CN117604040A - 马克斯克鲁维酵母的发酵产物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物提取领域及日化领域，具体公开了保藏号CGMCC No.21385的牦牛奶发酵制品来源的马克斯克鲁维酵母发酵产物及其作为活性成分用于制备皮肤外用剂、美容口服剂的应用。发酵产物具有多种功效，可用于制备具有保湿、提高皮肤光泽度、白度和亮度，或保护皮肤屏障功能，或者养护头皮和防脱育发的皮肤外用剂、美容口服剂；以及制备具有修红、美白、防止光老化或清除自由基的功能的皮肤外用剂、美容口服剂，具有良好的应用前景和市场前景。

Description

马克斯克鲁维酵母的发酵产物及其应用
技术领域
本发明属于生物提取领域及日化领域，具体涉及一种牦牛奶发酵制品来源的马克斯克鲁维酵母发酵产物及其作为活性成分用于制备皮肤外用剂、美容口服剂的应用。
背景技术
马克斯克鲁维酵母因其耐高温、生长速率快、底物谱广等诸多优点已经被越来越多地利用在工业生物技术领域。除了能够分泌菊粉酶、β-半乳糖苷酶等多种广泛用用的工业水解酶类，马克斯克鲁维酵母也可利用多种非粮底物生产乙醇，并且在外源蛋白分泌表达以及基因工程操作等工业分子生物领域取得突破。因此，马克斯克鲁维酵母在清洁能源、食品工业、生物酶工业、合成生物学等诸多领域具有广泛应用前景。
已有报道表明，青海、西藏地区的牦牛酸奶相较其他地区发酵酸奶含有更多的乳酸菌和酵母。越来越多的非传统酵母菌属在传统发酵乳制品中被发现，克鲁维酵母就是其中之一，而马克斯克鲁维酵母是克鲁维酵母中重要的一个种，是开菲尔等益生乳制品的发酵优势菌种。
该菌株已于2020年12月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21385。分类名为马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus，经检测存活。
马克斯克鲁维酵母K.marxianus CGMCC No.21385分离自西藏自治区产酸牦牛奶样品，可以利用木糖、葡萄糖发酵产生一定量的GABA，如在摇瓶中最高产量达到275.09mg/L；同时，所得的发酵滤液具有多方面的护肤功效，如促进真皮成纤维细胞、表皮细胞、毛乳头细胞增殖和胞内ATP提升，修复紫外线UVA/UVB对皮肤细胞产生的损伤，抑制黑色素生成和细胞炎症因子水平，增强皮肤屏障，促进皮肤结构，提升细胞Ki67、AQP3和Fillaggrin关键蛋白含量的作用。
CGMCC No.21385菌株的其他发酵产物在护肤功效方面的应用还没有研究。因此，需要对其发酵产物加以改进，使之实现更多的护肤功效。
发明内容
本发明旨在提供一种牦牛奶发酵制品来源的马克斯克鲁维酵母发酵产物及其应用。
本发明的技术方案为：
马克斯克鲁维酵母的发酵产物，其发酵培养基中含有牦牛奶、糖类和蛋白类。
马克斯克鲁维酵母来源于牦牛奶发酵制品，2020年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，菌株保藏号为CGMCC No.21385。
具体的，所述的发酵培养基为含有牦牛奶，以及糖类物质、蛋白类物质的培养基；以干重计，所述牦牛奶的添加量为0.1wt％-4.0wt％，优选为0.2wt％-2wt％。
其中，糖类为玉米浆、糖蜜或者葡萄糖、木糖中的至少一种，其添加量为0.1wt％-8.0wt％，优选为0.1wt％-7.0％；蛋白类为酵母膏、酵母浸粉、蛋白胨、酵母蛋白胨中的至少一种，其添加量为0.1wt％-5.0wt％，优选为0.2wt％-4.0wt％。
进一步，所述的发酵培养基还含有谷物粉或谷物浸粉，添加量为0wt％-6.0wt％，优选为0.1wt％-5.0wt％。
所述的谷物为麦类(大麦、小麦、燕麦、黑麦等)、稻类(籼稻、粳稻、糯稻等)、玉米、高粱、豆菽类(大豆、蚕豆、豌豆、绿豆、红小豆、芸豆等)、薯类(红薯、马铃薯、山药、芋头、木薯等)中的任一种或者其组合。在本发明的一个实例中，所述的谷物为马铃薯。
优选的，所述的发酵培养基为含有牦牛奶的YPD、PDB及其改良培养基。
