KR20170053755A

KR20170053755A - 현미상황 유산균발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20170053755A
Application number: KR1020150155479A
Authority: KR
Inventors: 김선희; 편새미; 김재원; 장정원; 강현걸; 안정모; 김호진; 이기범
Original assignee: 엠제이 주식회사
Priority date: 2015-11-06
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2017-05-17

Abstract

본 발명은 현미상황 유산균발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콜라겐의 생성을 유도하고 자외선 조사에 의한 피부 세포의 손상을 회복시킬 수 있는 현미상황 유산균발효 추출물을 포함하는 피부 노화 저감, 피부 탄력 증진 및 피부 주름 개선 효능을 갖는 저비용 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

현미상황 유산균발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION CONTAINING FERMENTED BROWN RICE-PHELLINUS LINTEUS EXTRACT}

본 발명은 현미상황 유산균발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물, 보다 상세하게는 현미상황 유산균발효 추출물을 포함하는 피부 노화 저감, 피부 탄력 증진 및 피부 주름 개선용 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부의 노화는 두 가지로 나누어 볼 수 있는데, 하나는 내인성 노화(chronologic aging)로 시간이 경과함에 따라 기관과 동반하여 피부의 구조와 기능이 지속적으로 감퇴되어지는 것이고 다른 하나는 외인성노화(Photoaging)로 장기간에 걸친 자외선의 노출로 인한 피부조직의 변화로 나누어진다. 이러한 노화 과정으로 피부는 건조해지고, 주름이 생기며 피부의 탄력을 잃게 된다.

피부의 노화에 관여하는 인자로는 콜라겐, 세라마이드(ceramide) 등이 알려져 있다. 콜라겐은 세포 간질의 주성분으로, 나이를 먹어감에 따라 감소하게 되며 80대가 되면 20대의 65% 정도 수준으로 감소하게 된다. 콜라겐 및 세라마이드(ceramide)의 감소가 노화에 따른 피부 주름의 주된 원인이 되며, 콜라겐과 프로테오글리칸(proteoglycan)이 분자간 교차결합이나 측쇄 수식에 의해 경화하여 세포-세포외기질 상호작용에 변화를 초래하여 피부의 노화가 발생하는 것으로 알려져 있다. 또한, 세포내 소포체 스트레스에 의한 이상단백질의 축적, 유극세포의 감소 및 표피세포의 회전율(turn over, 보통 28일) 감소로 인한 피부 잡티 유발 등도 피부 노화에 관여하는 것으로 알려져 있다.

노화의 중요한 원인으로는 산화적 스트레스가 있으며, 이러한 스트레스 유발인자로는 과산화물, 히드록시 라디칼, 과산화수소 등을 포함하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 대표적이다. 이 외에도 산화질소, 페록시나이트라이트 등의 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS) 및 지질 과산화물도 산화 스트레스 유발인자로 알려져 있다. 이러한 산화물들은 DNA염기인 구아닌(guanine)에 결합하여 돌연변이를 유발시킴으로써 피부노화 및 암 등을 유발하는 것으로 알려져 있다.

상황버섯(Phellinus linteus)은 담자균류에 속한 고등균류로 소나무비늘버섯과(Hymenochaetaceae) 진흙버섯속(Phellinus)에 속하는 백색부후균에 속한다. 목질진흙버섯이라고도 하며, 동의보감에서는 상목이(桑木耳)라는 이름으로 탕액편에 기록되어 있다. 갓은 지름 6∼12cm, 두께 2∼10cm로, 반원 모양, 편평한 모양, 둥근 산 모양, 말굽 모양 등 여러 가지 모양을 하고 있다. 주로 뽕나무와 활엽수의 줄기에 자생하며 삿갓 표면을 제외하면 모두 황색을 나타내어 상황으로 불린다.

상황버섯은 다년생 버섯으로 균사체의 단계를 거쳐 자실체로 성장하게 된다. 균사체는 포자가 발아하는 단계로, 균이 실처럼 덩어리를 이루고 있는 형태에서 기인하여 균사체로 부르고 있다. 이러한 균사체가 몇년을 더 성장하게 되면 포자형성체인 자실체가 된다. 상황버섯의 균사체는 황색을 띠고 있으며, 자실체가 되면 표면은 짙은 담황색을 띠게 되고, 속은 목질화되어 짙은 황갈색을 띠게 된다.

