WO2019088421A1 - 녹차 유래 유산균을 포함하는 미세먼지에 의한 피부 세포 손상 케어용 조성물 - Google Patents

녹차 유래 유산균을 포함하는 미세먼지에 의한 피부 세포 손상 케어용 조성물 Download PDF

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fine dust
acid bacteria
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신승현
명길선
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(주)아모레퍼시픽
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Definitions

  • compositions for treating skin cell damage caused by fine dusts More specifically, a composition comprising a green tea-derived lactic acid bacterium which is capable of significantly inhibiting skin cell damage by significantly changing a biomarker, such as a skin cell gene whose expression level is changed by fine dust as compared with a normal skin cell, is disclosed .
  • Fine dusts are smaller in size than normal dusts, so they penetrate the human body more and contain harmful substances such as heavy metals, nitrates, ammoniums, and sulfates, and are harmful to human body.
  • harmful substances such as heavy metals, nitrates, ammoniums, and sulfates
  • the cells responsible for the immune function of the human body act to remove dust. These side effects are accompanied by inflammation.
  • the World Health Organization categorizes fine dusts as a group of carcinogens directly related to cancer.
  • Non-Patent Document 1 discloses that the expression amount of clodin 1 (CLDN 1), which is a major constituent of a tight junction as a granule layer barrier, is reduced due to fine dust stimulation of PM 2.5.
  • Lactic acid bacteria refers to bacteria that decompose saccharides such as glucose to produce lactic acid, and are also referred to as lactic acid bacteria. Lactic acid produced by lactic acid fermentation of lactic acid bacteria can inhibit the growth of pathogens and harmful bacteria, and such properties are used in the manufacture of foods such as dairy products, kimchi, and brewed foods. Lactic acid bacteria are also important bacteria used as enteric agents because they live in the intestines of mammals and prevent abnormal fermentation by germs.
  • Lactobacillus plantarum is a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus, and it is known that kimchi is fermented mainly and grows when it becomes sour.
  • the optical isomers of lactic acid to be produced are D type and L type.
  • Lactobacillus plantarum can be widely used in various food products requiring fermentation, so it is known about Lactobacillus plantarum which is excellent in acid resistance, bile acid function and antibacterial activity. However, the effect of strengthening skin barrier, damage of skin cells It is not known as an anti-pollution material.
  • Non-Patent Document 1 Kim, HJ, et al., "Transcriptome analysis of airborne PM 2.5 -induced detrimental effects on human keratinocytes", Toxicology Letters 273, 26-35,
  • a fine dust has a deleterious effect on the skin, and by this influence, it also affects the expression of a skin cell gene, and thus symptoms such as skin cell damage appear, and the effect of the green tea- Respectively.
  • the present invention provides a composition for care of damage of skin cells caused by fine dust comprising a green tea-derived lactic acid bacterium, a lysate thereof, a culture thereof, or an extract thereof.
  • the present invention provides a composition
  • a composition comprising, as an active ingredient, a green tea-derived lactic acid bacterium, a lysate thereof, a culture thereof, or an extract thereof as an active ingredient,
  • the skin caused by fine dusts regulating at least one expression level selected from the group consisting of the genes keratin 1 (KRT 1), claudin 1 (CLDN 1), claudin 4 (CLDN 4), and occludin (OCLN)
  • KRT 1 keratin 1
  • CLDN 1 claudin 1
  • CLDN 4 claudin 4
  • OCLN occludin
  • the amount of gene expression changed by the fine dust can be returned to a normal level and skin cell damage can be cared.
  • FIG. 1A shows an increase in the mRNA expression level of clodin 1 (CLDN 1) gene by treatment with a reference strain (strain) or a green tea-derived lactic acid bacterium in skin cells.
  • FIG. 1B shows that mRNA expression of CLDN4 gene is increased by treatment with lactic acid bacteria derived from a reference strain or green tea in skin cells.
  • FIG. 1c shows that mucin expression level of the occludin (OCLN) gene is increased by treatment with a reference strain (strain) or a green tea-derived lactic acid bacterium.
  • FIG. 1D shows that mRNA expression of keratin 1 (KRT 1) gene is increased by treatment with lactic acid bacteria derived from a reference strain (type strain) or green tea in skin cells.
  • FIG. 2A shows a decrease in mRNA expression of the CLD1 gene in ERM-CZ120 micropore-stimulated skin cells, showing a return to normal levels by treatment with lactic acid bacteria derived from green tea.
  • FIG. 2B shows that mRNA expression of CLDN4 gene was decreased in ERM-CZ120 micropore-stimulated skin cells and returned to normal level by treatment with lactic acid bacteria derived from green tea.
  • FIG. 2c shows the decrease in mRNA expression of the ocludin (OCLN) gene in the ERM-CZ120 micropore-stimulated skin cells, showing a return to a normal level by treatment with lactic acid bacteria derived from green tea.
  • OCLN ocludin
  • FIG. 2d shows a decrease in mRNA expression of the keratin 1 (KRT 1) gene in skin cells stimulated by ERM-CZ120 fine particles and shows a return to normal level by treatment with lactic acid bacteria derived from green tea.
  • the composition for care of skin damage caused by fine dusts may comprise, as an active ingredient, a green tea-derived lactic acid bacterium, a lysate thereof, a culture thereof, or an extract thereof.
  • green tea-derived lactic acid bacteria may mean lactic acid bacteria isolated from tea leaves, tea leaves, tea leaves, tea roots, or nearby soil.
  • it may mean lactic acid bacteria cultured and isolated from green tea which is a tea leaf.
  • strain of the strain may mean a product obtained by breaking the strain itself by chemical or physical force.
  • culture means a substance comprising all the substances contained in the medium in which the strain has been cultured, and means, for example, a substance or secretion, including the metabolites or secretions, And the strain itself may be contained in the culture.
  • extract may mean a product obtained by extracting a strain itself, a lysate of a strain, a culture thereof, or a mixture thereof with an extraction solvent.
  • the green tea lactic acid bacteria according to an embodiment of the present invention is obtained by isolating lactic acid bacteria among various components contained in the leaves of tea trees as described above and is applied to tight junctions of skin barrier, The effect of repairing damaged skin is excellent.
  • the green tea-derived lactic acid bacterium may be Lactobacillus sp . Lactic acid bacteria. Specifically, the green tea-derived lactic acid bacterium may be Lactobacillus plantarum . More specifically, the green tea-derived lactic acid bacterium may be Lactobacillus plantarum APsulloc 331266 KCCM 11181P.
  • the green tea-derived lactic acid bacteria may enhance the tight junction of the skin barrier, and in particular, Lactobacillus plantarum APsulloc 331266 ( Lactobacillus plantarum APsulloc 331266) may have the effect of restoring skin barrier damaged by fine dust have.
  • the active ingredient of the composition may be a green tea-derived lactic acid bacterin.
  • the composition may comprise from 0.000001 to 30% by weight, based on the total weight of the composition, of a green tea-derived lactic acid bacterium, a lysate thereof, a culture thereof, or an extract thereof.
  • a green tea-derived lactic acid bacterium a lysate thereof, a culture thereof, or an extract thereof.
  • the content is 0.000001 to 30% by weight, the skin care effect by fine dust caused by the green tea-derived lactic acid bacteria is excellent.
  • 0.0000001 wt% or more 0.0000005 wt% or more, 0.0000007 wt% or more, 0.0000009 wt% or more, 0.0000009 wt% or more, 0.000001 wt% or more, 0.000002 wt% or more, 0.000004 wt% or more, 0.000006 wt% or more, 0.000008 wt.
  • % 0.0000007 wt% or less, 0.0000005 wt% or less, 0.0000003 wt% or less, 0.0000002 wt% or less, 0.0000001 wt% or less, or 0.00000009 wt% or less.
  • the active ingredient of the composition according to the invention may be one which acts on the tight junction of the skin barrier.
  • Tight junctions are a type of cell junction, consisting of claudin, tricellulin, junctional adhesion molecule (JAM), zona occluden (ZO), and the like.