优选的，所述发酵培养基还含有醇或酸的至少一种。所述的醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙三醇中的至少一种，添加量为体积分数0.0％-5.0％，优选为3.0％-5.0％；所述的酸选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸中的至少一种，添加量为0-5.0g/L，优选为3.0-5.0g/L。
优选的，所述发酵培养基还可以添加矿物质、微量元素、维生素及其他生长因子。矿物质包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、硅酸盐、磷酸盐、有机酸盐等。
发酵接种前，菌种经过活化、纯化、扩大培养。
菌种活化的方法为：挑取保藏菌种接入液体种子培养基中，摇床20-30℃、0-400rpm培养8-24小时将菌种活化。
菌种纯化的方法为：将活化后的菌液梯度稀释铺平板，连续传代以获取单个菌落。
菌种扩大培养的方法即种子培养方法为：挑取上步平板中单个菌落接种至液体PDB或YPD液体培养基中，摇床20-30℃、0-400rpm培养8-24小时，至OD600为1.0-10.0，得到发酵菌种子菌液。
所述发酵产物制备方法为：
将种子液菌体按0.1％-10.0％接种量(v/v)，接种入发酵培养基中，0-500rpm搅拌转速，通气量0-4.0vvm，10-52℃发酵12-96小时。优选的，种龄为8-24小时，更优选为16-20小时。
本发明的一个优选方式为，将16-20小时种龄的种子液菌体，按2.0％-5.0％接种量(v/v)接入发酵培养基中，按以下方法进行发酵：
(1)第一发酵阶段：种子菌液接入发酵培养基后，20-38℃发酵12-24小时，搅拌条件200-400rpm，通气量0-4.0vvm，；
第一阶段发酵的发酵培养基中，添加0-1.0wt％牦牛奶(干重)，优选为0.1wt％-0.5wt％；并添加蛋白类物质0.1wt-3.0wt％、糖类物质0.5wt％-2.5wt％、氯化钠0-0.5wt％、谷物0-2.0wt％；
(2)第二发酵阶段：发酵培养基中补充牦牛奶、糖类物质、蛋白类物质，30-45℃下继续发酵12-72小时；0-400rpm搅拌转速，0.5-2.0vvm通气量；
第二发酵阶段补充的牦牛奶(干重)为0.1wt％-1.0wt％，补充的蛋白类物质为0.1wt％-1.0wt％，补充的糖类物质为0.1wt％-5wt％；
第二发酵阶段还补充体积分数为3.0％-5.0％的乙醇或丙醇，或者3.0-5.0g/L乙酸或丙酸；
步骤(1)和(2)所述蛋白类物质为酵母提取物(酵母膏或酵母浸粉)、蛋白胨或酵母蛋白胨中的至少一种；所述糖类物质为玉米糖浆、糖蜜或者葡萄糖、木糖中的至少一种。
第二发酵阶段，补充物质的方式为流加。
更为优选的，第一发酵阶段的发酵培养基为含有0.1wt％-0.5wt％牦牛奶(干重)的PDB或YPD液体培养基。
发酵后去除菌体，取发酵滤液或上清液。
发酵液经蝶式离心火管式离心或膜过滤除菌体，优选的，用膜技术过滤除菌，以0.1μm-0.8μm膜进行正压、板框过滤或者陶瓷膜过滤。所述的膜为各类适用于板框的滤膜如聚醚砜树脂(PES)、聚丙烯(PP)、尼龙膜，以及柱式膜柱如中空纤维膜柱、陶瓷膜柱等。
所得到发酵滤液可以进一步浓缩或干燥，得到浓缩液或者干粉。发酵滤液、上清液、浓缩液或者干粉即马克斯克鲁维酵母发酵产物。
通过上述方法得到的牦牛奶发酵制品来源的马克斯克鲁维酵母发酵产物可用于制备皮肤外用剂或美容口服剂。优选的，所述皮肤外用剂为化妆品或护肤品；所述美容口服剂为美容口服液、美容丸，剂型包括片剂、液剂、粉剂、冲剂、丸剂或胶囊。
所述的发酵产物具有保湿、改善皮肤光泽度、亮度和白度的作用，能够保护皮肤屏障；同时有养护头皮、防脱育发的效果；还可以修复紫外造成的光损伤、清除自由基、促进细胞增殖、提高皮肤细胞活力、修红。
本发明的牦牛奶发酵制品来源的马克斯克鲁维酵母发酵产物可以显著提高皮肤含水量、ITA值、L值、光泽度，具有保湿、美白、亮肤、改善皮肤光泽度的功效。因此，可用于制备具有保湿、提亮肤色或者改善皮肤光泽度、白度和亮度功能的皮肤外用剂或者美容口服剂。
通过皮肤功效测试发现，使用酵母发酵产物后，角质层含水量、L值、ITA值、皮肤光泽度都有显著提高。
根据RHE人重组表皮细胞模型，本发明的牦牛奶发酵制品来源的马克斯克鲁维酵母发酵产物可以提高表皮跨上皮细胞电阻TEER，并且显示其促进皮肤细胞分化，还使皮肤表皮结构致密，结构更完整，起到稳固皮肤屏障的作用。
