WO2022145663A1 - 락토바실러스 플란타룸 유산균 사균체 또는 상기 유산균의 배양물을 포함하는 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

락토바실러스 플란타룸 유산균 사균체 또는 상기 유산균의 배양물을 포함하는 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물 Download PDF

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    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Definitions

  • the present invention relates to a cosmetic composition for preventing or improving skin aging, comprising Lactobacillus plantarum lactic acid bacteria dead cells or a culture of the lactic acid bacteria.
  • Plant lactic acid bacteria are lactic acid bacteria isolated from fermented foods such as pickles and kimchi, and there are many types compared to animal lactic acid bacteria, and they have excellent adaptability to the external environment.
  • plant lactic acid bacteria isolated from kimchi are known to be excellent in the production of various physiologically active substances because they grow in a barren environment. Accordingly, development of cosmetic materials using lactic acid bacteria isolated from kimchi, their dead cells, and cultures is being actively conducted.
  • Kimchi is a food fermented by lactic acid bacteria
  • the lactic acid bacteria isolated from kimchi include Leuconostoc mesenteroides , Leuconostoc dextranicum , Lactobacillus brevis , Lactobacillus Plantarum ( Lactobacillus plantarum ), Pediococcus pentosacus ( Pediococcus pentosacues ) and the like.
  • a cosmetic composition for improving skin wrinkles comprising dead cells of Lactobacillus plantarum nF1 strain (Accession No. NITE P-1462) isolated from kimchi (Korea) Patent Publication No. 2019-0002836), Lactobacillus plantarum WiKim0060 (Lactobacillus plantarum WiKim0060) isolated from kimchi, and a composition for skin whitening and moisturizing improvement comprising the same (Korean Patent Publication No. 2019-0055552), Lactobacillus plantarum Room ( Lactobacillus plantarum ) A cosmetic composition for skin wrinkle improvement (Korea Patent Publication No.
  • An object of the present invention is to show skin improvement effects through antioxidant, inflammation relief, moisturizing enhancement, skin tone improvement, elasticity and wrinkle improvement using natural materials that are skin-friendly, safe, and can improve skin function, and through this It is to provide a cosmetic composition for anti-aging or improvement that can satisfy the desire to look younger.
  • Lactobacillus plantarum Wikim 125 (Accession No.: BP1910798) isolated from kimchi
  • Lactobacillus plantarum Wikim 126 (Accession No.: BP1910799) isolated from sauerkraut prepared from cabbage
  • the culture of Lactobacillus plantarum Wikim 127 (Accession No.: BP1910800) and their dead cells are skin-friendly, safe, and a natural-derived material that can improve skin function.
  • the present invention was completed by finding that it promotes skin aging prevention and improvement through tone improvement, elasticity and wrinkle improvement.
  • Lactobacillus plantarum Wikim 125 (Accession number: BP1910798), Lactobacillus plantarum Wikim 126 (Accession number: BP1910799) and Lactobacillus plantarum Wikim 127 (Accession number: BP1910800) Lactobacillus selected from the group consisting of A cosmetic composition for anti-aging or improvement comprising one or more cultures.
  • Lactobacillus plantarum Wikim 125 (Accession number: BP1910798), Lactobacillus plantarum Wikim 126 (Accession number: BP1910799) and Lactobacillus plantarum Wikim 127 (Accession number: BP1910800) Lactobacillus selected from the group consisting of The cosmetic composition for anti-aging or improving of 1 above, further comprising one or more dead cells.
  • Lactobacillus plantarum Wikim 125 (Accession No.: BP1910798) is the anti-aging or improving cosmetic composition of 1 or 2 above, which is isolated from kimchi.
  • Lactobacillus plantarum Wikim 126 (Accession No.: BP1910799) and Lactobacillus plantarum Wikim 127 (Accession No.: BP1910800) of 1 or 2 above, which are isolated from sauerkraut prepared from cabbage or Brussels sprouts, respectively.
  • the culture of lactic acid bacteria is the anti-aging or improving cosmetic composition of 1 above, wherein the supernatant obtained by culturing lactic acid bacteria in a lactic acid bacteria culture medium and centrifugation is freeze-dried.
  • Lactobacillus plantarum Wikim 125 (Accession number: BP1910798), Lactobacillus plantarum Wikim 126 (Accession number: BP1910799) and Lactobacillus plantarum Wikim 127 (Accession number: BP1910800) selected from the group consisting of A cosmetic composition for preventing or improving aging, which includes a culture of one or more lactic acid bacteria, and may further include one or more dead cells of the lactic acid bacteria was provided.
  • Figure 1a shows the cytotoxicity confirmation result in Hs68 cells for the composition of Example 7 of the present invention
  • Figure 1b shows the MMP expression inhibitory ability confirmation result.
  • Figure 2a shows the measurement results of cytotoxicity (cell viability) in B16F10 cells for the composition of Example 7 of the present invention
  • Figure 2b shows the amount of melanin production (melanin content) in B16F10 cells.
  • Figure 3a shows the cytotoxicity (cell viability) confirmation results in HaCaT cells for the composition of Example 7 of the present invention
  • Figure 3b shows the HAS-2 expression in the HaCaT cells.
  • Figure 4a is the cytotoxicity (cell viability) confirmation result in RAW 264.7 cells for the composition of Example 7 of the present invention
  • Figure 4b is the NO production inhibitory ability in RAW 264.7 cells
  • Figure 4c is iNOS expression in RAW 264.7 cells
  • Example 5 shows the evaluation results of skin moisturizing power of cream cosmetics according to Example 21 and Comparative Example 5 of the present invention.
  • the present invention is Lactobacillus plantarum Wikim 125 ( Lactobacillus plantarum Wikim 125, accession number: BP1910798), Lactobacillus plantarum Wikim 126 (accession number: BP1910799) and Lactobacillus plantarum Wikim 127 (accession number: BP1910800) to BP1910800 It relates to a cosmetic composition for anti-aging or improvement comprising a culture of one or more lactic acid bacteria selected from the group consisting of.
  • the Lactobacillus plantarum Wikim 125 (Accession No.: BP1910798) may be one isolated from kimchi, and Lactobacillus plantarum Wikim 126 (Accession No.: BP1910799) and Lactobacillus plantarum Wikim 127 (Accession No.: BP1910800) are each sauerkraut, e.g. For example, it may be isolated from sauerkraut prepared from cabbage or Brussels sprouts.
  • the culture of the lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum Wikim 125 (Accession No.: BP1910798), Lactobacillus plantarum Wikim 126 (Accession No.: BP1910799) and Lactobacillus plantarum Wikim 127 (Accession No.: BP1910800) may be obtained by culturing each of the lactic acid bacteria selected from the group consisting of a lactic acid bacteria culture medium, for example, MRS agar medium, and then drying the supernatant obtained by centrifugation.
  • a lactic acid bacteria culture medium for example, MRS agar medium
  • the cosmetic composition for preventing or improving aging according to the present invention is Lactobacillus plantarum Wikim 125 (Accession No.: BP1910798), Lactobacillus plantarum Wikim 126 (Accession No.: BP1910799) and Lactobacillus plantarum Wikim 127 (Accession No. : BP1910800) may further include one or more dead cells of lactic acid bacteria selected from the group consisting of.
  • the dead cells of lactic acid bacteria may be obtained by methods known in the art, for example, culturing lactic acid bacteria in a lactic acid bacteria culture medium, MRS agar medium, centrifugation, and then heat-treating the precipitated cells.
  • the cosmetic composition for preventing or improving aging according to the present invention includes additional ingredients commonly used in cosmetic compositions, such as pH adjusters, surfactants, oils, alcohols, humectants, sterilization preservatives, chelating agents, fragrances, pigments, ultraviolet rays It may further include at least one component selected from the group consisting of an absorber, a UV scattering agent and an antioxidant, but is not limited thereto, and specific types and amounts of these additional components are well known in the art.
  • the formulation of the cosmetic composition for anti-aging or improvement according to the present invention is not limited to a particular form, and examples thereof include a softening lotion, astringent lotion, nourishing lotion, eye cream, nourishing cream, massage cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water. , powder, ampoule, essence, BB cream, sunscreen, pack, lip balm, etc. may be provided.
  • the cosmetic composition for anti-aging or improvement according to the present invention is not particularly limited, and a person skilled in the art according to the purpose can select and mix it without difficulty.
  • Lactobacillus plantarum Wikim 125 isolated from kimchi (Accession No.: BP1910798)
  • Lactobacillus plantarum Wikim 126 isolated from sauerkraut prepared from Brussels sprouts from Jeju (Accession No.: BP1910799)
  • prepared from cabbage from Jeju Lactobacillus plantarum Wikim 127 (Accession No.: BP1910800) isolated from sauerkraut was cultured in MRS agar medium at 30°C for 24 hours, centrifuged, and the precipitated cells were heat-treated at 80°C for 60 minutes. Thus, lactic acid bacteria dead cells were obtained.
  • Example of production of lactic acid bacteria dead cells division Lactobacillus culture
  • Example 1 (dead cells 1) Lactobacillus plantarum Wikim 125 (Accession No.: BP1910798) dead cells
  • Example 2 (dead cells 2) Lactobacillus plantarum Wikim 126 (Accession No.: BP1910799) dead cells
  • Example 3 (dead cells 3) Lactobacillus plantarum Wikim 127 (Accession number: BP1910800) dead cells
  • Lactobacillus plantarum Wikim 125 isolated from kimchi (Accession No.: BP1910798)
  • Lactobacillus plantarum Wikim 126 isolated from sauerkraut prepared from Brussels sprouts from Jeju (Accession No.: BP1910799)
  • prepared from cabbage from Jeju Lactobacillus plantarum Wikim 127 (Accession No.: BP1910800) was cultured on MRS agar medium at 30° C. for 24 hours, and the supernatant obtained by centrifugation was freeze-dried to obtain a lactic acid bacteria culture.
  • Example of lactic acid bacteria culture preparation division Lactobacillus culture Example 4 (Culture 1) Lactobacillus plantarum Wikim 125 (Accession No.: BP1910798) culture
  • Example 5 (Culture 2) Lactobacillus plantarum Wikim 126 (Accession No.: BP1910799) culture
  • Example 6 (Culture 3) Lactobacillus plantarum Wikim 127 (Accession No.: BP1910800) culture
  • a mixed composition was prepared by mixing the lactic acid bacteria dead cells and the culture prepared in Preparation Examples 1 and 2 in the composition (weight ratio) shown in Table 3 below.
