CN113332223A

CN113332223A - 戊糖乳杆菌菌株和包括其的用于改善微生物菌丛和改善皮肤屏障的组合物

Info

Publication number: CN113332223A
Application number: CN202011312427.7A
Authority: CN
Inventors: 裵秀珽; 高贤珠; 金珍和; 李根秀
Original assignee: Yisi Hanfo
Current assignee: Yisi Hanfo
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2020-11-20
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2040-11-20
Also published as: CN113332223B; KR102152878B1

Abstract

包括戊糖乳杆菌(Lactobacilus pentosus)HB‑8023(保藏号：KCTC13322BP)菌株，其破碎液或其培养液的组合物示出改善皮肤屏障、改善皮肤保湿、改善皱纹、增加多酚和类黄酮的总含量、改善微生物菌丛或抑制瘙痒的效果，并且可以在各种方面用作化妆品组合物、皮肤外用剂和食物组合物。

Description

戊糖乳杆菌菌株和包括其的用于改善微生物菌丛和改善皮肤屏障的组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年3月2日提交的韩国专利申请No.10-2020-0026122的优先权和权益，其通过引用合并于此用于所有目的，如同在此完全阐述一样。

技术领域

本公开涉及一种戊糖乳杆菌菌株和包括其的组合物的改善皮肤屏障和微生物菌丛的效果。

背景技术

虽然皮肤执行许多功能，但其主要功能是作为保护层或屏障的功能。对于陆上动物而言，皮肤最重要的作用是从干燥的外部环境保护富含水分的内脏器官。另外，除了有害的化学物质和物理力之外，皮肤更为了防止外部病原体的渗透而保护内部组织。然而，随着最近的现代化的持续，由于环境污染和环境因素以及社会压力的增加导致皮肤屏障功能的异常逐渐加剧，发生症状恶化的人数增加并且接受治疗的人数也在增加的趋势。

在这种技术背景下，正在积极地进行有关皮肤屏障功能的研究(KR注册号10-1552398)，但是仍然不足。

发明内容

一方面提供一种用于改善皮肤屏障的化妆品组合物，其包括戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)HB-8023(保藏号：KCTC13322BP)菌株，其破碎液或其培养液。所述戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)HB-8023菌株已经于2017年8月30日保藏于韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures,KCTC)，分类命名为戊糖乳杆菌HB-8023(Lactobacillus pentosus HB-8023)，保藏编号为KCTC13322BP。

另一方面提供一种用于增强皮肤屏障的皮肤外用剂组合物，其包括戊糖乳杆菌HB-8023(保藏号保存号：KCTC13322BP)菌株，其破碎液或其培养液。

另一方面提供一种用于改善皮肤屏障的食物组合物，其包括戊糖乳杆菌HB-8023(保藏号：KCTC13322BP)菌株，其破碎液或其培养液。

另一方面提供一种用于改善微生物菌丛的化妆品组合物，其包括戊糖乳杆菌HB-8023(保藏号：KCTC13322BP)菌株，其破碎液或其培养液。

一方面提供一种用于改善皮肤屏障的化妆品组合物，其包括戊糖乳杆菌HB-8023(保藏号：KCTC13322BP)菌株，其破碎液或其培养液。

术语“戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)HB-8023(保藏号：KCTC13322BP)”是乳杆菌属中的一种微生物，其是革兰氏阴性细菌，并且是生成乳酸的微生物。所述戊糖乳杆菌菌株可以具体为戊糖乳杆菌HB-8023，其以保藏号KCTC13322BP保藏。

术语“培养液”是指包括通过将菌株在培养基中培养来使菌株吸收营养并通过物质代谢产生的副产物的培养基，并且可以包括所述培养基的稀释液或浓缩液、干燥所述培养基而获得的干燥物、所述培养基的粗精净化产物、纯化物或其混合物等的通过使用所述培养基能够形成的任何剂型的培养物。

术语“皮肤屏障”可以指由角质形成细胞和脂质组成作为皮肤的最外层即表皮的上部层的角质层。构成皮肤屏障的脂质可以是神经酰胺(50％)、胆固醇(25％)和脂肪酸(25％)。当这些脂质减少时，由于屏障的破坏，皮肤很容易暴露于外部刺激，导致干燥和衰老。通常，在特应性皮炎或干燥皮肤中可以确认到神经酰胺的减少，此外，胆固醇的含量会随着年龄的增长而减少。在这些表皮脂质的合成中，表皮胆固醇合成可以与3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(3-hydroxy-3methylglutaryl-Coenzyme A；HMG CoA)还原酶(reductase)的活性度增加有关，表皮脂肪酸合成可以与乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoAcarboxylase)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase；FAS)活性度增加有关，表皮神经酰胺合成可以与丝氨酸棕榈酰转移酶(serine palmitoyl transferase；SPT)有关。因此，这些酶的增加可以指具有通过增加表皮脂质的合成而有助于改善长期的皮肤屏障功能来增强皮肤的水分含有能力并防止皮肤干燥等的皮肤保护效能。