  • the tight junction can be divided into a part contained in the cell membrane and an intracellular part.
  • Occludin and claudin are closely related constitutive proteins contained in cell membranes.
  • Occludin is the first transmembrane protein found in adherent synapses and has four transmembrane domains.
  • Occludin is known to regulate the function of tight junctions as well as constituents of tight junctions.
  • Claudin a close-coupled conformational protein with Occludin, also has four transmembrane domains.
  • the tight junction is a cell-to-cell linkage that fills the gap between neighboring cells, controls the movement of small molecules, controls the permeation of cells between cells, and maintains the polarity of the cells. Recently, it has been reported that tight junctions play an important role in skin barrier function.
  • a tight junction is a type of intercellular binding. It is a cell-to-cell junction that mainly occurs in epithelial cells and endothelial cells, forming a complex network with a string-like structure. Adhesive joints largely have two functions from this structure. The first is a barrier function that prevents material from leaking into the cells that make up epithelial cells or endothelial cells. It is mainly treated in blood vessels and digestive tracts.
  • the second is a fence function, which is a function to divide the cell membrane around the membrane fence in the cell membrane lipid. Accordingly, the active ingredient of the composition according to the present invention acts on adhesion of the skin barrier to enhance the barrier function and the fence function of the skin cells, thereby protecting the skin damaged by the fine dust stimulation.
  • Another aspect of the present invention includes skin care care applications for fine dusts of the composition.
  • a method for skin damage care by a fine dust of a subject comprising the step of administering an effective amount of a green tea-derived lactic acid bacterium, a lysate thereof, a culture thereof, / RTI >
  • Another aspect of the present invention provides the use of a green tea-derived lactic acid bacterium, a lysate thereof, a culture thereof, or an extract thereof for preparing a composition for care of skin damage caused by fine dusts.
  • a green tea-derived lactic acid bacterium in another aspect of the present invention, there is provided a green tea-derived lactic acid bacterium, a lysate thereof, a culture thereof, or an extract thereof for skin damage care by fine dusts.
  • fine dust refers to a particulate matter that is a very small material that is invisible to the naked eye and that floats or drifts in the air for a long time.
  • the particle size of fine dust in the present invention may be not more than 10 ⁇ m (PM 10), specifically not more than 2.5 ⁇ m (PM 2.5).
  • Particulate matter having a particle diameter of not more than 2.5 ⁇ m (PM 2.5) is referred to as "ultrafine dust”.
  • fine dust is also intended to include “ultrafine dust”.
  • the fine dust in the present invention may include one or more of arsenic, cardmium, lead, and nickel.
  • the heavy metal components such as arsenic, cardmium, lead, and nickel are included in the fine dust to attack skin cells and cause skin allergy, pigmentation, inflammation, .
  • the fine dust includes arsenic, cardmium, lead, and nickel.
  • care means to effectively protect skin cells from stimulation and to inhibit, prevent, and restore (restore) the expression level of a specific gene by the stimulation.
  • repair also includes improving the expression level beyond the reference, in addition to changing the expression level closer to the reference level based on the gene expression level in the absence of the stimulus.
  • the present invention provides a composition for inhibiting damage of skin cells caused by fine dusts by controlling the expression level of a specific gene in skin cells damaged by fine dust to a normal level.
  • genes in the skin cells to which the expression amount by the fine dust is affected include keratin 1 (KRT 1), cladin 1 (CLDN 1), cladin 4 (CLDN 4), and occludin And at least one selected from the group. Since the keratin 1 (KRT 1), claudin 1 (CLDN 1), claudin 4 (CLDN 4), and occludin (OCLN) are genes whose expression amount is decreased by fine dusts, To inhibit skin cell damage.
  • composition according to the present invention may have a skin barrier enhancing effect or a skin barrier restorative effect.
  • Analysis of the expression level of the gene or protein can be performed using a microarray, PCR, NGS (Nest Generation Sequencing), Western blot, northern blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, tissue immuno staining, Can be analyzed using a variety of analytical methods known in the art.
  • Damage to the skin cells is caused by fine dust, which leads to inflammation and further damage to the skin cells.
  • the skin condition can be improved by taking care of the vicious cycle of the skin cell damage by the lactic acid bacteria derived from green tea.
  • the composition may be a cosmetic composition, a pharmaceutical composition, or a health functional food composition.
  • cosmetic composition examples include cosmetics such as various creams, lotion creams, lotions, skins, and the like, and cleansing, cleansing agents, soaps, and essences.
  • the cosmetic composition to which the composition containing the green tea-derived lactic acid bacteria of the present invention is added may take the form of a solution, an emulsion, a viscous mixture or the like.
  • the cosmetic of the present invention is not particularly limited in its formulation, and examples thereof include an emulsion, cream, lotion, essence, pack, gel, powder, makeup base, foundation, lotion, ointment, patch, Formulations such as foam, cleansing cream, cleansing water, body lotion, body cream, body oil, body essence, shampoo, rinse, body cleanser, soap, hair dye, spray and the like.
  • the components other than the above-mentioned lactic acid bacteria derived from green tea can be mixed and selected without difficulty by those skilled in the art depending on the formulation or use of the other cosmetic ingredients.
  • the cosmetic of the present invention may comprise a composition selected from the group consisting of water-soluble vitamins, oil-soluble vitamins, high molecular weight peptides, polymeric polysaccharides, sphingolipids and seaweed extracts.
  • the cosmetic composition of the present invention may contain, in addition to the above essential ingredients, other ingredients usually added to cosmetics, if necessary.
  • Examples of the compounding ingredients that may be added include organic solvents such as a preservative component, a moisturizer, an emollient, a surfactant, an organic and inorganic pigment, an organic powder, an ultraviolet absorbent, a preservative, a bactericide, an antioxidant, a plant extract, a pH adjuster, A blood circulation accelerator, a cold agent, an antiperspirant agent, and purified water.
  • organic solvents such as a preservative component, a moisturizer, an emollient, a surfactant, an organic and inorganic pigment, an organic powder, an ultraviolet absorbent, a preservative, a bactericide, an antioxidant, a plant extract, a pH adjuster, A blood circulation accelerator, a cold agent, an antiperspirant agent, and purified water.
  • the components to be added in addition to these components are not limited thereto, and any of the above components can be compounded within a range that does not impair the objects and effects of the present invention.
  • the pharmaceutical compositions comprising the green tea-derived lactic acid bacteria of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents conventionally used in the production of pharmaceutical compositions.
  • the pharmaceutical composition containing the green tea-derived lactic acid bacteria may be formulated into tablets, capsules, powders or syrups, or external preparations such as ointments, gels, creams, patches or sprays, And can be formulated and used in any form suitable for pharmaceutical preparations.
  • the actual dosage of the active ingredient administered by the pharmaceutical composition should be determined in light of various relevant factors such as the severity of the symptoms, the route of administration selected, the age, sex, weight and health status of the subject.
  • the dosage of the active ingredient may be from 0.0001 mg / kg / day to 3000 mg / kg / day, for example from 10 mg / kg / day to 500 mg / kg / day.
  • the health food is produced by using a raw material or a component (functional raw material) having a function useful for a nutrient or a human body which is likely to be deficient in a daily meal, Or to maintain or improve health through the activation of physiological functions.
  • a raw material or a component having a function useful for a nutrient or a human body which is likely to be deficient in a daily meal, Or to maintain or improve health through the activation of physiological functions.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the health food may be manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, and circles, but is not limited thereto and may be manufactured and processed in any form according to the law.
  • the health beverage composition has no particular limitation on the other ingredients other than the above-mentioned compounds as essential ingredients in the indicated ratios, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients such as ordinary beverages.
  • natural carbohydrates are conventional sugars such as monosaccharide polysaccharides, cyclodextrins and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • Natural flavors tau martin, stevia extract (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavors (saccharin, aspartame, etc.) can be used as flavorings other than those described above.
  • the actual dosage of the active ingredient administered by the health functional food composition should be determined in light of various relevant factors such as the severity of the symptoms, the selected route of administration, the age, sex, weight and health status of the subject .
