선된 허머방법(Hummer's method)을 통해 오염되지 않은(pristine) 산화그래핀(graphene oxides; GOs)을 합성하였다. 나노크기의 GOs를 제조하기 위하여, 수득한 GOs의 증류수 용액(3 mg/ml)을 3시간 동안 격렬히 초음파 처리하고(tip-sonicated) 질산셀룰로오스 막 필터(cellulose nitrate membrane filter, 0.45 μm, GE Healthcare)로 진공-여과하였다.

제조예 2: 나노크기의 산화 그래핀의 비오틴 화

EDC 커플링에 의해 나노-GOs를 비오틴화하였다. 먼저, 10 mg의 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 염산염(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC reagent, Sigma)을 10 ml의 나노-GOs 용액(3 mg/ml)에 첨가하여 말단의 카르복실기(edge carboxyl groups)를 EDC 시약으로 치환하였다. 30분 후, 20 mg의 아민-PEG₃-비오틴(Thermo Scientific)을 상기 용액에 첨가하여 24시간 동안 반응시켜 나노-GO의 활성화된 말단과 비오틴의 반응성 아미드기 사이에 아미드 결합을 형성하도록 하였다. 상기 제조예 1에서와 유사하게 적절한 투석 및 여과 과정 후 분말의 형태로 최종 생성물을 수득하였다.

실험예 1: TEM 이미징

300 메쉬 레이스형 탄소(lacey carbon)가 코팅된 구리 격자(copper grids)(Ted Pella, Inc.)에 상기 제조예에 따라 준비한 시료를 분산시킨 용액(10 μg/ml)을 30분 동안 흡착시켰다. 이미징에 앞서 상기 격자를 수 방울의 증류수로 세척하고 데시케이터에서 완전히 건조시켰다. 이와 같이 준비한 시료를 고해상도 투과전자현미경(high resolution-transmission electron microscope; HR-TEM, JEM-3010, JEOL Ltd.)으로 분석하고, 현미경에 결합시킨 Gatan 디지털 카메라(MSC-794)로 이미지를 수집하였다.

실험예 2: 라만 분광 측정

라만 스펙트럼 측정을 위하여 상기 제조예에 따라 준비한 분말 상태의 생성물을 SiO₂ 기재 상에 준비하였다. 514.5 nm Ar 여기 레이저를 구비한 Renishaw 마이크로-라만 분광기로 스펙트럼을 측정하였다.

실험예 3: FT-IR 분광 측정

푸리에-변환 적외선 스펙트럼(Fourier-transform infrared(FT-IR) spectra) 측정에 앞서, 분말 상태의 시료를 데시케이터에서 완전히 건조하여 원치않는 산소 함유 피크(oxygen containing peaks)를 배제하였다. 통상적인 KBR 펠렛법(Nicolet 6700, Thermo Scientific)으로 스펙트럼을 측정하였다.

실험예 4: 실험동물

모든 동물실험은 서울대학교 동물실험윤리위원회(IACUC No. SNU-170523-4)의 승인된 지침에 따라 수행하였다. 6주령의 수컷 C57BL/6 마우스(Orientbio, Sungnam, Republic of Korea)를 무작위로 그룹화하고, 7일 동안 음용수에 3% DSS를 제공하였다(그룹 당 16마리). 1일차(Day1), 즉, DSS 유도 후 1일에, 마우스에 상기 제조예에 따라 준비한 난노-GOs를 15 g/kg 용량으로 복강 내 투여하였다. 마우스의 체중을 매일 측정하고, 체중 감소, 활성도, 배변일관성(stool consistency), 출혈 및 모발 상태로 구성되는 질병활성지수(disease activity index; DAI)를 7일차(Day7)와 10일차(Day10)에 평가하였다. 마우스를 치사시킨 후, 추가적인 체외 검사(ex vivo examinations)를 위해 비장(spleen), 대장(large intestine) 및 혈액 시료를 수집하였다.

실험예 5: 조직병리학적 평가

수집한 결장(colon) 시료를, 에탄올로의 탈수화, 자일렌으로의 투명화(clearing with xylene) 및 파라핀으로의 왁스 침윤(wax infiltration with paraffin)을 포함하는 통상적인 방법에 따라, 10% 포르말린에 고정하였다. 파라핀 내장된 블록을 5 μm 두께로 절단하고 H&E 또는 마송삼색(Masson's trichrome)으로 염색하였다. 배상세포(goblet cells)의 손실, 충혈(hyperemia)/부종(edema), 면역세포의 침윤(infiltration), 선와농양(crypt abscesses)의 존재 및 상피(epithelium)의 손실을 H&E 염색에 의한 조직병리학적 지수(histopathological index)로 기록하였다. 섬유증 조직(fibrotic tissue) 영역을 마송삼색 염색으로 측정하고 ImageJ 소프트웨어(version 1.46r, US National Institute of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량화하였다.

