KR102668566B1

KR102668566B1 - 수분 친화적 피부 마이크로바이옴에 대한 선택적 조절효능을 가진 락토바실러스 플란타럼 hdb 균주 및 이를 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102668566B1
Application number: KR1020220083083A
Authority: KR
Inventors: 이창완; 김경민; 김두성; 조영은; 송지원; 이성진; 이승훈
Original assignee: 주식회사 현대바이오랜드
Priority date: 2022-07-06
Filing date: 2022-07-06
Publication date: 2024-06-10
Also published as: KR20240006743A

Abstract

본 발명은 수분 친화적 피부 마이크로바이옴에 대한 선택적 조절효능을 가진 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주와 이의 배양물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 균주는 피부장벽층을 구성하는 단백질인 claudin-1 (CLDN-1), serine palmitoyltransferase (SPT), filaggrin (FLG), 피부장벽과 밀접한 보습관련 단백질인 aquaporin-3 (AQP-3), hyaluronic acid synthase-2 (HAS-2)의 유전자 발현을 촉진하여 표피의 수분치밀도를 높이고 경피수분손실량을 줄이는 효능이 있다. 또한 상기 균주는 수분 비친화적인 유해균을 억제하고 수분 친화적인 유익균을 늘리는 피부 마이크로바이옴의 조절 선택성을 갖는다. 이에 상기 균주 유래의 다양한 형태의 배양물은 피부 보습 및 피부 장벽 강화용 화장료 조성물로서 용이하게 이용 가능하다.

Description

수분 친화적 피부 마이크로바이옴에 대한 선택적 조절효능을 가진 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 및 이를 포함하는 화장료 조성물 {Lactobacillus plantarum HDB strain having selective control effect of moisture-friendly skin microbiome and cosmetic composition comprising the same}

본 발명은 수분 친화적 피부 마이크로바이옴에 대한 선택적 조절효능을 가진 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주와 이의 배양물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 균주는 피부장벽층을 구성하는 단백질인 claudin-1 (CLDN-1), serine palmitoyltransferase (SPT), filaggrin (FLG), 피부장벽과 밀접한 보습관련 단백질인 aquaporin-3 (AQP-3), hyaluronic acid synthase-2 (HAS-2)의 유전자 발현을 촉진시킴으로써 피부 표피의 수분치밀도를 높이고 경피수분손실량을 줄여 수분친화적 피부 마이크로바이옴을 조절하는 효능이 있어, 상기 균주 유래의 다양한 형태의 배양물을 피부 상태 개선용 화장료 조성물로 이용할 수 있다.

피부의 최외각에 위치한 표피(epidermis)는 체내의 수분손실을 막고 미생물 및 자외선(U.V.)과 같은 자극으로부터 피부를 보호하는 장벽기능을 수행하고 있다. 표피는 각질형성세포(keratinocyte)의 분화 정도에 따라 각질층, 과립층, 가시층 및 바닥층으로 나뉘며, 각질세포막, 각질세포간 지질, 천연보습인자(natural moisturizing factor) 및 밀착연접(tight junction)에 의해 피부장벽이 유지된다. 각질형성세포는 과립층과 각질층에서 천연보습인자, 세라마이드(ceramide), 콜레스테롤(cholesterol) 및 지방산 등의 각질세포 간 지질을 형성하여 피부보습과 각질층의 약산성을 유지하고 있다. 이중, 세라마이드는 각질세포간 지질의 40%를 차지하며, serine palmitoyltransferase (SPT)에 의해 serine과 palmitoyl-CoA가 결합되어 세라마이드 합성과정이 시작된다. 과립층에서는 involucrin (INV), filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) 등의 각질세포막 단백질들이 교차 결합되어 단단한 구조가 만들어진다. 특히, FLG는 케라틴 중간 미세섬유에 달라붙어 강한 물리적 지지력을 제공하고 이후 pyrrolidone carboxylic acid (PCA), trans-urocanic acid (trans-UCA) 같은 아미노산과 여러 대사산물로 분해돼 천연보습인자를 형성하게 된다. 또한, occludin (OCC), claudin (CLDN), junctional adhesion molecule (JAM), zonula occludens proteins (ZO) 등으로 이루어진 과립층 세포의 밀착연접은 액체의 이동을 조절하여 피부보습을 유지하는 역할을 하고 있다.

마이크로바이옴(Microbiome)은 우리 몸에 존재하는 상재균총을 의미하며 상재균총의 균형, 즉, 유익균과 유해균의 균형이 깨질 경우, 숙주인 사람에게 질병을 야기시키는 것으로 마이크로바이옴의 항상성(homeostasis)을 유지하는 것이 중요하다.

피부는 몸 속의 소화기관과 다르게 외부 공기층과 맞닿아 있어 기존의 피부 마이크로바이옴은 외부 공기층에서 유입되는 유해균들의 공격과 자외선, 화학물질등 의 유해물질을 총칭하는 엑스포좀(exposome)의 악영향을 끊임없이 받게 된다. 유해균 및 유해물질에 의해 공격받은 피부는 염증뿐만 아니라 피부 표피와 진피층 사이의 피부장벽층을 붕괴시켜 피부발적 및 부종을 야기시키고 무너진 피부장벽층을 통해 피부 속 수분 성분인 히알루론산, 엘라스틴, 콜라겐 등이 피부 밖으로 증발되고 몸 속 수분성분이 빈 공간은 함몰되어 겉으로 드러나는 주름이 되고 피부 노화가 가속화된다. 이럴 경우, 수분이 풍부한 피부조직 표면에 존재하는 피부 유익균이 수분결핍으로 종 다양성이 깨지고 수 또한 감소하게 된다. 반면, 피부장벽이 두꺼워 체내 수분성분이 풍부한 경우, 피부 표피의 수분량 또한 풍부하여 이를 기반으로 하는 피부 마이크로바이옴 또한 유익해지면서 건조한 환경에서 잘 자라는 공기 중의 유해균들이 피부에 정착할 수 있는 기회를 제거하게 된다.

