CN113208956B - 一种具有抗光老化功效的大豆发酵液及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗光老化功效的大豆发酵液及其制备方法与应用。本发明往豆浆中加入Alcalase碱性蛋白酶，50‑60℃酶解，灭酶，豆浆冷却；在酶解后的豆浆中接种已活化的阿米塞毕赤酵母(Pichia amenthionina)Y或嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)ATW‑1种子液，使体系中菌数达105～108CFU/g，培养，离心，获得具有抗光老化功效的发酵液。本发明发酵液富含异黄酮、多肽和脂质，具有较高体外清除自由基能力和还原三价铁能力，细胞实验表明其能够提高光老化HaCaT细胞存活率以及SOD、CAT酶活，降低IL‑6、IL‑10和NO的生成，从而发挥抗光老化功效。

Description

一种具有抗光老化功效的大豆发酵液及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及大豆发酵液，特别是涉及一种具有抗光老化功效的大豆发酵液及其制备方法与应用，主要应用于皮肤护理的技术领域。
背景技术
皮肤光老化是内在生理老化和紫外线诱导的相互作用下形成的。光老化皮肤的特征是皱纹、色素沉着、皮肤粗糙、水分流失、弹性降低，同时成纤维细胞、角化细胞和浸润性中性粒细胞也发生多种变化。随着人们对逆转或预防光老化效应的兴趣日益浓厚，寻求有效的抗光老化产品是目前护肤品行业关注的焦点之一。目前市面上的抗光老化产品主要是防晒产品，分为物理防晒剂和化学防晒剂。物理防晒剂的主要有效成分是二氧化钛和氧化锌等颗粒，这些防晒颗粒会造成毛孔的堵塞，并且抵御紫外线的能力有限。化学防晒剂如二苯酮、水杨酸乙基己酯等对皮肤刺激性比较大，其适用人群受到限制。此外，防晒手段主要起预防光老化的作用，无法修复光损伤，因此具有修复光损伤能力且富含天然活性成分的抗光老化产品，受到越来越多消费者的欢迎，具有更加广阔的应用前景。
紫外线作用于皮肤细胞引发的一系列功能退化性变化，主要涉及染色体DNA、线粒体(活性氧代谢和线粒体DNA)及细胞外基质(胶原蛋白、基质金属蛋白酶、透明质酸、炎症因子)不同程度的损伤。当前已发现多种药物在光老化各阶段发挥抑制作用，包括一些维生素、植物提取物、微量元素、信号通路调节物质等。其中，植物提取物含有植物化学物质(酚类、酮类、皂苷、生物碱)和多糖类化合物，其抗氧化和抗光老化作用得到了证实，受到国内外学者的广泛关注。一些植物种子和酵母中还含有天然保湿因子神经酰胺，外源性神经酰胺可以作为表皮补充剂，改善皮肤屏障和提高持水力；神经酰胺的前体物质鞘氨醇可以促进天然保湿因子的生成，提高皮肤自身的保湿能力。植物中存在的多种活性成分对光老化机体的作用机制存在功能互补，植物提取物的抗光老化功效通常是多成分综合作用的结果，这一种综合作用可能比单一植物组分的抗光老化效果更为突出和明显。如中国发明专利申请2010101742072公开了一种雪莲花提取物的制备方法，用该方法获得的雪莲花提取物具有抗氧化以及抗UVA和UVB照射作用，能够用于皮肤抗老化，尤其是抗光老化，所述雪莲花提取物可用作化妆品添加剂或者药物活性成分。本发明还公开了雪莲花提取物在制备用于皮肤抗老化，尤其是抗光老化的化妆品或者药品中的应用。但是该技术雪莲花原料较为难得，价格相对较高，且产品的抗光老化性能有待提高。
又如中国发明专利2017110893139公开了一种护肤基质及其制备方法与包括其的化妆品，涉及化妆品领域，该护肤基质按重量百分比计包括以下组分：去离子水55％～85％、改性裂褶菌多糖0.1％～3％、1,3-丁二醇5％～35％、苯氧乙醇0.1％～0.6％、南极洲丛梗藻提取物0.5％～5％和菊苣根提取物0.5％～5％。该护肤基质能够缓解现有技术中的护肤品功能单一的技术问题，同时具有抗光老化、保湿和修护的功效。但该技术南极洲丛梗藻和菊苣根提取物原料处理较为复杂，且原料也难得，产品的抗光老化的性能也有待提高。
近年来，有研究表明，乳酸菌发酵提取物具有一定的美白、抗氧化和抗光老化效果。如发酵米糠提取物对人成纤维细胞能够增加I型胶原蛋白的生成量、减少MMP-1的表达以及抑制IL-1α的生成，具有抗光老化功效；布氏乳杆菌发酵小麦叶、燕麦、菊芋、大豆和雪莲果能降低弹性蛋白酶和胶原蛋白酶活力，提高了I型胶原蛋白的合成，保湿因子和抗氧化酶的表达量也有所增加。但是该类技术产品的抗光老化性能都有待提高。
中国发明专利2014102764255公开了一种质构良好的大豆酸奶的生产方法。该方法将大豆加入水中，在NaHCO3溶液中浸泡；进行80-90℃热水打浆，在大豆浸泡阶段添加Alcalase蛋白酶，搅匀后在25-35℃处理6-14h；或者在制备好的豆浆中添加Alcalase蛋白酶，40-80℃保温；加入蔗糖、乳糖和葡萄糖，充分溶解后，然后在70-121℃的温度下处理，冷却后接入经过活化的直投式菌种XPL-1，然后在37-45℃下培养5-12h，冷藏；得大豆酸奶。本发明由于Alcalase蛋白酶对大豆蛋白的适度降解使得多肽链之间形成的凝胶更加均匀细腻，因此大豆酸奶质构明显改善，但是该技术虽然利用了Alcalase蛋白酶对大豆进行酶解，但其作用主要用于改善大豆酸奶的品质，并没有意识到用于制备具有抗光老化功效产品。
中国发明专利2015102533344公开了一种产香酵母及其在发酵豆乳中的应用。该产香酵母阿米塞毕赤氏酵母(Pichia amethionina Y)的保藏号为CGMCC NO.10183；该产香酵母在发酵豆乳中的应用是将乳酸菌XPL-1种子液与Pichia amethionina Y种子液接种到灭菌的豆浆中，32-36℃发酵12-16h，可去除豆乳中的豆腥味，并产生芳香风味。本发明解决了发酵豆乳中豆腥味难以去除的问题，提高了发酵豆乳的风味特征。该技术虽然利用了阿米塞毕赤氏酵母(Pichia amethionina Y)，但该技术是将阿米塞毕赤氏酵母配合乳酸菌XPL-1种子液改善大豆风味，去除豆乳中豆腥味，并没有意识到利用阿米塞毕赤氏酵母制备具有抗光老化功效的产品。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种具有抗光老化功效的大豆发酵液及其制备方法，该发酵液能满足人们对天然护肤品的安全性需求，富含异黄酮、多肽，具备较强的体外抗氧化性和细胞抗光老化活性。