  • the dosage of the active ingredient may be from 0.0001 mg / kg / day to 1000 mg / kg / day, for example from 0.02 mg / kg / day to 6 mg / kg / day.
  • tea leaves 200g are washed twice with primary distilled water to remove foreign matter. Shake off the water of the washed tea leaves and mix with the salt equivalent to 8% of the weight of the tea leaves and leave at room temperature for 3 hours.
  • Mixed tea leaves in 1000 mL of 1% fructose oligosaccharide solution and incubate in a 32 ° C incubator for 3 days. After 3 days, check if the pH of the culture has fallen below 5, and if it is below pH 5, take it and incubate in Difco Lactobacilli MRS Agar (R) medium. At this time, the culture is carried out in a chamber of anaerobic condition at 32 ° C for 2 days, and then a colony showing white colonies is taken.
  • R Difco Lactobacilli MRS Agar
  • Lactobacillus plantarum APsulloc 331266 Lactobacillus plantarum APsulloc 3312666 was isolated from tea leaves in the same manner as above.
  • the Lactobacillus plantarum APsulloc 331266 was deposited with the Korean Culture Center of Microorganisms on March 28,
  • APsulloc 331266 isolated in Example 1 is streaked onto MRS agar plates and incubated at 37 ° C for 2 days. A single colony obtained is inoculated into 10 mL of MRS broth and incubated overnight at 37 DEG C to prepare APsulloc 331266 culture.
  • the APsulloc 331266 culture prepared as described in (1) above was inoculated 0.5% in 10 mL of MRS broth and incubated overnight at 37 ° C. The culture was centrifuged at 8,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed to collect only the cells, followed by the addition of 2 mL of 0.85% saline buffer.
  • an API 50CHL kit Biomerieux
  • a suspension of the strain was added to 5 ml of the API suspension medium to measure the amount of suspension required to have a turbidity of about 2 McFarland Standard 2 (Biomerieux).
  • Two times the amount of the measured suspension was added to 10 mL of API 50CHL medium, and the mixture was shaken.
  • the mixture was placed in a cupule containing different substrates, and the mineral oil was dropped one by one.
  • the mixture was incubated at 37 ° C for 2 days, and the sugar fermentation pattern was analyzed.
  • APsulloc 331266 belonging to the Lactobacillus Planta room match degree (index%) of 99% appeared to Lactobacillus Planta room (Lactobacillus plantarum) or higher for.
  • APsulloc 331266 can be confirmed to be different strains with different properties of ⁇ -methyl-mannoside and raffinose in the standard strain (KCTC3108).
  • Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum
  • the isolated Lactobacillus plantarum APsulloc 33126 was cultivated in medium (MRS Broth) at 37 ° C for 24 hours.
  • the lactic acid bacteria were inoculated with skim milk, which was stored in a cryotube at 10% by weight.
  • the bacterial concentration in the liquid medium reached 5 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 9 CFU / mL
  • the nutrient cells were harvested by centrifugation at 4000 rpm at 4 ° C. and washed with PBS (phosphate buffered saline). Then, the washed cells were resuspended in PBS at a concentration of 5 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 9 CFU / mL and heated at 100 ° C. for 10 minutes to produce Lactobacillus plantarum deadis.
  • Keratinocyte cell line Human normal epidermal keratinocytes was Lonza ⁇ (Lonza, Inc. Walkersville, Maryland material) was purchased and subcultured in a culture under a CO 2 incubator (CO 2 incubator), 37 °C from, 5% CO 2 conditions Respectively.
  • Bovine pituitary extract (BPE), human epidermal growth factor (hEGF), insulin, hydrocortisone, gentamicin sulfate, and the like were added to 500 ml of KBM-2 (KBMTM-2, CC- (Gentamycin Suflate), Epinephrine, and Transferrin were used.
  • the fine dusts were ERM-CZ120 fine dusts commercially available from Sigma-Aldrich, and PM 10 levels of fine dust and arsenic, cardmium, lead, and nickel ).
  • a 6-well plate was used and 1 ' Cells cultured under the conditions of 3 ⁇ 10 5 cells / well (cells / well) were cultured in the untreated group (control 1), 50 ppm of fine dusts (Control group 2), a group treated with 1 ⁇ g / ml of Lactobacillus plantarum of Production Example 1 (Example 1), a group treated with 50 ppm of fine dust and 1 ⁇ g / ml of Lactobacillus plantarum of Production Example 1 Example 2), a group treated with 1 ⁇ ⁇ / ml of Lactobacillus plantarum (type strain) (Comparative Example 1), and treated with 50 ⁇ ppm of fine dust and 1 ⁇ ⁇ / ml of a lactobacillus plantarum-based strain Group (Comparative Example 2).
  • the type strain of Lactobacillus plantarum was obtained from the BRC and deposited with deposit number KCTC3108.
  • Control 1 Control 2, Example 1, and Comparative Example 1 obtained from fine dust and Lactobacillus plantarum treatment on keratinocyte cell line and cells were treated with 2 ml of phosphate buffered saline (PBS) After washing, RNA was isolated from the cells using a trizol reagent (Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA).
  • PBS phosphate buffered saline
  • RNA kit QIAGEN RNeasykt, QIAGEN, Valencia, Calif.
  • Agilent Technologies, Inc. Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, ) was used to confirm the quality of the RNA.
  • CDNA was synthesized from RNA using Invitrogen's Reverse Kit (Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, Calif.).
  • Q-RT-PCR real-time reverse transcription polymerase chain reaction
  • the change in gene expression pattern was evaluated by real-time PCR using the TaqMan gene expression assay kit (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) Of Applied Biosystems Inc., As shown in Fig. 2C.
  • Both Q-RT-PCR and real-time PCR were performed according to the standard protocols distributed by Life Technologies. Specifically, the Q-RT-PCR was performed at 95 ° C for 20 seconds, followed by 95 ° C for 3 seconds and 60 ° C for 30 seconds For 40 cycles.
  • Example 1 mRNA expression levels of Claudin 1, Claudin 4, Occludin, and Keratin 1 were increased compared to the control 1 there was.
  • lactic acid bacteria derived from green tea of the present invention had a skin barrier repair effect damaged by fine dusts in a single treatment.
  • Example 2 and Comparative Example 2 mRNA expression levels of Keratin 1, Claudin 1, Claudin 4, and Occludin were improved compared to the control 2 .
  • the amount of keratin 1 mRNA expression was 0.41
  • the amount of mRNA expression of cladin 1 was 0.57
  • the amount of mRNA expression of clad4 4 was 0.50
  • the expression level of occludin mRNA was 0.42
  • the amount of mRNA expression of keratin 1 decreased by Lactobacillus plutarum treatment of Preparation Example 1 was 1.01
  • the amount of mRNA expression of reduced clad 1 was 0.73
  • the amount of mRNA expression of reduced clad 4 was 1.18
  • the amount of mcRNA expression of ocurudin was restored to 0.79.
  • the mRNA expression level of keratin 1 was 0.51
  • the mRNA expression level of cladin 1 was 0.53
  • the mRNA expression level of cladin 4 was 0.60
  • the mRNA expression level of occludin was 0.51.
  • mRNA changes were not significant. Therefore, it was confirmed that the reference strain had no effect of restoring the reduced mRNA expression level of the markers.
  • the cosmetic composition, the pharmaceutical composition and the health functional food composition can be applied to various formulations, and the present invention is not limited thereto .
  • Lactobacillus plantarum lactobacillus 100 mg, lactose 400 mg, corn starch 400 mg and magnesium stearate 2 mg were mixed according to the examples of the present invention, and tablets were prepared by tableting according to a conventional method for preparing tablets.
  • Lactobacillus plantarum lactic acid bacteria 100 Lactose 400 Corn starch 400 Magnesium stearate 2
  • 100 mg of lactobacillus plantarum lactic acid bacteria, 400 mg of lactose, 400 mg of corn starch and 2 mg of magnesium stearate according to the present invention were mixed and filled in gelatin capsules according to the conventional preparation method of capsules to prepare capsules.