종래의 기술로 피부 상재균총을 정상화하려는 제품들은 피부표면에 1차적으로 도포하여 상재균총을 강화하는 방식으로 개발되는 추세이다. 그러나 이러한 제품들은 상재균총 속에 포함되어 있는 유익균과 유해균을 선택적으로 인식할 수 없어, 기존의 피부 마이크로바이옴과 공기 중으로부터 유입된 유해균 모두를 증식시키기 피부상재균총을 정상화시키는데 한계점이 있다. 따라서 피부에 존재하는 상재균총은 빛, 수분 등의 환경적 엑스포좀(exposome)에 민감하게 반응하여 다양성이 파괴되거나, 특정집단의 세균들이 늘거나 주는 결과를 발생시킨다.

이에 본 발명자들은 사람 피부로부터 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주를 분리하여 얻은 상기 균주의 배양물이 피부 속에 존재하는 장벽, 보습을 담당하는 단백질들의 발현을 높여 피부장벽을 강화시킴으로써 피부의 수분함량을 증가시키고, 수분 친화적인 마이크로바이옴만을 선택적으로 활성화하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-2157970호 (발명의 명칭 : 발아 새싹 추출물의 유산균 발효물을 함유하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물, 출원인 : 주식회사 현대바이오랜드 외 1인, 등록일 : 2020년09월14일) 대한민국 등록특허 제10-2263454호 (발명의 명칭 : 피부장벽강화 및 항주름 활성을 갖는 피부 유래 신규 유산균 및 이의 용도, 출원인 : 주식회사 세바바이오텍, 등록일 : 2021년06월04일) 대한민국 등록특허 제10-2263479호 (발명의 명칭 : 락토바실러스 플란타룸 유산균 사균체 또는 상기 유산균의 배양물을 포함하는 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물, 출원인 : 주식회사 닥터제이코스, 등록일 : 2021년06월04일) 중국공개특허 제113692273호 (발명의 명칭 : Method and of producing a conjugate derived from a mineral of molten rock seawater and a nucleotide originating from a skin microorganism, and a functional skin microbial cosmetic composition using the conjugate, 출원인 : HYUNDAI BIOLAND CO., LTD, 공개일 : 2021년11월23일) 중국공개특허 제114072128호 (발명의 명칭 : Method for preparing dermobiotics block composition having skin moisturizing and skin regeneration functions, 출원인 : HYUNDAI BIOLAND CO., LTD, 공개일 : 2021년01월14일)

Jubin Kim et al., Inferences in microbial structural signatures of acne microbiome and mycobiome J Microbiol. 59(4), 369-375, (2021). Aged related human skin microbiome and mycobiome in Korean women Scientific Reports. 12, 2351 (2022). Ji-Hee Kim et al., Taxonomic profiling of skin microbiome and correlation with clinical skin parameters in healthy Koreans Scientific Reports. 11, 16269 (2021).

본 발명의 목적은 수분 친화적 피부 마이크로바이옴에 대한 선택적 조절효능을 가진 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주와 이의 배양물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다. 상기 균주는 수분 비친화적인 유해균을 억제하고 수분 친화적인 유익균을 늘리는 피부 마이크로바이옴의 조절 선택성을 가지기에, 상기 균주 유래의 다양한 배양물은 크림, 에센스, 화장수, 인퓨전 워터와 같은 피부 상태 개선용 화장료 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명은 피부 유래 락토바실러스 플란타럼 HDB(Lactobacillus plantarum HDB, KCCM13182P) 균주의 배양물을 함유하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 화장료 조성물은 피부 수분 치밀도 증강 효능 또는 경피수분손실 억제 효능이 있는 것을 특징으로 한다.

상기 배양물은 피부 장벽 강화와 관련된 CLDN-1(claudin-1), SPT(Serine-palmitoyl transferase) 및 FLG(filaggrin)에서 선택되는 1종 이상의 유전자 발현을 증강시키는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는 상기 배양물을 피부세포에 1~3% 첨가시 CLDN-1 유전자의 발현이 220~300% 증가하고, SPT 유전자는 170~250% 증가, FLG 유전자는 180~240% 증가하는 것을 특징으로 한다.

상기 배양물은 피부 보습과 관련된 AQP-3(aquaporin-3) 및 HAS-2(hyaluronic acid synthase-2) 중 선택되는 1종 이상의 유전자 발현을 증강시킨다.

바람직하게는 상기 배양물을 피부세포에 1~3% 첨가시 AQP-3 유전자의 발현이 180~280% 증가하고, HAS-2 유전자의 발현이 150~180% 증가하는 것을 특징으로 한다.

상기 배양물은 피부 마이크로바이옴의 조절 선택성을 가지며, 바람직하게는, 피부 상재균 중 Staphylococcus 속 균총을 증강시키며, Lawsonella 속 균총을 감소시키며, Cutibacterium 균총은 거의 변화가 없다. 이 중 특히 Staphylococcus 속 균총을 2~3배 증가하는 증강시키며, 상기 균주는 피부 상재균 중 Lawsonella 속 균총이 3~5배 감소하는 특징이 있다.

상기 배양물은 생균체, 사균체, 배양물, 균체를 포함하는 배양액, 균체를 제거한 배양액, 배양액의 농축물, 균체의 파쇄물, 균체의 추출물, 배양액의 추출물, 및, 균체나 배양액으로부터 분리된 대사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 포함된 것을 특징으로 한다.

상기 피부 세포는 인간케라틴세포, 인간섬유아세포 및 인간각질형성세포 중 1종 이상 선택되는 것일 수 있다.

이에 본 발명은 신규 유산균 락토바실러스 플란타럼 HDB(Lactobacillus plantarum HDB, KCCM13182P) 균주에 관한 것일 수 있다.

상기 균주는 피부 마이크로바이옴의 조절 선택성을 가지며, 바람직하게는, 피부 상재균 중 Staphylococcus 속 균총을 증강시키며, 상기 균주는 피부 상재균 중 Lawsonella 속 균총을 감소시키는 특징이 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 균주는 30~37℃에서 16~24시간 배양하는 것이 바람직하며, 배양가능한 최적 온도는 37℃, 최소 온도는 15℃, 최대온도는 45℃이고, 최적 pH는 6.1, 배양가능한 최소 pH는 4.0 최대 pH는 7.8 이다. 최적 배양시간은 18시간이며 최소 배양시간은 8시간 최대 배양시간 120시간이다.