本发明另一目的在于提供所述的具有抗光老化功效的大豆发酵液在天然抗光老化发酵制品中的应用。
为达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
选用从豆腐酸浆水中分离的阿米塞毕赤酵母(Pichia amenthionina)Y和嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)ATW-1菌株：这两个菌株对大豆体系适应性强，酵母发酵可以提高大豆中异黄酮等活性物质的生物利用率和生物活性，从而提升发酵液的抗氧化活性。阿米塞毕赤酵母Y(Pichia amenthioninaY)的DNA序列为SEQ.ID.NO1；嗜酒假丝酵母ATW-1(Candida ethanolicaATW-1)菌株的DNA序列为SEQ.ID.NO2。
一种具有抗光老化功效的大豆发酵液的制备方法，包含以下步骤：
1)选黄豆，浸泡，磨浆，得豆浆；
2)往豆浆中加入Alcalase碱性蛋白酶，50-60℃酶解，灭酶，豆浆冷却；
3)在酶解后的豆浆中接种已活化的阿米塞毕赤酵母(Pichia amenthionina)Y或嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)ATW-1种子液，使体系中菌数达105～108CFU/g，28-37℃培养36-72h，离心，获得具有抗光老化功效的发酵液；阿米塞毕赤酵母(Pichiaamethionina)Y菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.10183，保藏日期为2014年12月15日，该阿米塞毕赤酵母(Pichia amethionina)Y菌株已经在中国发明专利2015102533344申请前进行了保藏，并记载在该专利申请说明书中。嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)ATW-1保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCC NO:61360，保藏日期为2020年12月11日。
为进一步实现本发明目的，优选地，所述的往豆浆中加入Alcalase碱性蛋白酶之前还包括在步骤1)所得豆浆中加入蔗糖。
优选地，所述的蔗糖加入量为步骤1)所得豆浆质量的2％-5％。
优选地，按蛋白含量计算，所述的Alcalase碱性蛋白酶加入量为1000U/g～2000U/g。
优选地，所述的酶解的时间为2-10h。
优选地，所述的灭酶的温度为90-100℃，时间为15-30min。
优选地，所述的选黄豆是挑选无霉变坏籽且颗粒饱满的黄豆，所述的浸泡的温度为4-30℃，时间为6-14h，封口浸泡。
优选地，所述的磨浆是分别以g和mL作为质量和体积单位，调配豆水质量体积比为1:6-10，豆浆机打磨。
一种具有抗光老化功效的大豆发酵液，由上述的制备方法制得。
所述的具有抗光老化功效的大豆发酵液在天然抗光老化发酵制品中的应用。
本发明发现，大豆豆浆经过Alcalase碱性蛋白酶酶解后，在配合阿米塞毕赤酵母(Pichia amenthionina)Y或嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)ATW-1种子液发酵，所得的发酵液具有抗光老化功效，该大豆发酵液还具备较强的体外抗氧化能力，包括DPPH、ABTS自由基清除能力和还原三价铁能力，能够提高光老化HaCaT细胞存活率和SOD、CAT酶活，同时可以抑制IL-6、IL-10和NO的生成。
大豆含有丰富的植物化学物质异黄酮和皂苷，以及大量的蛋白质和脂质，酵母则能合成脂质、代谢酶和维生素等，本发明发现，以酵母发酵大豆，那么酵母在生长的同时还会带来大豆成分的生物转化，可以提高大豆中生物活性物质的生物利用率和生物活性。两种手段相结合使发酵产品的生物活性更为多样化，以期获得具有强抗氧化能力的发酵产物。光老化的机制是由于紫外线刺激ROS的生成，当ROS的生成量超过机体的清除能力时，细胞内抗氧化系统失衡会造成氧化损伤和光老化的发生。因此抗氧化是抗光老化中的重要一环，提升活性成分的抗氧化性是抗光老研究的重点方向。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1)本发明应用蛋白酶催化与阿米塞毕赤酵母(Pichia amenthionina)Y或嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)ATW-1发酵的协同作用，先通过蛋白酶的作用使大豆蛋白充分降解，再应用自行分离的适应性酵母菌株发酵，使产品中含有丰富的小分子多肽。小分子多肽具有很强的抗氧化活性，也易于为皮肤所吸收。此外，小分子多肽也能促进酵母的生长和发酵作用，从而提高酵母的生物转化能力，生成更多的活性成分。
2)本发明获得的发酵液能够修复紫外线造成的光损伤。发酵液具有较强的体外自由基清除能力和还原三价铁能力，并且能够显著提高光老化HaCaT细胞的存活率和抗氧化酶的酶活力，减少炎症因子IL-6、IL-10和NO的生成量。
3)本发明是以全豆浆为原料，经生物处理后制备的抗光老化产品，具有天然绿色的特点，更容易获得现代消费者的认可。
4)本发明大豆加水打浆后，不过滤处理，采用豆浆豆渣一起发酵，工艺简单，处理成本低。
5)本发明原料主要就是大豆，来源丰富，不需要南极洲丛梗藻，雪莲花等特殊原料，也无需对原料进行提取处理，具有很好的产业化前景。
