KR20160141205A

KR20160141205A - 신규한 락토바실러스 속 균주 및 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20160141205A
Application number: KR1020150075812A
Authority: KR
Inventors: 신동주; 남상인; 최용복; 김용선; 강은수; 양수옥
Original assignee: 인코스(주)
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2016-12-08

Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주(기탁번호: KCTC18391P) 및 그 이용에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 우리나라 전통 발효 식품인 김치로부터 GRAS(Generally Recognized As Safe)급 신규한 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1균주를 분리하고 MRS 배지에 배양하여 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 노화방지, 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 락토바실러스 속 균주 및 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 { The novel strain Lactobacillus sp cosmetic composition containing the culture medium as an active ingredient }

본 발명은 락토바실러스 파라카제이 균주 배양액을 포함하는 피부 노화 방지, 미백용 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1(기탁번호: KCTC18391P) 균주 배양액을 포함하는 피부 노화 방지, 미백용 조성물 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 현대인들의 경제수준이 향상되고 사회생활의 참여도가 높아지면서 피부 미용 건강에 대한 관심이 다양한 연령층에서 높은 수준으로 증가하고 있다. 피부노화를 방지하고 피부 노화 과정을 지연시켜 건강한 피부를 유지하고자 하는 목적에 따라 많은 미용 관련 화장품 및 식품이 개발되고 있고 특히 발효 추출물을 이용한 피부 주름형성 완화와 개선을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

발효식품은 항산화 시스템 강화, 그리고 인체의 방어력을 높이는 면역 시스템 강화 효과를 가져다주며, 다양한 기능성 소재의 가능성이 보고되고 있다 (Magwamba et al., J. Food Port. 2010). 이러한 발효식품은 우수한 발효미생물과 이들의 발효작용에 의해 영양학적으로는 물론 생리 기능성 측면에서도 매우 우수한 물질을 함유하고 있는 식품이다.

따라서, 우수한 기능성 미생물을 다양하게 함유하고 있는 우리나라 전통발효 식품으로부터 식의약용으로 이용가능한 GRAS (Generally Recognized As Safe)급의 미생물 분리동정은 고부가가치를 가지고 산업적으로 이용가능성이 다양한 미생물자원의 확보를 위해서 반드시 필요한 분야라 할 것이다.

발효(fermentation)란 미생물이 분비하는 효소에 의해 유기물을 분해하거나 합성하는 과정을 말한다. 또한 미생물이 에너지를 얻는 과정에서 유용한 물질을 내는 것도 발효이다. 한국인은 이러한 발효와 친숙한데 예로부터 김치를 비롯하여 된장, 청국장 등의 전통 발효식품이 대표적이다. 이러한 발효과정은 무산소호흡을 하는 미생물들로 유기물을 완전히 분해 시키고 다른 종류의 유기물을 만들어 내기도 하여 적은 양의 에너지를 생성시킨다. 이러한 발효의 종류는 미생물에 따라 젖산발효, 알콜 발효, 프로피온산 발효, 메탄 발효 등이 있다.

피부의 색은 주로 피부 속에 존재하는 멜라닌(melanin)이라는 색소의 함량에 의해 결정된다. 멜라닌은 피부의 기저층에 존재하는 멜라닌 생성세포(멜라노사이트, melanocyte)에 의해서 생합성되고 세포질 돌기를 통하여 각질형성세포(keratinocyte)의 각화과정에 의해서 표피의 기저층에서 각질층으로 이동하게 된다. 이 멜라닌을 형성하는 주효소인 타이로시나아제 (tyrosinase)는 속도결정단계 (rate-limiting step)인 타이로신 (tyrosine)에서 디하이드록시페닐알라닌 (3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA, 도파)으로의 전환단계와 이후 단계인 도파(DOPA)에서 도파퀴논(DOPA quinone)으로의 전환단계를 매개한다. 따라서 타이로시나아제 효소의 활성을 저해하고 멜라닌 생성을 억제시켜 피부 미백 효과를 확인할 수 있다.