상황버섯은 우수한 항암 효과를 갖는 기능성 소재로 각광받고 있으나, 다년생 버섯으로 그 자실체를 구하기가 매우 어렵고, 자실체의 목질 성분으로 인하여 유효성분의 추출 수율이 매우 낮아 그를 이용한 제품의 가격이 크게 상승하는 문제가 있었다. 또한, 버섯류의 다당체 성분은 열수 추출이 어려운 문제가 있었다.

KR

101033671

B1

본 발명은 인체에 독성과 부작용을 나타내지 않으면서 피부의 노화를 저감시키고 피부 탄력을 증진시키며 피부 주름을 개선할 수 있는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 현미 상황(Brown rice-Phellinus Linteus) 유산균발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물이 제공된다.

또한, 상기 현미상황 유산균발효 추출물은 현미를 포함하는 배지에 상황버섯 균사체를 접종하여 얻어진 현미상황 배양물을 유산 발효하여 얻은 현미상황 유산균 발효물의 추출물일 수 있다.

또한, 상기 유산 발효는 락토바실러스 팔란타룸(Lactobacillus plantarum)을 이용할 수 있다.

또한, 상기 유산 발효는 32 내지 35℃에서 24 내지 72시간 동안 발효시킬 수 있다.

또한, 상기 현미상황 유산균발효 추출물은 현미상황 유산균 발효물을 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 추출용매로 추출할 수 있다.

또한, 1,2-헥산디올(1,2-hexandiol) 및 부틸렌글라이콜(Butylene glycol)을 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 수분로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 수분크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 화장료 조성물은 인체에 독성 및 부작용을 나타내지 않으며, 콜라겐 생합성을 촉진시킬 수 있다. 이를 통하여, 피부의 재생을 도울 수 있다.

또한, 피부의 탄력을 증진시키고 피부의 주름을 개선할 수 있다.

또한, 자외선에 의한 피부의 손상을 저감시켜 피부의 노화를 저감시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 조성물의 총 페놀 함량을 측정하기 위한 검량선이고,
도 2는 본 발명의 조성물의 총 플라보노이드 함량을 측정하기 위한 검량선이고,
도 3 및 도 4는 본 발명의 조성물의 세포독성을 측정한 결과이고,
도 5는 본 발명의 조성물의 콜라겐 생합성능을 측정한 결과이고,
도 6은 본 발명의 조성물의 자외선 조사 후 세포생존율을 측정한 결과이다.

본 발명은 현미상황(Brwon rice-Phellinus Linteus) 유산균발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에 의하면, 현미상황 유산균발효 추출물을 포함하는 조성물이 제공된다.

본 발명에서 이용되는 현미상황 유산균발효 추출물은 현미상황 유산균 발효물을 추출한 것이다. 상기 현미상황 유산균 발효물은 현미상황 배양물을 유산 발효시켜 얻을 수 있다.

본 발명에서 이용되는 상황은 상황버섯의 균사체이다. 본 발명은 상황버섯의 자실체가 아닌 균사체를 이용함으로써 원료의 성숙에 필요한 시간을 단축시키고 원료의 대량생산이 가능하므로 화장료 조성물의 제조에 필요한 제조시간 및 제조비용을 절감시킬 수 있다. 또한, 균사체는 자실체에 비하여 비용이 저렴하므로 화장료 조성물의 제조비용을 절감시킬 수 있다. 또한, 목질을 형성하기 전의 균사체를 이용함으로써, 원료 추출시 유효성분의 수율을 향상시킬 수 있다.