  • lactic acid bacteria culture and the mixed composition of the lactic acid bacteria dead cells and culture prepared in Preparation Examples 1 to 3 for improving skin aging antioxidant (active oxygen (ABTs) scavenging ability) , anti-inflammatory (NO inhibition), anti-inflammatory and moisturizing enhancement (hyaluronidase inhibition), whitening (tyrosinase inhibition) and elasticity improvement (collagenase inhibition) were evaluated.
  • antioxidant active oxygen (ABTs) scavenging ability
  • anti-inflammatory NO inhibition
  • anti-inflammatory and moisturizing enhancement hyaluronidase inhibition
  • whitening tyrosinase inhibition
  • elasticity improvement collagenase inhibition
  • the ABTS radical solution formed by mixing 2.45 mM potassium persulfate in a 7 mM ABTS solution at a ratio of 1:1 (v/v) and reacting in a dark place for about 24 hours is mixed with the sample and heated to 10 in the dark. After reacting for a minute, absorbance was measured at 734 nm.
  • ABTS radical scavenging ability (%) was calculated using the following formula, and is shown in [Table 4].
  • ABTs radical scavenging ability (absorbance of test group / absorbance of untreated group) X 100
  • Example 1 50 mg/mL 98.69
  • Example 2 50 mg/mL 99.42
  • Example 3 50 mg/mL 97.08
  • Example 4 1 mg/mL 36.37
  • Example 5 1 mg/mL 52.02
  • Example 6 1 mg/mL 41.05
  • Example 7 1 mg/mL 55.29
  • Example 8 1 mg/mL 51.00
  • Example 9 1 mg/mL 42.53
  • Example 10 1 mg/mL 45.68
  • Example 12 1 mg/mL 47.81
  • Example 13 1 mg/mL 39.30
  • NO nitric oxide
  • the sample was mixed with 10 mM sodium nitroferricyanide dihydrate and reacted at 25° C. for 150 minutes. After aliquoting 0.5 mL each, 1 mL of 1% sulfanylamine was added and at room temperature for 10 minutes. After the reaction, 2 mL of 0.1% N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride was mixed, and the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes, and then absorbance was measured at 540 nm. From this, the NO radical scavenging ability (%) was calculated using the following formula, and the results are shown in [Table 8].
  • NO radical scavenging ability (absorbance of test group / absorbance of untreated group) X 100
  • Example 1 50 mg/mL 44.59
  • Example 2 50 mg/mL 32.09
  • Example 3 50 mg/mL 80.22
  • Example 4 1 mg/mL 53.01
  • Example 5 1 mg/mL 30.24
  • Example 6 1 mg/mL 43.58
  • Example 7 1 mg/mL 74.18
  • Example 8 1 mg/mL 59.85
  • Example 9 1 mg/mL 53.44
  • Example 14 1 mg/mL 54.35
  • Example 15 1 mg/mL 59.33
  • Example 16 1 mg/mL 66.67
  • Hyaluronidase is an enzyme that hydrolyzes hyaluronic acid, a skin moisturizing factor, and has a function of causing inflammation. (Y Kakegawa, et al. , Japanese J. Inflammation , 4: 437-438, 1984) was used to evaluate the anti-inflammatory effect.
  • the sample was added to 0.1 ml of a hyaluronidase solution (10mg/ml) dissolved in 1M acetic acid buffer solution (pH 3.5), reacted at 37°C for 20 minutes, 12.5 mM CaCl 2 0.1ml was added, and then 20 at 37°C again.
  • a hyaluronic acid solution (6 mg/ml) dissolved in 0.25 ml of 0.1M acetic acid buffer solution (pH 3.5) was added and reacted at 37° C. for 40 minutes, 0.4N NaOH 0.1 ml and 0.4M potassium tetraborate 0.1 ml was added, reacted at 100° C.
  • Hyaluronidase inhibitory ability (absorbance of test group / absorbance of untreated group) X 100
  • Example 1 50 mg/mL 51.19
  • Example 2 50 mg/mL 52.10
  • Example 3 50 mg/mL 90.49
  • Example 4 1 mg/mL 36.13
  • Example 5 1 mg/mL 44.06
  • Example 6 1 mg/mL 33.55
  • Example 7 1 mg/mL 52.85
  • Example 8 1 mg/mL 33.33
  • Example 11 1 mg/mL 62.20
  • Example 13 1 mg/mL 47.32
  • Example 15 1 mg/mL 55.64
  • Example 17 1 mg/mL 55.60
  • Tyrosinase is an enzyme that promotes the oxidation of tyrosine in a living body to help produce melanin. By inhibiting the function of this enzyme, the whitening effect was obtained by applying a method of measuring the degree of inhibition of tyrosine oxidation and formation of a black polymer called melanin (Pomerantz SH: J. Biochem. , 24: 161 - 168, 1996). evaluated. Tyrosinase inhibitory activity was measured by modifying a method such as yagi for measuring DOPA chrome produced as a result of the action of tyrosinase by a colorimetric method.
  • Tyrosinase inhibitory ability (absorbance of test group / absorbance of untreated group) X 100
  • Example 1 50 mg/mL 85.68
  • Example 3 50 mg/mL 79.61
  • Example 4 1 mg/mL 44.13
  • Example 6 1 mg/mL 32.62
  • Example 7 1 mg/mL 34.13
  • Example 8 1 mg/mL 24.19
  • Example 14 1 mg/mL 47.89
  • Example 15 1 mg/mL 35.04
  • Collagenase is known to be an enzyme that decomposes collagen, and its expression is greatly increased by irradiation with ultraviolet rays, and it is a major cause of reduction and degeneration of collagen by ultraviolet rays, and is a major cause of skin wrinkle formation, etc. Using the fact that it is a factor, the collagenase inhibitory effect was measured for the test group, and the elasticity and wrinkle improvement effects were evaluated.
  • Collagenase enzyme activity inhibition experiment was performed using the azochol method using azocoll, which is a dye material for collagen.
  • azocoll which is a dye material for collagen.
  • 4mM CaCl 2 was added to 0.25 mL of 0.1M Tris-HCl buffer (pH 7.5) in 0.1 mL of sample, and 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg (0.3mg/ml) was dissolved.
  • Collagenase inhibitory ability (absorbance of test group / absorbance of untreated group) X 100
  • Example 1 50 mg/mL 79.33
  • Example 3 50 mg/mL 93.44
  • Example 4 1 mg/mL 36.73
  • Example 6 1 mg/mL 25.95
  • Example 7 1 mg/mL 33.36
  • Example 8 1 mg/mL 31.75
  • Example 14 1 mg/mL 25.36
  • Example 15 1 mg/mL 21.70
  • Collagenase inhibition evaluation result by concentration of culture 3 (Example 6) sample Concentration (mg/mL) O.D. 734 nm Average (%)Standard Deviation Inhibition rate (%) untreated group - 0.287 0.292 0.288 0.289 - - Example 6 0.1 0.274 0.282 0.288 0.281 2.43 2.65 0.2 0.269 0.274 0.279 0.274 1.73 5.19 0.4 0.258 0.263 0.253 0.258 1.73 10.73 0.6 0.224 0.232 0.248 0.235 4.23 18.80 1.0 0.219 0.214 0.209 0.214 1.73 25.95 2.0 0.178 0.183 0.181 0.181 0.87 37.49 5.0 0.147 0.135 0.143 0.142 2.11 50.98
  • Example 7 In order to verify the overall effectiveness of the composition of Example 7 on skin aging improvement at the cellular level, cytotoxicity, wrinkle improvement (Hs68 cells, ATCC, mRNA expression of MMP-1 using real time PCR) ), whitening improvement (B16F10 cells, Korea Cell Line Bank, melanin content confirmation), moisturizing improvement (HaCaT cells, ATCC, HAS-2 expression confirmation using real-time PCR), anti-inflammatory improvement (RAW264.7 cells, Korea Cell Line Bank, NO) Production inhibition ability and mRNA expression of iNOS using real-time PCR) were evaluated.
  • wrinkle improvement Hs68 cells, ATCC, mRNA expression of MMP-1 using real time PCR
  • B16F10 cells Korea Cell Line Bank, melanin content confirmation
  • moisturizing improvement HaCaT cells, ATCC, HAS-2 expression confirmation using real-time PCR
  • anti-inflammatory improvement RAW264.7 cells, Korea Cell Line Bank, NO
  • Skin aging is caused by a structural change in the extracellular matrix existing in the dermal layer of the skin, and it can be said that it is caused by a decrease in collagen, a protein that is a skin elasticity component among collagen in the dermal tissue of the skin.
  • Extracellular matrix degradation occurs by matrix-metalloproteinases (MMPs), and collagen degradation occurs by MMP-1 to cause wrinkles.
  • MMPs matrix-metalloproteinases
  • MMP-1 matrix-metalloproteinases
  • Hs68 cells used in the experiment were purchased from ATCC and used. 10% FBS and 1% Penicillin/streptomycin were added to DMEM medium and used, followed by incubation at 37°C, 90% relative humidity, and 5% CO2 incubator.
  • Hs68 cells were cultured in 96-well plates at a concentration of 5 x 10 3 cells/well for 24 hours. Samples were treated by concentration and incubated for 24 hours. MTT solution (5 mg/ml) was added at a time of 10 ⁇ l and further incubated for 4 hours. After removing the supernatant, 100 ⁇ l of dimethyl sulfoxide (DMSO) was added to measure the absorbance at 570 nm. Cell viability was calculated according to the following equation.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Hs68 cells were aliquoted to a volume of 5 x 10 5 cells/well in a 60 mm plate, and cultured at 37°C, 5% CO2 incubator for 24 hours.
  • Example 1 was treated for 45 minutes by concentration, and then treated with TNF- ⁇ (20 ng/ml) and reacted for 24 hours, after which the supernatant was removed.
  • Cells were lysed using Trizol reagent (Ambion, USA).
  • cDNA was synthesized according to the manufacturing instructions of Revertra ACE- ⁇ - (Toyobo, Japan). The synthesized cDNA was subjected to real-time PCR using GAPDH (Hs02786624_g1), MMP1 (Hs00899658_m1) primers and Taqman master mix (Thermo fisher, USA).
  • Figure 1a shows the cytotoxicity confirmation results in Hs68 cells
  • Figure 1b shows the MMP expression inhibitory ability confirmation results.
  • the darkening of the skin is due to increased melanogenesis in melanocytes present in the skin.
  • melanin-forming cells synthesize melanin from L-tyrosine, in which several enzymes are involved.