  • Lactobacillus plantarum lactic acid bacteria 100 Lactose 400 Corn starch 400 Magnesium stearate 2
  • Lactobacillus plantarum lactic acid bacteria 50 mg of Lactobacillus plantarum lactic acid bacteria, 250 mg of anhydrous crystalline glucose and 550 mg of starch according to the present invention were mixed and formed into granules by using a fluidized bed granulator, and then filled into bubbles.
  • Lactobacillus plantarum lactic acid bacteria 5.00 maintain Suitable amount Sodium hydroxide Suitable amount Sodium chloride Suitable amount Spices Suitable amount Purified water Balance
  • Lactobacillus plantarum lactic acid bacteria 5.00
  • L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium salt 1.00
  • Water soluble collagen 1.00
  • Sodium citrate 0.10
  • Citric acid 0.05
  • Licorice extract 0.20 1,3-butylene glycol 3.00 Purified water Balance
  • Lactobacillus plantarum lactic acid bacteria 3.00 Polyethylene glycol monostearate 2.00 Self emulsifying monostearic acid glycerin 5.00 Cetyl alcohol 4.00 Squalene 6.00 Tri-2-ethylhexanoic acid glyceryl 6.00 Sphingoglycolipids 1.00 1,3-butylene glycol 7.00 Purified water Balance
  • Lactobacillus plantarum lactic acid bacteria 3.00 Hydroxyethylene cellulose (2% aqueous solution) 12.00 Xanthan gum (2% aqueous solution) 2.00 1,3-butylene glycol 6.00 Concentrated glycerin 4.00 Sodium hyaluronate (1% aqueous solution) 2.00 Purified water Balance
  • Vitamin A acetate 70 ⁇ g Vitamin E 1.0 mg Vitamin B1 0.13 mg Vitamin B2 0.15 mg Vitamin B6 0.5 mg Vitamin B12 0.2 ⁇ g Vitamin C 10 mg Biotin 10 ⁇ g Nicotinic acid amide 1.7 mg Folic acid 50 ⁇ g Calcium pantothenate 0.5 mg Ferrous sulfate 1.75 mg Zinc oxide 0.82 mg Magnesium carbonate 25.3 mg Potassium monophosphate 15 mg Dicalcium phosphate 55 mg Potassium citrate 90 mg Calcium carbonate 100 mg Magnesium chloride 24.8 mg
  • Lactobacillus plantarum lactic acid bacteria 50 mg Citric acid 1000 mg oligosaccharide 100 g Taurine 1g Purified water Balance

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Abstract

본 명세서에는 녹차 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서, 미세먼지에 의해 발현량이 영향을 받는 피부 세포 내 유전자인 케라틴 1(KRT 1), 클라우딘 1(CLDN 1), 클라우딘 4(CLDN 4), 및 오클루딘(OCLN)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현량을 정상 수준으로 조절하는 미세먼지에 의한 피부 손상 케어용 조성물이 개시된다. 본 발명에 의한 조성물을 이용함으로써, 미세먼지에 의해 변화되는 유전자 발현량을 정상 수준으로 되돌려 피부 세포의 손상을 케어할 수 있다.

Description

녹차 유래 유산균을 포함하는 미세먼지에 의한 피부 세포 손상 케어용 조성물
본 명세서에는 미세먼지에 의한 피부 세포 손상을 케어하는 조성물이 개시된다. 보다 상세하게, 정상 상태의 피부 세포와 비교하여 미세먼지에 의해 발현 정도가 변화되는 피부 세포 유전자인 바이오마커 등을 유의미하게 변화시켜서 피부 세포 손상을 케어하는, 녹차 유래 유산균을 포함하는 조성물이 개시된다.
최근 환경적인 이슈로 미세먼지에 대한 관심이 높아지고 폴루션 시장이 확대되고 있다. 미세먼지는 일반적인 황사 등에 비하여 더 작은 크기의 입자를 갖기 때문에 인체에 더 잘 침투되며, 중금속, 질산염, 암모늄, 황산염 등의 유해물질을 더 많이 포함하고 있어서 인체에 유해하다. 미세먼지가 우리 몸 속으로 들어오면 인체의 면역을 담당하는 세포가 먼지를 제거하는 작용을 한다. 이 때의 부작용으로 염증을 수반하며, 이에 더하여 세계보건기구에서는 미세먼지를 암과 직접적인 관계가 있는 발암물질 1군으로 분류하고 있는 실정이다.
미세먼지는 호흡기뿐만 아니라 피부나 모낭으로도 침투되어서 피부트러블이나 탈모를 일으키는 것으로 예상되나, 어떻게 피부와 모발에 부정적 영향을 끼치는지에 대한 기전 및 타겟 연구는 미비한 수준에 그치고 있으며, 이에 따라 문제점을 해결하기 위한 안티폴루션 소재에 대한 연구 또한 진행되고 있지 않다.
비특허문헌 1은 과립층 장벽인 밀착연접(tight junction)의 주요 구성성분인 클라우딘 1(CLDN 1)의 발현량이 PM 2.5의 미세먼지 자극으로 인하여 감소하였음을 개시하고 있다.
유산균은 글루코오스 등 당류를 분해하여 락트산(lactic acid)을 생성하는 세균을 가리키며, 젖산균이라고도 한다. 유산균의 락트산 발효에 의해 생성되는 락트산은 병원균과 유해 세균의 생육을 저지할 수 있으며, 이러한 성질은 유제품, 김치류, 양조 식품 등의 식품 제조에 이용되고 있다. 또한 유산균은 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상 발효를 방지하므로 정장제(整腸劑)로도 이용되는 중요한 세균이다.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 유산균에 속하는 균주로 주로 김치의 발효가 많이 진행되어 신맛이 날 때 생장한다고 알려져 있다. 생성하는 락트산의 광학이성체는 D형과 L형이다. 락토바실러스 플란타룸은 발효가 필요한 각종 식품에 널리 이용될 수 있으므로, 내산성능, 내담즙산능 및 항균력이 우수한 락토바실러스 플란타룸에 관하여는 알려져 있지만, 피부 장벽을 강화시키는 효능, 피부 세포의 손상을 복구하는 효능 등의 안티폴루션 소재로는 알려져 있지 않다.
선행기술문헌
비특허문헌
(비특허문헌 1) Kim, H.J., et al, "Transcriptome analysis of airborne PM2.5-induced detrimental effects on human keratinocytes", Toxicology Letters 273, 26-35, 2017.
이에 본 발명자는 미세먼지가 피부에 유해한 영향을 미치며, 이러한 영향에 의하여 피부 세포 유전자의 발현에도 영향을 미침으로써 피부 세포 손상 등과 같은 증상이 나타나며, 녹차 유래 유산균이 유전자의 발현을 복구시키는 효과가 있다는 것을 확인 하였다.
따라서, 일 측면에서 본 발명은 녹차 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물을 포함하는 미세먼지에 의한 피부 세포의 손상 케어용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 일 측면에서, 본 발명은 녹차 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서, 미세먼지에 의해 발현량이 영향을 받는 피부 세포 내 유전자인 케라틴 1(KRT 1), 클라우딘 1(CLDN 1), 클라우딘 4(CLDN 4), 및 오클루딘(OCLN)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현량을 정상 수준으로 조절하는 미세먼지에 의한 피부 손상 케어용 조성물을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명에 의해 제공되는 미세먼지에 의한 피부 손상 케어용 조성물을 이용함으로써, 미세먼지에 의해 변화되는 유전자 발현량을 정상 수준으로 되돌려 피부 세포의 손상을 케어할 수 있다.
도 1a는 피부 세포 내에서 기준 균주(type strain) 또는 녹차 유래 유산균 처리에 의해 클라우딘 1(CLDN 1) 유전자의 mRNA 발현량이 증가함을 나타낸 것이다.
도 1b는 피부 세포 내에서 기준 균주(type strain) 또는 녹차 유래 유산균 처리에 의해 클라우딘 4(CLDN 4) 유전자의 mRNA 발현량이 증가함을 나타낸 것이다.
