CN114073659A

CN114073659A - 一种泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源类干酪乳杆菌的发酵产物制备及其应用

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Publication number: CN114073659A
Application number: CN202010761818.0A
Authority: CN
Inventors: 李俊; 周婧; 章漳; 黄�俊
Original assignee: Jala Group Co
Current assignee: Shanghai Natural Hall Group Co ltd
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2040-07-31
Also published as: CN114073659B

Abstract

本发明涉及生物提取领域及日化领域，公开了泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源类干酪乳杆菌发酵产物及其提取方法和应用。将泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌种子菌液接种到发酵培养基中，20～50℃，0～300rpm培养24～72小时。所得到的发酵产物可清除自由基、促进真皮成纤维细胞和表皮细胞增殖和活力、抑制酪氨酸酶、防止氧化损伤、防止紫外线UVA/UVB对皮肤产生的损伤以及促进胶原蛋白分泌，还可以调节皮肤菌群，帮助人体表面微生物菌群的稳态维持，因此具有维持皮肤健康、修复老化细胞的作用，能够抗衰老和美白，还能够对人皮肤细胞进行保护。该发酵产物可作为活性成分用于制备具有抗衰老、美白、防晒或保护皮肤屏障功能的皮肤外用剂。

Description

一种泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源类干酪乳杆菌的发酵产物制备及其应用

技术领域

本发明属于生物提取领域及日化领域，具体涉及泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源类干酪乳杆菌发酵产物及其提取方法和应用。

背景技术

鸡爪谷又名龙爪稷、鸡爪粟、鹰爪粟、鸭爪稗、碱谷等，是粟米的一种，鸡爪谷是西藏的称呼，广泛分布于东半球热带亚热带。夏尔巴人还保留着以鸡爪谷为主要原料酿酒的传统，与藏族人喜欢酿造乳酸杆菌酒不同的是，居住在亚热带气候区的门巴族、珞巴族、僜人和夏尔巴人更喜欢酿造类似于饮料的粮食酒，鸡爪谷酒酿制技艺是夏尔巴人在适应陈塘沟自然环境的基础上创造出来的非物质文化遗产，不仅是人们须臾不可分离的重要饮品，也是夏尔巴人的民族象征物和生活方式的体现物。类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)是近年来国外研究较多的一种益生乳酸细菌，广泛存在于传统的发酵乳制品和人体胃肠道中，还有少量报道表明也可从泡菜、发酵豆制品、发酵鱼制品以及一些酒类如低度清酒和白兰地中分离得到该菌种。研究表明，类干酪乳酸菌的代谢产物如有机酸、细菌素和苯乳酸等，不仅对很多细菌有拮抗作用，有的菌株还可抑制酵母及霉菌的生长。

角质细胞是表皮层中最主要的细胞，参与形成皮肤的物理屏障，防止物理、化学性及微生物等不良因素的侵袭，对皮肤起保护作用。皮肤衰老后的一个主要特征就是表皮变薄，伤口愈合速度变慢，这主要是由于表皮层中角质细胞的再生能力下降，角质细胞体系的增殖能力降低所导致。

真皮衰老表现为真皮对外来化学物清除力下降，真皮厚度变薄、胶原蛋白和弹性蛋白合成减少、分解增加，分解酶活性增强。这些现象都与成纤维细胞数减少以及分泌合成功能下降或异常有关。人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，是皮肤衰老和细胞受损后的主要修复细胞之一。它不但能够促进表皮细胞的迁移、增殖和分化，还能分泌大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，具有强大的自我更新能力，从而修复老化的皮肤。

色素沉着是由紫外线激活表皮中的黑色素细胞内的黑色素生成酶，产生色素所引起的。黑色素生成过程中，酪氨酸酶将酪氨酸转化成多巴，多巴醌，经非酶氧化而聚合生成大分子的黑色素。因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着。