术语“改善”可以指至少减小与治疗状态相关的参数如症状程度的所有动作行为。

根据一实施例，所述菌株，其破碎液或其培养液可以在植物培养基中被培养。

根据一实施例，所述植物培养基可以包括葡萄糖、豌豆蛋白胨(pea peptone)、酵母提取物、硫酸镁(magnesium sulfate)和硫酸锰(manganese sulfate)。

根据一实施例，基于所述植物培养基的总重量，可以包括0.001重量％至40重量％的所述葡萄糖、0.0001重量％至20重量％的所述豌豆蛋白胨，0.0001重量％至20重量％的所述酵母提取物、0.0001重量％至5重量％的所述硫酸镁和0.0001重量％至5重量％的所述硫酸锰。

所述葡萄糖可以包括0.01重量％至40重量％、0.1重量％至35重量％、1重量％至30重量％和10重量％至30重量％，所述豌豆蛋白胨可以包括0.001重量％至20重量％、0.01重量％至15重量％、1重量％至15重量％和5重量％至15重量％，所述酵母提取物可以包括0.001重量％至20重量％、0.01重量％至15重量％、0.1重量％至15重量％和5重量％至15重量％，所述硫酸镁和硫酸锰可以包括0.0001重量％至2重量％、0.001重量％至2重量％和0.001重量％至1重量％。

根据一实施例，所述化妆品组合物可以用于改善皮肤微生物菌丛。

术语“微生物菌丛(microbial flora)”是指包括在人体中存在的所有细菌、真菌和其他原核生物的微生物群落，并主要栖息在胃和皮肤等中。例如，栖息在皮肤上的有益菌或常在菌包括表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，并且有害菌包括葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、大肠菌(Escherichia coli)、念珠菌属(Candida spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、丙酸杆菌属(Propionibacterium spp.)、马拉色菌属(Malassezia spp.)、毛癣菌属(Trichophyton spp.)、链球菌(Streptococcs spp.)、不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium spp.)和其组合。

术语“微生物菌丛改善”可以指微生物菌丛的组成在通过组合物的施用和摄取减少有害菌的比例且增加有益菌的比例的方向上变化。

根据一实施例，所述化妆品可以用于抑制瘙痒。

所述瘙痒可以是由诸如以下的活性物质引起的瘙痒：胰蛋白酶(Trypsin)、类胰蛋白酶(Tryptase)、组织胺(Histamine)、抗霉素A(Antimycin A)、氯喹(Chloroquine)、β-丙氨酸(β-Alanine)、內皮素(Endothelin)、血清素(Serotonin)、聚肌胞苷酸(poly(I：C))、咪喹莫特(imiquimod)、胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin；TSLP)、异硫氰酸烯丙酯(Allyl isothiocyanate)、肉桂醛(cinnamaldehyde)和辣椒素(Capsaicin)等。

根据一实施例，所述化妆品可以用于改善皱纹。

所述改善皱纹可以指抑制或阻碍皮肤皱纹的产生，或者缓和已经形成的皱纹。

根据一实施例，所述戊糖乳杆菌HB-8023(保藏号：KCTC13322BP)菌株可以具有SEQID NO：1的16s rRNA序列。

根据一实施例，所述化妆品组合物可以包括0.01mg/g至20mg/g的多酚和0.01mg/g至20mg/g的类黄酮。

此外，所述化妆品组合物可以额外包括通常添加到化妆品组合物中的成分，例如诸如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维他命、颜料和香料的常规的助剂和载体。

所述化妆品组合物可以制备成本领域常规制备的任何剂型，例如，可以制剂成溶液、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、乳霜、乳液、粉末、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉末粉底、乳浊液粉底、蜡粉底和喷雾剂等，但不限于此。更具体地，可以制备成诸如以下的剂型：诸如柔软化妆水或营养化妆水等的化妆水、诸如面部乳液和身体乳液等的乳液、诸如营养霜、保湿霜和眼霜等乳霜、精华素、化妆软膏、喷雾剂、凝胶、面膜、防晒霜、妆前基础打底、液体型、固体型或喷雾型等的粉底和粉末等。在这种情况下，所述化妆品组合物可以含有赋形剂，其包括乳化剂、皂酸、溶剂、着色剂、保存剂、抗氧化剂、消泡剂、抗菌剂、抗再沉积剂、酶、植物油或矿物油、脂肪、荧光物质、杀真菌剂、疏水性诱导剂、保湿剂、芳香剂、芳香剂载体、蛋白质、硅、增溶剂、糖衍生物、防晒剂、维他命、植物提取物和蜡等。

当所述化妆品组合物的剂型是糊剂、乳霜或凝胶时，可以使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石粉或氧化锌作为载体成分。

当所述化妆品组合物的剂型是粉末或喷雾剂时，可以使用麦芽糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰亚胺粉末作为载体成分，特别是在喷雾剂的情况下，可以额外包括诸如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚的推进剂。

当所述化妆品组合物的剂型是溶液或乳浊液时，可以使用溶剂、增溶剂或乳浊化剂作为载体成分，例如，可以是水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇油、甘油脂肪族酸酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯。