상기 균주의 계대배양에 사용되는 배지는 MRS 액체배지 또는 고체배지인 것일 수 있으며, 통상의 유산균 배양배지는 모두 사용가능하다.

본 발명의 균주 유래 배양물은 여과 또는 농축하여 사용할 수도 있고, 이 때, 메시크기 0.1 ~ 10 ㎛, 바람직하게는 250 mesh ~ 1.0 ㎛의 메시크기의 필터 여과기로 배양물을 여과하거나 한외여과한 후 필요에 따라 농축할 수 있다. 농축과정은 통상의 약품, 식품 또는 화장료 원료의 제조시 사용하는 농축기를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 감압농축 방법을 이용하여 농축하는 것이 좋다.

상기 배양물은 배양 이후에 살균 또는 멸균 과정을 수행할 수 있으며, 바람직하게는 90~110℃에서 20~30분간 열을 가하는 방법을 이용할 수 있다.

본 발명에서 바람직하게는 균주 유래 배양물로서, 균체를 열압추출하여 균체 파쇄물을 얻고, 이로부터 상등액을 수득할 수 있다. 이 때, 열압추출 조건은 120~130℃, 0.12~0.30M Pa에서 15~200분간 수행되는 것을 특징으로 한다. 열압추출된 균체의 파쇄물로부터 상등액을 얻기 위해, 열압 추출 이후 바로, 냉각정제할 수 있는데, 바람직하게는 3~5℃로 유지된 상태에서 3,000~8,000 rpm에서 10~30분간 원심분리하고 200 nm 이하의 기공크기(pore size)를 갖는 나노막을 이용한 나노막 여과공정을 이용하여 정제할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 유래 배양물은 필요에 따라 용매 추출하여 사용할 수 있다. 이 때 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 프로필렌글리콘, 부틸렌글리콜, 글리세린, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합액을 추출용매로 하여 추출할 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 4의 저급알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 추출물의 제조시 사용되는 추출용매는 배양물 사용 중량 기준 1~40배의 부피(1kg 기준 1~40ℓ) 또는 중량(1kg 기준 1~40kg)을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~40배 부피 또는 중량을 사용할 수 있다. 상기 추출물의 추출조건은 20~100℃에서 30분~48시간일 수 있다. 상기 과정은 1~4번까지 반복할 수 있다. 또한, 당분야의 통상적인 방법으로서 상기 추출물을 물에 녹인 후에 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추가적으로 분획하여 분획물로 제조할 수 있다. 상기 추출물의 제조온도는 20 내지 100℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추출 시간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 10분 내지 2일 이내에 추출하는 것이 바람직하며, 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 상기 추출물 제조시, 추출액을 여과할 때, 상기 여과는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로 면, 나일론, 종이 등을 이용하여 입자를 걸러 내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 추출물 제조시의 추출 방법은 특별히 제한되지 않고 추출물의 종류와 추출하는 방법에 따라 예를 들어, 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 상온 추출, 열수 추출 등을 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 추출물은 열풍건조, 감압건조, 동결건조, 진공건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가할 수 있다. 또한, 상기 추출물은 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 사용할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주의 배양물이 0.1~20 중량%가 포함될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.

보다 더 자세하게는, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용목적에 따라 그 첨가량을 화장료 조성물 고유의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택할 수 있다. 상기 성분들의 첨가량은 예를 들어 조성물 총 중량에 대하여 0.1~10 중량%, 바람직하게는 0.1~6 중량%일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

도 1은 피부 유래 유산균 및 표준균주 시료의 피부 섬유아세포(진피세포)에 미치는 독성평가 결과를 나타낸다.
(도 1에서 C : Control, RA : Ratinoic acid, 20F : LAB20F, 20M : LAB20M, 25F : LAB25F, 25M : LAB25M, 30F : LAB30F, 30M : LAB30M, 14917 : ATCC14917, 14931 : ATCC14931, 53103 : ATCC53103, 1236 : HDB1236을 의미하며, 이하의 도면에서도 동일하게 기재하였다)
도 2는 피부 유래 유산균 및 표준균주 시료의 피부 각질세포(표피세포)에 미치는 독성평가 결과를 나타낸다.
도 3은 피부 유래 유산균 및 표준균주 시료의 CLDN-1 유전자 발현 효과를 나타낸다.
도 4는 피부 유래 유산균 및 표준균주 시료의 SPT 유전자 발현 효과를 나타낸다.
도 5는 피부 유래 유산균 및 표준균주 시료의 FLG 유전자 발현 효과를 나타낸다.
도 6은 피부 유래 유산균 및 표준균주 시료의 AQP-3 유전자 발현 효과를 나타낸다.
도 7은 피부 유래 유산균 및 표준균주 시료의 HAS-2 유전자 발현 효과를 나타낸다.
도 8은 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주의 16S rRNA(서열번호 1) 유전자 서열 및 계통수(phylogenetic tree)에서의 위치를 나타낸다.
도 9는 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료가 포함된 화장품 제형을 도포한 피부에 대한 수분맵 대표사진을 나타낸다.
도 10은 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료가 포함된 화장품 제형을 도포한 피부에 대한 수분치밀도 군간 비교 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료가 포함된 화장품 제형을 도포한 피부에 대한 경피수분손실량 측정값을 나타내는 그래프이다.
도 12는 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료가 포함된 화장품 제형을 도포한 피부에 대한 붉은기 이미지 전환 결과를 나타낸다.
도 13은 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료가 포함된 화장품 제형을 도포한 피부에 대한 붉은기 억제효과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 락토바실러스 플란타럼 HDB 시료가 포함된 화장료 제형 도포 전/후의 균총 조성의 변화를 나타낸다.
도 15는 락토바실러스 플란타럼 HDB 시료가 포함된 화장료 제형 도포 후 감소경향을 보인 Lawsonella 속과 이를 포함하는 Corynebacteriaceae의 경피수분 손실량과의 상관관계를 나타낸다.
도 16은 Staphylococcus 속 균주와 피부 붉은기의 상관관계를 나타낸다.