실험예 6: 사이토카인 생성

다양한 사이토카인의 분비 수준을 결정하기 위하여, 혈액으로부터 분리한 혈청, 결장 용해물(lysate of colon) 및 세포의 배양 상등액을 준비하였다. 생체 내 염증의 정도를 측정하기 위하여, 마우스 염증에 대한 사이토메트릭 비드 어레이(Cytometric Bead Array; CBA) 키트(BD Bioscience, San Jose, CA, USA) 및 MPO 및 TGF-β1에 대한 ELISA 키트(각각 R&D Systems, Minneapolis, MN, USA 및 Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)를 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하였다. 시험관 내(in vitro) 면역 세포의 유도된 사이토카인 분비를 평가하기 위해서는 Th1/Th2/Th17에 대한 CBA 키트(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)와 TGF-β1에 대한 ELISA 키트(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)를 사용하였다. 결과는 유동세포분석법(flow cytometry)과 분광광도계를 사용하여 검출하였다.

실험예 7: hMNCs의 분리 및 배양

인간 제대혈(human umbilical cord blood; hUCB) 또는 제대혈-유래 세포(UCB-derived cells)와 관련된 모든 실험 과정은 보라매병원 의학연구윤리심의위원회(Boramae Hospital Institutional Review Board(IRB))와 서울대학교 IRB의 승인된 지침에 따라 수행하였다. 공지의 방법으로 인간 제대혈-단핵구 세포(human umbilical cord blood-mononuclear cells; hUCB-MNCs)를 분리하여 배양하였다. 구체적으로, 사전 동의(informed consent) 및 보호자의 승인(parent approval) 하에 출산 직후 UCB 시료를 수집하였다. 수집한 UCB 시료는 HetaSep 용액(Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)과 5:1의 비율로 혼합하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, Ficoll로 상층액을 수집하고 2,500 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 단핵구 세포를 분리하였다. 분리한 세포는 PBS로 2회 세척하였다. 이상과 같이 분리한 세포로 이후 시험관 내 분석에서 추가로 수행되는 실험을 진행하였다.

실험예 8: T 세포의 분리 및 편향화 (polarization)

제조업자의 지시(instruction)에 따라 인간 순수 CD4⁺ T 세포 분리 키트 II(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)로 순수한(naive) CD4⁺ T 세포를 신선하게 분리한 hUCB-MNCs로부터 분리하였다. 분리한 CD4⁺ T 세포는, T 세포 아형(subsets) 증식에 필수적인, 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 항-CD3/28 비드 활성제(activator) 및 20 ng/ml의 IL-2를 포함하는 RPMI1640(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 배양하였다. 세포를 T 세포 아형으로 분화시키기 위하여, 유형-특이적 사이토카인(type-specific cytokines)(1형 도움 T 세포에 대해 20 ng/ml의 IFN-γ 및 20 ng/ml의 IL-12, 및 Treg 세포에 대해 20 ng/ml의 TGF-β1)을 성장 배지에 첨가하여 나노-GOs의 존재/부재 하에 습식 5% CO₂ 대기에서 37℃에 5일 동안 배양하였다. 편향된(polarized) Th1 및 Treg 세포를 유형-특이적 염색 및 유동세포분석법으로 확인하였다. Th1 세포에 대해서는, CD4 항체로 표면 염색 후 IFNγ로 세포 내 염색하였다. Treg 분석에는 CD4, CD25 및 IL-4 항체를 사용하였다.

실험예 9: 대식세포의 분리 및 편향화

공지의 방법으로 대식세포를 분리하고 배양하였다. 구체적으로, 제조업자의 지시에 따라 인간 CD4⁺ T 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)로 신선하게 분리한 hUCB-MNCs로부터 대식세포를 분리하였다. 분리한 CD14+ 세포를 10% FBS를 포함하는 RPMI1640에 배양하였다. 대식세포 아형으로 세포를 편향화하기 위하여, 유형-특이적 사이토카인(M1 세포에 대해 20 ng/ml의 IFN-γ 및 1 μg/ml의 LPS, 및 M2 세포에 대해 20 ng/ml의 IL-4 및 20 ng/ml의 IL-13)을 성장 배지에 첨가하여 나노-GOs의 존재/부재 하에 습식 5% CO₂ 대기에서 37℃에 5일 동안 배양하였다. 편향된 대식세포를 확인하기 위하여, 유형-특이적 염색 및 유동세포분석법을 이용하였다. 범 대식세포 마커(pan macrophage marker)로서 CD14 항체를 사용하였으며, M1 및 M2 아형에 대한 특이적 마커로서 CD86 및 CD206을 적용하였다.