当所述化妆品组合物的剂型是悬浮液时，可以使用诸如水、乙醇或丙二醇的液相稀释剂、诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯的悬浮液、微晶纤维素、氢氧化铝、膨润土、琼脂或西黄蓍胶等作为载体成分。

另一方面提供一种用于增强皮肤屏障的皮肤外用剂组合物，其包括戊糖乳杆菌HB-8023(保藏号：KCTC13322BP)菌株、其破碎液或其培养液。

所述皮肤外用剂组合物可以是药物组合物，所述药物组合物的剂型可以是硬膏剂(plasters)、乳液剂(lotions)、搽剂(liniments)、液剂(liquids and solutions)气溶胶剂(aerosols)、浸膏剂(extracts)、软膏剂(ointments)、流浸膏剂(fluid extracts)、乳剂(emulsions)、悬浮剂(suspensions)、胶囊剂(capsules)、乳霜剂(creams)、软或硬明胶胶囊、贴付剂和缓释剂。此外，可以按照每种常规方法制剂成护肤液、润肤乳、乳液、乳霜、软膏、凝胶、喷雾剂、摩丝、液相剂、面膜剂或贴付剂的形式来使用。

另一方面提供一种用于改善皮肤屏障的食物组合物或保健功能食品，其包括戊糖乳杆菌HB-8023(保藏号：KCTC13322BP)菌株、其破碎液或其培养液。

在所述食物组合物或保健功能食品中，可以将有效成分直接添加到食物中或与其他食物或食物成分一起使用，并且可以根据常规方法适当地使用。有效成分的混合量可以根据其使用目的(用于预防或改善)适当地确定。通常，当制备食物或饮料时，可以以基于原料的约15重量％以下，更具体地为约10重量％以下的量添加所述保健功能食品。但是，在以健康和卫生为目的或以健康控制为目的的长期摄取的情况下，所述量可能少于所述范围。

所述食物组合物或保健功能食品可以进一步包括载体、稀释剂、赋形剂和添加剂中的至少一种，并可以制剂成选自片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、粉末剂、胶囊剂和液剂中的一种。能够添加根据一方面的化合物的食物包括各种食物类、粉末、颗粒、片剂、胶囊、糖浆剂、饮料、口香糖、茶、维他命复合物和保健食品类等。

所述食物组合物或保健功能食品除了含有所述有效成分以外，还可以含有其他成分作为必要成分而没有特别限制。例如，与普通饮料一样，可以含有各种调味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。所述天然碳水化合物的比例可以通过本领域技术人员的选择适当地确定。

另一方面提供一种改善皮肤屏障、改善皱纹、抑制瘙痒或改善皮肤微生物菌丛的方法，其包括将所述组合物施用于个体的皮肤上。

术语“施用”包括施用或涂上至个体的皮肤上的方法，例如通过手指、刷子、棉球、垫、喷雾剂、海绵、棉棒、滚涂(roll-on)等的施用。本领域技术人员可以容易地确定适当的施用方法。

所述组合物可以是上述范围内的组合物，并且如上所述，通过施用所述组合物可以达到改善皮肤屏障、改善皱纹、抑制瘙痒和改善皮肤微生物菌丛效果。

根据一实施例，所述组合物可以增加作为与皮肤屏障功能相关的因子的凋亡相关因子(FAS)、人绝经期促性腺激素(human menopausal gonadotropin；HMG)、辅酶A(coenzyme A；CoA)、SPT因子的表达。此外，可以促进保湿相关基因的表达，并具有改善皮肤保湿力的临床效果。另外，具有抑制由紫外线引起的炎性物质表达的效果。此外，具有通过促进原骨胶原的生物合成来改善皱纹的效果。另外，由于具有增加的总多酚和类黄酮含量，还包括更多的有效成分。此外，可以通过减少胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromallymphopoietin；TSLP)表达而具有抑制瘙痒的效果。

附图说明

被包括以提供对本发明的进一步理解并且被并入且构成本说明书的一部分的附图例示本发明的示例性实施例，并且与说明书一起用于解释本发明构思。

图1为示出实施例和比较例影响皮肤有益菌和皮肤有害菌的生长变化的效果的结果。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅用于例示性地说明本公开目的，并且本公开的的范围不受这些实施例的限制，并且对于本公开所属领域的普通技术人员而言将是显而易见的。

[实施例]

戊糖乳杆菌HB-8023菌株的分离培养和鉴定

收集10g的济州柑橘泡菜并将其放入100ml的灭菌水中，在37℃下静置1小时。使用盐水稀释静置的灭菌水来按照每个稀释阶段分株并平板塗抹100μl至乳杆菌MRS肉汤(difco)固体培养基，并将经塗抹的固体培养基在37℃下培养两天。分取培养后生成的戊糖乳杆菌HB-8023(Lactobacillus pentosus；KCTC 13322BP)的菌落。通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction；PCR)对所述戊糖乳杆菌HB-8023进行分析。PCR反应条件为94℃预变性60秒，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，重复35个循环后72℃再延伸50分钟，最后在15℃(ever)下维持。此时，使用具有如下表2所示的引物序列(primersequence)的8种引物。作为分析结果，16S rRNA序列号如SEQ ID NO：1所示。