본 발명에서 락토바실러스 플란타럼 HDB를 선별하기 위한 방법은 바람직하게는 다음 단계들을 포함하여 수행된다.

(a)단계 : 피부조직과의 반응에서 피부독성이 낮은 피부 유래 유산균을 선발하는 단계;

(b)단계 : 상기 (a)단계에서 선발된 독성이 낮은 피부 유래 유산균을 이용하여 피부장벽강화기능이 우수한 유산균을 선발하는 단계;

(c)단계 : 상기 (b)단계에서 선발된 유산균 중, 피부 마이크로바이옴의 조절 선택성의 임상학적 특징을 나타내는 락토바실러스 플란타럼 HDB를 최종 선발하는 단계.

이를 보다 자세히 살펴보면 다음과 같다.

(a)단계 : 피부조직과의 반응에서 피부독성이 낮은 피부 유래 유산균을 선발하는 단계.

피부조직 내의 수분조절의 역할을 하는 피부 유산균을 선발하기 위해, BCP 평판법을 통해 유산균을 분리하고 16SrRNA 시퀀싱을 기반으로 한 분자생물학적 방법을 통해 동정 확인하였다. 확인된 피부 유산균들의 피부독성여부를 판단하기 위해 MTT법을 통해 독성을 평가하여 피부독성이 낮은 피부 유래 유산균 6종을 선발하였다.

(b)단계 : 상기(a)에서 선발된 독성이 낮은 피부 유래 유산균을 이용하여 피부장벽강화기능이 우수한 유산균을 선발하는 단계.

피부장벽강화기능이 우수한 유산균을 선발하기 위해 선별된 피부 유래 유산균 6종과 분양받은 유산균 3종 및 자사균주 1종들의 비교를 통해 피부 속 구조에서 피부장벽형성에 관여하는 단백질과 피부보습력에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자발현을 촉진시키는 유산균을 선발하였다. 피부장벽형성에 직접적으로 관여하는 단백질인 claudin-1 (CLDN-1), serine palmitoyltransferase (SPT), filaggrin (FLG), aquaporin-3 (AQP-3), hyaluronic acid synthase-2 (HAS-2)에서 분자생물학적 결과를 미시적으로 확인하고 여기서 최종 선발된 균주의 임상학적 피부장벽강화기능을 판단하는 수분치밀도, 경피수분손실량, 붉은기 감소효과의 거시적 임상결과를 유산균이 포함되어 있지 않은 보습제품을 대조군을 사용하여 그 기능성을 확인하였다.

피부의 유전자 수준의 발현효과(genotype)-피부임상에서의 발현효과(phenotype)에 이어 피부표피의 마이크로바이옴(microbiome type) 수준에서의 발현효과를 측정하기 위해 바르기 전과 후의 마이크로바이옴의 선택적 조절능력이 있는지를 확인하였다.

이를 위해 피부 유익균으로 분류되는 Staphylococcus 속의 움직임과 피부 유해균으로 분류되는 Lawsonella 속, Corynebacterium 속의 움직임과 상재균총 속 비율을 분석하여 상기 분리 유산균의 피부 마이크로바이옴의 선택적 조절 능력이 있음을 입증하였다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

실시예 1. 균주의 분리

피부장벽강화 효능이 있는 화장료에 적용 가능한 피부유래 유산균을 찾기 위해, 20~30대의 얼굴 피부(뺨) 샘플을 채취하여 유산균을 분리하였다.

이를 위해, 20~30대의 여성 또는 남성의 얼굴 뺨을 멸균된 면봉으로 3회 비벼 피부 상재균총을 채취하고 멸균식염수에 현탁하였다. 현탁액은 10배수 연속 희석하고 젖산에 의한 황변 분별을 위하여 BCP (Bromocresol purple) 고체배지에 섞어 접종하여 상온에서 굳힌 후, 37℃, 36시간 동안 배양하였다.

형성된 콜로니 중, 주변에 뚜렷한 황변을 나타내는 것을 선별하여 취한 후, 유산균 영양배지인 MRS (BD, Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA) 액상배지에 접종한 후 형태학적 관찰을 통해 유산균을 재선별하였다. 선별된 유산균들은 연속계대배양을 통해 순수 분리한 후, 피부장벽강화 효능 스크리닝 실험을 위해 사용하였다.

실시예 2. 피부 유산균 화장품 시료 제작

표 1에 나타난 균주 조건과 같이, 20~30대의 남녀 연령대 피부에서 분리한 피부 유래 유산균인 LAB20F, LAB20M, LAB25F, LAB25M, LAB30F, LAB30M 6개의 균주와 생물자원센터에서 분양받은 Lactobacillus plantarum ATCC14917, Lactobacillus fermentum ATCC14931, Lactobacillus rhamnosus ATCC53103, 자사분리균주 Lactobacillus plantarum HDB1236의 4개 균주, 총 10개 균주(strain)의 전배양액(MRS broth 배양)을 각각 새로운 MRS broth에 3%(v/v)가 되도록 접종하였다.

이 후 37℃의 조건에서 24시간 동안 각 균주를 배양하였고, 균주 배양액은 4℃, 20,000×g 조건에서 10분간 원심 분리하여 균체만을 회수하고 멸균 증류수로 2회 세척하였다. 세척된 균체를 다시 증류수에 현탁하고, 균주 현탁액을 121℃에서 0.12 MPa의 조건에서 2시간 동안 열압추출하여 세포를 파쇄한 후, 이를 4℃까지 냉각하였다. 다시 4℃, 24시간 조건에서 냉각 침전시키고 원심분리(6,000rpm, 20분)를 이용하여 상등액만을 회수하였다. 이후, 나노막여과 공정으로 상등액에 포함된 균체의 세포벽 등의 성분을 제거하여 화장료 조성물로 이용가능한 고순도의 유산균 시료를 제조하였다.