附图说明
图1为实施例1、2和对比例中多肽分子量分布情况图。
图2为实施例1、2和对比例中HaCaT细胞的存活率情况图。
图3为实施例1、2和对比例中HaCaT细胞内的SOD酶活情况图。
图4为实施例1、2和对比例中HaCaT细胞内的CAT酶活情况图。
图5为实施例1、2和对比例中HaCaT细胞的IL-10生成量情况图。
图6为实施例1、2和对比例中HaCaT细胞的IL-6生成量情况图。
图7为实施例1、2和对比例中HaCaT细胞的NO生成量情况图。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但实施例不对本发明保护范围构成任何限定。
以下实施例中：
(1)YPD培养基(用于酵母菌的培养)：由1％酵母提取物、2％蛋白胨和2％葡萄糖和1L蒸馏水配制而成，121℃灭菌15min。
(2)UHPLC-MS/MS分析：采用UHPLC-/Q-Exactive Plus超高效液相串联质谱仪和ACQUITY
Figure GDA0003621544990000051
BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)色谱柱，质谱系统为配备带有ESI离子源和Orbitrap的API14000质谱仪。色谱分离采用二元梯度洗脱，溶剂A为添加0.1％甲酸的水溶液，溶剂B为甲醇；流速是300μL/min，进样量为2μl。洗脱梯度条件如下：0min，85％溶剂B；2min，85％溶剂B；20min，100％溶剂B；22min，100％溶剂B；22.1min，85％溶剂B。在正离子模式下进行，MS扫描范围为150-10000。所有谱图数据处理采用Xcaliber 2.0软件分析，得到的图谱信息与MZcloud数据库进行比对确定物质的相关信息。
(3)多肽分子量分布测定方法参照GB/T 22492-2008。
(4)抗氧化检测方法：
①DPPH自由基清除能力
取2mL样品，加入等量用无水乙醇配置的0.15mol/L的DPPH溶液，振荡摇匀，在黑暗室温下放置30min。DPPH自由基呈紫色，随着自由基被清除溶液颜色变浅，用紫外分光光度计测定其在517nm处吸光值。用无水乙醇将生育酚稀释成系列梯度的标准品溶液，测定步骤同样品组。以生育酚的浓度为横坐标，对应吸光值为纵坐标，绘制得到标准曲线。将样品OD值代入标曲，可以得到样品对应的生育酚当量。
②ABTS自由基清除能力
配置7mmol/L的ABTS溶液和140mmol/L的过硫酸钾溶液，将5mL7 mmol/L ABTS溶液和89μL140 mmol/L过硫酸钾溶液混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS·+储备液。使用前用无水乙醇将ABTS·+储备液稀释成工作液，使其在734nm处吸光值在0.70±0.02范围内。准确吸取30μL样品，加入3mL稀释后的ABTS·+溶液，在室温下准确反应6min，于734nm处测定吸光值。用一系列不同浓度梯度的生育酚溶液与ABTS·+溶液反应，以生育酚的浓度为横坐标，对应吸光值为纵坐标，绘制得到标准曲线。
③Fe3+还原能力
用40mmol/L的HCL溶液配制10mmol/L的TPTZ溶液，将25mL20 mmol/L的FeCl3.6H2O、25mL TPTZ溶液和250mL的醋酸盐缓冲液(300mmol/L，pH 3.6)混合得到FRAP溶液。取100μL样品加入3mL FRAP试剂中，37℃保温10min，于593nm处测定吸光值。用一系列不同浓度梯度的生育酚溶液与FRAP试剂反应，以生育酚的浓度为横坐标，对应吸光值为纵坐标，绘制得到标准曲线。
(5)光老化HaCaT细胞存活率检测方法：往35mm的细胞培养皿中接种1×105个HaCaT细胞，置于CO2培养箱中培养24h。随后进行紫外照射建模，对经过紫外辐照的细胞进行加样处理。孵育24h后，每孔加入100μL MTT溶液，置于培养箱中孵育4h，吸弃MTT溶液，每孔再加入1000μLDMSO进行溶解，放置于摇床上缓慢振荡20min，于490nm处读取对应吸光值。
(6)HaCaT细胞中超氧化物歧化酶(SOD)酶活测定
WST-1可以与黄嘌呤氧化酶催化形成的超氧化物阴离子反应生成水溶性的甲臜染料，该反应可被SOD所抑制，故通过WST-1产物的比色分析即可计算SOD酶活。检测方法如下：测定孔和测定空白孔中加入20μL待测样品，对照孔和对照空白孔以20μL蒸馏水代替。随后往对照孔和测定孔中加入20μL酶工作液，对照空白孔和测定空白孔则加入20μL酶稀释液。最后分别加入200μL底物应用液，混匀后37℃孵育20min，于450nm处读取吸光值。SOD抑制率计算公式如下：
Figure GDA0003621544990000061
式中OD1表示对照OD值，OD2表示对照空白OD值，OD3表示样品测定OD值，OD4表示测定空白OD值。
(7)HaCaT细胞中过氧化氢酶(CAT)酶活测定
过氧化氢酶以H2O2为底物，该分解反应可通过加入钼酸铵而迅速终止，剩余H2O2可与磷酸铵生成淡黄色络合物，由此可以计算出CAT酶活力。首先设置空白对照管、样品对照管和样品管，检测方法如下：测定管中加入0.05mL稀释至适宜浓度的细胞裂解液，随后测定管和对照管各自加入1mL 37℃预热的试剂一和0.1mL试剂二，混匀后37℃准确反应1min，再加入1mL试剂三终止反应。此时对照管加入0.05mL细胞裂解液进行对照，双蒸水调零，用酶标仪读取405nm处的吸光值。以每mL样品每秒分解1μmolH2O2的量为一个酶活单位，计算公式如下：
Figure GDA0003621544990000071
式中OD对照表示对照管OD值；OD测定表示样品测定OD值；271为斜率倒数，A表示取样量，单位mL；60表示反应时间是60s。
(8)HaCaT细胞IL-6、IL-10和NO的生成量测定