본 발명에서 이용되는 현미상황 배양물은 현미에 상황버섯 균사체가 배양된 것이다. 이는 현미를 포함하는 배지에 상황버섯 균사체를 접종하여 얻을 수 있다. 보다 상세하게는, 물에 충분히 불린 현미를 고압멸균기에서 멸균시킨 후 순수하게 배양된 상황버섯균사를 무균 상태에서 접종한 후 배양하여 얻을 수 있다. 필요에 따라, 이를 건조한 후 분쇄함으로써 분말 형태의 현미상황 배양물을 얻을 수 있다. 본 발명은 현미상황 배양물을 이용함으로써, 현미 및 상황버섯의 기능성 성분을 동시에 포함하는 조성물을 제조할 수 있다. 또한, 현미에 배양된 상황버섯 균사체는 균사체의 성장속도가 빠르므로 원료 준비시간을 단축시켜 화장료 조성물의 제조에 필요한 시간을 절감시킬 수 있다.

본 발명의 현미상황 유산균 발효물은 현미상황 배양물에 발효 미생물을 접종하고 발효시켜 얻을 수 있다. 상기 발효는 유산 발효인 것이 바람직하다. 상기 발효 미생물은 유산균류인 것이 바람직하다. 상기 유산균류로는, 셀룰로오스에 대한 작용성이 우수한 락토바실러스속 균이 선택되는 것이 좋다. 상기 발효는 32 내지 35℃ 온도하에 24 내지 72시간동안 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명은 현미상황 배양물의 발효를 통해 현미상황 배양물에 포함되는 유효성분의 저분자화를 유도함으로써 유효성분의 추출 효율을 향상시킬 수 있다. 이를 통하여, 제조비용을 절감시킬 수 있다.

상기 현미상황 유산균발효 추출물의 분리방법은 특별히 한정되지는 않으며, 추출물을 제조하기 위해 당업계에서 통상적으로 이용하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출, 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출, 초음파추출 등의 추출장치를 이용하는 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함하는 흡착 수지를 이용하는 방법 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 추출용매를 처리하여 추출한 후 감압 농축하여 수득할 수 있다.

상기 추출용매는 특별히 한정되지는 않으며, 열수 또는 유기용매를 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 추출용매를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매가 선택되는 것이 좋다. 보다 바람직하게는, 정제수 또는 에탄올이 선택되는 것이 좋다. 보다 바람직하게는, 증류수에 20 내지 50%(v/v) 농도로 희석된 에탄올이 선택되는 것이 좋다.

추출용매를 처리하여 추출물을 분리할 시의 온도는 10 내지 120℃일 수 있다. 바람직하게는, 40 내지 100℃일 수 있다. 보다 바람직하게는, 80 내지 100℃일 수 있다. 상기 온도에서 1 내지 10시간 동안 추출하여 본 발명의 현미상황 유산균발효 추출물을 분리할 수 있다. 바람직하게는 5 내지 10시간 동안 추출하여 본 발명의 현미상황 유산균발효 추출물을 분리할 수 있다. 보다 바람직하게는 8 내지 10시간 동안 추출하여 본 발명의 현미상황 유산균발효 추출물을 분리할 수 있다. 분리된 추출물은 여과 및 농축된 후 멸균될 수 있다.

필요에 따라, 1,2-헥산디올(1,2-hexandiol) 및 부틸렌글라이콜(Butylene glycol)을 첨가할 수 있다. 1,2-헥산디올(1,2-hexandiol) 및 부틸렌글라이콜(Butylene glycol)은 인체에 무해하며 방부능력이 있어 방부제로서의 역할을 할 수 있다. 또한, 피부 보습력을 향상시킬 수 있다. 상기 1,2-헥산디올(1,2-hexandiol) 및 부틸렌글라이콜(Butylene glycol)은 제조되는 조성물 부피 총 100%에 대하여 각각 1 내지 5%가 되도록 첨가되는 것이 바람직하다.

본 발명의 현미상황 유산균발효 추출물을 포함하는 조성물은 콜라겐 생합성을 촉진시킬 수 있다. 이를 통하여, 피부의 노화를 방지하고 피부의 재생을 도우며 피부 주름을 개선할 수 있다.

또한, 본 발명의 현미상황 유산균발효 추출물을 포함하는 조성물은 자외선에 의한 피부의 손상을 저감시킬 수 있다. 이를 통하여, 피부 노화를 방지할 수 있다.

본 발명의 현미상황 유산균발효 추출물을 포함하는 조성물은 피부에 도포되는 물질로 제조될 수 있다. 예를 들면, 화장료로 제조될 수 있다.