구분	화장품 시료 균주	성별	연령	피부보습상태
피부 유래 유산균	LAB20F	여성	20대초반	촉촉한 편
	LAB20M	남성	20대초반	보통
	LAB25F	여성	20대후반	촉촉한 편
	LAB25M	남성	20대후반	보통
	LAB30F	여성	30대초반	건조한 편
	LAB30M	남성	30대초반	건조한 편
비교 균주	Lactobacillus plantarum ATCC14917
	Lactobacillus fermentum ATCC14931
	Lactobacillus rhamnosus ATCC53103
	Lactobacillus plantarum HDB1236

실시예 3. 피부 유래 유산균 시료들의 세포독성 확인

MTT assay는 살아있는 세포의 수를 측정함으로써 세포 증식이나 독성에 많이 사용되는 실험법으로서, 살아있는 세포는 미토콘드리아 내에서 수용성이고 노란색의 염인 MTT (3-[4,5-dimethlythiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)가 숙신산탈수소효소(succinate dehydrogenase 또는 mitochondrial dehydrogenase)에 의해 불용성의 보라색의 포르마잔(formazan) 유도체로 환원되는 원리를 이용하는 것이다.

실시예 2를 통해 얻은 유산균 시료의 피부세포에 대한 반응성을 살펴보기 위해, 즉, 피부용 화장료 조성물로 사용가능한지 확인하기 위해, MTT assay를 실시하여 피부세포에 대한 독성도를 측정하였다.

이를 위해, 24 well plate에 1.5×10⁵cells/well의 농도로 희석하고 10% (v/v) 소혈청을 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Welgene, Korea) 배지로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1일 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 모두 제거하고, 소혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지로 교체하고, 시험 시료인 실시예 2를 통해 제조된 유산균 화장료 조성물을 각각 농도별로 첨가한 후, 1일 동안 배양하였다.

그 후 배지를 제거하고 0.25 ㎎/㎖의 MTT 용액을 처리하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 그 후 MTT 용액을 제거한 세포에 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 MTT formazan을 용해시키고 570nm에서 흡광도로 측정하였다.

이에 대한 결과는 [도 1], [도 2]에 나타내었다. 도 1과 도 2에서 C : Control, RA : Ratinoic acid, 20F : LAB20F, 20M : LAB20M, 25F : LAB25F, 25M : LAB25M, 30F : LAB30F, 30M : LAB30M, 14917 : ATCC14917, 14931 : ATCC14931, 53103 : ATCC53103, 1236 : HDB1236을 의미한다.)

[도 1], [도 2]를 참고하면, LAB20F, LAB20M, LAB25F, LAB25M, LAB30F, LAB30M 6개의 균주; Lactobacillus plantarum ATCC14917, Lactobacillus fermentum ATCC14931, Lactobacillus rhamnosus ATCC53103, 자사분리균주 Lactobacillus plantarum HDB1236의 4개 균주; 총 10개 균주에 대한 유산균 물 시료가 모두 세포 처리 농도 3% (v/v)까지 세포 독성이 없는 것으로 확인된다.

실시예 4. 피부 유래 유산균 시료들의 피부장벽강화 효과

실시예 2를 통해 얻은 유산균 시료의 피부장벽강화 효과를 확인하기 위해 CLDN-1, SPT, FLG, Aquaporin-3 (AQP-3)와 Hyaluronic acid synthase-2 (HAS-2)의 유전자 발현을 측정하였다. 인간 표피 세포주(normal human epidermal keratinocytes, NHEKs; gibco, USA) 를 60 mm cell culture dish에 1.0×10⁶ cells/mL의 농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양한 뒤, serum free Epilife 배지에 피부 유산균 시료샘플을 3% (v/v) 농도로 처리하고 3일간 배양하였다. 배양이 끝나면 QIAzolTM Lysis 시약(Qiagen, Germany)을 처리하여 Applied Biosystem (USA) 방법에 따라 RNA를 추출 후 정량하였다. cDNA 합성 후 real-time PCR (Applied Biosystems 7500 FAST real-time PCR system)을 수행하였다. PCR에 사용된 primers는 [표 2]와 같다.

프라이머	방향	염기서열(5’→3’)
Claudin-1 (CLDN-1)	Forward	TATGAAGTGCTTGGAAGACGATGA (서열번호 2)
Claudin-1 (CLDN-1)	Reverse	AATATCGCACCCCCAATGAC (서열번호 3)
Serine palmitoyltransferase (SPT)	Forward	TGGTCATTTGGCCCAGGTC (서열번호 4)
Serine palmitoyltransferase (SPT)	Reverse	TCCCAACCATTGGCTTCACATC (서열번호 5)
Filaggrin (FLG)	Forward	CACGTGGCAGTCCTCACAGT (서열번호 6)
Filaggrin (FLG)	Reverse	CTTTTTGCCTTTCAGTGCCC (서열번호 7)
Aquaporin-3 (AQP-3)	Forward	GGGACCAGTCGGAAGGGAT (서열번호 8)
Aquaporin-3 (AQP-3)	Reverse	CACAGATGGACAGGCTGCCT (서열번호 9)
Hyaluronic acid synthase-2 (HAS-2)	Forward	ACAACACCTTAGTTCCTCTA (서열번호 10)
Hyaluronic acid synthase-2 (HAS-2)	Reverse	AGCAGTGATATGTCTCCT (서열번호 11)
β-Actin	Forward	GGCACCCAGCACAATGAAG (서열번호 12)
β-Actin	Reverse	CCGATCCACACGGAGTACTTG (서열번호 13)

각 실험은 LAB20F, LAB20M, LAB25F, LAB25M, LAB30F, LAB30M 6개의 균주; Lactobacillus plantarum ATCC14917, Lactobacillus fermentum ATCC14931, Lactobacillus rhamnosus ATCC53103, 자사분리균주 Lactobacillus plantarum HDB1236의 4개 균주; 총 10개 균주에 대해 모두 실시하였고, 실험 결과는 [도 3]에 나타내었다.

[도 3]을 참고하면 피부 유래 유산균 중에서 LAB25F 균주가 CLDN-1 유전자 발현이 가장 높은 것으로 확인된다. CLDN-1 은 water 및 ion의 passage를 조절하고 피부 장벽 강화 기능에 관여하는 tight junction protein (TJ)을 코딩하는 것으로 알려져 있다.