  • ⁇ -MSH 200 nM
  • a melanogenesis-stimulating hormone was treated, and the whitening effect was evaluated by confirming a decrease in melanin content.
  • B16F10 cells used in the experiment were purchased from the Korea Cell Line Bank and used. 10% FBS and 1% Penicillin/streptomycin were added to DMEM medium and used, followed by incubation at 37°C, 90% relative humidity, and 5% CO2 incubator.
  • *B16F10 cells were seeded in a 96-well plate at a concentration of 4 x 10 3 cells/well and cultured for 24 hours. After incubation for 24 hours, ⁇ -MSH (200 nM) and samples were treated for each concentration and cultured for 72 hours. MTT solution (5 mg/ml) was added at a time of 10 ⁇ l and further incubated for 4 hours. The medium was removed, 100 ⁇ l of dimethyl sulfoxide (DMSO) was added, and the absorbance was measured at 570 nm. Cell viability was calculated according to the following equation.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • B16F10 cells were seeded in a 6-well plate at a concentration of 4 x 10 4 cells/well and cultured for 24 hours.
  • ⁇ -MSH at a concentration of 200 nM was co-treated with the sample and melanin synthesis was promoted for 72 hours.
  • the cultured cells were treated with trypsin/EDTA and centrifuged. After reacting at 80° C. for 1 hour using 1N NaOH, absorbance was measured at 405 nm.
  • Figure 2a shows the measurement results of cytotoxicity (cell viability) in B16F10 cells
  • Figure 2b shows the amount of melanin production (melanin content) in B16F10 cells.
  • HA hyaluronic acid
  • HA is a high molecular weight glycosaminoglycan present in the extracellular connective tissue and acts as a barrier to prevent water evaporation. It is known that the content of HA decreases with age, and the decrease in the content of HA due to these intrinsic or extrinsic factors causes a decrease in skin elasticity, rough skin, wrinkles, and the like.
  • HAS-2 expression was evaluated through increased HAS-2 expression.
  • HAS-2 expression was evaluated through increased HAS-2 expression.
  • HAS-2 expression significantly increased at a concentration of 600 to 1,000 ⁇ g/ml
  • HAS-2 mRNA expression was reduced. It was found to increase by 54%.
  • HaCaT cells used in the experiment were purchased from ATCC and used. 10% FBS and 1% Penicillin/streptomycin were added to DMEM medium and used, followed by incubation at 37°C, 90% relative humidity, and 5% CO2 incubator.
  • HaCaT cells were seeded in a 96-well plate at a concentration of 1 x 10 5 cells/well and cultured for 24 hours. Samples were treated by concentration and incubated for 24 hours. MTT solution (5 mg/ml) was added at a time of 10 ⁇ l and further incubated for 4 hours. After removing the medium, 100 ⁇ l of Dimethyl Sulfoxide (DMSO) was added, and absorbance was measured at 570 nm. Cell viability was calculated according to the following equation.
  • DMSO Dimethyl Sulfoxide
  • HaCaT cells were aliquoted in a 60 mm plate at a volume of 6 x 10 5 cells/well, and cultured at 37° C., 5% CO 2 in an incubator for 24 hours. After the samples were treated for 24 hours at each concentration, the supernatant was removed. The treated cells were lysed using Trizol reagent (Ambion, USA). cDNA was synthesized according to the manufacturing instructions of Revertra ACE- ⁇ - (Toyobo, Japan).
  • the synthesized cDNA was subjected to real-time PCR using GAPDH (Hs02786624_g1), HAS-2 (Hs00193435_m1) primers and Taqman master mix (Thermo fisher, USA). As a result, no cytotoxicity was observed at a concentration of 1,000 ⁇ g/ml or less, and an increase in HAS-2 mRNA expression was confirmed to be 1.54% at a concentration of 1,000 ⁇ g/ml, and a production increase rate of 54% was observed.
  • Figure 3a shows the cytotoxicity (cell viability) confirmation results in HaCaT cells
  • Figure 3b shows the HAS-2 expression in HaCaT cells.
  • RAW 264.7 cells were treated with LPS, an inflammatory mediator, to significantly increase NO production, and anti-inflammatory efficacy through inhibition of NO production and iNOS expression of samples evaluated.
  • LPS an inflammatory mediator
  • cytotoxicity was not observed at a concentration of 1,000 ⁇ g/ml or less, and NO production was significantly reduced at a concentration of 400 ⁇ g/ml to 1,000 ⁇ g/ml, and NO production was reduced by 61.57% at a concentration of 1,000 ⁇ g/ml.
  • iNOS mRNA expression was significantly decreased at a concentration of 600 ⁇ g/ml to 1,000 ⁇ g/ml, and iNOS mRNA expression was reduced by 50.40% at a concentration of 1,000 ⁇ g/ml.
  • RAW 264.7 cells used in the experiment were purchased from Korea Cell Line Bank and used by adding 10% FBS and 1 % Penicillin/streptomycin to DMEM medium. was used.
  • RAW 264.7 cells were cultured in 96-well plates at a concentration of 5 x 10 4 cells/well for 24 hours. Samples were treated by concentration and incubated for 24 hours. MTT solution (5 mg/ml) was added at a time of 10 ⁇ l and further incubated for 4 hours. After removing the supernatant, 100 ⁇ l of dimethyl sulfoxide (DMSO) was added, and the absorbance was measured at 570 nm. Cell viability was calculated according to the following formula.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • RAW 264.7 cells were seeded in a 96-well plate at a concentration of 5 x 10 4 cells/well and cultured in DMEM medium containing 10% FBS for 24 hours. The medium was removed and LPS was treated at a concentration of 1 ⁇ g/ml together with samples diluted by concentration in DMEM (serum free) medium and cultured for 24 hours again. Griess reagent of the same volume as 100 ml of the culture supernatant was added, and the absorbance was measured at 540 nm after reaction for 10 minutes.
  • NO production inhibitory ability (%) (absorbance of sample added group / absorbance of no sample added group) X 100
  • Real-time PCR was performed to confirm the mRNA expression of iNOS in RAW 264.7 cells.
  • RAW 264.7 cells were aliquoted to 5 x 10 5 cells/well in a 6-well plate, and cultured at 37° C., 5% CO 2 in an incubator for 24 hours. After the samples were treated for 24 hours at different concentrations, the supernatant was removed. Cells were lysed using Trizol reagent (Ambion, USA). cDNA was synthesized according to the manufacturing instructions of Revertra ACE- ⁇ - (Toyobo, Japan).
  • the synthesized cDNA was subjected to real-time PCR using GAPDH (Mm99999915_g1), iNOS (Mm00440502_m1), primers and Taqman master mix (Thermo fisher, USA).
  • Figure 4a shows the cytotoxicity (cell viability) confirmation result in RAW 264.7 cells
  • Figure 4b shows the NO production inhibitory ability in RAW 264.7 cells
  • Figure 4c shows the iNOS expression inhibitory ability in RAW 264.7 cells, respectively.
  • a probiotic liquid polymersome material was obtained from the mixed composition of Example 7 prepared in Preparation Example 3 by a high-pressure dispersion process using a high-pressure disperser (Suflux, NLM 100, 10000 bar, 60° C.).
  • the composition (weight ratio) of the liquid polymersome is shown in Table 23 below.
  • Phase stability (discoloration, discoloration, phase separation, etc.) according to temperature conditions was evaluated for the solid powder composition prepared in Preparation Example 4 and the liquid polymersome composition prepared in Preparation Example 5, and the results are shown in Table 24 below. indicated.
  • the solid powder composition was confirmed to be stable when it contained maltodextrin and isomalt as excipients and phospholipids as stabilizers, and the liquid polymersome composition contained tamarind seed polysaccharide And, it was confirmed that it was stable when it contained phospholipids and polyglyceryl-6 oleate as stabilizers.
  • Cream cosmetics were prepared from the solid powder material of Example 18 prepared in Preparation Example 4 by an emulsion emulsification process using an emulsifier (T.K. Homo Mixer Markll, Model 2.5, 3,000rpm, 75°C).
  • the composition (weight ratio) is shown in [Table 25] below.
  • Example 21 Comparative Example 5 (%) awards 1. Purified water To 100 To 100 2. EDTA-2Na 0.05 0.05 3. Glycerin 10.00 10.00 4. 1,3-Butylene Glycol 10.00 10.00 5. Niacinamide 2.00 2.00 6. Carbomer 0.20 0.20 7. Xanthan Gum 0.05 0.05 paid 8. Cetostearyl Alcohol 2.50 2.50 9. Arachidyl Alcohol, Behenyl Alcohol, Arachidyl Glucoside 2.00 2.00 10. Self-emulsifying glycerin momostearate 1.00 1.00 11. Hydrogenated Polydecene 5.00 5.00 12. Ethylhexylisononanoate 5.00 5.00 13. Cyclomethicone 5.00 5.00 adding 12. Neutralizer appropriate amount appropriate amount 13. Fragrance, sterilization and preservative appropriate amount appropriate amount 14.
  • Example 18 3.00 0.00
  • the moisturizing power of the cream cosmetic prepared in Preparation Example 6 was evaluated as follows. After washing the forearm of the tester’s arm with water using a moisture meter of Janus Premium (Pie, Korea), which uses the principle that resistance decreases when alternating current is applied when water is contained, 10 ⁇ l of cream cosmetic is applied to the size of 2 cm x 2 cm. After instillation, well smearing using a latex glove and application, the moisture content in the stratum corneum was measured immediately after application, after 1 hour, and after 2 hours, respectively, and the results are shown in FIG. 5 . As shown in FIG.
  • the cream cosmetic (Example 21) containing the mixed composition of the lactic acid bacteria dead cells and the culture has superior moisture content compared to the cream cosmetic (Comparative Example 5) that does not contain the mixed composition of the lactic acid bacteria dead cells and the culture It showed an increase and moisturizing power.

Abstract

본 발명은 김치로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (기탁번호: BP1910798), 사우어크라우트로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799) 및 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균의 배양물을 포함하고, 이들 유산균 1종 이상의 사균체를 더 포함할 수 있는 피부 노화 개선 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 피부 노화 개선 화장료 조성물은 피부에 친화적이며, 안전하고, 피부 기능을 향상시킬 수 있는 천연 유산균 및 유산균 배양물을 이용하여 항산화, 염증 완화, 보습 증진, 피부톤 개선, 탄력 및 주름 개선을 통해 피부 노화 개선 효과를 촉진시킬 수 있다.