본 발명의 현미상황 유산균발효 추출물을 포함하는 화장료는 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 수분로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 수분크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클린저 등의 제형으로 제조될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 본 발명을 하기 실시예 및 비교예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예

<현미상황 유산균발효 추출물의 준비>

상황버섯 균사체의 원균을 평판 배양한 후 삼각 플라스크에서 재배양하여 종균을 준비하였다. 배지로 사용할 현미를 물에 불려 재배용기에 담은 후 고압멸균기를 이용하여 121℃, 1.5기압 조건에서 15분간 처리하여 멸균하였다. 배지를 상온에 방치하여 식힌 후 상황버섯균을 접종하고 25℃에서 배양하여 현미상황 배양물을 준비하였다.

현미상황 배양물을 발효시키기 위한 유산균으로 락토바실러스 플란타룸(Lctobacillus plantarum)을 32℃에서 이틀간 배양시켜 준비하였다. 현미상황 배양물에 유산균을 접종하고 32℃에서 이틀간 발효시킨 후 100℃에서 2시간 멸균하고 추출하였다. 추출용매로 물에 35%(v/v)로 희석한 에탄올을 사용하였으며, 80℃에서 8시간동안 추출하였다. 그 후 1μm 필터를 이용하여 여과하고 농축기를 이용하여 80℃에서 48시간동안 농축한 후 1μm 필터로 다시 여과하고 100℃에서 2시간 멸균 처리하였다. 이를 50℃로 냉각시키고 1,2-헥산디올(1,2-hexandiol) 및 부틸렌글라이콜(Butylene glycol)을 첨가한 후 10분간 혼합하고 0.45μm 필터로 여과하여 현미상황 유산균발효 추출물을 포함하는 조성물을 제조하였다. 1,2-헥산디올 및 부틸렌글라이콜은 조성물 부피 총 100%에 대하여 각각 3%, 5%가 되도록 첨가되었다.

<현미상황 유산균발효 추출물의 β-glucan 함량 측정>

β-glucan 함량은 mushroom and yeast beta-glucan assay procedure kit를 이용하여 측정하였다. 측정을 위한 시료로는 본 발명의 현미상황 유산균발효 추출물(이하, 발효군으로 기재) 및 미발효 현미상황 추출물(이하, 미발효군으로 기재)을 이용하였다. 미발효군은 유산발효를 하지 않는 것을 제외하면 발효군과 동일한 방법으로 제조하여 준비하였으며, 발효군과 미발효군 모두 동결건조 후 분쇄하여 파우더 형태로 수득하여 사용하였다. 시료 100 mg에 37% HCl 1.5 mL를 넣고 30℃ 항온수조에서 45분간 교반한 후 3차 증류수 10 mL를 가하고 100℃ 항온수조에서 다시 2시간 교반하였다. 이 반응액을 상온에서 식힌 후 2 N KOH 10 mL를 가하여 혼합하였다. 이 혼합물에 0.2 M sodium acetate buffer (pH 5.0)를 가하여 100 mL로 정용한 후 원심분리(1,500×g, 10분)하여 상등액을 얻었다. 상등액 0.1 mL에 exo-1,3-β-glucanase(20 U/mL) + β-glucosidase (4 U/mL) 용액 0.1 mL를 가하고 40℃ 항온수조에서 60분간 반응시켰다. 이 반응액에 GOPOD (glucose oxidase/peroxidase, Megazyme) 시약 3 mL를 넣고 40℃에서 20분간 반응 시킨 후 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 total glucan 함량 계산에 사용하였다.