현재 미백제로 가장 많이 사용되는 알부틴은 L-타이로신과 경쟁적으로 작용하는 저해제이다. 또한 미백제로 많이 사용되는 코직산(Kojic acid)는 타이로시나아제 활성 부위의 구리를 킬레이팅(chelating)하여 타이로신에서 도파로, 그리고 도파에서 도파퀴논으로 진행되는 과정을 저해한다.

이에 본 발명자들은 피부 미백 및 노화방지 효과를 갖는 발효 산물에 대하여 예의 연구 노력한 결과, 유산균 배양액이 세포 독성 없이 미백 및 노화방지 효과를 동시에 가짐을 확인하였고, 특히 유산균 배양액에 따라 그 기능이 더욱 강화됨을 발견하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 과제는 타이로시나아제 활성 억제효능 및 항산화 효능이 우수하여 피부 미백 기능 및 노화방지 효과가 현저하게 우수한 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 배양액을 기능성 원료로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 배양 방법은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1를 배양하는 단계, 상기의 배양 후, 얻어진 균체 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 상등액을 회수하는 단계, 상기에서 회수한 상등액을 여과하여 잔존 균체를 완전히 제거하는 단계로부터 수득한 피부 노화방지 및 미백 활성을 가지는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 배양액 얻는 단계를 포함한다.

본 발명에 따르면, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주(기탁번호: KCTC18391P)를 배양한 균주 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 노화방지, 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~95%(w/w)로 함유하고, 특히 1.0~90%(w/w)로 함유하는 노화방지, 미백용 화장료 조성물을 형성할 수 있다. 상기한 배양액은 본 발명의 미백용 화장품 조성물에서 95% 이상의 농도로 포함되면 방부제, 향료, 기타성분을 사용하기 어려울 수 있고, 0.01% 이하의 농도로 포함되면 노화방지, 미백효과가 미미하여 첨가의 의미가 없다.

본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 배양액은 스킨류, 로션류, 에센스류, 크림류, 팩류, 파운데이션류 및 메이크업베이스류 등의 화장료 형태로 제조할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 예시한다. 다만 하기의 실시예들은 본 발명의 예시에 불과할 뿐이므로, 그것들에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

본 발명은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) 균주 배양액을 포함하는 피부 노화방지, 미백용 조성물은 타이로시나아제 활성 억제효능 및 항산화 효과가 우수하여 피부 노화방지, 미백 기능이 현저하게 우수하면서도 피부 자극이 없는 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1의 동정 결과 16S rRNA 서열 이다
도 2는 본 발명 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1의 동정 결과를 나타낸 균주계통도이다.
도 3은 Ascorbic acid, 락토바실러스 플렌타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 배양액과 본 발명 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 배양액의 Tyrosinase 효소억제 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 Ascorbic acid, 락토바실러스 플렌타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 배양액과 본 발명 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 배양액의 DPPH(2.2-diphenyl-1-picryl hydrezyl) 라디칼 소거능 결과를 나타낸 그래프이다.

<실시예1> 유산균 분리 동정

유산균의 분리에 사용한 배추김치로 가정에서 직접 담근 2년 이상 된 묵은 김치를 사용하였다. 미생물 분리, 배양 및 보존에 사용된 배지는 Lactobacilli MRS Broth Difco사(Detroit, Ml, USA)의 제품이었다.

유산균을 분리하기 위하여, 3000rpm, 5분 동안 원심분리기에서 원심분리하여 상기 배추김치로부터 김치의 액상 부분만을 분리하였다. 분리된 상등액 20㎖를 취하여 Lactobacilli MRS Broth 1ℓ에 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하였다.

시료 1㎖를 취하여 십진 희석법으로 희석한 후, 상기 희석액 100㎕를 MRS 아가 접시(agar plate)에 도말(spread)하여 37℃ 배양기에 48시간 동안 배양한 후, 균을 관찰하였다. 균이 생성된 아가 접시에서 콜로니(colony)를 선별하여 Lactobacilli MRS Broth에 접종한 후 Mushrom Tyrosinase inhibition assay 를 통한 미백 활성 여부를 판단하였다. 활성도가 높아진 균을 MRS 배지에 배양하여 이를 유산균으로서 실험에 사용하였다.