실험예 10: 세포 증식 분석

세포 증식을 측정하기 위하여, 세포 증식 ELISA 키트(Roche, Indianapolis, IN, USA) 및 CCK-8 키트(Dojindo, Kumamoto, Japan)를 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 브로모데옥시우리딘(bromodeoxyuridine; BrdU) 세포 증식 어세이를 위하여, 공지의 방법을 사용하였다. 구체적으로, 세포를 100 μM의 BrdU 표지 시약(labeling reagent)과 함께 습식 5% CO₂ 대기에서 37℃에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 제공된 FixDenat 용액으로 30분 동안 고정한 후, 세포를 항-BrdU 항체 용액에서 90분 동안, 그리고 실온에서 제공된 기질(tetramethyl-benzidine; TMB) 용액에 5 내지 30분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰에 정지액(stop solution)을 부은 후, 450 nm 및 690 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포 증식 수준을 정량화하였다.

실험예 11: 정량적 RT- PCR

TRIzol(Invitrogen)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 총(total) RNA를 추출하였다. 수득한 RNA를 수퍼스크립트 퍼스트-스트렌드 합성 시스템(Superscript First-Strand Synthesis System, Invitrogen)에 의한 cDNA 합성에 사용하였다. 표적 mRNA의 상대적 발현 수준은 SYBR Green PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems, Foster City, USA)를 사용하여 ABI 7300 검출 시스템으로 측정하였다. 각 유전자에 대해 최소 3회의 독립적인 분석을 수행하였다.

실험예 12: 세포 주기 분석

공지의 프로토콜을 따라 세포 주기 분석(cell cycle assay)을 수행하였다. 구체적으로, 세포를 빙냉의 70% 에탄올로 -20℃에서 30분 이상 고정하였다. 고정된 세포는 PBS로 세척하고 400 μl의 RNase A 함유 PBS(7.5 μg/ml) 및 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide; PI, 50 μg/ml)와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포 주기는 Cell Quest 소프트웨어(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 사용하는 FACScalibur 상에서 수행하는 유동세포분석으로 분석하였다.

실험예 13: 세포사멸 분석

공지의 방법으로 세포사멸 분석(apoptosis assay)을 수행하였다. 구체적으로, 세포를 세포사멸 검출 키트(Apoptosis Detection Kits, BD Bioscience, San Jose, CA, USA) 중의 5 μl의 FITC annexin V와 5 μl의 PI로 염색하였다. 혼합물을 가볍게 볼텍스로 교반하고 실온의 암실에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 400 μl의 1× 결합완충액(binding buffer)을 상기 혼합물에 첨가하고, 모든 시료는 Cell Quest 소프트웨어를 사용하는 FACScalibur 상에서 수행하는 유동세포분석으로 분석하였다.

실험예 14: 면역형광 분석

세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde; PFA) PBS 용액에 실온에서 15분 동안 고정하고, 0.25% Triton X-100(Sigma)으로 10분 동안 처리하여 투과성을 높였다(permeablilized). 고정된 세포는 차단 용액(blocking solution, 5% 정상염소혈청(normal goat serum))과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고 일차 항체와 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 이후 세포를 Alexa Fluor 594(Invitrogen)로 표지된 이차 항체와 인큐베이션하고, DAPI(Sigma) 염색을 5분 동안 수행하여 핵을 염색하였다.

전 조직 면역형광(whole tissue immunofluorescence)을 위하여, 파라핀 슬라이드의 파라핀을 제거하고(deparaffinized), 5% 정상염소혈청 함유 PBS로 차단하였다. 단편(sections)을 일차 항체와 밤새도록 인큐베이션한 후, Alexa Fluor 594와 인큐베이션하고, DAPI 염색하였다. 이미지는 공초점 현미경(confocal microscope, Eclipse TE200, Nikon, Japan)으로 수집하였다.

실험예 15: 웨스턴블롯 분석

결장 시료를 Pro-Prep(Intron Biotechnology Co., Sungnam, Republic of Korea)로 용해시켜 조직으로부터 단백질을 추출하였다. 수득한 단백질 시료는 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하고 니트로셀룰로오스 막에 옮겼다. 3% BSA(Bovine Serum Albumin) 용액으로 차단한 후, 막 상의 단백질을 IL-10 일차 항체와 함께 4℃에서 12시간 이상 인큐베이션하고, 이차 항체와 인큐베이션하였다. 단백질과 항체 복합체는 ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약 및 분석 시스템을 통해 검출하였다.