또한 시료 100 mg에 2 N KOH 2 mL를 넣고 얼음을 채운 항온수조에서 20분간 교반 하였다. 이 반응액에 1.2 M sodium acetate buffer (pH 3.8) 8 mL와 amyloglucosidase (1,630 U/mL) + invertase (500 U/mL) 용액 0.2 mL를 가하고 40℃ 항온수조에서 30분간 교반한 후 원심분리(1,500×g, 10분)하여 상등액을 얻었다. 상등액 0.1 mL에 0.2 M sodium acetate buffer (pH 5.0) 0.1 mL와 GOPOD 시약 3 mL를 넣고 40℃에서 20분간 반응시킨 후 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 α-glucan의 흡광도는 표준물질인 glucose용액(1 mg/mL)을 GOPOD 시약과 반응시킨 반응액의 흡광도를 이용하여 각각 함량(g/100 g)값으로 계산하였다. β-glucan 함량은 total glucan 함량에서 α-glucan 함량을 뺀 값으로 계산하였다. 그리고 그 결과는 하기 표 1에 도시하였다.

	β-glucan (%)
미발효군	8.1±1.6
발효군	12.8±1.1

상기 표 1을 보면, 미발효군과 발효군의 β-glucan 함량은 각각 8.1, 12.8 %로 나타났다. 유산균 발효를 진행한 본 발명의 조성물인 발효군의 경우, 미발효군에 비해 β-glucan 함량이 58% 증가하여, 보다 높은 함량으로 유효성분을 포함하는 것을 확인할 수 있다.

<현미상황 유산균발효 추출물의 총 페놀 함량 측정>

추출물의 총 페놀 함량은 Folin-Denis 방법으로 측정하였다. 시료는 증류수에 녹여 농도를 조절하여 사용하였다. 시료 조성물(1 mg/mL) 100 μL와 증류수 900 μL를 혼합하였고 Folin-Ciocalteu's phenol reagent 100 μL를 가하여 혼합 후 5분간 상온에서 반응시켰다. 이 용액에 20% Na₂CO₃ 300 μL를 가하여 혼합한 다음 증류수를 가하여 2 mL로 정용하였다. 이 용액을 상온에서 2시간 동안 방치한 후 760 nm에서 흡광도(OD)를 측정하였고 gallic acid를 이용한 검량선과 비교하여 mg gallic acid equivalents (GAE)/g으로 나타내었다. 검량선은 도 1에 도시하고, 시료 조성물의 흡광도 및 검량선에 대입하여 측정한 총 페놀 함량은 하기 표 2에 도시하였다. 도 1 및 표 2에서, 흡광도는 블랭크값 0.043을 뺀 값으로 기재하였다.

	시료 조성물의 흡광도	총 페놀 함량(ppm)
미발효군	0.025	5.38
발효군	0.039	9.5

상기 표 2를 보면, 미발효군과 발효군의 총 페놀 함량은 각각 5.38, 9.5ppm으로 나타났다. 유산균 발효를 진행한 본 발명의 조성물인 발효군의 경우, 미발효군에 비해 총 페놀 함량이 43% 증가해, 보다 높은 함량으로 유효성분을 포함하는 것을 확인할 수 있다.

<현미상황 유산균발효 추출물의 총 플라보노이드 함량 측정>

시료 조성물(1 mg/mL) 200 μL를 취하여 에탄올 800 μL와 5% NaNO₂ 60 μL를 가하여 균질하게 혼합한 후 5분간 실온에서 반응시켰고 10% AlCl₃을 60 μL 가하여 실온에서 다시 5분간 반응시켰다. 그 후 1 M NaOH 용액을 400 μL 가하여 1분간 상온에서 반응시켰고 증류수 500 μL를 가하여 균질화 시킨 후 200 μL를 96 well plate에 분주하여 Microplate Reader(BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)로 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 쿼세틴(quercetin)을 이용하여 시료의 총 플라보노이드 함량은 mg quercetin equivalents(QE)/g으로 나타내었다. 시료 조성물의 흡광도는 총 3회 측정하고 평균값을 구하였다. 검량선은 도 2에 도시하고, 시료 조성물의 흡광도 및 검량선에 대입하여 측정한 총 플라보노이드 함량은 하기 표 3에 도시하였다. 도 2 및 표 3에서, 흡광도는 블랭크값 0.044를 뺀 값으로 기재하였다.