【表1】

实施例的制备

实施例1.植物培养基培养物(戊糖乳杆菌HB-8023；KCTC13322BP)

将戊糖乳杆菌HB-8023(Lactobacillus pentosus；KCTC13322BP)接种于培养基中，所述培养基包括20重量％的葡萄糖、10％重量的豌豆蛋白胨、10％重量的酵母提取物、2％的硫酸镁和2％的硫酸锰。在37℃下培养两天后，从除去菌体的培养物中制备实施例1。

实施例2.植物培养基石榴发酵物

将戊糖乳杆菌HB-8023(Lactobacillus pentosus；KCTC13322BP)接种到其中添加10％的石榴提取物的实施例1的培养基中。在37℃下培养两天后，从除去菌体的培养物中制备实施例2。

实施例3和实施例4.化妆品组合物

制备了实施例3和实施例4，其分别为含有实施例1和实施例2的化妆品组合物。制备的化妆品为乳霜状，其组成如表2所示。首先，将表2中记录的甲)相加热并在70℃下保存，并在乙)相上添加甲)相来进行预乳化，然后以均质机均匀乳化并缓慢冷却，从而制备乳霜。

【表2】

比较例的制备

比较例1.植物培养基培养物(戊糖乳杆菌JCM-1558；KCTC3120)

为了确认根据实施例1和菌株之间的差异的效果，制备了比较例1。将戊糖乳杆菌JCM-1558(Lactobacillus pentosus；KCTC3120)接种于培养基中，所述培养基包括20重量％的葡萄糖、10重量％的豌豆蛋白胨、10重量％的酵母提取物、2重量％的硫酸镁和2重量％硫酸锰。在37℃下培养两天后，从除去菌体的培养物中制备比较例1。

比较例2.动物培养基培养物

为了确认根据实施例2和培养基组成之间的差异的效果，制备了比较例2。将戊糖乳杆菌HB-8023(Lactobacillus pentosus；KCTC13322BP)接种于培养基中，所述培养基包括20重量％的葡萄糖、10重量％的牛肉提取物、10重量％的酵母提取物、2重量％的硫酸镁和2重量％的硫酸锰。在37℃下培养两天后，从除去菌体的培养物中制备比较例2。

比较例3至比较例5.化妆品组合物

制备了比较例3和比较例4，其分别为含有比较例1和比较例2的化妆品组合物。此外，制备了比较例5作为对照组，其为不包括培养物或发酵物的化妆品组合物。制备的化妆品为乳霜状，其组成如上表2所示。首先，将表2中记录的甲)相加热并在70℃下保存，并在乙)相上添加甲)相来进行预乳化，然后以均质机均匀乳化并缓慢冷却，从而制备乳霜。

[试验例]

试验例1.确认皮肤微生物菌丛的改善效果

为了确认实施例和比较例的皮肤微生物菌丛改善效果，进行了以下试验。

选择表皮葡萄球菌为皮肤有益菌，并且选择金黄色葡萄球菌为皮肤有害菌。从韩国典型菌种保藏中心(Korean collection for type cultures)接收所述表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis KCTC 1917)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusKCTC 1916)的分养。所述两种微生物与在胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic soy broth；TSB,merck)培养基中在32℃下培养一天的培养物混合，并用于试验。通过使用紫外可见分光光度计(UV-VIS spectrophotometer)在600nm下测量液相状态下的与实施例混合并培养的有害菌和有益菌的生长率。

在96孔板中，用1％含量的实施例和比较例分别处理皮肤有害菌和皮肤有益菌，并在TSB培养基中在37℃下培养一天。皮肤有益菌和皮肤有害菌的生长率在O.D600nm处测量。通过将每个值与阴性对照组(无样品处理)进行比较来计算生长率，被广泛用作化妆品成分的积雪草提取物由于具有抗菌和消炎作用，因此被用作阳性对照组。

<式1>

微生物生长率(％)＝100-{((A-B)/A)×100}

A：未用本公开的样品进行处理的对照组孔的吸光度

B：用本公开的样品进行处理的实验组孔的吸光度

如图1所示，在植物培养基中培养的实施例1和实施例2中均抑制了作为有害菌的金黄色葡萄球菌的生长，并且增加了作为有益菌的表皮葡萄球菌的生长。其中，实施例2显示出金黄色葡萄球菌的生长率为44％，并且确认了其抑制了最多的作为有害菌的金黄色葡萄球菌。比较例1和比较例2均显示出抑制皮肤有益菌和皮肤有害菌的生长的特性，特别地，比较例2对皮肤有益菌和皮肤有害菌均显示约60％的生长率，并且具有抑制两种菌生长的特性。

因此，确认了实施例1和实施例2能够通过抑制皮肤有害菌的生长并促进皮肤有益菌的生长而有助于改善皮肤微生物的菌丛。

试验例2.确认皮肤屏障改善效果

为了测量实施例和比较例的皮肤屏障改善效果，通过使用逆转录PCR(RT-PCR)方法评估与皮肤屏障功能相关的因子即FAS、HMG CoA和SPT因子的表达水平。RT-PCR方法是使用蛋白质的mRNA增幅的方法，当目标蛋白质的mRNA增加时，蛋白质合成也增加。