도 1c는 피부 세포 내에서 기준 균주(type strain) 또는 녹차 유래 유산균 처리에 의해 오클루딘(OCLN) 유전자의 mRNA 발현량이 증가함을 나타낸 것이다.
도 1d는 피부 세포 내에서 기준 균주(type strain) 또는 녹차 유래 유산균 처리에 의해 케라틴 1(KRT 1) 유전자의 mRNA 발현량이 증가함을 나타낸 것이다.
도 2a는 ERM-CZ120 미세먼지에 의해 자극된 피부 세포 내에서 클라우딘 1(CLDN 1) 유전자의 mRNA 발현량이 감소 하였고, 녹차 유래 유산균 처리에 의해 정상 수준으로 되돌아감을 나타낸 것이다.
도 2b는 ERM-CZ120 미세먼지에 의해 자극된 피부 세포 내에서 클라우딘 4(CLDN 4) 유전자의 mRNA 발현량이 감소 하였고, 녹차 유래 유산균 처리에 의해 정상 수준으로 되돌아감을 나타낸 것이다.
도 2c는 ERM-CZ120 미세먼지에 의해 자극된 피부 세포 내에서 오클루딘(OCLN) 유전자의 mRNA 발현량이 감소 하였고, 녹차 유래 유산균 처리에 의해 정상 수준으로 되돌아감을 나타낸 것이다.
도 2d는 ERM-CZ120 미세먼지에 의해 자극된 피부 세포 내에서 케라틴 1(KRT 1) 유전자의 mRNA 발현량이 감소 하였고, 녹차 유래 유산균 처리에 의해 정상 수준으로 되돌아감을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 미세먼지에 의한 피부손상 케어용 조성물은 녹차 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "녹차 유래 유산균"이란, 차나무 잎, 차나무 꽃, 차나무 줄기, 차나무 뿌리, 또는 인근 토양 등으로부터 분리된 유산균을 의미할 수 있다. 예컨대, 차나무 잎인 녹차로부터 배양, 분리된 유산균을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 "균주 파쇄물"이란, 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 "배양물"이란, 균주를 배양한 배지 내에 포함되어 있는 모든 물질을 포함하는 물질을 의미할 수 있으며, 예컨대 균주 배양의 결과물인 대사물 또는 분비물을 포함하는 물질 또는 그 파쇄물을 의미할 수 있고 균주 자체도 배양물 내에 포함되어 있을 수 있다.
본 명세서에서, "추출물"이란, 균주 자체, 균주의 파쇄물, 그 배양물 또는 이들의 혼합물을 추출용매를 이용하여 추출한 산물을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 녹차 유산균은 상기와 같은 차나무의 잎에 함유된 여러 성분 중 유산균을 분리한 것으로서, 미세먼지에 의하여 손상된 피부에, 구체적으로 피부장벽의 밀착연접(tight junction)에 적용시 손상된 피부를 복구하는 효능이 매우 우수하다.
일 측면에서, 상기 녹차 유래 유산균은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp .) 유산균일 수 있다. 구체적으로, 상기 녹차 유래 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 녹차 유래 유산균은 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331266(Lactobacillus plantarum APsulloc 331266) KCCM11181P 일 수 있다. 상기 녹차 유래 유산균은 피부장벽의 밀착연접(tight junction)을 강화시킬 수 있으며, 특히 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331266(Lactobacillus plantarum APsulloc 331266) KCCM11181P은 미세먼지에 의하여 손상된 피부 장벽을 복구하는 효과를 가질 수 있다.
일 측면에서, 상기 조성물의 유효성분은 녹차 유래 유산균 사멸체일 수 있다.
본 발명의 일 관점인, 조성물에 있어서, 상기 조성물은 녹차 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물을, 조성물 총 중량을 기준으로 0.000001 내지 30중량%로 포함할 수 있다. 그 함량이 0.000001 내지 30중량%인 경우, 녹차 유래 유산균에 의한 미세먼지에 의한 피부 손상 케어 효과가 우수하였다.
구체적으로, 0.0000001 중량% 이상, 0.0000005 중량% 이상, 0.0000007 중량% 이상, 0.0000009 중량% 이상, 0.000001 중량% 이상, 0.000002 중량% 이상, 0.000004 중량% 이상, 0.000006 중량% 이상, 0.000008 중량% 이상, 0.00001 중량% 이상, 0.00003 중량% 이상, 0.00005 중량% 이상, 0.00007 중량% 이상, 0.00009 중량% 이상, 0.0001 중량% 이상, 0.0003 중량% 이상, 0.0005 중량% 이상, 0.0007 중량% 이상, 0.0009 중량% 이상, 0.001 중량% 이상, 0.01 중량% 이상, 0.1 중량% 이상, 1 중량% 이상, 3 중량% 이상, 5 중량% 이상, 7 중량% 이상, 9 중량% 이상, 10 중량% 이상, 13 중량% 이상, 15 중량% 이상, 17 중량% 이상, 19 중량% 이상, 21 중량% 이상, 23 중량% 이상, 25 중량% 이상, 27 중량% 이상, 29 중량% 이상, 30 중량% 이상, 31 중량% 이상일 수 있고, 32 중량% 이하, 31 중량% 이하, 30 중량% 이하, 29 중량% 이하, 28 중량% 이하, 26 중량% 이하, 24 중량% 이하, 22 중량% 이하, 20 중량% 이하, 18 중량% 이하, 16 중량% 이하, 14 중량% 이하, 12 중량% 이하, 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 6 중량% 이하, 4 중량% 이하, 2 중량% 이하, 1 중량% 이하, 0.1 중량% 이하, 0.09 중량% 이하, 0.04 중량% 이하, 0.01 중량% 이하, 0.006 중량% 이하, 0.001 중량% 이하, 0.0009 중량% 이하, 0.0007 중량% 이하, 0.00005 중량% 이하, 0.00003 중량% 이하, 0.00001 중량% 이하, 0.000009 중량% 이하, 0.000007 중량% 이하, 0.000005 중량% 이하, 0.000003 중량% 이하, 0.000001 중량% 이하, 0.0000009 중량% 이하, 0.0000007 중량% 이하, 0.0000005 중량% 이하, 0.0000003 중량% 이하, 0.0000002 중량% 이하, 0.0000001 중량% 이하, 0.00000009 중량% 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 측면에서, 본 발명에 따른 조성물의 유효 성분은 피부 장벽의 밀착연접(tight junction)에 작용하는 것일 수 있다.
밀착연접(tight junction)은 세포연접의 한 종류로 occluding, claudin, tricellulin, junctional adhesion molecule(JAM), zona occluden(ZO) 등으로 구성되어 있다. 밀착연접은 세포막에 포함된 부분과 세포내 부분으로 나눌 수 있다. Occludin과 claudin은 세포막에 포함된 밀착연접 구성 단백질이다. Occludin은 밀착연접에서 처음으로 발견된 막관통 단백질로 4개의 막관통 영역을 가지고 있다. Occludin은 밀착연접의 구성 성분일 뿐만 아니라 밀착연접의 기능을 조절하는 것으로 알려졌다. Occludin과 함께 밀착연접 구성 단백질인 claudin도 4개의 막관통 영역을 가지고 있다. 밀착연접은 세포 간의 연결고리로 이웃한 세포와 세포 사이의 간격을 메워주고 작은 물질들의 이동을 조절하는 기능을 하며, 세포와 세포 간의 물질투과를 조절하고 세포의 극성을 유지하는 역할도 담당한다. 최근, 연구결과를 통해 밀착연접이 피부 장벽 기능에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다고 보고되었다. 밀착연접(tight junction)은 세포간 결합양식의 일종이다. 주로 상피세포와 내피세포에서 나타나는 세포간 연접으로서, 끈모양 구조를 갖는 복잡한 네트워크(network)를 형성한다. 밀착연접은 이러한 구조로부터 크게 두가지 기능을 갖는다. 첫째는 격벽(barrier)기능으로, 상피세포나 내피세포를 구성하는 세포 사이로 물질의 누출을 방지한다. 주로 혈관이나 소화관에서 중요하게 다루어진다. 둘째는 울타리기능으로, 세포막 지질에서 끈모양 울타리를 둘러 세포막을 구획하는 기능이다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물의 유효 성분은 피부 장벽의 밀착연접에 작용하여 피부 세포의 격벽 기능 및 울타리 기능을 강화시켜 미세먼지 자극에 의하여 손상된 피부를 케어할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 조성물의 미세먼지에 의한 피부 손상 케어 용도를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에서, 대상의 미세먼지에 의한 피부 손상 케어를 위한 방법으로서, 상기 방법은 녹차 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서 미세먼지에 의한 피부 손상 케어를 위한 조성물을 제조하는데 있어서의 녹차 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서 미세먼지에 의한 피부 손상 케어를 위한 녹차 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 "미세먼지"라 함은, 우리 눈에 보이지 않는 아주 작은 물질로 대기 중에 오랫동안 떠다니거나 흩날리는 입자상의 물질을 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서 미세먼지의 입자 크기는 입경 10μm 이하(PM 10), 구체적으로 입경 2.5μm 이하(PM 2.5)일 수 있다. 특히 입경이 2.5μm(PM 2.5) 이하인 입자상의 물질은 "초미세먼지"라 하는데, 본 명세서에서 "미세먼지"는 "초미세먼지"도 포함하는 것으로 의도된다.