Description

락토바실러스 플란타룸 유산균 사균체 또는 상기 유산균의 배양물을 포함하는 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 유산균 사균체 또는 상기 유산균의 배양물을 포함하는 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
식물성 유산균은 절임류, 김치 등과 같이 식물 원료의 발효 식품에서 분리된 유산균으로, 동물성 유산균과 비교하여 그 종류가 많고, 외부 환경에 대한 적응력이 뛰어나다. 특히 김치에서 분리된 식물성 유산균은 척박한 환경에서 생육하기 때문에 각종 생리 활성 물질의 생산력이 뛰어난 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 김치로부터 분리된 유산균, 그 사균체, 배양물을 이용한 화장품 소재 개발이 활발하게 이루어지고 있다.
김치는 유산균에 의하여 발효되는 식품으로, 김치에서 분리된 유산균으로는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 덱스트라니쿰(Leuconostoc dextranicum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 페디오코코스 펜토사쿠스(Pediococcus pentosacues) 등이 있다.
이들 중 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에 관한 종래기술로는 김치로부터 분리한 락토바실러스 플란타룸 nF1 균주(수탁번호 NITE P-1462)의 사균체를 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물 (대한민국 공개특허 제2019-0002836호), 김치로부터 분리한 락토바실러스 플란타럼 WiKim0060 (Lactobacillus plantarum WiKim0060) 및 이를 포함하는 피부 미백 및 보습 개선용 조성물 (대한민국 공개특허 제2019-0055552호), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) CJLP133 균주의 균체가 제거된 배양물을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물 (대한민국 공개특허 제2019-0056176호) 및 피부 항균용 조성물 (대한민국 공개특허 제2019-0056176호) 등이 있다. 그러나, 이들 선행특허는 피부 노화 현상의 주름 개선, 미백 개선, 보습 개선 등과 같이 한 두 가지 효능에 관한 것일 뿐, 항산화, 염증 완화, 보습 증진, 피부톤 개선, 탄력 및 주름 개선을 통해 피부 노화 현상에 대한 전반적인 개선 효과를 제공하는 것이 아니다.
현재, 소비자는 화장품에 대하여 단편적인 기능을 넘어, 복합적인 노화 현상 방지 또는 개선 효과, 즉, 항산화, 항염증, 보습 증진, 주름 개선, 미백 개선 등의 기능을 종합적으로 제공하는 다중 기능성 화장품을 요구한다. 이에 따라 피부에 안전한 유산균 소재의 개발을 통해 소비자의 요구에 부합하는 다중 기능성 화장품을 제공하는 것이 필요하다.
본 발명의 목적은 피부에 친화적이며, 안전하고, 피부 기능을 향상시킬 수 있는 천연 소재를 이용하여 항산화, 염증 완화, 보습 증진, 피부톤 개선, 탄력 및 주름 개선을 통해 피부 개선 효과를 나타내고, 이를 통해 더욱 젊어 보이려는 욕구를 충족시킬 수 있는 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 김치로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) Wikim 125 (기탁번호: BP1910798), 양배추로부터 제조된 사우어크라우트로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799) 및 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800)의 배양물과 이들의 사균체가 피부에 친화적이며, 안전하고, 피부 기능을 향상시킬 수 있는 천연 유래 소재로서, 항산화, 항염, 보습 증진, 피부 톤 개선, 탄력 및 주름 개선을 통해 피부 노화 방지 및 개선을 촉진한다는 것을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
따라서, 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 기술적 수단은 다음과 같다:
1. 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (기탁번호: BP1910798), 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799) 및 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800)로 구성된 군에서 선택되는 유산균 1종 이상의 배양물을 포함하는 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
2. 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (기탁번호: BP1910798), 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799) 및 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800)로 구성된 군에서 선택되는 유산균 1종 이상의 사균체를 더 포함하는 것인 상기 1의 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
3. 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (기탁번호: BP1910798)는 김치로부터 분리된 것인 상기 1 또는 2의 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
4. 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799) 및 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800)는 각각 양배추 또는 방울 양배추로 제조된 사우어크라우트로부터 분리된 것인 상기 1 또는 2의 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
5. 유산균의 배양물은 유산균 배양용 배지에서 유산균을 배양하고 원심 분리하여 수득한 상등액을 동결 건조한 것인 상기 1의 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
6. 유산균의 사균체는 유산균 배양용 배지에서 유산균을 배양하고 원심 분리한 후 침전된 세포를 열처리하여 얻은 것인 상기 1의 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
본 발명에 따라 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (기탁번호: BP1910798), 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799) 및 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800)로 구성된 군에서 선택되는 유산균 1종 이상의 배양물을 포함하고, 상기 유산균 1종 이상의 사균체를 더 포함할 수 있는 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물이 제공되었다.
본 발명에서는 피부에 친화적이며, 안전하고, 피부기능을 향상시킬 수 있는 천연 유래 유산균 및 이들 유산균을 이용한 배양물을 이용하여 항산화, 염증 완화, 보습 증진, 피부톤 개선, 탄력 및 주름 개선을 통해 피부 노화 방지 및 개선을 촉진시켜 더욱 젊어 보이도록 하는 효과를 나타낼 수 있다.
도 1a는 본 발명 실시예 7의 조성물에 대해 Hs68 세포에서의 세포 독성 확인 결과를 도시한 것이고, 도 1b는 MMP 발현 억제능 확인 결과를 도시한 것이다.
도 2a는 본 발명 실시예 7의 조성물에 대해 B16F10 세포에서의 세포 독성 (세포 생존률) 측정 결과를 도시한 것이고, 도 2b는 B16F10 세포에서의 멜라닌 생성량 (멜라닌 함량)을 도시한 것이다.
도 3a는 본 발명 실시예 7의 조성물에 대해 HaCaT 세포에서의 세포 독성 (세포 생존률) 확인 결과를 도시한 것이고, 도 3b는 HaCaT 세포에서의 HAS-2 발현도를 도시한 것이다.
도 4a는 본 발명 실시예 7의 조성물에 대해 RAW 264.7 세포에서의 세포 독성 (세포 생존율) 확인 결과를, 도 4b는 RAW 264.7 세포에서의 NO 생성 억제능을, 도 4c는 RAW 264.7 세포에서의 iNOS 발현 억제능 확인 결과를 각각 도시한 것이다.
도 5는 본 발명 실시예 21 및 비교예 5에 따른 크림 화장료의 피부 보습력 평가 결과를 도시한 것이다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (Lactobacillus plantarum Wikim 125, 기탁번호: BP1910798), 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799) 및 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800)로 구성된 군에서 선택되는 유산균 1종 이상의 배양물을 포함하는 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (기탁번호: BP1910798)는 김치로부터 분리된 것일 수 있고, 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799) 및 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800)은 각각 사우어크라우트, 예를 들면, 양배추 또는 방울 양배추로 제조된 사우어크라우트로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균의 배양물은 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (기탁번호: BP1910798), 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799) 및 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800)로 구성된 군에서 선택되는 유산균을 각각 유산균 배양용 배지, 예를 들면, MRS 한천 배지에서 배양한 후 원심 분리하여 수득한 상등액을 건조하여 수득한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물은 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (기탁번호: BP1910798), 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799) 및 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800)로 구성된 군에서 선택되는 유산균 1종 이상의 사균체를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 유산균의 사균체는 본 발명 분야에 알려져 있는 방법, 예를 들면, 유산균 배양용 배지, MRS 한천 배지에서 유산균을 배양하고 원심 분리한 후 침전된 세포를 열처리하여 얻은 것일 수 있다.
본 발명에 따른 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물은 필요에 따라 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 추가 성분, 예컨대 pH 조절제, 계면활성제, 유지류, 알코올류, 보습제, 살균보존제, 킬레이트제, 향료, 색소, 자외선 흡수제, 자외선 산란제 및 항산화제로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성분을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 이들 추가 성분의 구체적인 종류 및 사용량은 본 발명 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물의 제형은 특별한 형태로 제한되지 않으며, 그 예로는 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 앰플, 에센스, 비비크림, 선크림, 팩, 립밤 등의 형태로 제공될 수 있다. 또한 각 제형에 있어서, 본 발명에 따른 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물은 특별한 제한 없이, 목적에 따라 본 발명 분야의 통상의 기술자가 어려움 없이 선정하여 배합할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명이 이들 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 유산균 사균체 제조
김치로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (기탁번호: BP1910798), 제주산 방울 양배추로 제조된 사우어크라우트로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799), 제주산 양배추로 제조된 사우어크라우트로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800)를 각각 MRS 한천(agar) 배지에서 30℃에서 24시간 배양하고, 원심 분리한 다음, 침전된 세포를 80℃에서 60분간 열처리하여 유산균 사균체를 얻었다.
유산균 사균체 제조 실시예
구분 유산균 배양물
실시예 1 (사균체 1) 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (기탁번호: BP1910798) 사균체
실시예 2 (사균체 2) 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799) 사균체
실시예 3 (사균체 3) 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800) 사균체
제조예 2: 유산균 배양물 제조
김치로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (기탁번호: BP1910798), 제주산 방울 양배추로 제조된 사우어크라우트로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799), 제주산 양배추로 제조된 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800)를 각각 MRS 한천 배지에서 30℃에서 24시간 배양하고 원심 분리하여 얻어진 상등액을 동결 건조하여 유산균 배양물을 얻었다.
유산균 배양물 제조 실시예
구분 유산균 배양물
실시예 4 (배양물 1) 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (기탁번호: BP1910798) 배양물
실시예 5 (배양물 2) 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799) 배양물
실시예 6 (배양물 3) 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800) 배양물
제조예 3: 유산균 사균체와 배양물의 혼합 조성물 제조
제조예 1 및 2에서 제조한 유산균 사균체와 배양물을 하기 [표 3]에 나타낸 조성(중량비)으로 혼합하여 혼합 조성물을 제조하였다.