在添加了10％胎牛血清(fetal bovine serum；FBS)的培养基中，分株每3ml在35ф皿中稀释为3×10⁵/ml的角质形成细胞并培养24小时。将样品在含有2％FBS的培养基中稀释，并进一步培养24小时。培养后使用RNeasy小提试剂盒(mini kit)(Qiagen，希尔登(Hilden))提取总RNA，cDNA合成通过将1μg的总RNA与Oligo(dT)15引物、0.5uM的脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate：dNTP)、1单位(unit)的核糖核酸酶(RNase)抑制剂以及4单位的Omniscript反转录试剂盒(reverse transcriptase)(Qiagen，希尔登，德国)在37℃下加热60分钟并在93℃下加热5分钟来终止反应。进行PCR以从cDNA增幅FAS、HMG CoA和SPT。通过PCR产生的产物在2％琼脂糖凝胶上电泳来以图像分析仪(imageanalyzer)确认基因的表达，使用Image J程序(NIH Image软件，马里兰州，美国)测量每个条带的密度。

【表3】

在评估改善皮肤屏障功能的基因表达率的结果，如所述表3所示，确认了实施例1和实施例2的表达率高于比较例1和比较例2的表达率。因此，确认了相比于植物培养基培养物(戊糖乳杆菌JCM-1558；KCTC3120)和动物培养基培养物，植物培养基培养物(戊糖乳杆菌HB-8023；KCTC13322BP)和发酵物具有更高的皮肤屏障功能改善效果。

试验例3.确认皮肤保湿效果

3-1.确认保湿相关的基因表达促进

为了确认实施例和比较例中保湿相关基因表达的促进，进行了以下试验。

通过使用RT-PCR方法来测量作为在皮肤中产生的天然保湿因子(NaturalMoisturizing Factors；NMF)的前驱体的丝聚蛋白(filaggrin)、将水和甘油输送到整个皮肤以保持皮肤湿润的水通道蛋白3(aquaporin3)和作为在细胞中合成透明质酸的酶的透明质酸合酶3(Hyaluronan synthase 3；HAS 3)的表达，从而评估保湿效果。在添加了10％FBS的培养基中，分株每3ml在35ф皿中稀释为3×10⁵/ml的角质形成细胞并培养24小时。然后，将样品在含有2％FBS的培养基中稀释，并进一步培养48小时。培养后使用RNeasy小提试剂盒(Qiagen，希尔登，德国)提取总RNA,cDNA合成通过将1μg的总RNA与Oligo(dT)15引物、0.5uMdNTP、1单位的RNase抑制剂以及4单位的Omniscript反转录试剂盒(Qiagen，希尔登，德国)在37℃下加热60分钟并在93℃下加热5分钟来终止反应。PCR为了从cDNA增幅AQP-3、HAS-3和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；GAPDH)将2μl的cDNA、0.5uM的5'和3'引物、10×缓冲液(10mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)，pH8.3，50mM氯化钾(KCl)，0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X 100))、200uM的dNTP、25mM氯化镁(MgCl2)、2.5单位的Taq聚合酶(Qiagen，希尔登，德国)混合并用蒸馏水(distilledwater)将其整体调节至25μl后，进行PCR。通过PCR产生的产物在2％琼脂糖凝胶上电泳来以图像分析仪(Davinch k,韩国)确认基因的表达，并且使用Image J程序(NIH Image软件，马里兰州，美国)测量每个条带的密度。

结果，如表4所示，当与标准菌株和作为动物培养基组成的发酵物进行比较时，确认了保湿相关基因在实施例1中比作为阳性对照组的透明质酸1％增加，特别地，确认了在皮肤保湿中起重要作用的丝聚蛋白的基因表达与对照组相比增加了4倍。

【表4】

因此，确认了相比于植物培养基培养物(戊糖乳杆菌JCM-1558；KCTC3120)和动物培养基培养物，植物培养基培养物(戊糖乳杆菌HB-8023；KCTC13322BP)和发酵物具有更高的皮肤保湿改善效果。

3-2.确认皮肤保湿效果

为了测量对于化妆品组合物的皮肤保湿力改善的临床效果，进行以下试验。

以20多岁至40多岁的20名女性作为目标，在确定两个要测量的部位并分别测量三次皮肤中的水分量之后，在按照涂上实施例3、实施例4和比较例3至5的化妆品组合物的时间(涂上、涂上后30分钟、60分钟后、90分钟后、120分钟后)使用作为皮肤水分含量测量装置的皮肤水分含量测试仪(Coneometer)(CM 825,C+K,德国)来测量在角质层正下方的表皮层中的水分。

如下表5所示，在按照时间测量来确认认皮肤水分量的结果，与比较例3至5相比，实施例3和实施例4在涂上2小时后显示出最佳的水分量和保湿持久性，其中，实施例4的值最高。

【表5】

因此，确认了相比于包括植物培养基培养物(戊糖乳杆菌JCM-1558；KCTC3120)和动物培养基培养物的化妆品组合物，包括植物培养基培养物(戊糖乳杆菌HB-8023；KCTC13322BP)和发酵物的化妆品组合物具有更高的皮肤保湿改善效果。