일 측면에서, 본 발명에서 미세먼지는 비소(arsenic), 카드뮴(cardmium), 납(lead), 및 니켈(nikel) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 비소(arsenic), 카드뮴(cardmium), 납(lead), 및 니켈(nikel) 등의 중금속 성분은 미세먼지에 함께 포함되어 피부 세포를 공격해 피부 알러지, 색소 침착, 염증 등을 일으켜 피부노화를 유발시킬 수 있다. 일 실시예에서, 상기 미세먼지는 비소(arsenic), 카드뮴(cardmium), 납(lead), 및 니켈(nikel)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어"케어"라 함은, 자극으로부터 피부 세포를 효과적으로 보호하고, 상기 자극에 의하여 특정 유전자의 발현량이 변화하는 것을 억제, 방지, 복구(복원)시키는 것을 의미한다. 여기서, "복구"는 자극이 없는 경우의 유전자 발현량을 기준으로 할 때, 발현량을 상기 기준에 가깝게 변화시키는 것 외에도 상기 기준 이상으로 발현량을 향상시키는 것을 또한 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 미세먼지에 의해 손상된 피부 세포에서 특정 유전자의 발현량을 정상 수준으로 조절함으로써, 미세먼지에 의한 피부 세포의 손상을 억제하는 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 미세먼지에 의해 발현량이 영향을 받는 피부 세포 내 유전자로는 케라틴 1(KRT 1), 클라우딘 1(CLDN 1), 클라우딘 4(CLDN 4), 및 오클루딘(OCLN)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 케라틴 1(KRT 1), 클라우딘 1(CLDN 1), 클라우딘 4(CLDN 4), 및 오클루딘(OCLN)은 미세먼지에 의해 발현량이 감소하는 유전자이므로, 이들 유전자의 발현량을 증가시켜 정상 수준으로 조절함으로써 피부 세포의 손상을 억제할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명에 따른 조성물은 피부 장벽 강화 효능 또는 피부 장벽 복구 효능을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용되는, 미세먼지에 의해 발현량이 변화하는 유전자가 아래 [표 1]에 제시되어 있다. [표 1]은 미세먼지에 의해 발현량이 감소되는 유전자를 나타내는 것이며, 이들 표에서 Gene Symbol은 공식 유전자 심볼을 의미하며, Gene title은 각 유전자의 이름을 의미한다. 이러한 내용은 비특허문헌 1에 기재를 통하여 확인할 수 있다.
감소 유전자
GeneSymbol Gene title
KRT 1 Keratin 1
CLDN 1 Claudin 1
CLDN 4 Claudin 4
OCLN Occludin
상기 유전자 또는 단백질의 발현량 분석은 마이크로어레이, PCR, NGS(Nest Generation Sequencing; 차세대 염기서열분석), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 등 당업계에 공지된 다양한 분석 방법을 이용하여 분석될 수 있다.
미세먼지에 의해 피부 세포의 손상이 일어나며, 이 때 염증이 유도되어 다시 피부 세포의 손상이 추가로 일어나게 된다. 이렇게 피부 세포 손상의 악순환을 녹차 유래 유산균이 케어함으로써 피부 상태를 개선시킬 수 있게 된다.
본 발명의 일 관점인, 상기 조성물은, 화장료 조성물일 수 있고, 약학적 조성물일 수 있으며, 건강기능식품 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은, 예컨대, 각종 크림, 로션 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품 류와 클렌징, 세안제, 비누, 미용액 등이 있다.
일 측면에서, 본 발명의 상기 녹차 유래 유산균을 함유하는 조성물이 첨가된 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.
즉, 일 측면에서 본 발명의 화장료는 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 에센스, 팩, 젤, 파우더, 메이크업 베이스, 파운데이션, 로션, 연고, 패취, 미용액, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징워터, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 샴푸, 린스, 바디세정제, 비누, 염모제, 분무제 등과 같은 제형을 들 수 있다.
각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기 녹차 유래 유산균 이외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
또한, 일 측면에서 본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.
이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.
일 측면에서, 본 발명의 녹차 유래 유산균을 포함하는 약학적 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
그 제형으로는, 상기 녹차 유래 유산균을 포함하는 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 정제, 캡슐, 산제 또는 시럽 등의 경구제, 또는 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제 등의 외용제 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용할 수 있다.
일반적으로 상기 약학적 조성물에 의해 투여되는 유효성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로 유효성분의 투여량은 0.0001mg/kg/일 내지 3000mg/kg/일, 예를 들어 10 mg/kg/일 내지 500mg/kg/일 일 수 있다.
본 발명의 일 관점인 건강 기능식품 조성물에서, 건강식품은, 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분(기능성원료)을 사용하여 제조한 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 건강식품은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조, 가공될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 법률에 따라 어떤 형태로든지 제조, 가공될 수 있다.
구체적으로, 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드 폴리사카라이드, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
일반적으로 상기 건강 기능식품 조성물에 의해 투여되는 유효성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로 유효성분의 투여량은 0.0001mg/kg/일 내지 1000mg/kg/일, 예를 들어 0.02 mg/kg/일 내지 6mg/kg/일 일 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[제조예 1] 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) APsulloc 331266
1. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) APsulloc 331266의 배양 및 분리
차나무 잎 200g을 1차 증류수에 2회 세척하여 이물질을 제거한다. 세척한 차나무 잎의 물기를 털어내고 차나무 잎 중량의 8%에 해당하는 식염과 혼합한 후 3시간 동안 실온에 방치한다. 식염에 절여진 차나무 잎을 1% 프락토 올리고당 용액 1000 mL에 혼합한 후 3일간 32℃ 인큐베이터에서 배양한다. 3일 후 배양액의 pH가 5 미만으로 떨어졌는지 확인하고 pH 5 미만인 경우 이를 취해 디프코 락토바실리 MRS 아가®(Difco Lactobacilli MRS Agar®) 배지에 배양한다. 이때 배양은 32℃, 혐기 조건의 챔버에서 2일간 배양한 후 백색 집락을 보이는 콜로니를 취한다.
위와 같은 방법으로 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331266(Lactobacillusplantarum APsulloc 331266)을 차나무 잎으로부터 분리하였다. 상기 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331266(Lactobacillus plantarum APsulloc 331266)은 2011년 3월 28일 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 미생물 기탁번호 KCCM11181P로 기탁하였다.
2. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillusplantarum) APsulloc 331266의 동정
(1) 균주의 배양
실시예 1에서 분리한 APsulloc 331266을 MRS 아가 플레이트에 도말(streaking)하고 37℃에서 2일간 배양한다. 얻은 단일 콜로니(single colony)를 MRS 브로쓰(broth) 10mL에 접종하고 다시 37℃에서 밤새 배양하여 APsulloc 331266 배양액을 제조한다.