自由基可以从细胞水平、分子水平乃至组织器官水平上对机体造成各种不可逆性的氧化性损伤，加速生物体细胞乃至整个机体的衰老进程，诱发各种与衰老相关的疾病。清除自由基或者保护自由基再次的氧化损伤，能够保护皮肤。

皮肤的衰老分为内源性老化和外源性老化，日光尤其是紫外线(ultraviolet UV)照射是外源性老化形成的主要因素，所以外源性老化又称为光老化。与皮肤光老化有关的主要是UVA(320nm-400nm)和少量的UVB(280-320nm)。紫外线UVB则会直接作用于表皮细胞，通过诱导氧化应激、炎症过程进而影响皮肤屏障功能，形成光损伤。如果能够保护UVA/UVB造成的细胞损伤则有利于防止皮肤老化和衰老。

皮肤表面菌群或表面微生态，作为人体皮肤物理屏障更外层的一种重要生物屏障，对皮肤的健康状态有着重要作用。表面菌群根据不同的性别、年龄、外部环境等具有明显的个体差异，而表面菌群的失衡，特别是某些条件致病菌在表面菌群中的比例异常时，往往会引起各种肌肤疾病。表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis是人体皮肤的常驻菌之一，而金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus比例异常时，则会破坏皮肤表面屏障，或者引起炎症等皮肤问题。因此可以通过降低S.aureus/S.epidermidis值，帮助人体表面微生物菌群的稳态维持，或对失衡的皮肤表面微生态进行调整修复。

以上为皮肤功能障碍、衰老或其他损失的主要原因。

发明内容

本发明旨在提供一种泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物的应用。

本发明的泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌经过发酵生成的发酵产物具有较好的自由基清除能力，能够促进真皮成纤维细胞和表皮细胞增殖，并对B16黑色素细胞中酪氨酸酶具有抑制作用，因此具有维持皮肤健康、修复老化细胞的作用，能够抗衰老同时具有美白功效的潜力。还能够对人皮肤细胞进行保护，防止氧化损伤以及防止紫外线UVA和UVB对皮肤产生的损伤。而且，发酵产物还可以调节皮肤菌群，降低金黄色葡萄球菌S.aureus与表皮葡萄球菌S.epidermidis的比值，帮助人体表面微生物菌群的稳态维持，或对失衡的皮肤表面微生态进行调整修复，可以保护或增强皮肤屏障。

本发明技术方案为：

泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物在制备皮肤外用剂方面的应用。优选的，所述皮肤外用剂为化妆品或护肤品。

泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物在制备具有抗衰老、美白、防晒或保护皮肤屏障功能的皮肤外用剂方面的应用。

泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物在制备清除自由基的皮肤外用剂、抑制酪氨酸酶活性的皮肤外用剂、抑制黑色素生成的皮肤外用剂的皮肤外用剂、防止氧化损伤的皮肤外用剂、抗氧化的皮肤外用剂、防光老化的皮肤外用剂，或者调节皮肤表面微生物菌群、修复功能的皮肤外用剂方面的应用。

泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物在制备促进角质细胞或成纤维细胞增殖的皮肤外用剂，或者促进胶原蛋白、弹性纤维蛋白和细胞修复因子分泌的皮肤外用剂方面的应用。

上述发酵产物的制备方法为：泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌种子菌液接种到发酵培养基中，20～50℃，0～300rpm培养24～72小时。优选的，发酵液经过过滤和脱色，0.1μm～0.5μm薄膜正压过滤，得到发酵滤液。优选的，用0.1μm～0.5μm聚醚砜树脂(PES)或尼龙膜进行正压过滤。

发酵液或发酵滤液可以进一步浓缩或干燥，得到浓缩液或者干粉。

优选的，所述泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌保藏号：CGMCCNo.19731。由中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)于2020年4月26日完成专利保藏。

该微生物采集自形态特征、生理生化特征、DNA序列分析(16S rDNA和pheS)等多相种水平鉴定检测，鉴定为类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，由中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)于2020年4月26日完成专利保藏，保藏号：CGMCC No.19731。