실험을 위하여 먼저 세균의 genomic DNA를 추출한 후, 하기의 프라이머 세트를 이용하여 16S rRNA 유전자 영역을 PCR(MJ Research PTC 225, Ramsey, Minnesota, USA)로 증폭하였다.

(1) 프라이머 세트 1(27F, 서열목록 2) : 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'

(2) 프라미터 세트 2(1492R, 서열목록 3) : 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACT T-3'

PCR 조건은 어닐링 온도 60℃이며, 증폭된 PCR 생산물은 QIAquick PCR purification Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정제하였다.

정제된 PCR 산물의 염기서열을 ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing ready reaction kit(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)와 ABI 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) 를 이용하여 분석하였다.

분석된 각 균주의 염기서열을 NCBI Blast 검색을 통해 GenBank에 등록된 염기서열들과 비교하여 가장 높은 유사도를 나타내는 표준 균주를 기준으로 각 균주를 동정하였다.

유산균 분리 동정 결과, 도1과 같은 16S RNA의 염기서열을 갖는 것으로 나타났다.

이를 기초로 계통수 연구한 결과, 분리된 균주는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) strain R094과 99%의 염기서열 유사도를 나타내어 락토바실러스 파라카제이 종에 속하는 균주로 동정할 수 있었다(도 2 참조).

상기 분리된 균주를 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1로 명명하여 한국생명공학연구원에 2012년 3월 5일, 기탁번호 KCTC12511BP로 기탁하였다.

<실시예2> 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 배양액 준비

MRS 유산균 배양 배지 1ℓ에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 1%를 접종하여 48시간 배양하여 배양액을 얻었다. 얻어진 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 배양액을 100℃에서 20분간 열을 가하여 균의 기능상실을 유도하였다. 원심분리기를 이용하여 8,000 × g에서 30분간 원심 분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 사용하였다.

<비교예1> 락토바실러스 플렌타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 배양액 준비

MRS 유산균 배양 배지 1ℓ에 락토바실러스 플렌타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 1%를 접종하여 48시간 배양하여 배양액을 얻었다. 얻어진 락토바실러스 플렌타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 배양액을 100℃에서 20분간 열을 가하여 균의 기능상실을 유도하였다. 원심분리기를 이용하여 8,000 × g에서 30분간 원심 분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 사용하였다.

<실시예3> 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 배양액의 미백 활성 검증

실시예1에서 얻어진 상기 배양액의 Tyrosinase 저해활성 측정하여 본 발명 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 배양액의 미백활성을 검정하였다. 이때 양성 대조군(positive control)으로 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였고, 대조군으로 미백 활성을 지닌 다른 유산균을 사용한 비교예1을 처리하여 사용하였다.

Tyrosinase은 반응 후 DL-β-3,4-dihydroxyphenyl alanine (DOPA) chrom을생성하게 되고 상기 생성물이 감소할수록 미백활성에 뛰어난 효과가 있음을 나타낸다. DL-β-3,4-dihydroxyphenyl alanine (DOPA) chrom은 비색법에 의해 측정하였다.

Tyrosinase효소의 기질로는 5mM DOPA 용액 0.2ml을 사용하였고, 상기 기질에 0.1M phosphate buffer (pH 6.8) 0.2mL, 본 발명 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 배양액 0.5mL과 tyrosinase (250unit/ml) 0.1mL을 첨가하여 35℃에서 2분간 반응한 후 그 반응액을 475nm에서 측정하였다. 측정된 흡광도는 하기 tyrosinase 활성 저해율 계산식을 이용하여 산출하였다.

<계산식>

Tyrosinase 효소활성 저해율 (%) = {1-(시료 첨가구의 흡광도/대조구의 흡광도)} X 100

실험결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 1 mg/ml, 0.1 mg/ml의 아스코르브산(ascorbic acid)은 각 99.0, 38.6%의 Tyrosinase 효소활성 저해율이 나타났으며, 비교예1의 10%, 1% 락토바실러스 플렌타룸 배양액은 각 78.1%, 31.6%의 Tyrosinase 효소활성 저해율이 나타났다. 본 발명 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 배양액에서 비교예1 보다 Tyrosinase 효소 저해활성이 높음을 알 수 있었다.