分别采用IL-6、IL-10和NO试剂盒进行检测，步骤如下。在酶标包被板的待测样品孔中先加入样品稀释液40μl，然后再加入10μl待测样品，空白孔直接加入50μL稀释液。随后每孔加入100μl酶标试剂，空白孔除外。用封板膜封板后置于37℃孵育60min，小心揭掉封板膜，弃去液体并甩干。每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加入50μl显色剂A，再加入50μl显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min，每孔加入50μl终止液以终止反应(此时蓝色立转黄色)。以空白孔调零，450nm处测定各孔的吸光值。各标准品孔中分别加入50μL不同浓度的标准品，测定步骤同样品孔检测过程，根据测定吸光值和标品浓度可以绘制标准曲线。
下列各附图中n-UV表示正常组细胞，UV组表示模型组细胞，Trolox为对照组，其余各组表示UV辐照后分别加入100μg/mL对应样品处理。
菌株ATW-1的分离鉴定
第一步：分别取1ml的豆腐酸浆水和1g毛胚于9ml的无菌生理盐水中进行梯度稀释，吸取1ml适宜梯度的稀释液涂布于YPD平板上，28℃培养48h。挑取疑似酵母菌落进行液体培养并划线分离，如此反复3次，直至获得纯的单菌落，将划线分离得到的菌株保藏于50％的甘油溶液中，并于-20℃保存。
第二步：对分离获得菌株进行分子生物学鉴定。首先对酵母的基因组DNA进行提取，使用26s rDNA人工序列通用引物26S F1如SEQ.ID.NO3：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG和26S R1如SEQ.ID.NO4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG进行PCR扩增，扩增反应的条件：初始变性在94℃下进行3min，随后进行29个循环，94℃变性30s，46℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10分钟，然后在10℃下无限冷却。将扩增得到的DNA进行DNA测序(见序列表SEQ.ID.NO2)，并导入National Center for Biology Information(NCBI)进行BLAST比对。将菌株ATW-1的序列与标准菌株进行相似度分析，其与表1中3株嗜酒假丝酵母序列同源性超过98％，故确定ATW-1菌株为嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)。
表1菌株26S rDNA序列相似性对比结果
Figure GDA0003621544990000081
实施例1：嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)ATW-1发酵豆浆1
第一步：菌种制备。取100mL的三角瓶，加入50ml YPD培养基，121℃灭菌15min。冷却后接种1％(v/v)嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)ATW-1菌液，30℃培养48h，6000rpm离心10min，然后收集菌体，并用无菌水洗涤3次，重悬于适量无菌水中获得种子液。
第二步：豆浆制备。挑选无霉变坏籽且颗粒饱满的黄豆200g，冲洗去杂，加800mL水浸泡，封口并于4℃冷藏浸泡14h，调配豆水比为1:8(m/v，单位g/mL)，豆浆机打磨，获得均匀细腻的豆浆。取500g豆浆进行下一步操作。
第三步：豆浆酶解。根据豆浆中蛋白含量按1000U/g蛋白的比例加入Alcalase蛋白酶，在55℃条件下酶解5h，随后100℃处理15min灭酶，冷却后作为发酵底物。
第四步：发酵豆浆。往上述豆浆中接入已活化的嗜酒假丝酵母ATW-1种子液，使接种后豆浆中菌数达到106CFU/g，随后置于30℃培养箱中培养48h，离心获得发酵上清液。将发酵液冻干后保存于-80℃，记为H5-ATW1。
第五步：多肽分子量分布和体外抗氧化活性。如图1所示，H5-ATW1主要由451～1450Da和190～451Da的小分子多肽组成。小分子多肽含量的增加提升了发酵液的抗氧化活性，H5-ATW1的DPPH自由基清除能力为2.89μmol Trolox/g，FRAP为10.94μmol Trolox/g，ABTS为59.04μmol Trolox/g。
第六步：光老化HaCaT细胞的存活率。往35mm的细胞培养皿中接种1×105个HaCaT细胞，置于37℃细胞培养箱中培养24h后进行紫外照射建模，随后用含100μg/mL H5-ATW1的培养基替换原细胞培养液。继续放入培养箱中培养24h，随后往细胞培养皿中加入100μlMTT溶液，置于培养箱中孵育4h，吸弃MTT溶液，每孔再加入1000μl DMSO进行溶解，放置于摇床上缓慢振荡20min，于490nm处读取对应吸光值。以未经紫外辐照的HaCaT细胞存活率为100％，经过20mJ/cm2辐照剂量处理的细胞组为UV组。根据图2，不同发酵液处理后细胞存活率均高于UV组，H5-ATW1组细胞的存活率与NH-NF组基本一致，说明两组处理都能改善由于紫外辐照带来的细胞活力下降。
第七步：光老化HaCaT细胞抗氧化活力。往35mm的细胞培养皿中接种1×105个HaCaT细胞，置于37℃细胞培养箱中培养24h后进行紫外照射建模，随后用含100μg/mL H5-ATW1的培养基替换原细胞培养液，同时以水溶性维生素E(Trolox)作为对照，继续放入培养箱中培养24h。孵育24h后吸去上清，用胰酶进行消化，待细胞变圆脱落，收集离心弃上清。细胞用PBS缓冲液洗涤2次，再加入200μl 100倍稀释的细胞裂解液，裂解40min(可用显微镜观察细胞破碎情况)，随后将细胞裂解液吸出。利用SOD和CAT检测试剂盒分别进行SOD和CAT酶活测定。SOD酶活测定结果如图3所示，紫外辐照后SOD酶活显著下降，发酵液处理使SOD活力得以提升。NH-NF组与Trolox组SOD酶活基本维持在8％左右，而H5-ATW1组的SOD酶活分别可以达到13.37％，说明H5-ATW1能够显著提升HaCaT细胞内的SOD酶活。过氧化氢酶(CAT)活力测定如图4所示，紫外辐照后CAT酶活显著下降，经过发酵液处理后，CAT活力都得以提升。NH-NF和H5-ATW1的酶活提升能力较弱，H5-Y(见实施例5)与Trolox对照组的CAT酶活达到2U/mL左右。