培养方法为：培养基为经过破碎过筛蒸煮灭菌的谷物如麦类(大麦、小麦、燕麦、黑麦等)、稻类(籼稻、粳稻、糯稻)、玉米、高粱或者是豆菽类和薯类及其组合，也可以是合成培养基如MRS及其改良培养基，或者谷物类与酵母膏、酵母蛋白胨、矿物元素、生长因子等搭配的半合成培养基。

优选的，种子培养基为MRS培养基；发酵培养基为YPD培养基或改良YPD培养基。

培养条件为，种子培养：MRS培养基中20～40℃、0～200rpm培养12-24小时，至OD₆₀₀为0.5-5.0；发酵培养：将所述种子液菌体按0.1％-10.0％接种量接入发酵培养基中，20-50℃，0～300rpm培养24-72小时，所述百分比为质量百分比。

这种泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌(CGMCC No.19731)经过发酵生成的发酵产物具有较好的自由基清除能力，能够促进真皮成纤维细胞和表皮细胞增殖，并对B16黑色素细胞中酪氨酸酶具有抑制作用，因此具有维持皮肤健康、修复老化细胞的作用，同时具有美白皮肤细胞的潜力。还能够对人皮肤细胞进行保护，防止氧化损伤以及防止紫外线UVA/UVB对皮肤产生的损伤，并能够调节皮肤菌群，降低金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌的比值，帮助人体表面微生物菌群的稳态维持，或对失衡的皮肤表面微生态进行调整修复，保护皮肤屏障或者防止炎症。还可以提高皮肤细胞内ATP含量，提高细胞活力。

以固含量计，这种泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物在含量为0.005％～2.0％的情况下，即具有上述作用并且表现出良好效果。

因此，上述泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌可用于制备皮肤外用剂。

鸡爪谷酒酒糟中除了类干酪乳杆菌外，还可能筛选获得到并有可能在化妆品中应用的菌种：酿酒酵母、假丝酵母属(Candida spp.)，梅奇酵母属(Metschnikowia spp.)毕赤酵母属(Pichia spp.)、覆膜酵母属(Saccharomycopsis spp.)、红酵母属(Rhodotorulaspp.)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等。

一种皮肤外用剂，其活性成分包括泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物。优选的，其活性成分为泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物；更优选的，所述泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌保藏号为CGMCC No.19731。

所述的泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物为发酵液、发酵滤液、发酵液或发酵滤液的浓缩液或者干粉。优选的，所述的泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物为发酵滤液、发酵滤液的浓缩液或者干粉。

一种具有清除自由基、抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素生成、防止氧化损伤、抗氧化功能、防光老化、防光损伤或调节皮肤表面微生物菌群、修复功能的皮肤外用剂，以泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物为活性成分。优选的，其活性成分为泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物。

一种能够促进角质细胞或成纤维细胞增殖或者促进胶原蛋白、弹性纤维蛋白和细胞修复因子分泌的皮肤外用剂，以泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物为活性成分。优选的，其活性成分为泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物。

本发明的有益效果在于，采用泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌进行发酵，所获得的发酵产物能够清除自由基、促进真皮成纤维细胞和表皮细胞增殖，可以促进胶原蛋白、弹性纤维蛋白和细胞修复因子分泌，并抑制酪氨酸酶，因此具有抗氧化、维持皮肤健康、修复老化细胞的抗衰老作用，同时具有美白皮肤细胞的潜力。还能够对人皮肤细胞进行保护，防止氧化损伤以及防止紫外线UVA/UVB对皮肤产生的损伤，并能够调节皮肤菌群，帮助人体表面微生物菌群的稳态维持，或对失衡的皮肤表面微生态进行调整修复，保护皮肤屏障或者防止炎症。还可以提高皮肤细胞内ATP含量，提高皮肤细胞活力。因此，将发酵产物或提取物用作皮肤外用剂的活性成分，可以实现抗衰老、美白、防晒或保护皮肤屏障功能，具有良好的应用前景和市场前景。