혼합 조성물의 조성
실시예
성분 		7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
배양물 1 20.0 25.0 50.0 20.0 40.0 25.0 75.0 67.0 50.0 60.0 0.0
배양물 2 60.0 70.0 25.0 20.0 20.0 75.0 0.0 0.0 0.0 0.0 33.0
배양물 3 10.0 5.0 25.0 60.0 40.0 0.0 25.0 33.0 50.0 40.0 67.0
사균체 1 4.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
사균체 2 5.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
사균체 3 1.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
총 합 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
실험예 1: 생체외( in-vitro ) 유효성 평가
제조예 1 내지 3에서 제조한 유산균 사균체, 유산균 배양물 및 유산균 사균체와 배양물의 혼합 조성물 각각에 대해 피부 노화 개선에 관한 종합적인 유효성을 검증하기 위하여, 항산화 (활성 산소(ABTs) 소거 능력), 항염 (NO 억제력), 항염 및 보습 증진 (히알루로니다제 억제력), 미백 (티로시나제 억제력) 및 탄력 개선(콜라게나제 억제력) 평가를 수행하였다. 유산균 사균체 및 배양물의 혼합 조성물인 실시예 1과 2의 경우 모든 항목에서 평가 결과가 우수하여 피부 노화 개선에 유용하다는 것이 확인되었다. 실험 절차 및 평가 결과는 다음과 같다.
실험예 1-1: 항산화 효과 (활성산소(ABTs) 소거 능력) 평가
항산화 활성 측정의 일환인 ABTS+[2,2'-Azino-bis(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid)] 라디칼 소거 활성은 수소 공여 항산화제(hydrogen-donating antioxidants)와 연쇄 절단형 항산화제 (chainbreaking antioxidants) 모두를 측정할 수 있으며, 수상(aqueous phase)과 유상(organic phase) 모두에 적용 가능한 측정법이다.
본 발명에서는 7 mM ABTS 용액에 2.45 mM 과황산칼륨(potassium persulfate)을 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 암소에서 약 24시간 반응시켜 형성된 ABTS 라디칼 용액을 시료와 혼합하여 암소에서 10분간 반응시킨 다음, 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거능(%)을 하기 식을 이용하여 계산하고, [표 4]에 나타내었다.
ABTs 라디칼 소거능(%) = (시험군의 흡광도/무처리군의 흡광도) X 100
항산화 효과 (활성 산소(ABTs) 소거 능력) 평가 결과
시료 시험 농도 활성 산소 (ABTs) 소거능 (%)
실시예 1 50 mg/mL 98.69
실시예 2 50 mg/mL 99.42
실시예 3 50 mg/mL 97.08
실시예 4 1 mg/mL 36.37
실시예 5 1 mg/mL 52.02
실시예 6 1 mg/mL 41.05
실시예 7 1 mg/mL 55.29
실시예 8 1 mg/mL 51.00
실시예 9 1 mg/mL 42.53
실시예 10 1 mg/mL 45.68
실시예 12 1 mg/mL 47.81
실시예 13 1 mg/mL 39.30
또한, 실시예 4 내지 6 (배양물 1 내지 3)에 대해 ABTS 라디칼의 활성을 50% 억제하는 최소 억제 농도 (IC50, mg/ml)를 확인하였다. 하기 [표 5] 내지 [표 7]에서 보는 것과 같이, 각각 1.47 mg/ml, 0.96 mg/ml, 1.35 mg/ml의 낮은 농도에서도 우수한 ABTS 라디칼 소거 효과를 나타내었다.
배양물 1의 농도별 항산화 효과 평가 결과
시료 농도(mg/mL) O.D. 734 nm 평균 (%)표준편차 억제율(%)
무처리군 - 0.560 0.561 0.556 0.559 - -
실시예 4 0.1 0.536 0.531 0.537 0.535 0.58 4.35
0.2 0.532 0.527 0.525 0.528 0.65 5.55
0.4 0.494 0.492 0.493 0.493 0.18 11.81
0.6 0.458 0.454 0.452 0.454 0.72 18.78
1.0 0.358 0.358 0.351 0.356 0.72 36.37
2.0 0.198 0.195 0.188 0.194 0.92 65.35
5.0 0.012 0.011 0.019 0.014 0.78 97.50
배양물 2의 농도별 항산화 효과 평가 결과
시료 농도(mg/mL) O.D. 734 nm 평균 (%)표준편차 억제율(%)
무처리군 - 0.608 0.609 0.611 0.609 - -
실시예 5 0.1 0.575 0.578 0.577 0.577 0.25 5.36
0.2 0.561 0.554 0.555 0.557 0.62 8.64
0.4 0.505 0.513 0.502 0.507 0.93 16.85
0.6 0.459 0.455 0.451 0.455 0.66 25.33
1.0 0.289 0.298 0.290 0.292 0.81 52.02
2.0 0.217 0.184 0.195 0.199 2.76 67.40
5.0 0.002 0.003 0.004 0.003 0.34 99.62
배양물 3의 농도별 항산화 효과 평가 결과
시료 농도(mg/mL) O.D. 734 nm 평균 (%)표준편차 억제율(%)
무처리군 - 0.595 0.595 0.593 0.594 - -
실시예 6 0.1 0.571 0.567 0.563 0.567 0.67 4.60
0.2 0.547 0.544 0.543 0.545 0.35 8.36
0.4 0.494 0.497 0.498 0.496 0.35 16.49
0.6 0.445 0.453 0.443 0.447 0.89 24.79
1.0 0.357 0.344 0.350 0.350 1.09 41.05
2.0 0.208 0.195 0.195 0.199 1.26 66.46
5.0 0.018 0.010 0.009 0.012 0.73 98.82
실험예 1-2: 항염 효과 (NO 억제력) 평가
포유류는 염증성 자극을 받으면 대식 세포에 의해 NO (nitric oxide)를 합성하며, 이는 혈관을 확장시키고 염증을 억제하는 신경 전달 물질이다.
따라서 NO 라디칼을 억제하는 효과를 확인하고자 시료를 10 mM 니트로페리시안화나트륨 2수화물과 혼합하여 25℃에서 150분간 반응시키고, 0.5 mL씩 분주한 후 1% 설파닐아민 1 mL를 넣어 10분간 실온에서 반응시키고, 이어서 0.1% N-(1-나프틸) 에틸렌디아민 디하이드로클로라이드 2 mL를 혼합하고, 30분간 실온에서 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이로부터 하기 식을 이용하여 NO 라디칼 소거능 (%)를 계산하고, 그 결과를 [표 8]에 나타내었다.
NO 라디칼 소거능(%) = (시험군의 흡광도/무처리군의 흡광도) X 100
항염증 효과(NO 생성 억제율) 평가 결과
시료 시험 농도 NO 생성 억제율 (%)
실시예 1 50 mg/mL 44.59
실시예 2 50 mg/mL 32.09
실시예 3 50 mg/mL 80.22
실시예 4 1 mg/mL 53.01
실시예 5 1 mg/mL 30.24
실시예 6 1 mg/mL 43.58
실시예 7 1 mg/mL 74.18
실시예 8 1 mg/mL 59.85
실시예 9 1 mg/mL 53.44
실시예 14 1 mg/mL 54.35
실시예 15 1 mg/mL 59.33
실시예 16 1 mg/mL 66.67
또한, 실시예 4 내지 6 (배양물 1 내지 3)에 대해 NO 라디칼의 활성을 50% 억제하는 최소 억제 농도 (IC50, mg/ml)를 확인하였다. [표 9] 내지 [표 11]에서 보는 것과 같이, 각각 0.80 mg/ml, 3.19 mg/ml 및 1.41 mg/ml의 낮은 농도에서도 우수한 NO 라디칼 소거 효과를 나타내었다.
배양물 1 (실시예 4)의 농도별 항염증 효과 평가 결과
시료 농도(mg/mL) O.D. 734 nm 평균 (%)표준편차 억제율(%)
무처리군 - 0.113 0.116 0.120 0.116 - -
실시예 4 0.1 0.096 0.098 0.089 0.094 4.06 18.91
0.2 0.081 0.078 0.078 0.079 1.49 32.09
0.4 0.071 0.068 0.071 0.070 1.49 39.83
0.6 0.058 0.049 0.068 0.058 8.17 49.86
1.0 0.050 0.060 0.054 0.055 4.33 53.01
2.0 0.057 0.046 0.047 0.050 5.23 57.02
5.0 0.036 0.043 0.036 0.038 3.47 67.05
배양물 2 (실시예 5)의 농도별 항염증 효과 평가 결과
시료 농도(mg/mL) O.D. 734 nm 평균 (%)표준편차 억제율(%)
무처리군 - 0.193 0.191 0.198 0.194 - -
실시예 5 0.1 0.178 0.181 0.172 0.177 2.36 8.76
0.2 0.171 0.175 0.174 0.173 1.07 10.65
0.4 0.161 0.155 0.164 0.160 2.36 17.53
0.6 0.150 0.145 0.153 0.149 2.08 23.02
1.0 0.138 0.135 0.133 0.135 1.30 30.24
2.0 0.118 0.115 0.106 0.113 3.22 41.75
5.0 0.078 0.077 0.063 0.073 4.32 62.54
배양물 3 (실시예 6)의 농도별 항염증 효과 평가 결과
시료 농도(mg/mL) O.D. 734 nm 평균 (%)표준편차 억제율(%)
무처리군 - 0.182 0.173 0.175 0.176 - -
실시예 6 0.1 0.140 0.145 0.147 0.144 2.04 18.49
0.2 0.126 0.129 0.119 0.125 2.90 29.43
0.4 0.115 0.121 0.114 0.117 2.14 33.96
0.6 0.102 0.107 0.112 0.107 2.83 39.43
1.0 0.100 0.101 0.098 0.100 0.86 43.58
2.0 0.077 0.068 0.073 0.073 2.55 58.87
5.0 0.058 0.057 0.057 0.057 0.33 67.55
실험예 1-3: 항염 및 보습 증진 효과 (히알루로니다제 억제력) 평가
히알루로니다제(hyaluronidase)는 피부 보습 인자인 히알루론산 (hyaluronic acid)을 가수분해하는 효소로서, 염증을 유발하는 기능을 가지고 있으므로, 히알루로니다제의 활성 억제 정도를 확인하여 항염증 효과를 측정하는 방법 (Y Kakegawa, et al., Japanese J. Inflammation, 4: 437-438, 1984)을 이용하여 항염 효과를 평가하였다.
시료를 1M 아세트산 완충 용액 (pH 3.5)에 녹인 히알루로니다제 용액 (10mg/ml) 0.1 ml에 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시키고, 12.5 mM CaCl2 0.1ml를 첨가한 후 다시 37℃에서 20분간 반응시킨 다음, 0.1M 아세트산 완충 용액 (pH 3.5) 0.25 ml에 녹인 히알루론산 용액 (6㎎/㎖)을 첨가하여 37℃에서 40분간 반응시키고, 0.4N NaOH 0.1 ml와 0.4M potassium tetraborate 0.1 ml를 가하여 100℃에서 3분간 반응시키고 냉각시킨 다음, ρ-디메틸아미노벤즈알데히드 용액 2.5 ㎖를 넣고 다시 20분간 37℃에서 반응시킨 후 발색시켜, 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이로부터 히알루로니다제 억제능을 하기 식을 이용하여 계산하고, 그 결과를 [표 12]에 나타내었다.