	시료 조성물의 흡광도	총 플라보노이드 함량(ppm)
미발효군	0.008	12.83
발효군	0.022	36.72

상기 표 3을 보면, 미발효군과 발효군의 총 플라보노이드 함량은 각각 12.83, 36.72ppm으로 나타났다. 유산균 발효를 진행한 본 발명의 조성물인 발효군의 경우, 미발효군에 비해 총 플라보노이드 함량이 65% 증가해, 보다 높은 함량으로 유효성분을 포함하는 것을 확인할 수 있다.

<현미상황 유산균발효 추출물의 세포독성 확인>

본 발명의 조성물의 세포독성을 확인하기 위해, 인간섬유아세포주인 HS27을 대상으로 발효군 및 미발효군을 농도별로 각각 처리하여 독성평가 실험을 수행하였다.

HS27세포는 DMEM(Dublbecco'S Modified Eagle Medium) 1L에 FBS(fetal bovine serum) 100mL을 첨가하여 10% 농도로 FBS를 사용하였으며 100X Penicillin/Streptomycine(LONZA사)을 100배 희석한 희석액을 10mL/L 첨가 후 37℃ CO₂ 세포 배양기에서 배양한 것을 사용하였다. 세포를 Serum free medium에서 6시간 배양 후 농도 조절한 시료 조성물을 세포에 처리하고, 24시간 배양한 후 CCK-8 assay solution을 50ul 씩 넣은 후 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 3시간동안 반응시키고 ELISA Leader로 OD 480nm에서 흡광도를 확인하였다. 음성대조군으로는 세포와 CCK-8 solution만을 반응시킨 것을 사용하였다. 시료 조성물 및 CCK-8 assay solution이 들어간 용액을 농도별로 준비하여 각 농도별 블랭크값으로 사용하였다. 세포생존율은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다. 실험은 3회 수행하였으며, 그 결과는 도 3 및 도 4에 도시하였다. 도 3에서 대조군은 시료 조성물을 처리하지 않은 세포의 생존율을 기준으로 분석하였다.

도 3을 보면, 발효군과 미발효군 모두 2000μg/mL 농도까지 세포독성이 나타나지 않는 것을 확인할 수 있다.

미발효군의 경우 2500μg/mL 농도에서 대조군 대비 82% 생존율을 보여 약한 독성을 나타냈으며, 3000μg/mL 농도에서 37%의 생존율을 보여 독성을 나타냈다. 발효군의 경우 대조군 대비 모든 농도 처리군에서 세포가 높은 생존율을 보여 독성을 나타내지 않았다.

도 4를 보면, 발효군과 미발효군 모두 대조군 대비 모든 농도 처리군에서 세포 독성이 나타나지 않는 것을 확인할 수 있다. 발효군의 경우, 대조군 대비 모든 농도 처리군에서 세포의 높은 생존율이 나타나 세포독성이 나타나지 않으며, 세포의 분열을 촉진하는 것으로 나타났다.

도 3 및 도 4를 참고하면, 본 발명의 현미 상황버섯 발효 추출물이 세포독성을 갖지 않는 것을 확인할 수 있다.

<현미상황 유산균발효 추출물의 콜라겐 생합성능 측정>

인간섬유아세포주인 HS27을 이용하여 본 발명의 조성물의 콜라겐 생합성능을 측정하였다. 세포에 발효군 및 미발효군 시료 조성물을 처리한 후 Procollagen type 1 PIP kit(Takara)을 이용하여 반응시켜 세포배양액 내의 콜라겐 함량을 측정하고 그 결과를 도 5에 도시하였다. 양성 대조군(Positive Control)으로 아데노신(adenosine) 400μg/mL 로 처리한 배양액을 이용하였다. 음성 대조군(Negative Control)은 동량의 증류수를 처리한 배양액을 이용하였다.