附图说明

图1为实施例8类干酪乳杆菌发酵产物对皮肤菌群调节作用

具体实施方式

实施例1菌株分离、纯化、鉴定和专利保藏

从泛喜马拉雅地区藏民的传统自制鸡爪谷酒酒糟中分离本发明所使用的菌种。

取1克样品与9mL生理盐水于恒温振荡培养箱振荡30min后梯度稀释至10倍，100倍与1000倍。将各个梯度的液体涂布到加入抗生素和1％CaCO₃的MRS固体培养基上，每次涂布取200μL稀释液。37℃条件下进行恒温培养。取生长平板产生透明圈的菌进行下一步操作。

用接种器材挑取较为理想的菌落，在平板上进行划线，灼烧灭菌后再次划线，重复灼烧划线直到划到适宜梯度后再次灼烧接种器材，并在平板底部标记序号以及接种时间。放置恒温培养下进行培养。待长到适宜大小再次进行单克隆。将单克隆菌株挑入液体MRS中进行扩增培养。将纯化后的乳酸菌进行16S测序。初步鉴定获得的乳酸菌送中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)进行形态特征、生理生化特征、DNA序列分析(16S rDNA和pheS)等多相种水平鉴定检测，鉴定为类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，将保留的菌种放入-80℃冰箱进行保藏。

MRS培养基36℃培养48h，菌落白色，圆形，表面光滑，湿润，边缘整齐；微观形态特点为菌体成杆状，0.5-0.8μm×1.0-2.1μm，单个、成对或呈链状排列，革兰氏阳性。

VITEK ANC鉴定卡表征该菌生理生化特性如下:

符号说明：“+”，阳性；“-”，阴性。

本株类干酪乳杆菌编号JBA-MBB-JT003，由中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)于2020年4月26日完成专利保藏，保藏号：CGMCC No.19731。

本发酵产物的培养基可以为经过破碎过筛蒸煮灭菌的谷物如麦类(大麦、小麦、燕麦、黑麦等)、稻类(籼稻、粳稻、糯稻)、玉米、高粱或者是豆菽类和薯类及其组合，也可以是合成培养基如MRS及其改良培养基，或者谷物类与酵母膏、酵母蛋白胨、矿物元素、生长因子等搭配的半合成培养基。

种子培养基(MRS培养基)：1％蛋白胨(Peptone)、1％牛肉提取Triammoniumcitrate物(Beef Extract)、0.5％酵母提取物(Yeast Extract)、2％葡萄糖(Dextrose)、0.2％柠檬酸三铵(Triammonium citrate)、0.5％乙酸钠(Sodium acetate)、0.01％MgSO₄、0.005％MnSO₄、0.2％K₂HPO₄、0.1％吐温80(Polysorbate)，余量为水，所述百分比为质量百分比。

发酵培养基(改良YPD培养基)：1％酵母浸粉(Yeast Extract)、2％酵母蛋白胨(Yeast Peptone)、2％葡萄糖(Dextrose)，余量为水，所述百分比为质量百分比。

2)培养条件

种子培养：MRS培养基中20～40℃、0～200rpm培养12-24小时，至OD₆₀₀为0.5-5.0；

发酵培养：将所述种子液菌体按0.1％-10.0％接种量接入发酵培养基中，20～50℃，0～300rpm培养24～72小时，所述百分比为质量百分比。

实施例2类干酪乳杆菌发酵产物的制备

1)培养基配制：按照乳酸杆菌生长要求分别配制种子培养基(MRS培养基)和发酵培养基(改良YPD培养基)，115℃，20～30min高温高压灭菌后冷却备用。

2)菌种活化：挑取-80℃保藏菌种，接入液体种子培养基中，摇床中20-40℃、0～200rpm培养12-48小时将菌种活化。

3)菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。

4)菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至液体MRS培养基中，20-40℃、0～200rpm培养12-24小时，得到发酵菌种子菌液，至OD₆₀₀为0.5～2.0。