히알루로니다제 억제능(%)=(시험군의 흡광도/무처리군의 흡광도) X 100
항염 및 보습 증진 효과 (히알루로니다제 억제력) 평가 결과
시료 시험 농도 히알루로니다제 억제능 (%)
실시예 1 50 mg/mL 51.19
실시예 2 50 mg/mL 52.10
실시예 3 50 mg/mL 90.49
실시예 4 1 mg/mL 36.13
실시예 5 1 mg/mL 44.06
실시예 6 1 mg/mL 33.55
실시예 7 1 mg/mL 52.85
실시예 8 1 mg/mL 33.33
실시예 11 1 mg/mL 62.20
실시예 13 1 mg/mL 47.32
실시예 15 1 mg/mL 55.64
실시예 17 1 mg/mL 55.60
또한, 실시예 4 내지 6 (배양물 1 내지 3)에 대해 히알루로니다제 활성을 50% 억제하는 최소 억제 농도 (IC50, mg/ml)를 확인하였다. [표 13] 내지 [표 15]에서 보는 것과 같이, 각각 1.36 mg/ml, 2.09 mg/ml 및 3.99 mg/ml의 낮은 농도에서도 우수한 히알루로니다제 억제 효과를 나타내었다.
배양물 1 (실시예 4)의 농도별 히알루로니다제 억제력 평가 결과
시료 농도(mg/mL) O.D. 734 nm 평균 (%)표준편차 억제율(%)
무처리군 - 0.255 0.248 0.236 0.246 - -
실시예 4 0.1 0.242 0.239 0.244 0.241 1.02 1.89
0.2 0.237 0.241 0.241 0.239 0.94 2.71
0.4 0.194 0.212 0.202 0.203 3.66 17.73
0.6 0.163 0.174 0.179 0.169 3.32 30.18
1.0 0.158 0.169 0.145 0.164 4.88 36.13
2.0 0.136 0.131 0.127 0.134 1.83 46.68
5.0 0.106 0.112 0.108 0.109 1.24 55.89
배양물 2 (실시예 5)의 농도별 히알루로니다제 억제력 평가 결과
시료 농도(mg/mL) O.D. 734 nm 평균 (%)표준편차 억제율(%)
무처리군 - 0.148 0.163 0.152 0.154 - -
실시예 5 0.1 0.144 0.148 0.139 0.144 2.92 6.91
0.2 0.134 0.128 0.122 0.128 3.89 17.06
0.4 0.121 0.129 0.116 0.122 4.25 20.95
0.6 0.105 0.111 0.107 0.108 1.98 30.24
1.0 0.078 0.097 0.084 0.086 6.29 44.06
2.0 0.073 0.079 0.081 0.078 2.70 49.68
5.0 0.054 0.061 0.069 0.061 4.86 60.26
배양물 3 (실시예 6)의 농도별 히알루로니다제 억제력 평가 결과
시료 농도(mg/mL) O.D. 734 nm 평균 (%)표준편차 억제율(%)
무처리군 - 0.145 0.157 0.151 0.151 - -
실시예 6 0.1 0.153 0.149 0.150 0.151 1.38 0.22
0.2 0.142 0.148 0.139 0.143 3.03 5.30
0.4 0.132 0.141 0.128 0.134 4.41 11.48
0.6 0.119 0.108 0.121 0.116 4.64 23.18
1.0 0.098 0.103 0.100 0.100 1.67 33.55
2.0 0.088 0.097 0.084 0.090 4.41 40.62
5.0 0.071 0.063 0.071 0.068 3.06 54.75
실험예 1-4: 미백 효과 (티로시나제 억제력) 평가
티로시나제는 생체 내에서 티로신의 산화를 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 이 효소의 기능을 억제하여 티로신이 산화되어 멜라닌이라는 흑색의 고분자를 형성하는 것을 억제하는 정도를 측정하는 방법(Pomerantz S. H.: J. Biochem., 24: 161 - 168, 1996)을 응용하여 미백 효과를 평가하였다. 티로시나제의 작용 결과 생성되는 도파크롬(DOPA chrome)을 비색법에 의해 측정하는 야기(yagi) 등의 방법을 변형하여 티로시나제 저해 활성을 측정하였다. 구체적으로는, 50mM 인산나트륨 완충 용액 (pH 6.8) 2.3 mL에 10mM L-DOPA 0.5 mL와 0.5 mL 110 unit/ml mushroom tyrosinase 및 시료 용액 20 ㎕를 넣은 후, 25
Figure PCTKR2021015017-appb-img-000001
에서 10분간 반응시킨 후 475 nm에서 흡광도를 측정하고, 이로부터 다음 식을 이용하여 티로시나제 억제능 (%)을 계산하여 [표 16]에 나타내었다.
티로시나제 억제능(%) = (시험군의 흡광도/무처리군의 흡광도) X 100
미백 효과 (티로시나제 억제력) 평가 결과
시료 시험 농도 티로시나제 억제능 (%)
실시예 1 50 mg/mL 85.68
실시예 3 50 mg/mL 79.61
실시예 4 1 mg/mL 44.13
실시예 6 1 mg/mL 32.62
실시예 7 1 mg/mL 34.13
실시예 8 1 mg/mL 24.19
실시예 14 1 mg/mL 47.89
실시예 15 1 mg/mL 35.04
또한, 실시예 4 및 6 (배양물 1 및 3)에 대해 티로시나제 활성을 50% 억제하는 최소 억제 농도 (IC50, mg/ml)를 확인하였다. [표 17] 및 [표 18]에서 보는 것과 같이, 각각 2.03 mg/ml 및 4.16 mg/ml의 낮은 농도에서도 우수한 티로시나제 억제 효과를 나타내었다.
배양물 1 (실시예 4)의 농도별 티로시나제 억제력 평가 결과
시료 농도(mg/mL) O.D. 734 nm 평균 (%)표준편차 억제율(%)
무처리군 - 0.283 0.288 0.285 - -
실시예 4 0.1 0.267 0.279 0.273 2.97 4.38
0.2 0.238 0.248 0.243 2.48 14.89
0.4 0.231 0.228 0.230 0.74 19.61
0.6 0.201 0.198 0.200 0.74 30.12
1.0 0.156 0.163 0.160 1.73 44.13
2.0 0.142 0.144 0.143 0.50 49.91
5.0 0.111 0.126 0.119 3.72 58.49
배양물 3 (실시예 6)의 농도별 티로시나제 억제력 평가 결과
시료 농도(mg/mL) O.D. 734 nm 평균 (%)표준편차 억제율(%)
무처리군 - 0.451 0.461 0.443 0.451 - -
실시예 6 0.1 0.437 0.444 0.451 0.444 1.55 1.70
0.2 0.422 0.417 0.423 0.421 0.71 6.86
0.4 0.377 0.383 0.384 0.381 0.84 15.57
0.6 0.334 0.34 0.349 0.341 1.67 24.50
1.0 0.317 0.299 0.297 0.304 2.44 32.62
2.0 0.268 0.279 0.259 0.269 2.22 40.52
5.0 0.196 0.222 0.210 0.209 2.88 53.65
실험예 1-5: 탄력 및 주름 개선 효과 (콜라게나제 억제력) 평가
콜라게나제 (collagenase)는 콜라겐을 분해하는 효소라고 알려져 있으며, 그 발현은 자외선의 조사에 의하여 크게 증가하고, 자외선에 의한 콜라겐의 감소·변성의 주요 원인이 되고, 피부의 주름의 형성 등의 큰 요인이 된다는 점을 이용하여 시험군에 대하여 콜라게나제 억제 효과를 측정하여 탄력 및 주름 개선 효과를 평가하였다.
콜라게나제 효소 활성 저해 실험은 콜라겐의 염색 물질인 아조콜 (azocoll)을 사용하는 아조콜 방법을 이용하였다. 효소 저해 활성 측정은 시료 0.1 mL에 0.1M Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 0.25 mL에 4mM CaCl2를 첨가하여, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg(0.3mg/ml)를 녹인 기질액과 콜라게나제(0.2mg/ml) 효소 용액 0.15 mL를 첨가하고 실온에서 20분간 반응 후, 6% 구연산 0.5 mL를 첨가하고 2.5 mL 에틸 아세테이트를 첨가한 후, 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이로부터 다음 식을 이용하여 콜라게나제 억제능 (%)를 계산하고, 그 결과를 [표 19]에 나타내었다.
콜라게나제 억제능(%) = (시험군의 흡광도/무처리군의 흡광도) X 100
탄력 및 주름 개선 효과 (콜라게나제 억제력) 평가 결과
시료 시험 농도 콜라게나제 억제능 (%)
실시예 1 50 mg/mL 79.33
실시예 3 50 mg/mL 93.44
실시예 4 1 mg/mL 36.73
실시예 6 1 mg/mL 25.95
실시예 7 1 mg/mL 33.36
실시예 8 1 mg/mL 31.75
실시예 14 1 mg/mL 25.36
실시예 15 1 mg/mL 21.70
또한, 실시예 4 및 6 (배양물 1 및 3)에 대해 콜라게나제 활성을 50% 억제하는 최소 억제 농도(Inhibition Concetration, IC50 (mg/ml))를 확인하였다. [표 20] 및 [표 21]에서 보는 것과 같이, 각각 3.12 mg/ml 및 4.78 mg/ml의 낮은 농도에서도 우수한 콜라게나제 억제 효과를 나타내었다.