특히, 상기 LAB25F와 비교군 ATCC14917, ATCC14931, ATCC53103, HDB1236들을 비교하였을 때, LAB25F가 비교군 중에서 가장 CLDN-1 발현율이 높은 균주인 ATCC53103와 비교할 때에도 유전자 발현율이 57% 더 높고, 양성대조군인 락토페린 1μM보다 CLDN-1 발현 효과가 현저하여 피부 장벽기능 강화 효능이 우수한 균주임이 입증된다.

[도 4]에는 유산균 시료 처리 시의 피부 장벽(brick and mortar) 기능 중 mortar(lipids)에 해당되는 ceramide 합성 관련 효소 Serine palmitoyl-transferase(SPT)의 유전자 발현율을 확인하여 나타내었다.

확인 결과, SPT 유전자도 다른 유산균들에 비해 LAB25F 균주에서의 발현양이 더 높은 것으로 확인되며, 특히 비교군 ATCC14917, ATCC14931, ATCC53103, HDB1236 균주 그룹 중에서 SPT 유전자 발현이 높은 ATCC14917 균주 대비 SPT 유전자가 96% 높게 발현되는 것을 알 수 있다.

[도 5]에는 유산균 시료 처리 시의 filaggrin(FLG) 발현율을 확인하였다. FLG는 terminally differentiation marker 중 하나로 피부 장벽을 구성함과 동시에 천연보습인자(Natural Moisturerizing Factor) 전사체로 분류된다.

확인결과, LAB25F 균주가 filaggrin(FLG)의 유전자 발현율이 198%로서 양성 대조군인 락토페린과 다른 유산균들보다 높게 나타났다.

또한, [도 6]에는 보습관련 AQP-3 유전자 발현 결과를, [도 7]에는 Hyaluronic acid synthase-2 (HAS-2) 유전자 발현 결과를 나타낸 바, 역시 LAB25F 균주가 가장 관련 효능이 우수하였다.

이와 같은 피부 장벽강화 및 수분/보습과 관련된 CLDN-1, SPT, FLG, AQP-3와 HAS-2의 유전자 발현양상을 분석한 결과, 상기 LAB25F 균주가 피부 개선용 화장료 조성물로 이용하기에 가장 적합함을 알 수 있었다.

실시예 5. 피부 유래 유산균 LAB25F의 동정

피부장벽강화 효능 스크리닝 실험을 통해 선발된 LAB25F 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 서열비교를 통한 계통유전학적 분석(phylogenetic analysis)을 수행하였다. 블라스트 유사성 조사 프로그램(Blast Similarity Search Program: National Institute of Biotechnology Information)을 이용하여 LAB25F 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열과 GenBank에 등록된 유산균들의 16S rRNA 유전자 서열들과 함께 각각 다중 서열 정렬을 진행한 후 유전학적 위치를 판별하였다. LAB25F 균주의 16S rRNA 시퀀싱 분석 결과, [도 8]에 기재한 서열번호 1의 유전자를 가지며, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 가장 가까운 상동성(homology)을 보이는 것으로 확인되었다(99% 이상).

이와 같은 분자생물학적방법으로 동정한 결과를 통해, LAB25F 균주를 락토바실러스 플란타럼으로 동정하였고, 피부장벽강화 효능작용을 하는 상기 LAB25F 균주를 '락토바실러스 플란타럼 HDB(Lactobacillus plantarum HDB)'로 명명하고 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 수탁하였다(수탁번호: KCCM13182P).

실시예 6. 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료의 피부 수분치밀도 효과 확인

락토바실러스 플란타럼 HDB의 피부장벽 개선효과가 미치는 영향을 피험자 21명(34.7±8.98세, 여성)을 대상으로 피부 수분치밀도 확인 임상실험을 통해 평가하였다.

이를 위해 다음과 같이 각 원료를 혼합하여 각 화장품 제형을 제조하였다.

원료	대조군 화장품 제형 %(v/v)	실험군 화장품 제형 %(v/v)
락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료	0.0	3.0
피이지-240/에이치디아이코폴리머비스-데실테트라데세스-20에텔	1.6	1.6
1,2-헥산디올	1.2	1.2
피이지-60하이드로제네이티드캐스터오일	0.3	0.3
에틸헥실글리세린	0.05	0.05
다이소듐이디티에이	0.02	0.02
향료	0.06	0.06
부틸렌글라이콜	6.0	6.0
글리세린	9.0	9.0
정제수	잔량	잔량

상기 표 3에서 균주 시료는 실시예 2의 방법으로 제조한 균체 파쇄물 시료를 의미한다. 또한 이후의 피부 임상 실험은 이 화장료 제형을 이용하여 실험하였다.

상기 수분치밀도 확인은 전기용량(capacitance) 원리로 피부와 접촉하여 수분량을 측정하는 Epsilon(E100, Biox Systems Ltd., England)를 이용하여 시험 부위의 수분맵 이미지를 얻은 다음, 3차원 이미지로 변화하여 평가하였다.

각 평가시점에 D-Squame sampling disc(D100, Clinical and derm)를 이용하여 tape stripping을 10회 실시하였으며 tape stripping 실시 전의 각질층 표면 수분치밀도와 tape stripping 10회 실시 후의 각질층 속 수분치밀도를 각각 측정하였다. 화장료 제형 사용 전(0주), 화장료 제형 사용 후 1주 및 2주차에 tape stripping 10회 전후의 수분치밀도를 측정하고 대조군과 실험군의 군간 비교를 진행하였고, 이에 대한 결과는 [도 9]에 이미지로서 나타내었고, 도 [10]에 이 이미지를 수치화하여 나타내었다.

[도 9]는 각 화장품 제품을 도포한 피부의 수분맵을 3차원 이미지로 전환한 것으로서, 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료가 포함된 화장품을 도포한 피부의 수분맵에서 단위면적당 수분량이 대조군 대비 상대적으로 높은 것을 확인할 수 있다.

이 결과를 수치화하여 나타낸 [도 10]를 참고하면, 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료가 포함된 화장품은, 도포 2주차에 각각 각질층 표면에서 108.29% 수분치밀도가 증가하였으며, 각질층 속에서 121.83% 모두 증가하였다. 반면, 대조군 화장품은, 도포 2주차에 각질층 표면과 각질층 속의 수분치밀도 변화율이 각각 71.40%, 49.45% 상승하였을 뿐이다.