5)乳酸杆菌接种发酵：将扩大培养后的乳酸杆菌菌液按1.0％接种量加入至已灭菌发酵培养基中，摇床20～50℃，0～300rpm培养24～72小时，所述百分比为质量百分比。

6)过滤及脱色：发酵后所得的发酵产物经0.22μm中空纤维膜除菌体及杂质后，滤液添加0.1～5.0％粉末或颗粒活性炭，4～60℃下静置或搅拌处理0.5～20小时，0.22μm聚醚砜树脂(PES)或尼龙膜正压过滤，调节得到最终固含量为1～2wt％左右的滤液，即得类干酪乳杆菌发酵产物，用于后续的实验和检测。表1为该类干酪乳杆菌发酵产物的理化参数。

表1类干酪乳杆菌发酵产物的理化参数

实施例3类干酪乳杆菌发酵产物的清除自由基能力

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)是一种稳定的氮中心有机自由基。DPPH法于1958年被提出，广泛用于地量测定生物试样、分类物质和食品的抗衰老能力。此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析，来检测自由基清除情况，从而评价样品的抗衰老能力。

实施例2的类干酪乳杆菌发酵产物(固含量1.7wt％)稀释，稀释后的样品液中分别含1.5％和15％体积比类干酪乳杆菌发酵产物，取稀释后的样品液0.1mL加入试管中，再加入0.1ml30μg/mL DPPH(浓度)乙醇溶液，混匀，室温下避光在黑暗处反应30min，在525nm处测定OD值，按照下面公式计算清除率：

清除率I(％)＝[1-(T-T₀)/(C-C₀)]×100％

式中：T₀：0.1ml样品液加0.1mL 95％乙醇的吸光度；T：0.1ml样品液加0.1ml 30μg/mL DPPH溶液的吸光度；C₀：0.1ml水加0.1ml 95％乙醇的吸光度；C：0.1ml水加0.1ml 30μg/mL DPPH溶液的吸光度。

表2类干酪乳杆菌发酵产物的DPPH清除率

实施例4类干酪乳杆菌发酵产物的细胞增殖作用

将实施例2的类干酪乳杆菌发酵产物(固含量1.7wt％的滤液)加入到人成纤维细胞和表皮细胞的各自无血清培养液中，以不含样品的去离子水为空白对照，含5％新生牛血清(FCS)的培养基为阳性对照，培养48小时后，用MTT法对细胞染色后，用酶标仪测定550nm处吸光度，空白对照的增殖率为100％，参比空白对照，评估对人成纤维细胞的增殖作用。

类干酪乳杆菌发酵产物对Fibroblast和HaCaT的生长影响如表3结果所示，添加3％(v/v)类干酪乳杆菌发酵产物能够使成纤维细胞和HaCaT的最高细胞活力分别达到135％和124％。

表3类干酪乳杆菌发酵产物对人皮肤细胞的增殖作用

因此，来自泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟的类干酪乳杆菌经发酵后的产物，能够促进表皮屏障形成和促进人皮肤细胞增殖，从而维持皮肤状态健康，修复老化的皮肤，具有抗衰老的潜力。

实施例5小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶抑制作用

皮肤的颜色来自于角质形成细胞内存储的黑色素。一般来讲，存储黑色素多的人肤色更深，也更受到保护，远离阳光辐射。黑色素数量和质量在皮肤黑色素是决定皮肤颜色的重要因素。酪氨酸酶是结构复杂的含铜氧化还原酶，广泛存在于微生物、动植物及人体中。在人体中酪氨酸酶是皮肤合成黑色素的关键酶。

近年的研究证明色素沉着是由紫外线激活表皮中的黑色素细胞内的黑色素生成酶，产生色素所引起的。人表皮中位于基底层的黑素细胞与周围的角质形成细胞接触并发生联系，构成“表皮黑素单元”，其中黑素是一种含氮的复合物,在黑素小体中进行合成。一般来讲，黑色素数量和质量在皮肤黑色素是决定皮肤颜色的重要因素。黑色素生成过程中，酪氨酸酶将酪氨酸转化成多巴，多巴醌，经非酶氧化而聚合生成大分子的黑色素。因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着。