第八步：光老化HaCaT细胞IL-6、IL-10和NO的生成量。往35mm的细胞培养皿中接种1×105个HaCaT细胞，置于37℃细胞培养箱中培养24h后进行紫外照射建模。随后用含100μg/mL H5-ATW1的培养基替换原细胞培养液，同时以水溶性维生素E(Trolox)作为对照，继续放入培养箱中培养24h，孵育24h后收集上清用于测定IL-6、IL-10和NO。分别采用IL-6、IL-10和NO试剂盒进行检测，各标准品测定步骤同样品孔检测过程，根据测定吸光值和标品浓度可以绘制标准曲线，计算出IL-6、IL-10和NO生成量。从图5中可以看到，紫外损伤促使HaCaT细胞产生较多的IL-10，NH-NF组和H5-ATW1组的IL-10含量最低，而Trolox组细胞内的IL-10含量处于较高水平。细胞的IL-10含量反映了细胞内的炎症应激水平，说明Trolox组细胞的免疫反应较为剧烈，其通过提高抗炎因子IL-10的表达量来抑制其他炎症因子的生成。从图6中可以看到，紫外辐照促使HaCaT细胞生成更多的IL-6，H5-ATW1组细胞中IL-6出现了显著下降，说明其能够降低光老化细胞内炎症因子IL-6的生成量。Trolox组的IL-6含量与UV组相当，说明其并不能降低光老化诱导的IL-6。从图7可以看到，紫外辐照后HaCaT细胞的NO生成量显著上升，H5-ATW1和H5-Y组细胞内NO降至正常水平以下，而NH-NF和Trolox组也能够将NO降低至正常水平左右，但是效果略逊于H5-ATW1和H5-Y。
实施例2：阿米塞毕赤酵母(Pichia amenthionina)Y发酵豆浆1
第一步：菌种制备。取100mL的三角瓶，加入50mL YPD培养基，121℃灭菌15min。接种1％(v/v)阿米塞毕赤酵母(Pichia amenthionina)Y菌液，30℃培养48h，6000rpm离心10min，然后收集菌体，并用无菌水洗涤3次，重悬于适量无菌水中获得种子液。
第二步：豆浆制备。挑选无霉变坏籽且颗粒饱满的黄豆200g，冲洗去杂，加800mL水浸泡，封口并于4℃冷藏浸泡14h，调配豆水比为1:8(m/v，单位g/mL)，豆浆机打磨，获得均匀细腻的豆浆。取500g豆浆进行下一步操作。
第三步：豆浆酶解。根据豆浆中蛋白含量按1000U/g蛋白的比例加入Alcalase蛋白酶，在55℃条件下酶解5h，随后100℃处理15min灭酶，冷却后作为发酵底物。
第四步：发酵豆浆。往豆浆中分别接入已活化的阿米塞毕赤酵母Y，使接种后豆浆中菌数达到106CFU/g，随后置于30℃培养箱中培养48h，离心获得发酵上清液。将发酵液冻干后保存于-80℃，记为H5-Y。
第五步：多肽分子量分布和体外抗氧化活性。如图1所示，H5-Y的多肽分子量主要分布在451～1450Da和190～451Da，小分子多肽含量的增加提升了发酵液的抗氧化性。H5-Y的DPPH自由基清除能力为3.40μmol Trolox/g，FRAP为13.05μmol Trolox/g，ABTS为61.99μmol Trolox/g。
第六步：光老化HaCaT细胞的存活率。往35mm的细胞培养皿中接种1×105个HaCaT细胞，置于37℃细胞培养箱中培养24h后进行紫外照射建模，随后用含100μg/mL H5-Y的培养基替换原细胞培养液。继续放入培养箱中培养24h，随后往细胞培养皿中加入100μlMTT溶液，置于培养箱中孵育4h，吸弃MTT溶液，每孔再加入1000μl DMSO进行溶解，放置于摇床上缓慢振荡20min，于490nm处读取对应吸光值。以未经紫外辐照的HaCaT细胞存活率为100％，经过20mJ/cm2辐照剂量处理的细胞组为UV组。根据图2，不同发酵液处理后细胞存活率均高于UV组，H5-Y的细胞存活率高达102.14％。可见，H5-Y能显著改善由于紫外辐照带来的细胞活力下降。
第七步：光老化HaCaT细胞抗氧化活力。往35mm的细胞培养皿中接种1×105个HaCaT细胞，置于37℃细胞培养箱中培养24h后进行紫外照射建模，随后用含100μg/mL H5-Y的培养基替换原细胞培养液，同时以水溶性维生素E(Trolox)作为对照，继续放入培养箱中培养24h。孵育24h后吸去上清，用胰酶进行消化，待细胞变圆脱落，收集离心弃上清。细胞用PBS缓冲液洗涤2次，再加入200μl 100倍稀释的细胞裂解液，裂解40min(可用显微镜观察细胞破碎情况)，随后将细胞裂解液吸出。利用SOD和CAT检测试剂盒分别进行SOD和CAT酶活测定。如图3所示，紫外辐照后SOD酶活显著下降，发酵液处理使SOD活力得以提升，H5-Y组的SOD酶活可以达到15.17％。如图4所示，紫外辐照后CAT酶活显著下降，经过发酵液处理后，CAT活力都得以提升，H5-Y与Trolox对照组的CAT酶活均达到2U/mL左右。
第八步：光老化HaCaT细胞IL-6、IL-10和NO的生成量。往35mm的细胞培养皿中接种1×105个HaCaT细胞，置于37℃细胞培养箱中培养24h后进行紫外照射建模。随后用含100μg/mL H5-ATW1的培养基替换原细胞培养液，同时以水溶性维生素E(Trolox)作为对照，继续放入培养箱中培养24h后收集上清用于测定IL-6、IL-10和NO。分别采用IL-6、IL-10和NO试剂盒进行检测，各标准品测定步骤同样品孔检测过程，根据测定吸光值和标品浓度可以绘制标准曲线，计算出IL-6、IL-10和NO生成量。从图5中可以看到，紫外损伤促使HaCaT细胞产生较多的IL-10，H5-Y组的IL-10含量接近于正常水平，而Trolox组细胞内的IL-10含量处于较高水平。细胞的IL-10含量反映了细胞内的炎症应激水平，说明H5-Y组细胞的免疫应激水平与正常细胞一致，细胞处于一种正常状态，而Trolox组细胞的免疫反应较为剧烈，其通过提高抗炎因子IL-10的表达量来抑制其他炎症因子的生成。从图6中可以看到，紫外辐照促使HaCaT细胞生成更多的IL-6，但H5-Y中IL-6含量与n-UV组基本一致，说明H5-Y能够降低光老化细胞内炎症因子IL-6的生成量。Trolox组的IL-6含量与UV组相当，说明其并不能降低光老化诱导的IL-6。从图7可以看到，紫外辐照后HaCaT细胞的NO生成量显著上升，而H5-Y组细胞内NO降至正常水平以下。