同时基底层细胞中ki-67和表皮细胞中AQP3、Fillaggrin的表达量也得到明显提升。Ki67是表征基底细胞新生状态的重要核蛋白，帮助调节细胞周期和细胞增殖；提高Ki-67的表达水平，可促进皮肤细胞增殖和分化。水通道蛋白AQP3在皮肤细胞中的主要功能是促进水和甘油在细胞膜上的运动，在调节水分稳态和维持皮肤水分方面起着重要作用。丝聚蛋白Fillaggrin在维持皮肤的屏障功能和防止水分流失方面起着重要作用，分解形成的聚丝蛋白衍生肽有助于形成包围角质细胞的脂质包膜，维持皮肤屏障的完整性，防止水分和其他重要分子从皮肤流失；还可以减少如特应性皮炎(湿疹)和寻常型鱼鳞病等皮肤病发生。而且Filaggrin对于促进皮肤细胞分化、调节表皮稳态、促进细胞修复等至关重要。
因此，发酵物可以起到调节水分稳态、维持皮肤的水分平衡和水合作用的效果，保持皮肤水分，防止水分流失，并减少皮肤干燥、鳞屑和瘙痒，实现保湿功能，并有助于维持皮肤屏障的完整性。
同时，马克斯克鲁维酵母发酵产物可以促进DP真皮毛乳头细胞增殖。DP细胞在毛发生长和再生中起着至关重要的作用。因此发酵产物具有促进毛发再生功能，可用于制备具有养护头皮、防脱、育发功能的皮肤外用剂，如洗护产品，包括但不限于洗发液、护发素、护发精油、发膜、头皮养护精华、染发剂、定型剂和生发剂等。
本发明的牦牛奶发酵制品来源的马克斯克鲁维酵母发酵产物还可以抑制抑制酪氨酸酶的活性，减少黑色素生成，具有美白效果。
此外，该发酵产物除了对人体皮肤细胞如人成纤维细胞和人表皮细胞的增殖有促进作用，从而促进表皮屏障形成和真皮细胞增殖，修复老化皮肤；还对于UVB或者UVA+UVB对皮肤细胞造成的损伤具有保护或修复作用，能够抵御光老化，并能够清除自由基，具有抗衰老的潜力；同时该发酵产物可以提高皮肤细胞内ATP水平。
发酵产物还能显著降低炎症因子水平，可以起到修红功能。
综上所述，上述马克斯克鲁维酵母发酵产物可用于制备具有保湿、提高皮肤光泽度、白度和亮度，或保护皮肤屏障功能，或者养护头皮和防脱育发的皮肤外用剂、美容口服剂。
上述马克斯克鲁维酵母发酵产物可用于制备具有修红、美白、防止光老化或清除自由基的功能的皮肤外用剂、美容口服剂。
上述马克斯克鲁维酵母发酵产物可用于制备具有上调Ki-67基因、AQP3基因和Filaggrin基因表达量，抑制酪氨酸酶活性，促进皮肤细胞增殖和分化或者提高皮肤细胞ATP水平功能的皮肤外用剂、美容口服剂。
以干物质计，马克斯克鲁维酵母发酵产物在皮肤外用剂或美容口服剂中的含量为0.001％-5％。在发酵产物的固含量为0.001％-0.1％的情况下，即可发挥良好的效果。
牦牛奶是一种独特而营养丰富的乳制品，产自高海拔地区的牦牛。牦牛奶蛋白质含量高，富含微生物生长所必需的氨基酸。并且其氨基酸分布均衡，包括必需氨基酸，如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。这确保了微生物在发酵过程中可以获得广泛的氮源来合成蛋白质。其次，牦牛奶中含有生物活性肽，这些具有多种健康益处的小蛋白质片段也有助于发酵产品的功能特性。除此之外，牦牛奶中所含的必需营养素，如多种维生素、矿物质和脂肪酸，在发酵过程中为微生物提供了额外的生长因子，促进了它们的代谢活性和所需化合物的产生。综上，以牦牛奶为发酵主要氮源之一的马克斯克鲁维酵母Y140K发酵产物，可能因为牦牛奶的上述优势，使微生物代谢合成途径得以强化，相对于普通氮源发酵物，能带来更强的功效潜力。
本发明的有益效果在于，采用牦牛奶发酵制品来源的马克斯克鲁维酵母进行发酵，所获得的发酵产物用作皮肤外用剂、美容口服剂的活性成分，可以实现保湿和维持皮肤屏障的效果，提高皮肤光泽度的值、L值、ITA值，可提亮皮肤和美白；还能够保持和提高细胞内ATP水平，提高皮肤细胞活力、维护皮肤健康；并且可以显著降低炎症因子水平，可以起到修红功能；还可以促进人头皮细胞如真皮毛乳头细胞增殖，可用于养护头皮和育发。可以促进真皮成纤维细胞和表皮细胞增殖、分化，还可以对人皮肤细胞进行保护，防止氧化损伤以及防止紫外线UVA和UVB对皮肤产生的损伤，因此具有维持皮肤健康、修复老化细胞的抗衰老作用。这种发酵产物具有多种功效，可用于制备皮肤外用剂和内服的美容口服剂，具有良好的应用前景和市场前景。