이러한 결과는 화장품 제형에 포함된 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료로 인해 피부장벽이 강화되면서 수분치밀도가 상승하였다는 것을 의미한다.

실시예 7. 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료의 경피수분손실량 감소효과

피부 유래 락토바실러스 플란타럼 HDB의 피부장벽 개선효과가 피부의 수분 손실억제에 영향을 주는지 평가하기 위하여 피험자 21명(34.7±8.98세, 여성)을 대상으로 표 3의 화장품 제형 및 Vapometer (Delfin, Filand)를 이용하여 경피수분손실량에 관한 임상을 수행하였다.

이를 위해, 화장품 제형 사용 전(0주), 사용 후 1주, 2주차에 경피수분손실량을 측정하고 대조군과 실험군의 군간 비교를 통해 그 효과를 확인하고 그 결과를 [도 11]에 나타내었다.

확인 결과, 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료가 포함된 실험군 화장품을 도포한 부위에서, 도포 후 2주차에 경피수분손실량이 대조군 화장품을 도포한 부위 대비 7.82% 통계적으로 유의하게 감소하는 것을 알 수 있다.

이러한 결과로부터 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료에 의해 피부장벽이 개선되어 궁극적으로는 경피수분손실량이 대조군 대비 감소됨을 확인할 수 있었다.

실시예 8. 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료의 피부 붉은기 억제효과

피부 유래 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료의 피부장벽 개선효과를 평가하기 위하여 피험자 21명(34.7±8.98세, 여성)을 대상으로 표 3의 화장품 제형을 도포한 후 피부 붉은기 감소효과에 관한 임상을 수행하였다.

피부 붉은기를 평가하기 위해서는 VISIA-CR(Canfield Scientific, USA)을 이용하여 동일한 조건에서 피험자의 얼굴을 촬영하고 Image J Software(NIH, USA)를 이용하여 붉은기 면적을 분석하였다. 이를 위해, 표 3의 각 화장품 제형 사용 전(0주), 사용 후 1주, 2주차에 피험자의 붉은기 면적을 분석하고 대조군과 실험군의 군간 비교를 진행하였다.

[도 12]는 피부의 붉은기 측정결과에 대한 3차원 이미지이고, 수치 결과는 도 13에 나타내었는데, [도 12]의 이미지를 확인할 때, 대조군 화장품을 도포한 피부 대비 락토바실러스 플란타럼 HDB 시료가 포함된 실험군 화장품을 도포한 피부에서의 붉은기가 시각적으로 뚜렷하게 감소하는 것을 알 수 있다.

[도 13]의 수치결과에서, 락토바실러스 플란타럼 HDB 시료가 포함된 화장품 제형을 도포한 피부는, 2주차가 되었을 때, 대조군 화장품 제형을 도포한 피부 대비 붉은기가 16.81% 억제되었다. 피부 붉은기는 피부 속 피부장벽이 손상되었을 때 증가하는데, 이러한 결과로부터 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주 시료의 도포가 직접적으로 피부장벽을 견고하게 함으로써 붉은기를 감소시켰음을 알 수 있다.

실시예 9. 수분 친화적 피부 마이크로바이옴의 선택적 조절효능

피부 상재균총(마이크로바이옴) 분석을 위해 지금까지 실험한 화장료 제형을 도포한 피험자 21명을 대상으로 피부 샘플을 채취하였다. 시험 전, 후 각각 1회씩 피부 채취 테이프(D-squame standard disc, D100)를 부착했다가 떼는 것을 3번 반복하여 채취한 후 DNA를 추출하였다. 16S-rRNA 유전자의 가변 V4 영역을 증폭하여 PCR 산물(~250 bp)을 얻은 후, HiAccuBeads로 정제하여 앰플리콘 라이브러리를 제작하고, MiSeq 시약 키트 v2를 사용하여 Illumina MiSeq 시스템에서 시퀀싱되었다. 16S rRNA 유전자 데이터베이스를 이용하여 97% 이상의 동일성을 기준으로 시퀀스를 분석하고 각 균총 별 조성을 operational taxonomic units(OTUs)로 환산하였다. OTUs를 기준으로 시험 전, 후 및 수분 친화적 상재균총을 도출하고 상관관계를 분석하였다.

[도 14]를 참고하면, 락토바실러스 플란타럼 HDB 시료가 포함된 화장료 제형 도포 전(0w)에 비해, 화장료 제형 도포 2주(2w) 후 주요 피부 상재균 중에서 Cutibacterium 균총은 변화가 크지 않았고, Staphylococcus 속 균총은 증가하는 경향을 보였고, Corynebacterium 속에 속하는 Lawsonella 속 균총은 감소하는 경향이 높았다.

[도 15]에는 락토바실러스 플란타럼 HDB 시료가 포함된 화장료 제형 도포 후 감소 경향을 보인 Lawsonella 속과 이를 포함하는 family Corynebacteriaceae는 경피수분손실량에 비례하는 상관관계를 나타내었다. 일반적으로 Corynebacteriaceae와 Lawsonella 속은 피부유해균으로 분류되며, 수분이 많은 피부조직에서 증식이 많이 되지 않으며, 아토피 등 피부장벽이 붕괴되어 수분이 없는 건조한 피부조직에서 잘 생장하는 경향을 나타낸다.

한편, [도 16]은 본 발명자들이 별도로 실험하여 확인한 Staphylococcus 속 균주의 피부 붉은기 정도와의 반비례의 상관성을 나타낸 실험결과다.

Staphylococcus 속에는 피부 주요 상재균인 Staphylococcus epidermidis가 포함되며, 해당 균총은 수분이 풍부한 건강한 피부에서 우점하는 것으로 알려져 있다. 피부 붉은기 증상은 피부장벽이 무너지면서 각질층이 얇아지고, 외부 자극에 대한 민감도가 증가하면서 염증반응이나 혈관 팽창 등에 의해 도드라지게 나타나는 현상이다.