실험예 16: 통계적 분석

모든 결과의 평균 값은 평균(mean)±SEM(standard error of mean)으로 표현하였다. 통계적 분석은, GraphPad Prism version 5.0(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 이용하는 다중 그룹 비교(multigroup comparisons)를 위하여, 스튜던트 양측 티-검정(Student's 2-tailed t-test) 또는 본페로니 사후 검정(Bonferroni post-hoc test)으로 이어지는 일원 ANOVA(one-way ANOVA)을 사용하여 수행하였다. 통계적 유의성은 도면에 대한 설명에 나타내었다.

실시예 1. 나노-산화 그래핀의 특성분석

본 발명에 사용한 나노-GOs의 합성 방법을 도 1A에 개략적으로 나타내었다. 나노-GOs의 크기와 형태를 동정하기 위하여, TEM 이미지 및 제한시야 전자회절(selected area electron diffraction; SAED) 패턴 분석을 사용하여 입자를 분석하였다(도 1B 및 1C). 합성된 나노-GOs의 특성은 원자력현미경(atomic force microscopy; AFM)으로 평가하였다(도 1C). 또한, 나노-GOs의 라만 스펙트럼을 측정하였다(도 1D). 나노-GOs를 면역 세포 내에 위치시키기 위하여, 비오틴화된(biotinylated) 나노-GOs를 제조하였다. 나노-GOs의 비오틴으로의 개질 후, FT-IR 스펙트럼은 아민의 진동 피크를 나타내었다.

실시예 2. 마우스 모델에서 나노- GOs의 DSS-유도 결장염 개선효과

DSS-유도 대장염(DSS-induced colitis) 마우스에서 나노-GOs의 치료적 효과를 확인하기 위하여, 상기 나노-GOs를 대장염 유도 후 1일차에 복강 내 주사하고, 체중, 생존율 및 활동성을 2주 동안 모니터하였다. 그 결과, 나노-GOs는 증가된 생존율 및 감소된 체중 감소로 결정되는, 중증 대장염(severe colitis)으로부터 마우스를 보호하는 효과를 나타내었다(도 2A, B). 그러나, 생존율 및 체중 변화에서의 보호 효과는 나노-GO-처리 마우스에서 보다 현저하였다. 나아가, 7일차 및 10일차에, 질병활성지수를 측정하여 대장염의 경과를 확인하였다. 생존율 및 체중으로부터의 결과와 마찬가지로, 나노-GO-처리 마우스가 현저히 감소된 질병활성지수를 나타내었다(도 2C). 대장염 유도 후 14일차에, 각 그룹으로부터 결정을 수집하고 그 길이를 측정하였다. 나노-GOs는 대장염에 의해 유도된 결장 길이 감소를 현저하게 차단하였다(도 2D). 그래핀 유도체는 내장 기관(visceral organs) 근처와 인접한 장막(omentum)에서 발견되었다(도 3). 나노-GOs의 위치 특이적 축적(region specific accumulation) 기전은 아직 밝혀지지 않았다. 종합적으로, 이러한 결과는 나노-GOs가 마우스에서 결장의 염증을 감소시킴을 나타내는 것이다.

실시예 3. 나노-GO에 의한 DSS-결장염 유도 염증 반응에 대한 손상

결장의 조직학적 분석은 DSS가 induced destruction of the 상피(epithelium)의 파괴, 점막하 부종(submucosal edema), 선와농양(crypt abscesses) 및 림프구성 침윤(lymphocytic infiltration)을 유도함을 나타내었다(도 4A). 나노-GO-처리 마우스에서, 염증 병변(inflammatory lesions)은 PBS-처리 마우스에 비해 거의 관찰되지 않았다. 나아가, 대장염에 의해 유도된 결장의 점막 및 점막하에서 섬유증을 평가하기 위하여, 마송 삼색 염색을 수행하였다. PBS-처리 마우스는 파란색 염색에 의해 확인되는 콜라겐 침착을 나타내었다. 나노-GOs는 콜라겐 축적 또한 현저하게 감소시켰다. 전신염증(systemic inflammation)을 평가하기 위하여, CBA 분석을 이용하여 혈청으로부터 분비된 전염증성(proinflammatory) 사이토카인의 수준을 측정하였다. 크론병(Crohn's disease)에서 비중을 차지하는 주된 사이토카인인 IFNγ의 유도(induction)는 나노-GO-처리 마우스에서 현저하게 저해되었다(도 4C). 또한 나노-GOs의 처리는 IFN-γ, TNF, IL-6 및 MCP-1의 후속 사이토카인(downstream cytokines)을 감소시켰다. 호중성 과립 성분(neutrophil granule constituent)인 미엘로퍼옥시다아제(myeloperoxidase; MPO)는 이동된 호중구(migrated neutrophils)의 수에 비례하는 것으로 알려져 있다. 나노-GOs-처리 마우스는 결장 조직에서 PBS-처리 마우스에 비해 감소된 MPO 활성을 나타내었으며, 이는 나노-GOs가 호중구의 이동 및 염증을 억제함을 나타내는 것이다(도 4D). 따라서, 이러한 결과는 크론병 모델에서 나노-GOs가 면역-억제 특성을 가짐을 나타낸다.