试验例4.测量抑制通过紫外线照射的炎症物质表达的效果

为了测量实施例和比较例的抑制通过紫外线的炎症物质表达的效果，进行了以下试验。

测量了抑制通过紫外线照射表达的炎性细胞因子表达的程度。作为对照组，使用了羟基积雪草甙(SIGMA)，其为积雪草提取物的主要成分，并且以其减轻炎症的功效而著称。当皮肤受到外部刺激时，促炎细胞因子(proinflammatory cytokines)IL1((alpha,beta)，IL6，和TNF alpha被分泌为初始炎症反应。当随着细胞因子的增加而炎症进一步发展时，作为炎症介质的cox-2的表达增加，从而产生炎症产物PGE2。在本文中，通过使用RT-PCR方法评估促炎细胞因子和作为炎症介质的cox-2的表达。RT-PCR方法是使用蛋白质的mRNA增幅的方法，当目标蛋白质的mRNA增加时，蛋白质合成也增加。

在添加了10％FBS的培养基中，分配每3ml在35ф皿中稀释为3×10⁵/ml的角质形成细胞并培养24小时。然后，用15mJ/cm²的UVB照射，将样品在含有2％FBS的培养基中稀释之后，并进一步培养24小时。培养后使用RNeasy小提试剂盒(Qiagen，希尔登)提取总RNA，cDNA合成通过将1μg的总RNA与Oligo(dT)15引物、0.5uM的dNTP、1单位的RNase抑制剂以及4单位的Omniscript反转录试剂盒(Qiagen，希尔登，德国)在37℃下加热60分钟并在93℃下加热5分钟来终止反应。进行PCR以从cDNA增幅IL-1α、TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2和GAPDH。通过PCR产生的产物在2％琼脂糖凝胶上电泳来以图像分析仪确认基因的表达，使用Image J程序(NIH Image软件，马里兰州，美国)测量每个条带的密度。因此，确认了相比于包括植物培养基培养物(戊糖乳杆菌JCM-1558；KCTC3120)和动物培养基培养物的化妆品组合物，包括植物培养基培养物(戊糖乳杆菌HB-8023；KCTC13322BP)和发酵物的化妆品组合物具有更高的皮肤保湿改善效果。

通过以下式2计算。

<式2>

表达抑制率(％)＝1-(St-Bo)/(Bt-Bo)×100

Bo：未经过紫外线照射和未经过样品处理的孔的产量

Bt：经过紫外线照射和未经过样品处理的孔的产量

St：经过紫外线照射和经过样品处理的孔的产量

【表6】

结果，如上述表6所示，相比于比较例1、比较例2和对照组，实施例1和实施例2显示出更高的对炎性细胞因子表达的抑制率和对炎症介质表达的抑制率，其中，实施例2显示最高的抑制率。

因此，确认了相比于植物培养基培养物(戊糖乳杆菌JCM-1558；KCTC3120)和动物培养基培养物，植物培养基培养物(戊糖乳杆菌HB-8023；KCTC13322BP)和发酵物具有更高的对炎症物质的抑制效果。

试验例5.测量原骨胶原生物合成促进效果

为了确认实施例和比较例的促进作为皮肤基质成分的1型原骨胶原的生物合成的效果，进行了以下试验。

使用维他命C(100μg/ml)作为阳性对照组，原骨胶原分析如下进行。从新生儿表皮组织中分离出的人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblast)从Modern TissueTechnology(MTT，韩国)接受分养，并在DMEM/F-12(3：1)培养基中添加10％FBS来培养至1×104细胞/cm²的浓度。当生长70％至80％时，将其按1：3的比例分株并继代培养，并将3至4代继代培养的细胞用于试验。为了进行测量原骨胶原的量的试验，在48孔板中培养90％或以上的成纤维细胞，以0.02％的浓度添加每个样品，并在24小时后通过使用原骨胶原型-1C-肽EIA试剂盒(procollagen type-1C-peptide EIA kit)(MK101,Takara，日本)来测量培养基中释放的原骨胶原的量。

结果，如下表7所示，确认了相比于维他命C，实施例1和实施例2类似地显示出原骨胶原生物合成的促进效果。

【表7】

因此，确认了相比于植物培养基培养物(戊糖乳杆菌JCM-1558；KCTC3120)和动物培养基培养物，植物培养基培养物(戊糖乳杆菌HB-8023；KCTC13322BP)和发酵物具有更高的皱纹改善效果。

试验例6.确认每个培养基中有效成分的差异

为了确认有效成分的差异是否由于实施例和比较例的培养基的种类的差异而出现，进行了以下试验。

6-1.测量总多酚含量

分别向1ml的实施例和比较例中加入10ml的蒸馏水后，加入2ml的福林酚试剂(Folin-Ciocalteu phenol reagent)(Sigma)并混合，然后在室温下反应5分钟。将2ml的20％碳酸钠添加到反应物中，然后混合，并在室温下反应1小时，在680nm下测量吸光度。此时，使用没食子酸(gallic acid)作为指标物质。