(2) APsulloc 331266의 당 발효 패턴 분석
상기 (1)과 같이 제조한 APsulloc 331266 균주 배양액을 MRS 브로쓰 10mL에 0.5% 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 8,000 rpm에서 5분간 원심 분리하고 상등액을 제거하여 균체만 모은 후, 0.85% 완충 식염수(saline buffer)를 2mL 첨가하여 현탁하였다. 이후 API 50CHL 키트(Biomerieux)를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 진행하였다. 그 구체적인 내용은 아래와 같다.
먼저 API 현탁 미디움(medium) 5mL에 균주의 현탁액을 조금씩 넣으면서 맥파랜드 기준 2(McFarland Standard 2)(Biomerieux) 정도의 탁도가 되는데 필요한 현탁액 량을 측정하였다. 측정된 현탁액 량의 2배를 API 50CHL 미디움 10mL에 넣은 후 흔들어 섞어주었다. 각기 다른 기질이 들어있는 쿠풀(cupule)에 상기 혼합물을 넣은 후, 미네랄 오일을 한방울씩 떨어뜨리고 37℃에서 2일간 배양한 다음, 당 발효 패턴을 분석하였다.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillusplantarum) 균주(KCTC3108)를 표준 균주로 하여 비교한 APsulloc 331266의 당 발효 패턴 결과 및 그 결과를 이용한 APsulloc 331266의 동정 결과는 아래 표와 같다.
기질 KCTC3108 APsulloc 331266 기질 KCTC3108 APsulloc 331266
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
대조군 - - - - 에세쿨린 + + + +
글리세롤 - - - - 살리신 + + + +
에리스리톨 - - - - 셀로비오스 ? + + +
D-아라비노스 - - - - 말토스 + + + +
L-아라비노스 + + + + 락토스 + + + +
리보스 + + + + 멜리비오스 + + + +
D-자일로스 - - - - D-사카로스 (수크로스) + + + +
L-자일로스 - - - - 트레할로스 + + + +
아도니톨 - - - - 이눌린 - - - -
β-메틸-D-자일로스 - - - - 멜레치토스 + + + +
갈락토스 + + + + 라피노스 - - + +
글루코스 + + + + 아미돈(전분) - - - -
프럭토스 + + + + 글리코겐 - - - -
만노스 + + + + 자일리톨 - - - -
소르보스 - - - - 겐티오비오스 - - + +
람노스 - - - - D-튜라노스 + + + +
덜시톨 - - - - D-릭소스 - - - -
이노시톨 - - - - D-타가토스 - - - -
만니톨 + + + + D-퓨코스 - - - -
소르비톨 + + + + L-퓨코스 - - - -
α-메틸-D-만노사이드 ? + - - D-아라비톨 ? - - -
α-메틸-D-글루코사이드 - - - - L-아라비톨 - - - -
N-아세틸-글루코사민 + + + + 글루콘산 ? + + +
아미그달린 + + + + 2-케토글루코네이트 - - - -
알부틴 + + + + 5-케토글루코네이트 - - - -
+: 기질 분해, -: 해당 기질을 분해하지 못 함, ?: 판정 불가
균주 종속명 % 인덱스 T 인덱스
KCTC 락토바실러스 플란타룸 99.9 0.8
3108 락토바실러스 펜토수스 0.1 0.29
APsulloc 331266 락토바실러스 플란타룸 99.4 0.99
락토바실러스 펜토수스 0.4 0.71
상기에서 볼 수 있듯이, APsulloc 331266은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillusplantarum)에 대한 일치도(% index)가 99% 이상으로 나타나 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에 속하는 것을 알 수 있다. 또한 APsulloc 331266은 표준 균주(KCTC3108)와 α-메틸-만노사이드(mannoside) 및 라피노스(raffinose) 이용 성질이 달라 서로 다른 균주임을 확인할 수 있다.
3. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillusplantarum) APsulloc 331266 사멸체 제조
분리 동정한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillusplantarum) APsulloc 33126을 배지(MRS Broth)에서 37℃ 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 여기서, 유산균은 탈지유(Skim milk)에 10중량%로 크라이오튜브(Cryotube)에서 보관한 것을 접종한 것이다. 액체 배지 내 균 농도가 5 X 108 ~ 1 X 109 CFU/mL가 되었을 때, 4℃에서, 4000 rpm 원심 분리를 통하여 영양세포를 수확하고 PBS(phosphate buffered saline)으로 균체를 세척하였다. 그런 뒤 세척한 균체를 PBS에 5 X 108 ~ 1 X 109 CFU/mL의 농도로 재분산(resuspension)시키고 100℃에서 10분간 가열하여 락토바실러스 플란타룸 사멸체를 제조하였다.
[실험예 1] 실시간 qPCR 정량을 통한 유전자 발현량 측정 실험
1. 각질형성세포주의 배양
각질형성세포주(Human normal epidermal keratinocytes)는 론자 社(Lonza, Inc. 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재)에서 구입하여 계대배양한 후 CO2 배양기(CO2 incubator)에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 500ml의 KBM-2(KBMTM-2, CC-3103) 배지에 BPE(Bovine pituitary extract), 인간표피 성장인자(human epidermal growth factor, hEGF), 인슐린(Insulin), 하이드로코티손(Hydrocortisone), 젠타마이신 설페이트(Gentamycin Suflate), 에피네프린(Epinephrine), 트랜스페린(Transferrin)을 포함한 배양액을 사용하였다.
배양시 최대 90% 정도의 컨플루언시(confluency)를 유지하였으며, 그 이후에는 계대배양(subcultivation)하였다.
2. 각질형성세포주에 미세먼지 및 락토바실러스 플란타룸 처리
미세먼지는 시그마-알드리치 社(Sigma-Aldrich)에서 시판하는 ERM-CZ120 미세먼지를 사용하였으며, PM 10 수준의 미세먼지와 비소(arsenic), 카드뮴(cardmium), 납(lead), 및 니켈(nikel)을 포함하고 있다.
6-웰 플레이트를 사용하였고 '1. 각질형성세포주의 배양'에서의 세포배양조건으로 3 Х 105 세포수/웰(cells/well)인 조건으로 배양한 세포주에 각각 대조군으로 미처리군(대조군 1), 미세먼지를 50 ppm 처리한 군(대조군 2), 제조예 1의 락토바실러스 플란타룸 1 ㎍/ml 처리한 군(실시예 1), 미세먼지 50 ppm 및 제조예 1의 락토바실러스 플란타룸 1 ㎍/ml 처리한 군(실시예 2), 락토바실러스 플란타룸 기준 균주(type strain) 1㎍/ml 처리한 군(비교예 1) 및 미세먼지 50 ppm 및 락토바실러스 플란타룸 기준 균주(type strain) 1㎍/ml 처리한 군(비교예 2)으로 총 6개의 군을 물질 처리 하였다.
여기서 락토바실러스 플란타룸 기준 균주(type strain)는 생물자원센터에서 입수한 것으로 기탁번호 KCTC3108의 기탁 균주를 사용하였다.
실험군 미세먼지 ( ERM -CZ120 Fine Dust) APsulloc 331266 기준 균주 (type strain)
대조군 1(미세먼지 미처리) - - -
대조군 2(미세먼지 처리) 50 ppm - -
실시예 1(제조예 1의 APsulloc 331266 처리) - 1 ㎍/ml -
실시예 2(미세먼지+ 제조예 1의 APsulloc 331266 처리) 50 ppm 1 ㎍/ml -
비교예 1(type strain 처리) - - 1 ㎍/ml
비교예 2(미세먼지+type strain 처리) 50 ppm - 1 ㎍/ml
3. 실시간 qPCR 정량
3-1. RNA 추출 과정
'2. 각질형성세포주에 미세먼지 및 락토바실러스 플란타룸 처리'에서 얻은 대조군 1, 대조군 2, 실시예 1, 및 비교예 1에서 배양액을 제거하고, 2ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다.