实施例3：阿米塞毕赤酵母(Pichia amenthionina)Y发酵豆浆2
第一步：菌种制备。取100mL的三角瓶，加入50mLYPD培养基，121℃灭菌15min。接种1％(v/v)阿米塞毕赤酵母(Pichia amenthionina)Y菌液，30℃培养48h，6000rpm离心10min，然后收集菌体，并用无菌水洗涤3次，重悬于适量无菌水中获得种子液。
第二步：豆浆制备。挑选无霉变坏籽且颗粒饱满的黄豆200g，冲洗去杂，加800mL水浸泡，封口并于22℃浸泡8h，调配豆水比为1:10(m/v，单位g/mL)，豆浆机打磨，过滤，获得均匀细腻的豆浆。
第三步：豆浆酶解。根据豆浆中蛋白含量按1500U/g蛋白的比例加入Alcalase蛋白酶，在50℃条件下酶解3h，随后100℃处理10min灭酶，冷却后作为发酵底物。
第四步：发酵豆浆。往豆浆中接入已活化的阿米塞毕赤酵母Y，使接种后豆浆中菌数达到106CFU/g，随后置于37℃培养箱中培养36h，离心获得发酵上清液。
实施例4：嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)ATW-1发酵豆浆2
第一步：菌种制备。取100mL的三角瓶，加入50ml YPD培养基，121℃灭菌15min。冷却后接种1％(v/v)嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)ATW-1菌液，28℃培养60h，6000rpm离心10min，然后收集菌体，并用无菌水洗涤3次，重悬于适量无菌水中获得种子液。
第二步：豆浆制备。挑选无霉变坏籽且颗粒饱满的黄豆200g，冲洗去杂，加800mL水浸泡，封口并于22℃冷藏浸泡8h，调配豆水比为1:8(m/v，单位g/mL)，豆浆机打磨，获得均匀细腻的豆浆。取500克豆浆进行如下操作。
第三步：豆浆酶解。根据豆浆中蛋白含量按1000U/g蛋白的比例加入Alcalase蛋白酶，在55℃条件下酶解2h，随后100℃处理15min灭酶，冷却后作为发酵底物。
第四步：发酵豆浆及其体外抗氧化活性。往上述豆浆中接入已活化的嗜酒假丝酵母ATW-1种子液，使接种后豆浆中菌数达到106CFU/g，随后置于30℃培养箱中培养48h，离心获得发酵上清液。经实施例1和2同样方式的检测，该发酵液的抗氧化活性为DPPH自由基清除能力为3.22μmol Trolox/g，FRAP为11.83μmol Trolox/g，ABTS为56.58μmol Trolox/g。
对比例
第一步：豆浆制备。挑选无霉变坏籽且颗粒饱满的黄豆200g，冲洗去杂，加800mL水浸泡，封口并于4℃冷藏浸泡14h，调配豆水比为1:8(m/v，单位g/mL)，豆浆机打磨，获得均匀细腻的豆浆。取500g未发酵豆浆离心处理，上清液冻干后记为NH-NF。
第二步：多肽分子量分布和体外抗氧化活性。多肽分子量分布情况如图1所示，NH-NF的分子量主要分布在1450～6500Da的范围，其DPPH自由基清除能力为2.07μmol Trolox/g，FRAP为6.23μmol Trolox/g，ABTS为9.29μmol Trolox/g。
第三步：光老化HaCaT细胞的存活率。往35mm的细胞培养皿中接种1×105个HaCaT细胞，置于37℃细胞培养箱中培养24h后进行紫外照射建模，随后用含100μg/mL NH-NF的培养基替换原细胞培养液。继续放入培养箱中培养24h，随后往细胞培养皿中加入100μL MTT溶液，置于培养箱中孵育4h，吸弃MTT溶液，每孔再加入1000μLDMSO进行溶解，放置于摇床上缓慢振荡20min，于490nm处读取对应吸光值。以未经紫外辐照的HaCaT细胞存活率为100％，经过20mJ/cm2辐照剂量处理的细胞组为UV组。根据图2，NH-NF处理后细胞存活率为83％，高于UV组。
第四步：光老化HaCaT细胞抗氧化活力。往35mm的细胞培养皿中接种1×105个HaCaT细胞，置于37℃细胞培养箱中培养24h后进行紫外照射建模，随后用含100μg/mLNH-NF的培养基替换原细胞培养液，同时以水溶性维生素E(Trolox)作为对照。孵育24h后吸去上清，用胰酶进行消化，待细胞变圆脱落，收集离心弃上清。细胞用PBS缓冲液洗涤2次，再加入200μL100倍稀释的细胞裂解液，裂解40min(可用显微镜观察细胞破碎情况)，随后将细胞裂解液吸出。利用SOD和CAT检测试剂盒分别进行SOD和CAT酶活测定。如图3所示，紫外辐照后SOD酶活显著下降，NH-NF处理使SOD活力得以提升，与Trolox组一样维持在8％左右。如图4所示，紫外辐照后CAT酶活显著下降，经过NH-NF处理后，CAT活力得以提升，与未经紫外照射细胞基本一致。