<실시예4> 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 배양액의 항산화 활성 검증

락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 배양액의 항산화 활성을 측정하기 위하여, DPPH(2.2-diphenyl-1-picryl hydrezyl) 라디칼 소거능을 사용하였다.

0.4 mM DPPH(2.2-diphenyl-1-picryl hydrezyl) 용액을 에칠 알콜에 녹여 여과한 후 즉시 사용하였다. 제조된 DPPH 용액과 시료 용액을 1:1로 혼합하여 격렬하게 섞은 후, 상온 암소에 10 분간 방치하였다. Microplate reader (BioTek, USA)를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정한 후, 하기 수학식 1을 통해 DPPH 라디칼 제거율(%)을 산출하였다. 이때 라디칼을 제거하는 양성 대조군(positive control)으로 0.1 mg/ml의 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다.

[수학식 1]

DPPH 라디칼 제거율(scavenging, %) = (A - B) / A x 100

상기 식에서, A는 공시험액에서 얻은 흡광도이고, B는 검액에서 얻은 흡광도임

실험결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml의 아스코르브산(ascorbic acid)은 각 98.5, 63.8%의 항산화 활성이 나타났으며, 비교예1의 10%, 1% 락토바실러스 플렌타룸 배양액은 각 79.3%, 45.5%의 항산화 활성이 나타났다. 본 발명 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 배양액에서 비교예1 보다 항산화능이 높음을 알 수 있었다.

<실시예5> 유연화장수(스킨로션)

하기의 표 1과 같이 상기 실시예2에서 만들어진 유산균 배양액을 함유하는 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량%
유산균배양액<실시예2>	10
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
카복시비닐폴리머	0.1
피이지-12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트80	0.4
에탄올	5
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

<실시예6> 밀크로션(유액)

하기의 표 2과 같이 상기 실시예2에서 만들어진 유산균 배양액을 함유하는 밀크로션을 수상과 유상은 각각 75℃에 가열 후 5분간 유화시켜 냉각 탈포하여 제조하였다.

원료명	중량%
유산균배양액<실시예2>	10
스쿠알란	5.0
밀납	4.0
폴리솔베이트60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

<실시예7> 영양크림

하기의 표 3과 같이 상기 실시예2에서 만들어진 유산균배양액을 함유하는 영양크림은 수상과 유상은 각각 75℃에 가열 후 5분간 유화시켜 냉각 탈포하여 제조하였다.

원료명	중량%
유산균배양액<실시예2>	10
밀납	10.0
폴리솔베이트60	1.5
피이지 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	10.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

<실시예8> 에센스

하기의 표 4과 같이 상기 실시예2에서 만들어진 유산균 배양액을 함유하는 에센스를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량%
유산균배양액<실시예2>	30.0
히아루론산	3.0
부칠렌글리콜	5.0
글리세린	5.0
위치하젤 추출물	0.5
레시친	0.2
알란토인	0.1
변성알콜	5.0
피이지60 하이드로제네이티드 캐스터 오일	0.5
내추럴베테인	1.5
잔탄검	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

Claims

김치에서 분리 동정한 미백 활성이 우수한 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus Paracasei) INK-1. (기탁번호: KCTC18391P)
락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1를 배양하는 단계; 상기의 배양 후, 얻어진 균체 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 상등액을 회수하는 단계; 상기에서 회수한 상등액을 여과하여 잔존 균체를 완전히 제거하는 단계로부터 수득한 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus Paracasei) INK-1 균주 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
2항에 있어서, 상기 유산균 배양액을 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.01~99%(w/w)로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨류, 로션류, 에센스류, 크림류, 팩류, 파운데이션류 및 메이크업베이스류 중 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 노화 방지, 미백 효과를 갖는 화장료 조성물.