附图说明
图1为马克斯克鲁维酵母JBA-MBY-JT140K在400x显微镜下的形态
图2为马克斯克鲁维酵母发酵产物KmFF对RHE模型上皮肤表皮结构的作用
图3为25倍RHE模型HE染色显微图(A：空白组样品；B：1％KmFF处理样品)
图4为25倍RHE模型ki-67染色显微图(A：空白组样品；B：1％KmFF处理样品)
图5为KMFF对提升ki-67表达的作用
图6为25倍RHE模型AQP3染色显微图(A：空白组样品；B：1％ KmFF处理样品)
图7为KmFF对提升AQP3表达的作用
图8为25倍RHE模型Filaggrin染色显微图(A：空白组样品；B：1％ KmFF处理样品)
图9为KmFF对提升Filaggrin表达的作用
具体实施方式
实施例1菌株分离、纯化、鉴定和专利保藏
从藏族传统的牦牛奶发酵制品中分离本发明所使用的菌种，编号Y140K。经中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)进行形态特征、生理生化特征和DNA序列分析(26SrDNA)等多相鉴定检测，鉴定为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，将保留的菌种纯培养物放入-80℃冰箱进行保藏。该菌的碳源利用情况如下：
符号说明：“+”，阳性；“-”，阴性。
本株马克斯克鲁维酵母，编号JBA-MBY-JT140K，下文记作K.marxianus Y140K由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)于2020年12月17日完成专利保藏，保藏号：CGMCC No.21385。
马克斯克鲁维酵母本身的鲁棒性和耐热性，其最高生长温度可达到52℃。本株K.marxianus Y140K采集地区常年平均温度低于20℃，因此该株K.marxianus Y140K可在较低温度下正常生长，可生长温度为10℃-52℃。
实施例2马克斯克鲁维酵母发酵产物的制备
一、种子培养
种子培养条件如下：
1)配制种子培养基
种子培养基可采用YPD培养基(酵母培养基)或PDB培养基(马铃薯葡萄糖培养基)。
种子培养基1-YPD培养基：1％酵母膏或酵母浸粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖，余量为水，所述百分比为质量百分比。
种子培养基2-PDB培养基：0.5％马铃薯浸粉，1％蛋白胨，1.5％葡萄糖，0.5％氯化钠,余量为水，所述百分比为质量百分比。
种子培养基在121℃，20-30min高温高压灭菌后冷却。
2)菌种活化：挑取-80℃保藏的K.marxianus Y140K菌种，接入液体种子培养基(YPD或PDB)中，摇床20-40℃、0-400rpm培养8-24小时将菌种活化。
3)菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取K.marxianus Y140K单菌落纯培养物。
4)菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至液体YPD培养基中，摇床20-40℃、0-400rpm培养8-24小时，至OD600为0.1-10，得到发酵菌种子菌液。
二、发酵
发酵培养基1(改良YPD培养基)：含有0.5wt％牦牛奶(干重)的YPD培养基，其中含酵母膏或酵母浸粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，余量为水，所述百分比为质量百分比。
发酵培养基2(改良PDB培养基)：含有0.5wt％牦牛奶(干重)的PDB培养基，其中含0.5％马铃薯浸粉、1％蛋白胨、1.5％葡萄糖、0.5％氯化钠，余量为水，所述百分比为质量百分比。
将16-20小时种龄的种子液菌体，按2.0％-5.0％接种量(v/v)接入发酵培养基1或2中，按以下方法进行发酵：
发酵第一阶段，20-38℃，200-400rpm转速搅拌，通气量2-3vvm，先发酵24小时；