采用L-Dopa氧化法测定样品对酪氨酸酶的抑制作用。小鼠黑色素瘤B16细胞以1×10⁵密度培养在96孔板中，经24h后，将发酵产物用培养基稀释后，加入到细胞中培养48h，去掉培养液，每孔加入含1％TritonX-100的PBS缓冲液100μL，然后加入50μL 0.2mg/mL的L-DOPA，37℃处理3h后再测定490nm的吸光值。按如下公式计算酶活力：酪氨酸酶抑制率＝[1-(实验组OD值/对照组OD值]×100％。同时用MTT法测定样品对B16细胞的活力影响。

采用NaOH裂解法测定细胞内黑色素的含量。小鼠黑色素瘤B16细胞以1X10⁵密度培养在12孔板中，经24h后，将发酵产物用培养基稀释后，加入到细胞中，培养48h弃去上清液，胰酶消化后离心收集细胞到离心管，加入150μL的1mol/L的NaOH溶液(含10％DMSO),在-80℃条件下充分裂解细胞1h,测定405nm的吸光值。B16细胞的蛋白浓度以BCA法测定，用于吸光值的校正。数据统计以对照组的百分比表示。

由表4结果可知，类干酪乳杆菌发酵产物能够抑制B16细胞的酪氨酸酶活性和黑素生成。

表4类干酪乳杆菌发酵产物对小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶抑制作用

实施例6类干酪乳杆菌发酵产物对皮肤细胞氧化损伤的保护作用

自由基可以从细胞水平、分子水平乃至组织器官水平上对机体造成各种不可逆性的氧化性损伤，加速生物体细胞乃至整个机体的衰老进程，诱发各种与衰老相关的疾病。过氧化氢(hydrogen peroxide，H₂O₂)是细胞内一种重要的氧自由基，对人体皮肤细胞能造成直接的氧化应激反应和氧化应激所致的氧化性损伤。在体外利用H₂O₂能够诱导并加速细胞因氧化应激所致的衰老进程，模拟体内氧化损伤的病理过程。

发酵产物加入到人成纤维细胞和表皮细胞的各自培养液中，培养24小时。然后换成含有过氧化氢(H₂O₂)500μM的饥饿培养基处理1h，再换成含有待测样品的培养基，继续培养24小时，用MTT法检测细胞活力。用不含H₂O₂处理的为空白对照。用VE作为阳性对照。空白对照的增殖率为100％，参比空白对照，评估样品对细胞活力的影响。

由表5结果可知，类干酪乳杆菌发酵产物对双氧水造成的细胞氧化损伤有明显的保护作用。

表5类干酪乳杆菌发酵产物对人皮肤细胞的氧化损伤保护作用

实施例7类干酪乳杆菌发酵产物对皮肤细胞紫外损伤的保护作用

皮肤的衰老分为内源性老化和外源性老化，日光尤其是紫外线(ultraviolet UV)照射是外源性老化形成的主要因素，所以外源性老化又称为光老化。与皮肤光老化有关的主要是UVA(320nm-400nm)和少量的UVB(280-320nm)。许多资料表明照射到皮肤的紫外线95％是由角质形成细胞吸收，皮肤暴露于UVA辐射下会产生ROS并导致氧化应激在内的不同损伤。紫外线UVB则会直接作用于表皮细胞，通过诱导氧化应激、炎症过程进而影响皮肤屏障功能，形成光损伤。因此我们用UVA/UVB照射人永生化表皮HaCaT细胞和真皮成纤维细胞Fibroblast建立皮肤的光损伤模型，利用该模型评估活性物对皮肤紫外损伤的保护作用。