3-2. cDNA 합성 과정
분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트 社의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.
3-3. qPCR 수행
이를 프라이머를 이용한 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(Q-RT-PCR: real time-reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 정량적으로 분석하였다. 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 세포의 유전자 변화를 실시간 PCR로 평가하였으며, 그 결과를 [도 1a] 내지 [도 2c]에 나타내었다. 이용한 Q-RT-PCR과 실시간 PCR은 모두 라이프테크놀로지에서 배포하는 표준 프로토콜에 따라서 실행하였으며, 구체적으로 95℃에서 20초 동안 처리한 후, 95℃에서 3초 및 60℃에서 30초를 처리하는 공정을 40주기 진행하였다.
4-1. 락토바실러스 플란타룸의 피부 세포 손상 강화 효능 평가
[도 1a] 내지 [도 1d]에 나타낸 바와 같이, 기준 균주 및 본원 발명의 녹차 유래 유산균 모두 단독 처리시 피부 장벽 강화 효과를 가짐을 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1 및 비교예 1는 대조군 1에 비하여 클라우딘 1(Claudin 1), 클라우딘 4(Claudin 4), 오클루딘(Occludin), 및 케라틴 1(Keratin 1)의 mRNA 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
4-2. 락토바실러스 플란타룸의 피부 세포 손상 복구 효능 평가
[도 2a] 내지 [도 2d]에 나타낸 바와 같이, 본원 발명의 녹차 유래 유산균은 단독 처리시 미세먼지에 의하여 손상된 피부 장벽 복구 효과를 가짐을 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2 및 비교예 2는 대조군 2에 비하여 케라틴 1(Keratin 1), 클라우딘 1(Claudin 1), 클라우딘 4(Claudin 4), 및 오클루딘(Occludin)의 mRNA 발현량이 향상된 것을 확인 하였다. 실험에서, 미세먼지 처리에 의하여 케라틴 1의 mRNA 발현량은 0.41로, 클라우딘 1의 mRNA 발현량은 0.57으로, 클라우딘 4의 mRNA 발현량은 0.50으로, 오클루딘의 mRNA 발현량은 0.42로 모두 감소하였으며, 제조예 1의 락토바실러스 플란타룸 처리에 의하여 감소된 케라틴 1의 mRNA 발현량은 1.01로, 감소된 클라우딘 1의 mRNA 발현량은 0.73으로, 감소된 클라우딘 4의 mRNA 발현량은 1.18로, 감소된 오클루딘의 mRNA 발현량은 0.79로 복구된 것을 확인할 수 있었다.
반면, 기준 균주의 경우는 케라틴 1의 mRNA 발현량은 0.51, 클라우딘 1의 mRNA 발현량은 0.53, 클라우딘 4의 mRNA 발현량은 0.60, 오클루딘의 mRNA 발현량은 0.51로 기준 균주의 처리에 의하여는 mRNA 변화량이 유의미한 값을 갖지 않았다. 따라서 기준 균주는 상기 마커들의 감소된 mRNA 발현량을 복구시키는 효과는 없는 것으로 확인되었다.
이하, 본 발명에 따른 조성물의 제형예를 설명하나, 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 건강 기능식품 조성물은 여러 가지 제형으로 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[제형예 1] 정제
본 발명 실시예에 따른 락토바실러스 플란타룸 유산균 100mg, 락토오스 400mg, 옥수수 전분 400mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
배합성분 함량(mg)
락토바실러스 플란타룸 유산균 100
락토오스 400
옥수수 전분 400
스테아린산 마그네슘 2
[제형예 2] 캡슐제
본 발명 실시예에 따른 락토바실러스 플란타룸 유산균 100mg, 락토오스 400mg, 옥수수 전분 400mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조 방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
배합성분 함량(mg)
락토바실러스 플란타룸 유산균 100
락토오스 400
옥수수 전분 400
스테아린산 마그네슘 2
[제형예 3] 과립제
본 발명 실시예에 따른 락토바실러스 플란타룸 유산균 50mg, 무수결정 포도당 250mg 및 전분 550mg을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하였다.
배합성분 함량(mg)
락토바실러스 플란타룸 유산균 50
무수결정 포도당 250
전분 550
[제형예 4] 비누
배합성분 함량(%)
락토바실러스 플란타룸 유산균 5.00
유지 적량
수산화나트륨 적량
염화나트륨 적량
향료 적량
정제수 잔량
[제형예 5] 로션
배합성분 함량(%)
락토바실러스 플란타룸 유산균 5.00
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 1.00
수용성 콜라겐 (1 % 수용액) 1.00
시트르산나트륨 0.10
시트르산 0.05
감초 엑기스 0.20
1,3-부틸렌글리콜 3.00
정제수 잔량
[제형예 6] 크림
배합성분 함량(%)
락토바실러스 플란타룸 유산균 3.00
폴리에틸렌글리콜모노스테알레이트 2.00
자기유화형모노스테아르산글리세린 5.00
세틸알코올 4.00
스쿠알렌 6.00
트리2-에틸헥산산글리세릴 6.00
스핑고당지질 1.00
1.3-부틸렌글리콜 7.00
정제수 잔량
[제형예 7] 연고
배합성분 함량(%)
락토바실러스 플란타룸 유산균 5.00
폴리비닐알코올 13.00
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 1.00
라우로일히드록시프롤린 1.00
수용성 콜라겐 (1 % 수용액) 2.00
1,3-부틸렌글리콜 3.00
에탄올 5.00
정제수 잔량
[제형예 8] 미용액 제조
배합성분 함량(%)
락토바실러스 플란타룸 유산균 3.00
히드록시에틸렌셀룰로오스(2 % 수용액) 12.00
크산탄검(2 % 수용액) 2.00
1,3-부틸렌글리콜 6.00
진한 글리세린 4.00
히알루론산나트륨 (1 % 수용액) 2.00
정제수 잔량
[제형예 9] 건강식품
배합 성분 함량
락토바실러스 플란타룸 유산균 2mg
비타민 A 아세테이트 70μg
비타민 E 1.0mg
비타민 B1 0.13mg
비타민 B2 0.15mg
비타민 B6 0.5mg
비타민 B12 0.2μg
비타민 C 10mg
비오틴 10μg
니코틴산아미드 1.7mg
엽산 50μg
판토텐산 칼슘 0.5mg
황산 제1철 1.75mg
산화아연 0.82mg
탄산마그네슘 25.3mg
제1인산칼륨 15mg
제2인산칼슘 55mg
구연산칼륨 90mg
탄산칼슘 100mg
염화마그네슘 24.8mg
[제형예 10] 건강음료
배합성분 함량
락토바실러스 플란타룸 유산균 50mg
구연산 1000mg
올리고당 100 g
타우린 1g
정제수 잔량
수탁번호
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11181P
수탁일자 : 20110328
[미생물 기탁증]
Figure PCTKR2018009465-appb-I000001
Figure PCTKR2018009465-appb-I000002

Claims (14)

  1. 녹차 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 의한 피부 손상 케어용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 녹차 유래 유산균은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp .) 유산균인, 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 락토바실러스 속 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)인, 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 녹차 유래 유산균은 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331266(Lactobacillus plantarum APsulloc 331266) KCCM11181P 인, 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 유효성분은 녹차 유래 유산균 사멸체인, 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 녹차 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.000001 내지 30중량%로 포함된, 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물의 유효성분은 피부 장벽의 밀착연접(tight junction)에 작용하는 것인, 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 케라틴 1(KRT 1), 클라우딘 1(CLDN 1), 클라우딘 4(CLDN 4), 및 오클루딘(OCLN) 중 하나 이상의 발현을 복구시키는, 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 미세먼지는 비소(arsenic), 카드뮴(cardmium), 납(lead), 및 니켈(nikel) 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 미세먼지는 입자크기가 PM 10 이하인, 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물의 유효성분은 10 내지 500 mg/kg/일의 투여량으로 투여되는, 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 화장료 조성물인, 조성물.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적 조성물인, 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 건강 기능식품 조성물인, 조성물.
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