发酵第二阶段，30-45℃，流加补充1.0wt％的葡萄糖、0.2wt％牦牛奶粉、0.3wt％酵母膏，流加补充体积分数3.0％-5.0％乙醇或3.0-5.0g/L乙酸，50-400rpm转速搅拌，1-1.5vvm通气量，发酵60小时。
发酵液经蝶式离心火管式离心或膜过滤除菌体。膜技术过滤除菌为：以0.1μm-0.8μm膜进行正压、板框过滤或者陶瓷膜过滤。所述的膜为各类适用于板框的滤膜如聚醚砜树脂(PES)、聚丙烯(PP)、尼龙膜，以及柱式膜柱如中空纤维膜柱、陶瓷膜柱等。所得到发酵滤液可以进一步浓缩或干燥及其它下游处理，得到浓缩液或者干粉。上述发酵滤液、浓缩液或者干粉即马克斯克鲁维酵母发酵产物。
其中，发酵后调节得到最终固含量为0.005％-5.0％的滤液，即马克斯克鲁维酵母发酵产物(K.marxianus Ferment Filtrate，简称KmFF)，用于后续的实验和检测。
表1为该马克斯克鲁维酵母发酵产物的理化参数。经3批次30L罐制备马克斯克鲁维酵母发酵产物，KMFF平均固含量为0.60-1.50％，一般地，调整至约1.0wt％。
表1马克斯克鲁维酵母发酵产物的理化参数和主要成分
实施例3马克斯克鲁维酵母发酵产物的清除自由基能力
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)是一种稳定的氮中心有机自由基。当有自由基清除剂存在时，由于与DPPH单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析，来检测自由基清除情况，从而评价样品的抗衰老能力。
实施例2的用发酵培养基1获得的KmFF(平均固含量0.60-1.50wt％，调整至约1.0wt％进行后续试验)经稀释后的样品液中分别含体积比2.5％、5.0％、10％和25％的发酵物滤液(KmFF干物质含量分别为0.25、0.5、1和2.5mg/mL)，取稀释后的样品液0.1mL加入试管中，再加入0.1mL30μg/mL DPPH乙醇溶液，混匀，室温下避光在黑暗处反应30min，测定OD525，按照下面公式计算清除率：
清除率I(％)＝[1-(T-T0)/(C-C0)]×100％
式中，T0：0.1ml样品液加0.1mL 95％乙醇的吸光度；T：0.1ml样品液加0.1ml 30μg/mL DPPH溶液的吸光度；C0：0.1ml水加0.1ml 95％乙醇的吸光度；C：0.1ml水加0.1ml 30μg/mL DPPH溶液的吸光度。
表2马克斯克鲁维酵母发酵产物的DPPH清除率
实施例4马克斯克鲁维酵母发酵产物对人体皮肤细胞的增殖作用
将实施例2发酵培养基1获得的KmFF加入到人成纤维细胞(Fibroblast,FB)和人表皮细胞(HaCaT)的各自无血清培养液中，以不含样品补加PBS的培养基为空白对照，含5％新生牛血清(FCS)的培养基为阳性对照，培养48小时后，MTT法细胞染色。酶标仪测定550nm处吸光度，以空白对照为100％增殖率，评估KmFF相对空白对照对人成纤维细胞和表皮细胞的增殖作用。
KmFF对FB和HaCaT的生长影响如表3结果所示，添加10wt％实施例2的KmFF能够使FB和HaCaT的最高细胞活力分别达到120.20％和108.96％。
表3马克斯克鲁维酵母发酵产物对HaCaT和Fibroblast细胞的增殖作用
因此，来自牦牛奶发酵制品的KmFF，能够促进表皮屏障形成和促进人皮肤真皮细胞增殖，从而维持皮肤状态健康，修复老化的皮肤，具有抗衰老的潜力。
实施例5马克斯克鲁维酵母对人头皮细胞的增殖作用
真皮毛乳头(DP,dermal papilla)细胞是存在于毛囊底部真皮中的特化间充质细胞。这些细胞在头发形成、生长和循环中起着关键作用。真皮乳头是真皮的一个小突起，延伸到毛囊中。DP细胞的功能是支持和滋养负责产生头发的毛囊。DP细胞在毛发生长和再生中起着至关重要的作用。它们参与毛囊与周围细胞之间的通讯，提供控制毛母细胞生长和分化的信号，毛母细胞负责产生新的毛细胞。DP细胞还产生多种生长因子和信号分子，如Wnt和BMP，它们参与调节毛发生长和再生。此外，DP细胞已被证明具有干细胞样特性，这意味着它们有可能分化为参与毛发生长和再生的各种细胞类型。综上所述，DP细胞是支持和滋养毛囊的重要细胞，在毛发生长和再生中起着至关重要的作用。
表4马克斯克鲁维酵母发酵产物对DP细胞的增殖作用