본 발명의 실험을 통해, 락토바실러스 플란타럼 HDB 시료가 포함된 화장료 제형 도포 후 피부 붉은기 증상이 감소하였는데, 이는 락토바실러스 플란타럼 HDB 시료가 각질층에 직접적으로 영향을 주는 것 외에도, 1차 피부 보호층인 피부상재균인 Staphylococcus 속을 증가시키며 외부 자극으로부터 피부 보호효과를 높여준 것임을 입증하는 결과라 할 수 있다.

따라서, 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주가 피부장벽을 강화하여 인체 내 수분 성분들의 증발을 막아 피부 수분량을 높여 수분 친화적 피부 마이크로바이옴의 비율을 증가시키고, 상대적으로 수분 비친화적인 피부 마이크로바이옴을 감소시키는 조절능력을 통해 건강한 피부를 유지시킴을 알 수 있다.

<화장료 제형예 1. 유연 화장수의 제조>

실시예 2에 개시된 균체 파쇄물 제조 방법으로 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주의 균체 파쇄물을 제조하고, 이를 시료로서 함유한 유연 화장수(스킨, 100g)를 통상의 방법에 따라 표 4와 같이 제조하였다. 이 후의 화장료 제형에서는 상기 균체 파쇄물을 이용하였다.

원료	함량 (g)
락토바실러스 플란타럼 HDB 균주의 균체 파쇄물	3.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
폴리옥시에칠렌(60)경화 피마자유	1.0
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제	미량
색소	미량
향료	미량
정제수	잔량

<화장료 제형예 2. 영양 화장수의 제조>

표 5와 같이 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주의 균체 파쇄물을 함유한 영양 화장수(로션, 100g)를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량 (g)
락토바실러스 플란타럼 HDB 균주의 균체 파쇄물	3.0
시토스테롤	1.7
폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
세테아레스	1.2
콜레스테롤	1.5
디세틸포스페이트	0.4
농글리세린	5.0
선플라워오일	10.0
카르복시비닐폴리머	0.2
산탄검	0.3
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

<화장료 제형예 3. 영양크림의 제조>

하기 표 6의 조성과 같이 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주의 균체 파쇄물을 함유한 영양크림(100g)을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량 (g)
락토바실러스 플란타럼 HDB 균주의 균체 파쇄물	3.0
시토스테롤	4.0
폴리글리세릴 2-올레이트	3.0
세라마이드	0.7
세테아레스-4	2.0
콜레스테롤	3.0
디세틸포스페이트	0.4
농글리세린	5.0
선플라워오일	22.0
카르복시비닐폴리머	0.5
트리에탄올아민	0.5
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

<화장료 제형예 4. 에센스의 제조>

하기 표 7의 조성과 같이 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주의 균체 파쇄물을 함유한 에센스(100g)를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량 (g)
락토바실러스 플란타럼 HDB 균주의 균체 파쇄물	3.0
시토스테롤	1.7
폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
세테아레스-4	2.0
콜레스테롤	3.0
디세틸포스페이트	0.4
농글리세린	5.0
선플라워오일	22.0
카르복시비닐폴리머	0.5
트리에탄올아민	0.5
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

<화장료 제형예 5. 파운데이션의 제조>

하기 표 8의 조성과 같이 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주의 균체 파쇄물을 함유한 파운데이션(100g)을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량 (g)
락토바실러스 플란타럼 HDB 균주의 균체 파쇄물	3.0
밀납	2.0
사이클로메치콘	2.0
유동파라핀	5.0
스쿠알란	5.0
스테아린산	2.0
친유성 모노스테아린산 글리세린	3.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	3.0
부틸렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	1.0
알루미늄마그네슘실리케이트	0.5
안료	12.0
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

<화장료 제형예 6. 헤어샴푸의 제조>

하기 표 9의 조성과 같이 락토바실러스 플란타럼 HDB 균주의 균체 파쇄물을 함유한 헤어샴푸(100g)를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량 (g)
락토바실러스 플란타럼 HDB 균주의 균체 파쇄물	3.0
아라키딜 글루코사이드	4.5
에탄올	2.0
부틸렌글리콜	2.0
시트르산	0.1
페녹시에탄올	0.02
정제수	잔량

[수탁기관]

기탁기관명 : 한국미생물보존센터

수탁번호 : KCCM13182P

수탁일자 : 20220519

서열목록 전자파일 첨부

Claims

신규 유산균 락토바실러스 플란타럼 HDB(Lactobacillus plantarum HDB, KCCM13182P) 균주 유래 배양물을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 피부 수분 치밀도 증강 효능 또는 경피수분손실 억제 효능이 있는 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배양물은 피부 장벽 강화와 관련된 CLDN-1(claudin-1), SPT(Serine-palmitoyl transferase) 및 FLG(filaggrin)에서 선택되는 1종 이상의 유전자 발현을 증강시키는 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배양물은 피부 보습과 관련된 AQP-3(aquaporin-3) 및 HAS-2(hyaluronic acid synthase-2) 중 선택되는 1종 이상의 유전자 발현을 증강시키는 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 배양물은 생균체, 사균체, 배양물, 균체를 포함하는 배양액, 균체를 제거한 배양액, 배양액의 농축물, 균체의 파쇄물, 균체의 추출물, 배양액의 추출물, 및, 균체나 배양액으로부터 분리된 대사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 포함된 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.
신규 유산균 락토바실러스 플란타럼 HDB(Lactobacillus plantarum HDB, KCCM13182P) 균주.
제8항에 있어서,
상기 균주는 피부장벽 강화 효능이 있는 것을 특징으로 하는 균주.
제8항에 있어서,
상기 균주는 피부 수분 치밀도 증강 효능 또는 경피수분손실 억제 효능이 있는 것을 특징으로 하는 균주.
제8항에 있어서,
상기 균주는 피부 장벽 강화와 관련된 CLDN-1(claudin-1), SPT(Serine-palmitoyl transferase) 및 FLG(filaggrin)에서 선택되는 1종 이상의 유전자 발현을 증강시키는 것을 특징으로 하는 균주.
제8항에 있어서,
상기 균주는 피부 보습과 관련된 AQP-3(aquaporin-3) 및 HAS-2(hyaluronic acid synthase-2) 중 선택되는 1종 이상의 유전자 발현을 증강시키는 것을 특징으로 하는 균주.
삭제
삭제