실시예 4. 그래핀 유도체의 CD4 ⁺ T 세포 활성 억제 효과

Th1 세포가 장염에서 중요한 역할을 하는 것을 고려하여, CD4⁺ T 세포에서 나노-GOs의 직접적인 효과를 확인하였다. 먼저, 적정 농도를 결정하기 위하여, MNCs 및 일차 CD4⁺ T 세포에 나노-GOs를 다양한 농도로 처리하였다(도 6A). 20 μg/ml의 나노-GOs는 MNCs 및 T 세포의 증식을 독성 없이 효과적으로 억제하였다(도 6B 및 6C). CD4⁺ T 세포 내에 그래핀 유도체를 위치시키기 위하여, GFP-비오틴 항체를 이용하여 비오틴-표지된 나노-GOs를 처리한 후, CD4⁺ Th1 세포를 면역염색하였다(도 7A). 비오틴-표지된 나노-GOs는 T 세포 내에서 검출되었다. 이는 물질이 세포 내로 내재화될 수 있음을 나타내는 것이다. 면역 세포 증식에 대한 그래핀 유도체의 효과를 확인하기 위하여, hUCB-유래 MNCs 및 CD4⁺ T 세포를 나노-GOs로 처리한 후 배양하였다(도 7B 및 C). 나노-GOs는 MNCs 및 CD4⁺ T 세포의 증식을 효과적으로 억제하였다. 나노-GOs의 Th1 억제 특성은 크론병 모델에서 치료 효과를 나타내는 주된 기전일 수 있다. annexin V 분석은 나노-GOs가 세포사멸 경로에 영향을 주지 않음을 나타내었다(도 7D). 그러나, 나노-GOs는 세포 주기에서 G1기를 다소 증가시켰으며, 이는 세포 주기 진행을 억제함을 나타낸다(도 7E). 나노-GOs의 Th1 세포에 대한 특이적인 효과를 확인하기 위하여, hUCB로부터 CD4⁺ T 세포를 정제하고 나노-GOs 존재 하에 Th1 타입으로 분화시켰다(도 7F). 그 결과, 나노-GOs는 Th1 분화를 현저히 억제하였다. Th1 편향된 조건에서 배양된 CD4⁺ T 세포에서 Th1 특이적 유전자 발현을 분석하였다(도 7G). 나노-GOs-처리된 CD4⁺ T 세포는 현저히 억제된 Th1 유전자 발현을 나타내었다. 나노-GOs-처리된 Th1 세포에서 기능적 변화를 분석하기 위하여, 세포 배양 상층액에 분비된 사이토카인의 농도를 측정하였다(도 7H). 나노-GOs-처리된 세포에서 IFNγ, TNF 및 IL-2의 분비는 현저하게 감소하였다. 한편, 나노-GOs-처리된 Th1 세포에서 IL-6, IL-4 및 IL-10의 수준은 증가하였다. 이러한 결과는 나노-GOs가 Th1 반응의 억제 및 조절 T 세포 활성의 촉진에 의해 대장염을 완화시킴을 나타내는 것이다.

실시예 5. 나노- GOs에 의한 생체 내 조절 T 세포 침윤 증가

본 발명자는 선행연구를 통해 실험적 대장염의 회복이 조절 T 세포의 확장 및 침윤을 수반함을 확인한 바 있었다. 이에, 본 발명자는 나노-GOs의 투여가 Treg 세포의 국지화(localization)에 영향을 주는지를 유동세포분석법으로 확인하였다. 나노-GOs의 투여는 CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ Treg 세포의 결장 침윤(colonic infiltration) 및 비장 편향화(splenic polarization)를 증가시켰다. 나노-GOs 처리된 마우스에서 Treg 세포의 증가된 결장 침윤을 면역조직화학(immunohistochemistry)으로도 확인하였다(도 8). 다음으로, Treg 밀도(population)의 주된 유도체 및 생성물이며 Treg-매개 대장염 완화에서 중요한 역할을 하는, IL-10 및 TGF-β1의 발현을 결정하였다. IL-10 발현 수준은 나노-GOs 처리된 마우스의 결장에서 현저히 증가하였다. 나노-GOs가 직접적으로 Treg 세포의 편향화에 영향을 주는지 확인하기 위하여, 나노-GOs 존재 하에 순수한 CD4⁺ 세포를 조절 T 세포 계통(lineage)으로 유도하였다. 그 결과, 나노-GOs는 Treg 편향화에 대한 증가 효과를 갖지 않았으며, 오히려 간섭하였다.