发酵产物加入到人成纤维细胞和表皮细胞的培养液中，培养过夜24h。去除培养基后加入PBS，UVA(365nm)辐照，剂量为10J/cm2。UVB(312nm)辐照，剂量为40mJ/cm2，再加入含有待测样品的培养基，继续培养24小时，用MTT法检测细胞活力。无辐照组作为空白对照，用Vc作为阳性对照。空白对照的增殖率为100％，参比空白对照，评估样品对细胞活力的影响。

由表6和表7结果可知，类干酪乳杆菌发酵产物对UVA/UVB造成的细胞损伤有明显的保护作用。

表6类干酪乳杆菌发酵产物对人皮肤细胞的UVA损伤保护作用

表7类干酪乳杆菌发酵产物对人皮肤细胞的UVB损伤保护作用

实施例8类干酪乳杆菌发酵产物对皮肤菌群调节作用

人体皮肤表面和肠道中贮存着大量的微生物，自出生开始就伴随着我们，与人类为共生关系。其中，皮肤表面菌群或表面微生态，作为人体皮肤物理屏障更外层的一种重要生物屏障，对皮肤的健康状态有着重要作用。表面菌群根据不同的性别、年龄、外部环境等具有明显的个体差异，而表面菌群的失衡，特别是某些条件致病菌在表面菌群中的比例异常时，往往会引起各种肌肤疾病。表皮葡萄球菌(S.epidermidis)是人体皮肤的常驻菌之一，而金黄色葡萄球菌(S.aureus)比例异常时，则会破坏皮肤表面屏障，或者引起炎症等皮肤问题。因此可以通过降低S.aureus/S.epidermidis值，帮助人体表面微生物菌群的稳态维持，或对失衡的皮肤表面微生态进行调整修复。

将保藏的S.aureus和S.epidermidis接入无菌LB液体培养基中活化复苏(1CFU/4mL或50μL/mL)；摇床37℃，150-250rpm培养8-24小时后获得等OD₆₀₀菌悬液。利用S.aureus和S.epidermidis的等OD菌悬液，分别加入不同浓度的乳杆菌发酵产物滤液到无菌LB培养基中，获得质量百分数(以发酵产物干物质计)为0.05％、0.1％和0.5％的类干酪乳杆菌发酵产物培养基，测试体系总体积4mL，并按体积比0.2％～2％接种。培养8-24小时后，采用比浊法通过测定吸光值OD₆₀₀表示微生物的生物量。

类干酪乳杆菌发酵产物对皮肤菌群具有对S.aureus/S.epidermids比值的影响如图1所示。三种浓度下，S.aureus/S.epidermidis的值相比于空白对照的1.22，分别下降25.64％、35.15％和80.39％。这表明类干酪乳杆菌发酵产物能显著地降低生物量比值，并且随着浓度的增加而逐渐降低，具有将皮肤表面微生物菌群中S.aureus和S.epidermids的比例调整至更加健康状态的潜力。

实施例9类干酪乳杆菌发酵产物对细胞内ATP的影响

腺苷三磷酸(ATP adenosine triphosphate)是由腺嘌呤、核糖和3个磷酸基团连接而成，水解时释放出能量较多，是生物体内最直接的能量来源。生物体在其生命活动所需的能量都以ATP的形式来提供。作为最重要的能量分子，在细胞的各种生理过程中起着重要作用，ATP水平的改变会影响细胞的功能，如在细胞凋亡或者处于毒性状态时ATP水平会下降。因此用来评估类干酪乳杆菌发酵产物对皮肤细胞内ATP含量的影响。

发酵产物加入到人成纤维细胞培养液中，培养过夜24h。去除培养基后加入200μL裂解液，裂解细胞后4℃12000g离心5min，取上清液。按照ATP检测试剂盒说明操作检测样品ATP含量：取100μL检测工作液到检测孔内，室温放置3-5min，后加入20μL细胞裂解上清液或者ATP标准溶液。混匀后用化学发光仪测定后，以标准曲线计算细胞内ATP含量。同时，使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品中的蛋白浓度，然后以μmol/mg蛋白来表示ATP含量。