结果显示，相较于空白组，15％范围内的KmFF(1.5mg/mL)能够有效地提升DP细胞的活力，并且呈现浓度依赖关系，表明马克斯克鲁维酵母发酵产物具有促进毛囊生长和育发方面的功效潜力。
实施例6马克斯克鲁维酵母发酵产物对黑素细胞黑色素含量的作用
一般来讲，黑色素数量和质量在皮肤黑色素是决定皮肤颜色的重要因素。黑色素生成过程中，酪氨酸酶将酪氨酸转化成多巴，多巴醌，经非酶氧化而聚合生成大分子的黑色素。因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着。
小鼠黑色素瘤B16细胞以3000/孔的密度接种在96孔板中，经48h后，换成含forskolin的培养基，48h后将发酵产物用含forskolin培养基稀释后，加入到细胞中，培养24h后加DOPA，测定405nm的吸光值。B16细胞的蛋白浓度以BCA法测定，用于吸光值的校正。结果表明，相较于空白组，10％的KmFF(1.0mg/mL)能够抑制B16细胞的黑素生成至95.04％(**)。
实施例7马克斯克鲁维酵母发酵产物对紫外诱导的细胞损伤的修护作用
皮肤的衰老分为内源性老化和外源性老化，日光尤其是紫外线(ultraviolet UV)照射是外源性老化形成的主要因素，所以外源性老化又称为光老化。与皮肤光老化有关的主要是UVA(320nm-400nm)和少量的UVB(280-320nm)。资料表明，照射到皮肤的紫外线95％是由角质形成细胞吸收，紫外线中UVB则会直接作用于表皮细胞，通过诱导氧化应激、炎症过程进而影响皮肤屏障功能，形成光损伤。如果能够保护UVA/UVB造成的细胞损伤则有利于防止皮肤老化和衰老。
利用UVB照射人永生化表皮HaCaT、真皮成纤维细胞FB，或在FB细胞上同时UVA+UVB辐照处理，建立皮肤的光损伤模型，评估活性物KmFF对皮肤细胞紫外损伤的保护作用。
发酵产物KmFF溶液分别加入到FB和HaCaT的培养液中，两种细胞培养过夜后，去除培养基加入PBS。
用剂量为20mJ的UVB(312nm)辐照HaCaT细胞；用剂量为5.0JUVA和50mJUVB辐照FB细胞。辐照后的细胞分别再加入含有KmFF的培养基，继续培养24小时，用MTT法检测细胞活力。辐照后不加KmFF处理组作为空白对照(NT)。以空白对照的增殖率为100％，评估样品对皮肤细胞相对活力的影响。
表5马克斯克鲁维酵母发酵产物对HaCaT细胞的UVB损伤以及对FB细胞的UVA+UVB损伤的修复作用
由表5结果可知，KmFF对UVB造成的FB和HaCaT细胞损伤有明显的保护作用。
实施例8马克斯克鲁维酵母发酵产物对LPS诱导的THP-1细胞炎症因子的抑制作用
取对数生长期的THP-1细胞，离心重悬后使用100nM Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)的RPMI 1640培养基调整细胞密度为6×10^5个/ml，每孔1ml接种于24孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中孵育72h，待孵育结束后，吸出旧培养基，PBS清洗2次，一次加入空白对照组(BC)、阴性对照组(NC)、待测样品组，其中BC组为无血清的RPMI 1640培养基，NC组为含1μg/ml脂多糖(LPS)的无血清的RPMI 1640培养基，待测样品组使用含1μg/ml LPS的无血清的RPMI 1640培养基，并加入不同浓度的发酵物溶液，继续培养24h。待孵育结束后，收集上清液通过ELISA试剂盒测定炎症因子TNF-α和IL-6的含量。结果显示，炎症因子水平明显降低。表6马克斯克鲁维酵母发酵产物对LPS诱导的THP-1细胞中炎症因子水平的影响
实施例9马克斯克鲁维酵母发酵产物对人皮肤细胞内ATP的影响
皮肤细胞与体内所有其他细胞一样，需要ATP来执行其代谢功能，例如细胞分裂、分化和修复。细胞内ATP为蛋白质合成和DNA复制提供燃料。ATP在维持皮肤屏障功能方面也起着至关重要的作用。皮肤屏障由被脂质基质包围的称为角质细胞的扁平皮肤细胞层组成。这种脂质基质有助于防止水分流失并保持皮肤的水合作用水平。ATP是合成和维持这种脂质基质所必需的。此外，研究表明，皮肤细胞中ATP水平降低会导致皮肤老化和紫外线辐射等环境因素造成的损伤。因此，保持足够的细胞内ATP水平对于皮肤细胞的整体健康和功能非常重要。