배양물 1 (실시예 4)의 농도별 콜라게나제 억제 효과 평가 결과
시료 농도(mg/mL) O.D. 734 nm 평균 (%)표준편차 억제율(%)
무처리군 - 0.314 0.315 0.315 - -
실시예 4 0.1 0.312 0.311 - 0.312 0.22 1.22
0.2 0.302 0.305 - 0.304 0.67 3.75
0.4 0.299 0.289 - 0.294 2.24 6.77
0.6 0.288 0.274 - 0.281 3.14 10.89
1.0 0.255 0.245 - 0.250 2.24 20.72
2.0 0.201 0.198 - 0.200 0.67 36.73
5.0 0.165 0.168 - 0.167 0.67 47.20
배양물 3 (실시예 6)의 농도별 콜라게나제 억제평가 결과
시료 농도(mg/mL) O.D. 734 nm 평균 (%)표준편차 억제율(%)
무처리군 - 0.287 0.292 0.288 0.289 - -
실시예 6 0.1 0.274 0.282 0.288 0.281 2.43 2.65
0.2 0.269 0.274 0.279 0.274 1.73 5.19
0.4 0.258 0.263 0.253 0.258 1.73 10.73
0.6 0.224 0.232 0.248 0.235 4.23 18.80
1.0 0.219 0.214 0.209 0.214 1.73 25.95
2.0 0.178 0.183 0.181 0.181 0.87 37.49
5.0 0.147 0.135 0.143 0.142 2.11 50.98
실험예 2. 세포에서의 생체 외( in-vitro ) 유효성 평가
실시예 7의 조성물에 대해 세포 수준에서의 피부 노화 개선에 관한 종합적인 유효성을 검증하기 위하여, 세포 독성, 주름 개선 (Hs68 세포, ATCC, 실시간 (real time) PCR을 이용한 MMP-1의 mRNA 발현 확인), 미백 개선 (B16F10 세포, 한국세포주은행, 멜라닌 함량 확인), 보습 개선 (HaCaT 세포, ATCC, 실시간 PCR을 이용한 HAS-2 발현 확인), 항염증 개선 (RAW264.7 세포, 한국세포주은행, NO 생성 억제능 및 실시간 PCR을 이용한 iNOS의 mRNA 발현 확인) 평가를 수행하였다. 그 결과, 1,000 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포 독성이 관찰되지 않았으며, MMP-1의 mRNA 발현 억제, 멜라닌 생성 감소, HAS-2 발현 촉진, NO 생성 억제, iNOS mRNA 발현 억제를 통해 피부 노화 개선 효과가 우수한 것으로 확인되었다. 유의성 검증은 독립 표본 Student t-test로 실시하여 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다. 실험 절차 및 평가 결과는 다음과 같다.
실험예 2-1: 주름 개선 효과 (MMP1 발현 억제) 평가
피부 노화는 피부 진피층에 존재하는 세포외기질의 구조적인 변화로 발생하게 되는데 피부 진피조직의 교원질 중 피부 탄력 성분 단백질인 콜라겐의 감소에 의해서라고 할 수 있다. 세포외 기질 분해는 matrix-metalloproteinases (MMPs)에 의해 일어나며, MMP-1에 의해서 콜라겐의 분해가 발생하여 주름이 발생하기 때문에 MMP-1 발현 억제능을 통한 효능을 평가한 결과, 1,000㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포 독성이 관찰되지 않았으며, 600 ~ 1,000㎍/㎖ 농도에서 유의적으로 감소하여 1,000㎍/㎖ 농도에서 52.63% MMP-1 mRNA 발현이 억제되었다.
1-1) 세포 배양
실험에 사용된 Hs68 세포는 ATCC에서 구입하여 사용하였다. DMEM 배지에 10% FBS와 1% Penicillin/streptomycin를 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 상대습도 90%, 5% CO2 incubator 배양하여 사용하였다.
1-2) 세포 생존율
Hs68 세포를 96-웰 플레이트에 5 x 103 세포/웰의 농도로 24시간 동안 배양하였다. 시료를 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. MTT 용액 (5 ㎎/㎖)을 10 ㎕씩 첨가하고 4시간 동안 추가 배양하였다. 상등액을 제거하고 디메틸 설폭시드 (DMSO)를 100 ㎕을 첨가하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 아래의 식에 따라 계산하였다.
세포 생존율(%)=(시료 첨가군의 흡광도/시료 무첨가군의 흡광도) X 100
1-3) 실시간 PCR
Hs68 세포에서 MMP-1의 mRNA 발현을 확인하기 위해 실시간 PCR을 진행하였다. Hs68 세포는 60mm plate에 5 x 105 세포/웰이 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 실시예1을 농도별로 45분간 처리해 준 다음, TNF-α (20 ng/㎖)를 처리하고 24시간 동안 반응시킨 후 상층액을 제거하였다. 세포는 Trizol reagent (Ambion, USA)를 이용하여 용해시켰다. cDNA는 Revertra ACE-α- (Toyobo, Japan)의 제조 지시에 따라 합성시켰다. 합성된 cDNA는 GAPDH (Hs02786624_g1), MMP1 (Hs00899658_m1) primer와 Taqman master mix (Thermo fisher, USA)를 이용하여 실시간 PCR을 진행하였다.
도 1a는 Hs68 세포에서의 세포 독성 확인 결과를 도시한 것이고, 도 1b는 MMP 발현 억제능 확인 결과를 도시한 것이다.
실험예 2-2 미백 효과 (멜라닌 생성 억제) 평가
피부의 흑화는 피부에 존재하는 멜라닌 형성 세포 (melanocyte)의 멜라닌 생성 증가 때문이다. UV 노출 등의 외부 자극을 통해 멜라닌 형성 세포 는 L-티로신으로부터 멜라닌을 합성하는데, 이때 여러 효소들이 관여한다. B16F10 세포에서 멜라닌 합성을 촉진하기 위해 멜라닌 합성 자극 호르몬인 α-MSH (200 nM)를 처리하고 멜라닌 함량 감소를 확인하여 미백 효과를 평가하였다. 1,000 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포 독성이 관찰되지 않았으며, 600 ~ 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 멜라닌 함량이 유의적으로 감소하여 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 멜라닌 생성이 46.69% 억제되었다.
1-1) 세포 배양
실험에 사용된 B16F10 세포는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였다. DMEM 배지에 10% FBS와 1% Penicillin/streptomycin를 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 상대습도 90%, 5% CO2 incubator 배양하여 사용하였다.
1-2) 세포 생존율
*B16F10 세포를 96-웰 플레이트에 4 x 103 세포/웰의 농도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 후 α-MSH(200nM)와 시료를 농도별로 처리하여 72시간 배양하였다. MTT 용액 (5 ㎎/㎖)을 10 ㎕씩 첨가하고 4시간 동안 추가 배양하였다. 배지를 제거하고 디메틸설폭시드 (DMSO) 100 ㎕을 첨가하고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 아래의 식에 따라 계산하였다.
세포 생존율(%)=(시료 첨가군의 흡광도/시료 무첨가군의 흡광도) X 100
1-3) 멜라닌 함량
B16F10 세포를 6-웰 플레이트에 4 x 104 세포/웰의 농도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 200 nM 농도의 α-MSH를 시료와 동시 처리하고 72시간 동안 멜라닌 합성을 촉진시켰다. 72시간 후 배양된 세포는 트립신/EDTA를 처리하고 원심 분리하였다. 이후 1N NaOH를 이용하여 80℃에서 1시간 반응시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 2a는 B16F10 세포에서의 세포 독성 (세포 생존률) 측정 결과를 도시한 것이고, 도 2b는 B16F10 세포에서의 멜라닌 생성량 (멜라닌 함량)을 도시한 것이다.
실험예 2-3: 보습 효과 (HAS-2 발현 증가) 평가
*피부 장벽이 원활히 작동하기 위해 여러 종류의 지질, 당, 단백질 등이 관여하고 상호 작용을 한다. 이중 히알루론산(HA)은 세포 외 연결 조직에 존재하는 고분자의 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan)으로서 수분 증발을 막는 장벽 역할을 수행한다. 나이가 들어감에 따라 HA의 함량이 줄어든다고 알려져 있는데, 이러한 내재적 혹은 외재적 요인으로 인한 HA의 함량 감소는 피부 탄력 감소, 거친 피부, 주름 등의 요인이 된다. HA는 지속적인 히알루론산 합성 효소 (HAS)에 의한 합성과 히알루로니다제 (HYAL)에 의한 분해에 의해 함량이 조절된다는 점을 이용하여, HAS-2 발현 증가를 통해 보습 효과를 평가하였다. 그 결과, 1,000㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포 독성이 관찰되지 않았으며, 600 ~ 1,000㎍/㎖ 농도에서 HAS-2 발현이 유의적으로 증가하여, 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 HAS-2 mRNA 발현이 54% 증가한 것으로 확인되었다.
1-1) 세포 배양
실험에 사용된 HaCaT 세포는 ATCC에서 구입하여 사용하였다. DMEM 배지에 10% FBS와 1% Penicillin/streptomycin를 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 상대습도 90%, 5% CO2 incubator 배양하여 사용하였다.
1-2) 세포 생존율
HaCaT 세포를 96-웰 플레이트에 1 x 105 세포/웰의 농도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 시료를 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. MTT 용액 (5 ㎎/㎖)을 10 ㎕씩 첨가하고 4시간 동안 추가 배양하였다. 배지를 제거하고 Dimethyl Sulfoxide (DMSO)를 100 ㎕을 첨가하고 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 아래의 식에 따라 계산하였다.
세포 생존율(%)=(시료 첨가군의 흡광도/시료 무첨가군의 흡광도) X 100
1-3) 실시간 PCR
HaCaT 세포에서 HAS-2의 mRNA 발현을 확인하기 위해 실시간 PCR을 진행하였다. HaCaT 세포는 60 mm plate에 6 x 105 세포/웰이 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 시료를 농도별로 24시간 동안 처리한 후 상층액을 제거하였다. 처리된 세포는 트리졸 시약 (Trizol reagent, Ambion, USA)를 이용하여 용해시켰다. cDNA를 Revertra ACE-α- (Toyobo, Japan)의 제조 지시에 따라 합성하였다. 합성된 cDNA를 GAPDH (Hs02786624_g1), HAS-2 (Hs00193435_m1) 프라이머와 Taqman master mix (Thermo fisher, USA)를 이용하여 실시간 PCR을 진행하였다. 그 결과, 1,000 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포 독성이 관찰되지 않았으며, 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 HAS-2 mRNA 발현 증가율이 1.54%로 확인되었고, 54%의 생성 증가율을 보였다.
도 3a는 HaCaT 세포에서의 세포 독성 (세포 생존률) 확인 결과를 도시한 것이고, 도 3b는 HaCaT 세포에서의 HAS-2 발현도를 도시한 것이다.