종합적으로, 이러한 결과는 나노-GOs가 생체 내에서 조절 T 세포의 수 및 이와 관련된 사이토카인을 증가시키며 이는 Treg 편향화에 대한 직접적인 효과에 의해 매개되지 않음을 나타내는 것이다.

실시예 6. 나노- GOs에 의한 면역 반응 동안 M1 대식세포의 M2 타입으로의 전환

장 대식세포(intestinal macrophages)의 면역관용성(tolerogenic) 및 보호적인 면역 반응 사이의 불균형에 의해 결장 염증이 발생할 수 있고, 이는, Treg 세포 및 이의 분비성 사이토카인을 모집하는 역할을 하는, 대안적으로 활성화된(alternatively activated) M2 유형 대식세포에 의해 개선될 수 있다. 이에, 나노-GOs로의 처리가 대식세포의 세포 운명 결정에 영향을 미치는지 확인하였다. 나노입자의 내재화(internalization)가 비오틴화된 그래핀 유도체 및 면역조직화학에 의해 확인되었다(도 9A). 나노-GOs 처리시, 마우스 대식세포 세포주인 Raw264.7 세포의 증식은 증가되었으며, 확대된 세포 형태가 관찰되었다(도 10A). Raw264.7 세포에서와 유사하게, 일차적으로 분리된(primarily isolated) CD14⁺ 세포도, 나노-GOs와 함께 M0 및 M2 유형 세포로 배양되었을 때, 증가된 증식을 나타내었다. 반면, 나노-GOs는 M1 유형 세포에는 어떠한 유효한 변화도 나타내지 않았다(도 9B 및 도 10B).

대식세포 유형-특이적 편향화에 대한 나노-GOs의 효과를 유동세포분석법을 이용한 세포 표면 마커 분석을 통해 확인하였다. 상기 그래핀 유도체는 모두 순수한 CD14⁺ 세포를 다른 추가되는 사이토카인 없이 대식세포의 보다 전염증성 유형(classical type)으로 유도하는 경향을 나타내었다. M2-유형 대식세포와 관련하여, 나노-GOs 처리는 CD14⁺CD86⁺ 세포 및 CD14⁺CD206⁺ 세포 모두의 증가를 유도하였다. CD14⁺ 세포 상에서 CD206 표면 마커의 발현은 면역조직화학에 의해 확인되었다(도 9D). 이러한 결과는 나노-GOs가 전염증성으로 활성화된 대식세포의 M1-유사 특성을 하향 조절하고 M2 유형을 전환함으로써 염증 해소(inflammatory resolution)에 역할을 함을 나타내는 것이다.

실시예 7. 나노- GOs에 의해 유도된 대체적으로 활성화된 대식세포 중 주요 아류형인 M2b

나노-GOs 처리가 고전적으로 활성화된 M1 유형 대식세포를 항-염증성 M2 아류형(subtypes)으로 전환함을 확인하기 위하여, 추가적으로 다른 M2 유형 특이적 특성의 발현을 확인하였다. 헤모글로빈 스캐빈저 수용체(hemoglobin scavenger receptor) CD163의 발현은 나노-GOs의 존재 시 증가하였다(도 11A 및 11C). 대표적인 전염증성 사이토카인인 TNF 및 IFN-γ의 분비 수준은 현저히 감소하였으나, IL-6 수준에는 어떠한 유의적인 변화도 나타나지 않았다(도 11B). 나아가, 나노-GOs 처리는 IL-12, IL-23, TNFα 및 M1 유형 특이적 전사인자인 IRF5의 mRNA 발현을 억제하였다. 반면, M2 대식세포의 가장 중요한 마커인 IL-10의 수준은 증가하였다. 그러나, 나노-GOs 처리는 CLEC7A 및 IL-1ra의 발현을 향상시키지 않았으며, 오히려 저해하였다(도 11C).

M2 대식세포는 면역 체계에서 뚜렷한 역할을 갖는 셋 또는 그 이상의 아류형으로 구분될 수 있다. IL-10의 분비는 증가한 반면 M2a 마커인 CLEC7A 및 IL-1ra는 감소하였는 바, 이를 토대로 나노-GOs가 다른 M2 아류형 세포를 상향조절함을 가정하였다. 이를 입증하기 위하여, M2a, M2b 및 M2c 대식세포를 유도하고, 그래핀 유도체의 역할을 확인하였다. 이전의 결과에서 나타난 바와 같이, M2a 대식세포의 CD163 및 CD206 발현은 나노-GOs 존재 시 현저히 감소하였다(도 11D 및 도 12A). 또한, 마커 유전자 CLEC7A 및 IL-1ra, 전사인자 IRF4의 발현은 감소하였다(도 12B). M2c 아류형과 관련하여, 아무런 눈에 띄는 변화도 나타나지 않았다. M2b 아류형 대식세포의 비율은 나노-GOs 처리에 의해 증가하였다(도 11D 및 도 12A). 또한, 나노-GOs 처리된 M2b 대식세포는 엄청난 양의 TNF 및 IL-6을 분비하였고 더 많은 IL-1β 및 IL-10을 발현하였다(도 11E 및 11F). 이러한 결과는 나노-GOs가, M2a나 M2c가 아닌 M2b 대식세포를 상향조절함으로써, 염증성 반응을 약화시킬 수 있음을 나타내는 것이다.