将FB以5000个细胞/孔的水平接入96孔细胞培养板中，培养48小时后移除上清，每个培养孔更换为不含血清的DMEM基础培养基，对细胞进行饥饿处理。细胞饥饿16h后做加样处理，对照组为DMEM基础培养基(NT)。
培养24h后使用试剂测量细胞ATP含量。取出100μL培养基，设置标准品孔，加入100μL工作液，室温避光反应10min，酶标仪读板(Luminescence)，计算细胞内相对ATP含量。相对ATP含量＝样品组ATP含量/空白对照组ATP含量×100％。
HaCaT细胞和DP细胞用同样方法培养和检测，结果如表7。
表7马克斯克鲁维酵母发酵产物对不同人皮肤细胞内ATP含量的影响
实施例10马克斯克鲁维酵母发酵产物在RHE人重组表皮模型上结构形态的作用
RHE人重组表皮模型的培养基中，添加1％浓度KmFF样品(终浓度0.1mg/mL)，对RHE人重组表皮模型进行连续培养；17天后观察表皮模型结构，检测表皮模型跨上皮细胞电阻(TEER)。结果如图2，与未处理的模型相比，连续添加1％浓度KmFF样品的表皮模型，TEER提高309.98％。表皮模型跨上皮细胞电阻(TEER)与组织间紧密连接的完整性相关，KmFF处理过的RHE表皮电阻值显著升高，说明KMFF能够使得表皮结构较未处理组的结构更加致密。
苏木精和伊红(HE)染色用于在显微镜下观察不同类型的细胞和组织。对于皮肤表皮细胞，HE染色可用于区分表皮的各层及其内部结构，是研究表皮细胞形态和结构的有用工具。同时，从图3的HE染色中也能看出，连续添加1％浓度KmFF样品的表皮模型，其结构较空白对照组明显的结构更为致密，分化更加完善。
实施例11马克斯克鲁维酵母发酵产物在RHE上提升ki-67表达的作用
Ki-67是一种在增殖细胞中表达的核蛋白质，包括正在进行细胞分裂或增殖的皮肤细胞。它的功能是帮助调节细胞周期和细胞增殖。在细胞周期中，细胞经历不同的阶段，包括G1、S、G2和M期。Ki-67存在于细胞周期的活跃期，特别是G1、S、G2和有丝分裂(M)期间，但不存在于静息期(G0)期间。因此，Ki-67的表达水平被用作确定特定组织或样本中活跃分裂或增殖的细胞百分比的标志物。在皮肤细胞中，Ki-67在表皮基底层的表达最高，那里通过细胞分裂不断产生新的皮肤细胞。随着皮肤细胞向上移动穿过表皮，Ki-67表达减少，直到它不再在表皮的最上层角质层中表达。
如图4所示，连续添加1％浓度KMFF的表皮模型中，基底层的Ki-67表达显著高于空白对照组。如图5，通过成像系统的定量计算，KmFF对RHE中Ki-67的表达量提升至1.73倍。
实施例12马克斯克鲁维酵母发酵产物提升RHE人重组表皮模型上AQP3表达的作用
水通道蛋白-3(AQP3)是一种水通道蛋白,在皮肤细胞中，AQP3在皮肤细胞中的主要功能是促进水和甘油在细胞膜上的运动，可能有助于甘油在角质层的运输发挥作用，因此在调节水分稳态和维持皮肤水分方面起着重要作用。这对于维持皮肤的水分平衡和水合作用以及支持各种细胞过程(如细胞增殖、分化和迁移)非常重要。此外，研究表明，敲除AQP3的小鼠伤口愈合缓慢，所以AQP3也可能通过促进细胞迁移和组织修复在伤口愈合中发挥作用。在3D全皮模型上，1％的KmFF处理后的样品组，细胞中AQP3的表达量明显高于对照组，如图6。相应的蛋白表达提升量如表8和图7。
表8KmFF提升RHE人组人重组表皮模型上AQP3表达的作用
实施例13马克斯克鲁维酵母发酵产物提升RHE人重组表皮模型上Filaggrin表达的作用
丝聚蛋白Filaggrin是一种由角质形成细胞产生、在颗粒层中表达的蛋白质。它在维持皮肤的屏障功能和防止水分流失方面起着重要作用。Filaggrin的主要功能是结合和压实构成皮肤最外层的角蛋白纤维，形成抵御紫外线辐射、污染物和微生物等环境压力源的保护屏障。Filaggrin参与角质化过程，在此过程中，Filaggrin被分解成更小的蛋白质，称为聚丝蛋白衍生肽，有助于形成包围角质细胞的脂质包膜。脂质包膜有助于维持皮肤屏障的完整性，防止水分和其他重要分子从皮肤流失。聚丝蛋白衍生肽还有助于皮肤的天然保湿因子(NMF)，有助于保持皮肤水分。除了其结构作用外，Filaggrin还在皮肤细胞分化和调节皮肤pH平衡中发挥作用。Filaggrin基因突变与各种皮肤病有关，例如特应性皮炎(湿疹)和寻常型鱼鳞病，可导致皮肤干燥、鳞屑和瘙痒。KmFF处理组和空白组的Filaggrin染色显微图如图8所示，相应的蛋白表达提升量如图9。结果显示1％ KmFF处理后，Filaggrin基因表达量提高68.8％。