실험예 2-4: 항염증 효과(NO 생성 억제 및 iNOS 발현 억제) 평가
자가 면역 질환과 염증성 질환을 초래하는 NO 생성 억제능을 평가하기 위하여 RAW 264.7 세포에 염증 매개 물질인 LPS를 처리하여 NO 생성을 유의하게 증가시키고, 시료의 NO 생성 억제 및 iNOS 발현 억제를 통한 항염 효능을 평가하였다. 그 결과, 1,000 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포 독성이 관찰되지 않았으며, NO 생성은 400 ㎍/㎖ 내지 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 유의적으로 감소하여 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 NO 생성이 61.57% 감소하였고, iNOS mRNA 발현은 600 ㎍/㎖ 내지 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 유의적으로 감소하여 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 iNOS mRNA 발현이 50.40% 감소하였다.
1-1) 세포 배양
실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였으며 DMEM 배지에 10% FBS와 1% Penicillin/streptomycin를 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 상대습도 90%, 5% CO2 배양기에서 배양하여 사용하였다.
1-2) 세포 생존율
RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트에 5 x 104 세포/웰의 농도로 24시간 동안 배양하였다. 시료를 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. MTT 용액 (5 ㎎/㎖)을 10 ㎕씩 첨가하고 4시간 동안 추가 배양하였다. 상등액을 제거하고 디메틸설폭시드 (DMSO) 100 ㎕을 첨가하고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 하기 식에 따라 계산하였다.
세포 생존율(%)=(시료 첨가군의 흡광도/시료 무첨가군의 흡광도) X 100
1-3) NO 생성 억제
RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트에 5 x 104 세포/웰의 농도로 분주하고 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 DMEM (Serum free) 배지에 농도별로 희석한 시료와 함께 LPS를 1 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 다시 24시간 배양하였다. 배양 상등액 100 ㎖와 동일한 용량의 Griess 시약을 넣은 다음 10분간 반응 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
NO 생성 억제능(%)=(시료 첨가군의 흡광도 /시료 무첨가군의 흡광도) X 100
1-4) 실시간 PCR
RAW 264.7 세포에서 iNOS의 mRNA 발현을 확인하기 위해 실시간 PCR을 진행하였다. RAW 264.7 세포를 6-웰 플레이트에 5 x 105 세포/웰이 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 샘플을 농도별로 24시간 동안 처리한 후 상층액을 제거하였다. 세포는 트리졸 시약 (Ambion, USA)를 이용하여 용해시켰다. cDNA는 Revertra ACE-α- (Toyobo, Japan)의 제조 지시에 따라 합성시켰다. 합성된 cDNA는 GAPDH (Mm99999915_g1), iNOS(Mm00440502_m1), 프라이머와 Taqman master mix (Thermo fisher, USA)를 이용하여 실시간 PCR을 진행하였다.
도 4a는 RAW 264.7 세포에서의 세포 독성 (세포 생존율) 확인 결과를, 도 4b는 RAW 264.7 세포에서의 NO 생성 억제능을, 도 4c는 RAW 264.7 세포에서의 iNOS 발현 억제능 확인 결과를 각각 도시한 것이다.
제조예 4: 유산균 사균체와 배양물의 혼합 조성물의 고형 분말 제조
제조예 3에서 제조한 실시예 7 및 8의 혼합 조성물을 각각 분무건조기(Buchi Co. B-290, Swiss, Inlet 160℃, Outlet 100℃, Pump 10%, Aspirator 100%))로 분무 건조하여 유산균 사균체 및 배양물 혼합 조성물의 고형 분말을 얻었다. 그 조성(중량비)은 하기 [표 22]와 같다.
유산균 사균체 및 배양물의 혼합 조성물의 고형 분말 조성
실시예
성분 		실시예 18 실시예 19 비교예 1 비교예 2
말토덱스트린 25.00 0.00 15.00 0.00
이소말트(isomalt) 0.00 15.00 0.00 25.00
인지질(phospholipid) 0.25 0.15 0.00 0.00
실시예 7 0.25 0.00 1.50 0.00
실시예 8 0.00 0.85 0.00 0.50
정제수 74.50 84.00 83.50 74.50
총 합 100.00 100.00 100.00 100.00
제조예 5: 유산균 사균체 및 배양물의 액상 폴리머좀 조성물 제조
제조예 3에서 제조한 실시예 7의 혼합 조성물로부터 고압 분산기(Suflux, NLM 100, 1,0000 bar, 60℃)를 이용한 고압 분산 공정으로 프로바이오틱스 액상 폴리머좀 소재를 얻었다. 액상 폴리머좀의 조성 (중량비)은 하기 [표 23]과 같다.
액상 폴리머좀 조성물의 조성
성분 실시예 20 비교예 3 비교예 4
정제수 88.95 88.95 89.95
타마린드씨 폴리사카라이드
(Tamarindus Indica Seed Polysaccharide) 		0.05 0.00 0.05
잔탄검 0.00 0.05 0.00
부틸렌글리콜 6.00 6.00 6.00
1,2-헥산디올 3.00 3.00 3.00
인지질 0.50 0.50 0.00
폴리글리세릴-6 올레이트 0.50 0.50 0.00
실시예 7 1.00 1.00 1.00
총 합 100.00 100.00 100.00
실험예 3: 안정성 평가
제조예 4에서 제조한 고형 분말 조성물 및 제조예 5에서 제조한 액상 폴리머좀 조성물에 대해 온도 조건에 따른 상 안정성 (변색, 변취, 상분리 여부 등)을 평가하고, 그 결과를 하기 [표 24]에 나타내었다.
[표 24]에서 보는 것과 같이, 고형 분말 조성물은 부형제로서 말토덱스트린과 이소말트를 함유하고, 안정화제로서 인지질을 함유하는 경우 안정한 것으로 확인되었고, 액상 폴리머좀 조성물은 타마린드씨 폴리사카라이드를 함유하고, 안정화제로서 인지질과 폴리글리세릴-6 올레이트를 함유하는 경우 안정한 것으로 확인되었다.
고형 분말 및 액상 폴리머좀 조성물의 안정성 평가 결과
구 분 1일 후 1주 후 2주 후 4주 후
실시예 18 상온 ◎ ◎ ◎ ◎
50℃ ◎ ◎ ◎ ◎
4℃ ◎ ◎ ◎ ◎
실시예 19 상온 ◎ ◎ ◎ ◎
50℃ ◎ ◎ ◎ ○
4℃ ◎ ◎ ◎ ◎
비교예 1 상온 ◎ ○ ○ ▲
50℃ ○ ▲ ▲ ▲
4℃ ◎ ○ ○ ○
비교예 2 상온 ○ ○ ▲ ▲
50℃ ○ ▲ ▲ ▲
4℃ ◎ ○ ○ ▲
실시예 20 상온 ◎ ◎ ◎ ◎
50℃ ◎ ◎ ◎ ◎
4℃ ◎ ◎ ◎ ◎
비교예 3 상온 ◎ ○ ▲ ▲
50℃ ◎ ★ ★ ★
4℃ ◎ ○ ▲ ▲
비교예 4 상온 ◎ ○ ▲ ★
50℃ ◎ ★ ★ ★★
4℃ ◎ ○ ▲ ▲
안정성 평가 기준 - ◎: 변화 없음, ○: 연한 황색 변화, ▲: 황색 변화 및 변취 발생, ★: 상분리 발생, ★★: 상분리 및 변색, 변취 발생
제조예 6: 유산균 사균체 및 배양물 함유 크림 화장료 제조
유화제조기(T.K. Homo Mixer Markll, Model 2.5, 3,000rpm, 75℃)를 이용하여 에멀젼 유화 공정으로 제조예 4에서 제조한 실시예 18의 고형 분말 소재로부터 크림 화장료를 제조하였다. 그 조성(중량비)은 하기 [표 25]와 같다.
크림 화장료의 조성
구분 구성 성분 실시예 21 (%) 비교예 5 (%)
수상 1. 정제수 To 100 To 100
2. EDTA-2Na 0.05 0.05
3. 글리세린 10.00 10.00
4. 1,3-부틸렌글라이콜 10.00 10.00
5. 니아신아마이드 2.00 2.00
6. 카보머 0.20 0.20
7. 잔탄검 0.05 0.05
유상 8. 세토스테아릴알코올 2.50 2.50
9. 아라키딜알코올, 베헤닐알코올, 아라키딜글루코사이드 2.00 2.00
10. 자기유화형 모모스테아린산글리세린 1.00 1.00
11. 하이드로제네이티드 폴리데센 5.00 5.00
12. 에칠헥실이소노나노에이트 5.00 5.00
13. 사이클로메치콘 5.00 5.00
첨가 12. 중화제 적량 적량
13. 향, 살균보존제 적량 적량
14. 실시예 18 3.00 0.00
실험예 4: 크림 화장료의 피부 보습력 평가
제조예 6에서 제조한 크림 화장료의 보습력을 다음과 같이 평가하였다. 수분 함유 시 교류 전류를 가했을 때 저항이 감소되는 원리를 이용한 야누스 프리미엄(파이㈜, 한국)의 수분측정기를 이용하여 시험자 팔의 전박을 물로 씻은 후 크림 화장료를 10 ㎕씩 2 ㎝ x 2 ㎝ 규격에 점적하고, 라텍스 장갑을 이용하여 잘 도말하여 도포한 다음, 도포 직후, 1시간 후, 2시간 후 각각 각질층 내의 수분 함량을 측정하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보는 것과 같이, 유산균 사균체와 배양물의 혼합 조성물을 함유하는 크림 화장료 (실시예 21)는 유산균 사균체와 배양물의 혼합 조성물을 함유하지 않는 크림 화장료 (비교예 5)에 비해 우수한 수분 함량 증가 및 보습력을 나타내었다.

Claims (6)

  1. 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (기탁번호: BP1910798), 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799) 및 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800)로 구성된 군에서 선택되는 유산균 1종 이상의 배양물을 포함하고, 항산화, 항염증, 보습 증진, 주름 개선 및 미백 개선을 통해 피부 노화를 방지 또는 개선하는 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (기탁번호: BP1910798), 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799) 및 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800)로 구성된 군에서 선택되는 유산균 1종 이상의 사균체를 더 포함하는 것인 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타룸 Wikim 125 (기탁번호: BP1910798)는 김치로부터 분리된 것인 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 (기탁번호: BP1910799) 및 락토바실러스 플란타룸 Wikim 127 (기탁번호: BP1910800)는 각각 양배추 또는 방울 양배추로 제조된 사우어크라우트로부터 분리된 것인 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유산균의 배양물은 유산균 배양용 배지에서 유산균을 배양하고 원심 분리하여 수득한 상등액을 동결 건조한 것인 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 유산균의 사균체는 유산균 배양용 배지에서 유산균을 배양하고 원심 분리한 후 침전된 세포를 열처리하여 얻은 것인 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
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