第五步：光老化HaCaT细胞的白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)和NO的生成量。往35mm的细胞培养皿中接种1×105个HaCaT细胞，置于细胞培养箱中37℃培养24h后进行紫外照射建模，随后用含100μg/mL NH-NF的培养基替换原细胞培养液，同时以水溶性维生素E(Trolox)作为对照，孵育24h后收集上清液测定IL-6、IL-10和NO。分别采用IL-6、IL-10和NO试剂盒进行检测，各标准品测定步骤同样品孔检测过程，根据测定吸光值和标品浓度可以绘制标准曲线，计算出IL-6、IL-10和NO生成量。从图5中可以看到，紫外损伤促使HaCaT细胞产生较多的IL-10，NH-NF组的IL-10含量最低，Trolox组细胞内的IL-10含量处于较高水平。细胞的IL-10含量反映了细胞内的炎症应激水平，说明Trolox组细胞的免疫反应较为剧烈，其通过提高抗炎因子IL-10的表达量来抑制其他炎症因子的生成。从图6中可以看到，紫外辐照促使HaCaT细胞生成更多的IL-6，NH-NF组细胞中IL-6出现了显著下降，说明NH-NF能够降低光老化细胞内炎症因子IL-6的生成量。Trolox组的IL-6含量与UV组相当，说明其并不能降低光老化诱导的IL-6。从图7可以看到，紫外辐照后HaCaT细胞的NO生成量显著上升，NH-NF组和Trolox组一样，都能够将NO降低至正常水平。
从上述对比例和实施例比较可见，上述实施例中利用嗜酒假丝酵母(Candidaethanolica)ATW-1或阿米塞毕赤酵母(Pichia amenthionina)Y发酵Alcalase蛋白酶酶解豆浆，获得一种具有抗光老化功效的大豆发酵液，该发酵液富含小分子肽、异黄酮、皂苷、脂质等功能性成分，具有较高体外清除自由基能力和还原三价铁能力，以及提高光老化HaCaT细胞存活率和SOD、CAT酶活的能力，同时可以降低IL-6、IL-10和NO的生成，从而发挥抗光老化功效。
从效果上看，两株酵母在抗光老化研究中都具有潜在的研究和应用价值，H5-Y和H5-ATW1均具备抗光老化能力，H5-Y对于体外抗氧化、细胞活力以及胞内抗氧化酶酶活的改善效果更为显著。由此可见，这两株酵母可应用于开发具有经济效益的天然抗光老化发酵制品，酵母Y的大豆发酵液抗光老化效果优于酵母ATW-1。
本发明发现，本发明的嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)ATW-1或阿米塞毕赤酵母(Pichia amenthionina)Y相对于现有的大多酵母，在脂质种类和含量上具有明显的优势，具体分析如下：
1)菌种活化与制备。将实验室保存的腐乳源酵母菌株嗜酒假丝酵母ATW-1、膜璞毕赤氏酵母ATW-6、马克斯克鲁维酵母SP-1、库德里阿兹威毕赤氏酵母SP-4、挪威毕赤氏酵母SP-5、阿米塞毕赤氏酵母Y和商业对照菌株马克斯克鲁维酵母K在YPD培养基中活化后，取1％接种到已灭菌的YPD液体培养基，30℃培养48h，低温离心10min。并用无菌水洗涤菌体，重复3次后再次加入无菌水重悬菌体，获得种子液。
2)发酵豆浆。称取100g大豆，加入400mL水浸泡，封口并于4℃冷藏浸泡14h。调配豆水比为1:8(m/v)，豆浆机打磨。往250ml的三角瓶中加入100mL的豆浆，并于100℃下灭菌15min，冷却后作为发酵底物。每瓶豆浆分别接种体积分数为1％的酵母种子液，使接种后豆浆中菌数达到106CFU/mL，30℃发酵48h，分别获得7组由不同酵母发酵得到的产物：F-ATW1-SB、F-ATW6-SB、F-SP1-SB、F-SP4-SB、F-SP5-SB、F-Y-SB、F-K-SB，立即进行冻干处理，保存于-80℃。
3)脂质分析。分别取0.12g上述发酵豆浆冻干粉于带螺旋盖的玻璃试管中，再加入2ml体积比为1:1的氯仿:甲醇溶液，涡旋提取1min。加入2mL 0.8MKOH的甲醇溶液，在42℃、160rpm条件下孵育30min。随后加入5mL的氯仿和2.25mL的水涡旋直至皂化完全，离心10min，得到下层有机相，取下层有机相过0.22有机膜，上样进行脂质分析。从发酵豆浆的UHPLC-MS/MS总离子流图可以看到，阿米塞毕赤氏酵母Y发酵豆浆F-Y-SB的脂质非常丰富，其中十六酰胺和油酸乙酯丰度特别高，从发酵豆浆的UHPLC-MS/MS检测结果的热图分析可看出，α-亚麻酸的含量也比较高，嗜酒假丝酵母ATW-1发酵豆浆F-ATW1-SB虽然与未发酵的豆浆NF-SB的图谱相似，但脂质种类更多，如增加了二十碳五烯酸等脂质。在所有发酵豆浆中，阿米塞毕赤氏酵母Y发酵豆浆F-Y-SB的N,N-二甲基鞘氨醇响应值最高，嗜酒假丝酵母ATW-1发酵豆浆F-ATW1-SB的植物鞘氨醇响应值最高。
总体而言，本发明应用蛋白酶催化与阿米塞毕赤酵母(Pichia amenthionina)Y或嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)发酵的协同作用，先通过蛋白酶的作用使大豆蛋白充分降解，再应用自行分离的适应性酵母菌株发酵，使产品中含有丰富的小分子多肽。小分子多肽具有很强的抗氧化活性，也易于为皮肤所吸收。此外，小分子多肽也能促进酵母的生长和发酵作用，从而提高酵母的生物转化能力，生成更多的活性成分。本发明获得的发酵液能够修复紫外线造成的光损伤。发酵液具有较强的体外自由基清除能力和还原三价铁能力，并且能够显著提高光老化HaCaT细胞的存活率和抗氧化酶的酶活力，减少炎症因子IL-6、IL-10和NO的生成量。可见本发明发酵液富含异黄酮、多肽和脂质，具有较高体外清除自由基能力和还原三价铁能力，细胞实验表明其能够提高光老化HaCaT细胞存活率以及SOD、CAT酶活，降低IL-6、IL-10和NO的生成，从而发挥抗光老化功效。
而且本发明是以全豆浆为原料，来源丰富，不需要南极洲丛梗藻，雪莲花等特殊原料，也无需对原料进行提取处理，本发明原料经生物处理后制备的抗光老化产品，具有天然绿色的特点，更容易获得现代消费者的认可，具有很好的产业化前景。
本发明的实施方式并不受上述实施案例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种具有抗光老化功效的大豆发酵液及其制备方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 573