6-2.测量总类黄酮含量

将1.5ml的实施例和比较例与溶于相同量的甲醇中的2％氯化铝(AlCl₃)和水(H₂O)混合，然后在室温下反应10分钟，并在367nm下测量吸光度。此时，使用儿茶素(catechin)作为指标物质。

总多酚和总类黄酮含量的测量结果如表8所示，作为植物培养基组成的实施例1和实施例2显示出最高含量，并且实施例1和实施例2和比较例2的含量高于比较例1。

【表8】

因此，确认了相比于动物培养基，在植物培养基中培养的培养物和发酵物含有更多的多酚和类黄酮。

试验例7.确认皮肤皱纹改善效果

7-1.根据菌株类型的比较试验

为了比较包括植物培养基培养物(戊糖乳杆菌HB-8023；KCTC13322BP)或植物培养基培养物(戊糖乳杆菌JCM-1558；KCTC3120)的化妆品组合物的皮肤皱纹改善效果，进行了如下的试验。

制备如表2中所示的化妆品组合物来评估对于人的皮肤皱纹改善效果。以15名受试者(20至35岁的女性)作为对象，将实施例3涂在面部的右边部位并将作为对照组的比较例5涂在面部的左边部位，分别每天涂两次，持续2个月。

同样地，以20名受试者(20至35岁的女性)作为对象，将比较例3在面部的右边部位并将作为对照组的比较例5涂在面部的左边部位，分别每天涂两次，持续2个月。为了在试验完成后找出在使用产品前和使用两个月后的皮肤皱纹改善效果，通过制备硅材质的复制品(replica)来使用作为图像分析仪的能见度测定仪(visiometer：SV60,C+K ElectronicCo.，德国)测量指定部位的皱纹状态。结果如表9所示，该结果示出分别从两个月后的参数值减去2个月前的参数值的平均值。换句话说，该值越负，皱纹改善效果越高。如下表9所示，确认了实施例3相比于比较例3的乳霜显着促进皮肤皱纹改善效果。

【表9】

R1：皱纹等高线的最高值和最低值之间的差值/R2：将皱纹等高线任意分为五格后其中R1值的平均值/R3：分为五个的R1值中的最高值

因此，可以确认包括植物培养基培养物的(戊糖乳杆菌HB-8023；KCTC13322BP)的化妆品组合物相比于比植物培养基培养物(戊糖乳杆菌JCM-1558；KCTC3120)具有更高的皱纹改善效果。

7-2.根据培养基类型的比较试验

为了比较包括植物培养基培养物或动物培养基培养物的化妆品组合物的皮肤皱纹改善的效果，进行了以下试验。

同样地，以20名受试者(20至35岁的女性)作为对象，将比较例4在面部的右边部位并将作为对照组的比较例5涂在面部的左边部位，分别每天涂两次，持续2个月。

为了在试验完成后找出在使用产品前和使用两个月后的皮肤皱纹改善效果，通过制备硅材质的复制品(replica)来使用作为图像分析仪的能见度测定仪(visiometer：SV60,C+K Electronic Co.，德国)测量指定部位的皱纹状态。结果如下表10所示，该结果示出分别从两个月后的参数值减去2个月前的参数值的平均值。换句话说，该值越负，皱纹改善效果越高。

如下表10所示，确认了实施例3相比于比较例4和比较例5的乳霜显着促进皮肤皱纹改善效果。

【表10】

	R1	R2	R3
				实施例3	-0.25	-0.22	-0.18
比较例4	-0.23	-0.19	-0.17
				比较例5(对照组)	-0.13	-0.10	0.10

因此，可以确认了包括植物培养基培养物(戊糖乳杆菌HB-8023；KCTC13322BP)的化妆品组合物相比于包括动物培养基培养物的化妆品组合物具有具有更高的皱纹改善效果。

试验例8.确认抑制瘙痒的效果

为了确认实施例和比较例的抑制瘙痒的效果，进行以下试验。

胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic Stromal Lymphopoietin；TSLP)使各种生物信号的异常传递而诱发免疫失衡的最佳蛋白质，并是在与外部抗原或微生物接触时由组成皮肤的角质形成细胞、成纤维细胞或肥大细胞(mast cell)产生。迄今为止，TSLP可以说是已发现的各种生物学原因中特应性皮炎最强力的上位衍生物。通过测量TSLP表达的减少率，可以知道瘙痒的改善程度。

在添加了10％FBS的培养基中，分株每3ml在35ф皿中稀释为3×10⁵/ml的角质形成细胞并培养24小时。此后，将5ug/ml的聚肌胞苷(Poly(I：C))和样品在含有2％FBS的培养基中稀释，然后进一步培养48小时。培养后使用RNeasy小提试剂盒(Qiagen，希尔登，德国)提取总RNA，cDNA合成通过将1μg的总RNA与Oligo(dT)15引物、0.5uM的dNTP、1单位的RNase抑制剂以及4单位的Omniscript反转录试剂盒(Qiagen，希尔登，德国)在37℃下加热60分钟并在93℃下加热5分钟来终止反应。PCR为了从cDNA增幅TSLP和GAPDH将2μl的cDNA、0.5uM的5'和3'引物、10×缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，0.1％Triton X 100)、200uMdnTP、25mM MgCl2、2.5单位的Taq聚合酶(Qiagen，希尔登，德国)混合并用蒸馏水将其整体调节至25μl后，进行PCR。通过PCR产生的产物在2％琼脂糖凝胶上电泳来以图像分析仪(Davinch k,韩国)确认基因的表达，并且使用Image J程序(NIH Image软件，马里兰州，美国)测量每个条带的密度。