表8类干酪乳杆菌发酵产物对人皮肤细胞内ATP含量影响

**P<0.01

实施例10类干酪乳杆菌发酵产物对细胞分泌的I型胶原蛋白含量测定

皮肤衰老是机体衰老的重要外在表现之一,年龄的增长，成纤维细胞的合成能力下降，若皮肤中缺乏胶原蛋白，胶原纤维就会发生联固化，使细胞间粘多糖减少，皮肤便会失去柔软、弹性和光泽，发生老化。成纤维细胞是真皮层的主要细胞,具有合成和分泌胶原纤维、弹性纤维及其他基质成分的功能,这些成分与成纤维细胞共同作为真皮的主体并维持真皮层的弹性。Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)是青年期皮肤中含量最多的胶原蛋白,维持着皮肤真皮层结构稳定性。随着年龄增长成纤维细胞合成ColⅠ逐渐减少,使皮肤呈现出衰老的迹象。通过测定细胞内Ⅰ型胶原蛋白的含量中用来评估类干酪乳杆菌发酵产物对皮肤细胞的作用。

发酵产物加入到人成纤维细胞培养液中，培养过夜48h。用ELISA试剂盒检测Ⅰ型胶原含量：取细胞上清液40μL(以及标准品)加入酶标包被板后，在加生物素标记的抗Col-I抗体10μL。轻轻晃动混匀，加入50μL酶标试剂，37℃温育30min。吸去液体，加入洗涤液洗涤5次，拍干。加入显色剂100μL后，37℃避光显色10min加入50μL终止液。测定450nm的吸光值。根据标准曲线计算样品浓度。同时，使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品中的蛋白浓度，然后以ng/mg蛋白来表示I型胶原蛋白含量。

表9类干酪乳杆菌发酵产物对细胞分泌分泌的I型胶原蛋白含量测定

*P<0.05

实施例11类干酪乳杆菌发酵产物成分分析测定

表10类干酪乳杆菌发酵产物成分分析

Claims

1.泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物在制备皮肤外用剂方面的应用。

2.泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物在制备具有抗衰老、美白、抗氧化、提高皮肤细胞活力、防晒或保护皮肤屏障功能的皮肤外用剂方面的应用。

3.泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物在制备清除自由基的皮肤外用剂、抑制酪氨酸酶活性的皮肤外用剂、抑制黑色素生成的皮肤外用剂、防止氧化损伤的皮肤外用剂、防光老化的皮肤外用剂，或者促进角质细胞或成纤维细胞增殖和活力的皮肤外用剂，或者促进胶原蛋白分泌的皮肤外用剂或者调节皮肤表面微生物菌群功能的皮肤外用剂方面的应用。

4.权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述的泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物为发酵液、发酵滤液、发酵液或发酵滤液的浓缩液或者干粉。

5.权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述的类干酪乳杆菌的保藏号为CGMCC No.19731。

6.泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物的制备方法，其特征在于，步骤包括：将泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌种子菌液接种到发酵培养基中，20～50℃、0～300rpm培养24～72小时。

7.一种具有抗衰老、美白、抗氧化、防晒、提高皮肤细胞活力功能的皮肤外用剂，其特征在于，以泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物为活性成分。

8.一种具有清除自由基、抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素生成、防止氧化损伤、防光老化或调节皮肤表面微生物菌群功能的皮肤外用剂，其特征在于，以泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物为活性成分。

9.一种能够提高皮肤细胞内ATP含量，或者促进角质细胞或成纤维细胞增殖或者促进胶原蛋白、弹性纤维蛋白和细胞修复因子分泌的皮肤外用剂，其特征在于，以泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌发酵产物为活性成分。

10.一种泛喜马拉雅地区鸡爪谷酒酒糟来源的类干酪乳杆菌，其特征在于，保藏号为CGMCC No.19731。