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcctcagta gcggcgagtg aagcggcaag agctcagatt tgaaatcgtg ctttgcggca 60
cgagttgtag attgcaggtt ggagtctgtg tggaaggcgg tgtccaagtc ccttggaaca 120
gggcgcccag gagggtgaga gccccgtggg atgccggcgg aagcagtgag gcccttctga 180
cgagtcgagt tgtttgggaa tgcagctcca agcgggtggt aaattccatc taaggctaaa 240
tactggcgag agaccgatag cgaacaagta ctgtgaagga aagatgaaaa gcactttgaa 300
aagagagtga aacagcacgt gaaattgttg aaagggaagg gtattgcgcc cgacatgggg 360
attgcgcacc gctgcctctc gtgggcggcg ctctgggctt tccctgggcc agcatcggtt 420
cttgctgcag gagaaggggt tctggaacgt ggctcttcgg agtgttatag ccagggccag 480
atgctgcgtg cggggaccga ggactgcggc cgtgtaggtc acggatgctg gcagaacggc 540
gcaacaccgc ccgtcttgaa acacggaccc aaa 573
<210> 2
<211> 541
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcatgcc tcagtagcgg cgagtgaagc ggcaagagct cagatttgaa atcgtgtttc 60
ggcacgagtt gtagagtgta ggcgggagtc tctgtggagc gcggtgtcca agtcccttgg 120
aacagggtgc ctgagagggt gagagccccg tggggtgctg cgcgaagctt tgaggccctg 180
ctgacgagtc gagttgtttg ggaatgcagc tctaagcggg tggtaaattc catctaaggc 240
taaatactgg cgagagaccg atagcgaaca agtactgtga aggaaagatg aaaagcactt 300
tgaaaagaga gtgaaacagc acgtgaaatt gttgaaaggg aagggtattg ggcccgacat 360
ggggagtgcg caccgctgtc tcttgtaggc ggcgctctgg gcgctctctg ggccagcatc 420
ggttcttgct gcgagagaag tggcgccgga aagtggctct tcggagtgtt atagccggtg 480
ccggatgtcg cgtgcgggga ccgagggctg cgacatctgt ctcggatgct gcactcgcac 540
c 541
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtccgtgtt tcaagacgg 19

Claims (10)

1.一种具有抗光老化功效的大豆发酵液的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
1)选黄豆，浸泡，磨浆，得豆浆；
2)往豆浆中加入Alcalase碱性蛋白酶，50-60℃酶解，灭酶，豆浆冷却；
3)在酶解后的豆浆中接种已活化的阿米塞毕赤酵母(Pichia amenthionina)Y或嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)ATW-1种子液，使体系中菌数达105～108CFU/g，28-37℃培养36-72h，离心，获得具有抗光老化功效的发酵液；阿米塞毕赤酵母(Pichiaamenthionina)Y的保藏号为CGMCC NO:10183；嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)ATW-1的保藏号为GDMCC NO:61360。
2.根据权利要求1所述的具有抗光老化功效的大豆发酵液的制备方法，其特征在于：所述的往豆浆中加入Alcalase碱性蛋白酶之前还包括在步骤1)所得豆浆中加入蔗糖。
3.根据权利要求2所述的具有抗光老化功效的大豆发酵液的制备方法，其特征在于：所述的蔗糖加入量为步骤1)所得豆浆质量的2％-5％。
4.根据权利要求1所述的具有抗光老化功效的大豆发酵液的制备方法，其特征在于：按豆浆中蛋白含量计算，所述的Alcalase碱性蛋白酶加入量为1000U/g～2000U/g。
5.根据权利要求1所述的具有抗光老化功效的大豆发酵液的制备方法，其特征在于：所述的酶解的时间为2-10h。
6.根据权利要求1所述的具有抗光老化功效的大豆发酵液的制备方法，其特征在于：所述的灭酶的温度为90-100℃，时间为15-30min。
7.根据权利要求1所述的具有抗光老化功效的大豆发酵液的制备方法，其特征在于：所述的选黄豆是挑选无霉变坏籽且颗粒饱满的黄豆，所述的浸泡的温度为4-30℃， 时间为6-14h，封口浸泡。
8.根据权利要求1所述的具有抗光老化功效的大豆发酵液的制备方法，其特征在于：所述的磨浆是分别以g和mL作为质量和体积单位，调配豆水质量体积比为1:6-10，豆浆机打磨。
9.一种具有抗光老化功效的大豆发酵液，其特征在于其由权利要求1-8任一项所述的制备方法制得。
10.权利要求9所述的具有抗光老化功效的大豆发酵液在制备天然抗光老化发酵制品中的应用。
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