도 5를 보면, 발효군과 미발효군 모두 100μg/mL 이상의 농도에서 콜라겐 전구체 펩타이드(procollagen type I carboxy-terminal peptide, PIP)의 농도가 증가하였으며, 음성 대조군과 비교하면 3배 이상으로 증가한 것으로 나타났다. 폴드값(fold, 시료 조성물 처리군PIP/음성 대조군PIP)은 미발효군의 경우 100μg/mL 농도로 처리한 배양액에서 3.5배, 400μg/mL 농도로 처리한 배양액에서 3.9배, 800μg/mL 농도로 처리한 배양액에서 4.1배, 1000μg/mL 농도로 처리한 배양액에서 3.7배, 1500μg/mL 농도로 처리한 배양액에서 3.2배로 측정되었으며, 발효군의 경우 100μg/mL 농도로 처리한 배양액에서 4.3배, 400μg/mL 농도로 처리한 배양액에서 4.6배, 800μg/mL 농도로 처리한 배양액에서 4.6배, 1000μg/mL 농도로 처리한 배양액에서 4.3배, 1500μg/mL 농도로 처리한 배양액에서 4.2배로 측정되어, 발효군이 미발효군보다 우수한 콜라겐 생합성능을 갖는 것을 확인할 수 있다. 본 발명의 조성물은 콜라겐 생합성을 증진시켜 피부의 재생을 도움으로써 피부 탄력성을 증진시키고 피부 주름을 개선할 수 있다.

<현미상황 유산균발효 추출물의 피부 주름 개선 효능 측정>

인간섬유아세포주인 HS27을 이용하여 본 발명의 조성물의 피부 주름 개선 효능을 측정하였다. 24well culture plate에 HS27세포주 5 X 10⁴ 개를 complete media(DMEM, 10%FBS, 1X P/S)에 넣어 하루동안 배양시킨 후 5시간 serum free starvation을 진행하였다. 시료 조성물을 처리하기 전에 UVB 30mJ/Cm² 조사하여 세포의 스트레스를 유도한 직후 시료 조성물을 농도별(0, 100, 400, 800, 1000, 1500 ug/ml)로 세포에 처리하였다. 아데노신(Adenosine)을 0.2um filter를 사용하여 필터링 한 후 소재와 동일 농도별로 준비한 후 세포에 처리하였다. 24시간 경과 후 콜라겐 생합성 및 MMP1 저해활성 측정 실험을 위한 배양액을 200ul 수거한 후 CCK-8 assay solution을 30ul 씩 넣은 후 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 3시간 반응시켜 세포재생 및 생존율을 측정하였다. HS27 세포에 UVB를 조사한 후 자외선 조사에 의한 산화 스트레스 유발 조건에서 시료 조성물의 농도별 처리에 의한 세포재생 및 생존율을 측정한 결과는 도 6에 도시하였다. 아데노신은 식약청 고시 주름개선 소재로서 양성 대조군으로 사용하였다.

도 6을 보면, 미발효군 100, 400 및 800ug/ml 처리군의 경우 처리하지 않은 대조군에 비해 세포재생 및 세포생존율이 증가한 것을 확인할 수 있다. 발효군의 경우, 모든 농도 처리군에서 대조군에 비해 세포재생 및 세포생존율이 증가하였다. 특히, 800ug/ml 농도로 처리한 경우 가장 우수한 효과를 나타냈다. 발효군을 800ug/ml 농도로 처리한 경우, 세포 생존율이 대조군 대비 41% 증가한 것으로 나타나 아데노신을 100ug/ml 이하의 농도로 처리한 양성 대조군보다도 우수한 효과를 나타냈다.

도 6을 참고하면, 본 발명의 현미상황 유산균발효 추출물이 자외선의 조사에 의한 세포 손상을 회복시키는 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 본 발명의 조성물은 자외선에 의한 피부의 노화를 저감시킴으로써 피부 탄력성을 증진시키고 피부 주름을 개선할 수 있다.

Claims

현미상황(Brown rice-Phellinus Linteus) 유산균발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 현미상황 유산균발효 추출물은 현미를 포함하는 배지에 상황버섯 균사체를 접종하여 제조된 현미상황 배양물을 유산 발효하여 얻은 유산균 발효물의 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 유산 발효는 락토바실러스 팔란타룸(Lactobacillus plantarum)을 이용한 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 유산 발효는 32 내지 35℃에서 24 내지 72시간 동안 발효시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 현미상황 유산균발효 추출물은 현미상황 배양물의 유산균 발효물을 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 추출용매로 추출하여 얻어진 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
1,2-헥산디올(1,2-hexandiol) 및 부틸렌글라이콜(Butylene glycol)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 수분로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 수분크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.