实施例14马克斯克鲁维酵母发酵产物的人体皮肤功效测试
使用马克斯克鲁维酵母发酵产物(0.1mg/mL)涂抹受试者前臂3cm*3cm区域，于使用前后检测受试者前臂皮肤3cm*3cm区域的角质层含水量、L值、ITA值、皮肤光泽度的变化。
招募健康受试者10名，20-45岁，受试者清洁前臂皮肤，在平衡20分钟后，选择受试者前臂皮肤区域3cm*3cm区域，测试角质层含水量、L值、ITA值、皮肤光泽度的初始值。
然后分别涂抹等量的酵母发酵产物并于初次使用后20min检测该区域角质层含水量、L值、ITA值、皮肤光泽度的值，其结果如下表所示。
表9KmFF的人体皮肤功效测试指标变化结果
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空白组(即不涂抹马克斯克鲁维酵母发酵产物)角质层含水量变化设为100％，从表可以看出，与空白组相比，使用马克斯克鲁维酵母发酵产物，皮肤角质层含水量提高，说明本发明所述的发酵滤液能够提高皮肤角质层含水量，具有皮肤保湿功效。
从表9可以看出，空白组(即不涂抹马克斯克鲁维酵母发酵产物)L值和ITA值变化设为100％，与空白组相比，发酵产物KmFF组ITA值和L值升高，说明使用本发明马克斯克鲁维酵母发酵滤液能够提高皮肤白度和亮度，具有皮肤美白功效。
从表9可以看出，空白组(即不涂抹马克斯克鲁维酵母发酵产物)L值变化设为100％，与空白组相比，使用马克斯克鲁维酵母发酵产物，L升高，说明本发明所述的发酵滤液能够提高皮肤白度。
从表9可以看出，空白组(即不涂抹马克斯克鲁维酵母发酵产物)皮肤光泽度变化设为100％，与空白组相比，使用马克斯克鲁维酵母发酵产物，皮肤光泽度升高，说明本发明所述的发酵滤液具有改善皮肤光泽度功效，具有提亮肤色的效果。
实施例3-14采用实施例2培养基2所获得的发酵产物时，所获得的效果相同。

Claims (10)

1.马克斯克鲁维酵母的发酵产物，其特征在于，其发酵培养基中含有牦牛奶、糖类和蛋白类；马克斯克鲁维酵母菌株保藏号为CGMCCNo.21385。
2.根据权利要求1所述的发酵产物，其特征在于，以干重计，牦牛奶的添加量为0.1wt％-4.0wt％。
3.根据权利要求1所述的发酵产物，其特征在于，所述糖类物质为玉米浆、糖蜜、葡萄糖和木糖中的至少一种，添加量为0.1wt％-8.0wt％；蛋白类物质为酵母膏、酵母浸粉、蛋白胨和酵母蛋白胨中的至少一种，添加量为0.1wt％-5.0wt％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的发酵产物，其特征在于，所述的发酵培养基为含有牦牛奶的YPD、PDB及其改良培养基。
5.根据权利要求1所述的发酵产物，其特征在于，所述的发酵培养基中还含有谷物粉或谷物浸粉，添加量为0wt％-6.0wt％。
6.权利要求1-5任一项所述马克斯克鲁维酵母菌株的发酵产物的制备方法，其特征在于，步骤包括：
(1)第一阶段发酵：将种子菌液接入发酵培养基中，20-38℃发酵12-24小时；
(2)第二阶段发酵：发酵培养基中补充牦牛奶、糖类物质、蛋白类物质，并且补充酸或醇，继续发酵12-72小时。
7.权利要求1-5任一项所述的发酵产物在制备具有保湿、提高皮肤光泽度、白度和亮度，或者稳固皮肤屏障效果的皮肤外用剂或者美容口服剂方面的应用。
8.权利要求1-5任一项所述的发酵产物在制备具有养护头皮、防脱、育发功能的皮肤外用剂方面的应用。
9.权利要求1-5任一项所述的发酵产物在制备具有修红、美白、防止光老化或清除自由基的功能的皮肤外用剂或者口服美容品方面的应用。
10.权利要求1-5任一项所述的发酵产物在制备具有上调Ki-67基因、AQP3基因和Filaggrin基因表达量，抑制酪氨酸酶活性、促进皮肤细胞增殖和分化或者提高皮肤细胞ATP水平功能的皮肤外用剂或者口服美容品方面的应用。
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