<결론>

최근, 풀러렌(fullerene), 나노튜브 및 그래핀 유도체를 포함한 탄소 동소체(carbon allotropes)가 면역 조절 능력 및 살아있는 생물체에 생물의학적 용도로의 잠재력을 갖는 것이 보고되고 있다. 본 발명에서는, 이러한 치료적 잠재력과 관련하여, 그래핀 유도체, 나노-GOs의 실험적 대장염에 대한 보호 효과 및 이의 작용 기전을 분석하였다.

그래핀 유도체의 치료 용도에 대한 이전의 연구는, 생체적합성을 개선하고 가능한 위험성을 회피하기 위하여, 나노물질을 스크리닝하고 적합한 조건, 예컨대, 크기, 농도, 표면에 흡착된 작용기 및 전자기적 특성을 확립하는데 집중해왔다. 일례로, 크기가 큰 GO는 염증성 사이토카인의 분비를 촉진하고 세포 표면에 부착하여 톨-유사 수용체(toll-like receptor) 관련 경로를 활성화함으로써 고전적으로 M1 대식세포를 활성화하는 것으로 보고되었다. 반면, 대식세포는 식균작용(phagocytosis)에 의해 더 큰 GO 보다 작은 GO를 보다 활발히 섭취하였다. 하지만 이러한 그래핀 산화물의 크기-의존적 역할을 규명하는 연구들은 모두 마이크로 크기의 입자와 나노 크기의 입자만을 비교하였다. 이에 본 발명자들은, 세포 내 적용이 용이하며 염증반응을 유발하지 않는, 나노 크기의 그래핀 유도체 입자의 치료적 잠재력과 작용 기작을 평가하고자 하였다. 본 발명에서는, 보다 큰 측면 크기를 갖는 나노-GOs가 대장염의 전형적인 증상을 보다 효과적으로 개선하였다. 이러한 결과는 15 내지 50 nm의 측면 크기를 갖는 나노-GOs의 성질이 대장염에 대한 임상적 응용에 보다 적합함을 나타낸다.

본 발명자들은 선청성 면역세포와 적응 면역세포에 대한 나노-GOs의 종합적인 영향을 식별하기 위하여 일련의 시험관 내 실험을 수행하였다. 나노-GOs는 일차적으로 분리된 Th1 세포 및 CD14⁺ 대식세포 유사 세포에 의해 다량 섭취되었다. 전염증성 사이토카인, 특히, IL-2, IL-12, IFN-γ 및 전사인자 T-bet가 1형 도움 T 세포의 작용(commitment)에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 반면, Th2 및 Treg에 대한 대표적인 사이토카인인 IL-4와 IL-10, 나아가 전염증성 사이토카인인 IL-6은 Th1 발달 저해를 매개하였다. 나노-GOs는 면역성 환경(immunogenic milieu)을 조절하는데 있어 우수하였으며, 이는 사이토카인 생성으로 확인되었다.

조절 T 세포는 과도한 염증으로부터 조직을 보호하며, 활성화된 면역 세포를 억제함으로써 조직의 치유 과정을 돕는다. IL-10 및 TGF-β1는 Treg의 발달, 확장 및 특이적 역할에 관여되었다. 본 발명에서는, 세포 운명에 직접적으로 영향을 주지는 않음에도 불구하고, 나노-GOs의 투여가 IL-10 및 TGF-β1의 증가된 생성을 통해 조절 T 세포의 결장 및 비장 침윤(colonic and splenic infiltration)을 향상시킴을 확인하였다.