结果，如表11所示，确认了由实施例1和实施例2减少了由Poly(I：C)增加的TSLP基因。

【表11】

因此，可以得知植物培养基培养物(戊糖乳杆菌HB-8023；KCTC13322BP)和植物培养基培养物石榴发酵物在抑制瘙痒方面比植物培养基培养物戊糖乳杆菌JCM-1558；KCTC3120)和动物培养基培养物更有效。

包括戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)HB-8023(保藏号：KCTC13322BP)菌株，其破碎液或其培养液的组合物具有改善皮肤屏障、改善皮肤保湿、改善皱纹、增加总多酚和类黄酮含量、改善微生物菌丛或抑制瘙痒的效果。

虽然已在此描述了某些示例性实施例和实施方式，但是根据该描述，其它实施例和修改将是明显的。因此，本发明构思不限于这些实施例，而是限于所附权利要求的更宽范围，并且对于本领域普通技术人员来说，各种显而易见的修改和等同布置将是明显的。

序列表

<110> （株）伊思韩佛(IT'S HANBUL CO., LTD)

<120> 戊糖乳杆菌菌株和包括其的用于改善微生物菌丛和改善皮肤屏障的组合物

<130> PN130995KR

<160> 1

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1506

<212> RNA

<213> 戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)

<400> 1

gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgaacgaac tctggtattg 60

attggtgctt gcatcatgat ttacatttga gtgagtggcg aactggtgag taacacgtgg 120

gaaacctgcc cagaagcggg ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc gcataacaac 180

ttggaccgca tggtccgagt ttgaaagatg gcttcggcta tcacttttgg atggtcccgc 240

ggcgtattag ctagatggtg rggtaacggc tcaccatggc aatgatacgt agccgacctg 300

agagggtaat cggccacatt gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag 360

tagggaatct tccacaatgg acgaaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg 420

gtttcggctc gtaaaactct gttgttaaag aagaacatat ctgagagtaa ctgttcaggt 480

attgacggta tttaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 540

taggtggcaa gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gttttttaag 600

tctgatgtga aagccttcgg ctcaaccgaa gaagtgcatc ggaaactggg aaacttgagt 660

gcagaagagg acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaagaac 720

accagtggcg aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa agtatgggta 780

gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca taccgtaaac gatgaatgct aagtgttgga 840

gggtttccgc ccttcagtgc tgcagctaac gcattaagca ttccgcctgg ggagtacggc 900

cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt 960

taattcgaag ctacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tactatgcaa atctaagaga 1020

ttagacgttc ccttcgggga catggataca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc 1080

gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt attatcagtt gccagcatta 1140

agttgggcac tctggtgaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa 1200

atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggatggt acaacgagtt 1260

gcgaactcgc gagagtaagc taatctctta aagccattct cagttcggat tgtaggctgc 1320

aactcgccta catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata 1380

cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag agtttgtaac acccaaagtc 1440

ggtggggtaa ccttttagga accagccgcc taaggtggga cagatgatta gggtgaagtc 1500

gtaaca 1506

Claims

1.一种用于改善皮肤屏障的化妆品组合物，其包括戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)HB-8023(保藏号：KCTC13322BP)菌株，其破碎液或其培养液。

2.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其中，所述菌株，其破碎液或其培养液在植物培养基中被培养。

3.根据权利要求2所述的化妆品组合物，其中，所述植物培养基包括葡萄糖、豌豆蛋白胨(pea peptone)、酵母提取物、硫酸镁(magnesium sulfate)和硫酸锰(manganesesulfate)。

4.根据权利要求3所述的化妆品组合物，其中，基于所述植物培养基的总重量，包括0.001重量％至40重量％的所述葡萄糖、0.0001重量％至20重量％的所述豌豆蛋白胨，0.0001重量％至20重量％的所述酵母提取物、0.0001重量％至5重量％的所述硫酸镁和0.0001重量％至5重量％的所述硫酸锰。

5.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物用于改善皮肤微生物菌丛。

6.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物用于抑制瘙痒。

7.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物用于改善皱纹。

8.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其中，所述戊糖乳杆菌HB-8023(保藏号：KCTC13322BP)菌株具有SEQ ID NO：1的16s rRNA序列。

9.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物包括0.01mg/g至20mg/g的多酚和0.01mg/g至20mg/g的类黄酮。

10.一种用于增强皮肤屏障的皮肤外用剂组合物，其包括戊糖乳杆菌HB-8023(保藏号：KCTC13322BP)菌株，其破碎液或其培养液。

11.一种用于改善皮肤屏障的食物组合物，其包括戊糖乳杆菌HB-8023(保藏号：KCTC13322BP)菌株，其破碎液或其培养液。