대식세포는 특이적인 가소성(distinctive plasticity)을 나타내며 환경적 자극에 따라 그 성질을 조절한다. 장 대식세포는 면역관용(immune tolerance)의 주요 조절자(regulator)로서 내장(gut)의 항상성을 조절하고, 조절 T 세포의 기능성을 유지함으로써 과도한 면역 반응에 대해 조직을 보호한다. 또한, '대안적으로(alternatively) 활성화된 M2 대식세포 역시 조직 복구 및 Th2 반응에 중요한 역할을 한다. 대식세포 편향화의 GO-매개된 결정(determination)은 거의 설명되지 않았으며, 현재로서는 그 결과들에 대해서도 논란이 있다. 몇몇 연구는 GO 처리가 M1 유형으로의 대식세포 편향화를 크기 의존적 방식으로 조절한다고 보고한 반면, 다른 연구는 GO 스캐폴드가 M2 유형 세포의 침윤을 증가시킴을 규명하였다. 이러한 견해의 차이를 극복하기 위하여, M0, M1 및 M2 상태의 세포에 나노입자를 처리함으로써 나노-GOs가 대식세포 편향화에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다.

결과로서, 나노-GOs가 M0 세포를 활성화하여 M1 유형 세포로 편향화하며, M2 유형 세포를 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 나노-GOs-처리가, M1으로부터 M2 대식세포로의 전환을 유도함으로써, 잠재적 면역억제성 약물일 수 있음을 확인하였다.

염증 동안 결장 Treg 및 M2 유형 대식세포의 침윤이 증가하는 것을 고려할 때, 나노-GOs가 IL-10 및 TGF-β1 신호전달(signaling)을 통해 Treg 및 장 대식세포의 조절 루프를 형성하는데 중요한 역할을 함을 알 수 있다.

M2 대식세포는, 유전자 프로파일 및 다양한 사이토카인 생산에 의해 매개되는 구별되는 기능 등의 다양한 세포적 특성을 갖는, 적어도 3 종류 이상의 아류형으로 분류된다. 그 중 M2a 및 M2b는 면역조절 활성(immunoregulatory activities)을 나타내며 Th2 반응을 유도하고, M2c는 면역억제능(immunosuppressive capacity)과 조직-리모델링에 관여한다. 이들 대식세포의 아류형과 그래핀 유도체 사이의 상호작용은 아직 밝혀지지 않았다. 본 발명에서는, M1 유도 동안, M1 유사 특성이 감소하는 반면, M2 유형 세포를 유도하는 IL-6 수준은 변화하지 않았다. 또한, IL-10과 같은 대표적인 M2 관련 인자(related factors)는 나노-GOs 존재 시 현저히 증가되었다. M2a 관련 유전자인 CLEC7A 및 IL-1Ra는 세포 마커의 발현이 감소함에 따라 하향조절되었으며, M2c 세포는 어떠한 유효한 변화도 나타내지 않았다. 오히려, M2b 아류형 세포 및 이의 관련 생성물의 비율은 나노-GOs 처리에 반응하여 증가하였다.

이러한 결과는 나노-GOs가 TLR 매개 신호전달의 증가에 관여함을 나타내는 것이며, 따라서 M2 유형 세포 중, M2b 대식세포는 나노-GOs에 의해 직접적으로 영향을 받으며 염증 상태 하의 결장에서 Treg의 이동에 관여하였다.

결론적으로, 본 발명에서는 그래핀 유도체, 나노크기의 산화 그래핀(나노-GOs)이 1형 도움 T 세포를 억제하는 동시에 장 대식세포와 조절 T 세포 사이의 조절 루프(regulatory loop)를 활성화함으로써 실험적 대장염에 대한 보호 효과를 가짐을 확인하였다. 나아가, 이러한 치료적 효과는 나노입자의 크기 및 형태에 따라 변화함을 확인하였다.

Claims (11)

1. 나노크기의 산화 그래핀(nano-sized graphene oxide; nano-GO)을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 전염증성 사이토카인의 발현 또는 분비 저해, 미엘로퍼옥시다아제 활성 저해, Th1 분화 또는 반응 억제, T 세포 활성 촉진, M2b 대식세포 상향조절 또는 이들의 조합에 의해 염증을 억제하거나 감소시키는 것인, 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물인 것인, 조성물.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 염증성 질환은 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 자궁내막증, 건선, 백반증, 전신성 경피증 또는 궤양성 대장염인 것인, 조성물.
   
5. 제3항에 있어서,
   상기 염증성 질환은 크론병(Chron's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 장형 베체트병(intestinal Bechet's disease)로 구성된 군으로부터 선택되는 염증성 장질환인 것인, 조성물.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 염증성 장질환은 결장의 단축(shortening of colon), 탈모, 활동성 저하, 체중감소, 출혈지수 상승 또는 배변지수 상승의 증상을 수반하는 것이 특징인, 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장품 조성물인 것인, 조성물.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 첨가물인 것인, 조성물.
   
9. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물인 것인, 조성물.
   
10. 제1항의 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 조성물의 투여에 의해 짧아진 결장, 탈모, 저하된 활동성, 감소된 체중, 상승된 출혈지수 또는 상승된 배변지수를 회복시키는 것이 특징인, 방법.

Images