CN115287204B - 一种马克斯克鲁维酵母菌株及其应用 - Google Patents

一种马克斯克鲁维酵母菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种马克斯克鲁维酵母菌株及其应用，该菌株为马克斯克鲁维酵母菌株（Kluyveromyces marxianus）SEUNEU‑114，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022690。体外细胞实验表明，该马克斯克鲁维酵母菌株SEUNEU‑114，具有抗衰老、促进细胞增殖、抗炎抗自由基，可用于制备药品、化妆品等。

Description

一种马克斯克鲁维酵母菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种马克斯克鲁维酵母菌株及其应用。
背景技术
皮肤是人体内最大的器官，总重量大约占个体体重的16%，一方面维持机体稳定，另一方面也是抵御外界不良因素侵扰的第一道防线。有研究表明，如果外界环境导致皮肤屏障中的相关基因异常，就会诱发皮肤疾病。
皮肤衰老，包括由空气污染、吸烟、营养不良和紫外线（UV）等环境因素引起的外在衰老和由时间变化引起的内在衰老。其典型特征是皮肤变薄、产生细纹，这可能是由于细胞增殖减少以及随着年龄增长引起的真皮成分发生显着变化导致的。细胞外基质成分（胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖等）随着皮肤衰老而显着减少。此外，伴随增龄，多种因素如线粒体损伤、炎症反应等产生的活性氧增加，同时，与年龄相关的细胞修复能力下降，使得氧化应激增加，老化受损细胞无法及时清除，从而导致了皮肤衰老。
益生菌用在化妆品上可抵御皮肤衰老，促进细胞增殖，起到抗炎抗自由基的作用，有效增加肌肤对营养物质的吸收，增强免疫力。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种马克斯克鲁维酵母菌株及其应用。
本发明公开了一种马克斯克鲁维酵母菌株（Kluyveromyces marxianus），所述菌株为马克斯克鲁维酵母菌株SEUNEU-114（Kluyveromyces marxianus SEUNEU-114），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2022690，保藏日期为2022年5月23日。
本发明还公开了一种马克斯克鲁维酵母菌株在制备改善肌肤状况的产品中的应用，所述产品为药品或化妆品，所述改善肌肤状况包括抗衰老、促进细胞增殖和抗自由基中的至少一种。
进一步的，上述应用，其中，所述抗衰老为上调细胞外基质相关基因的表达，所述细胞外基质相关基因包括TIMP1、SMAD3、COL-1、COL3A1、MKX、SPTSSA中的至少一种。
进一步的，上述应用，其中，所述抗衰老为上调细胞自噬相关基因LC3B的表达。
进一步的，上述应用，其中，所述抗衰老为上调细胞抗氧化相关基因NRF2的表达。
进一步的，上述应用，其中，所述抗衰老为下调细胞凋亡相关基因的表达，所述细胞凋亡相关基因包括BAX和Caspase家族的Caspase-3基因的表达。
进一步的，上述应用，其中，所述促进细胞增殖包括促进人成纤维细胞的增殖。
进一步的，上述应用，其中，所述抗自由基为清除羟自由基和/或ABTS自由基。
本发明还公开了一种马克斯克鲁维酵母菌株在制备肌肤抗炎产品中的应用，所述产品为药品或化妆品。
进一步的，上述应用，其中，所述抗炎为下调细胞炎症相关因子基因的表达，所述细胞炎症相关因子基因包括IL-6、IL-22和TRPV1中的至少一种。
本发明中马克斯克鲁维酵母菌株SEUNEU-114（Kluyveromyces marxianus SEUNEU-114），保藏编号为CCTCC NO: M 2022690。体外细胞实验表明，该马克斯克鲁维酵母菌株SEUNEU-114，具有抗衰老、促进细胞增殖、抗炎抗自由基，可用于制备药品、化妆品等。
生物保藏说明
马克斯克鲁维酵母SEUNEU-114（Kluyveromyces marxianus SEUNEU-114），于2022年5月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2022690。
具体实施方式
本发明提供了马克斯克鲁维酵母及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的马克斯克鲁维酵母菌株SEUNEU-114，来源于传统发酵牦牛酸奶酒，经18SrDNA鉴定为马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）。菌株SEUNEU-114显微镜下呈椭圆形，大小约4-8μm，出芽生殖，单个、两个或多个系成串黏连；在麦芽汁琼脂平板上生长，可形成圆形、乳白色、边缘整齐菌落；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度30℃。
马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）SEUNEU-114，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2022年5月23日，保藏编号为 CCTCC NO: M 2022690。
进一步，本发明提供的马克斯克鲁维酵母SEUNEU-114在本发明所述的应用或产品中，存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为酵母菌产物的形式或为上清液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：上清液、灭活菌体。
体外细胞实验表明，本发明的马克斯克鲁维酵母SEUNEU-114具有上调HaCaT角质细胞外基质相关的组织金属蛋白酶抑制物1基因TIMP1、信号转导蛋白SMAD3，细胞自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3β基因LC3B，抗氧化相关基因核因子E2相关因子2 NRF2基因表达的作用，基因相对表达量上调1.23~1.78倍；具有下调炎症因子白介素6基因IL-6，基因相对表达量下调0.78~0.82倍。
体外细胞实验表明，本发明的马克斯克鲁维酵母SEUNEU-114具有促进HFF人成纤维细胞增殖的作用，增殖率 49.61~87.40%。
体外细胞实验表明，本发明的马克斯克鲁维酵母SEUNEU-114具有上调HFF人成纤维细胞外基质相关的I型胶原蛋白COL-1及Ⅲ型胶原蛋白α链COL-3A1和莫霍克蛋白基因MKX及丝氨酸棕榈酰转移酶基因SPTSSA表达的作用，基因相对表达量上调1.10~3.57倍；具有下调细胞凋亡相关BCL2-Associated X蛋白基因BAX、半胱氨酸蛋白酶家族基因Caspase-3、基质金属蛋白酶家族(MMP-2、MMP-3和 MMP-10)、炎症因子白介素6基因IL-6的表达，基因相对表达量下调0.30~0.92倍。
体外细胞实验表明，本发明的马克斯克鲁维酵母SEUNEU-114具有清除羟自由基和ABTS自由基的功能，自由基清除率14.04%~22.47%。
本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 SEUNEU-114的分离
于传统发酵牦牛酸奶酒中采样。吸取1 mL牦牛酸奶酒置于装有9 mL无菌生理盐水的试管中，充分振荡使其混匀。将混合后牦牛酸奶进行梯度稀释，吸取 1 mL 样液采用涂布法均匀涂布于麦芽汁琼脂培养基上，将制备好的平板置于28 ℃恒温培养箱中培养24～48h，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，即马克斯克鲁维酵母菌株SEUNEU-114。
镜检：菌株SEUNEU-114显微镜下呈椭圆形，大小约4-8μm，出芽生殖，单个、两个或多个系成串黏连；在麦芽汁琼脂平板上生长，可形成圆形、乳白色、边缘整齐菌落；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
实施例2 SEUNEU-114的核酸鉴定
1、18S rDNA基因序列分析：
挑取单菌落置麦芽汁液体培养基中，28℃培养过夜后，12000转离心1min收集菌体，按照DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用酵母菌通用引物NS1，NS8， PCR扩增体系为50μL体系，95℃预变性5min；94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 1.5min，36个循环；72℃延伸10min。
2、结果
PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较（BLASTN）后得出SEUNEU-114菌株为马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）。
实施例3：SEUNEU-114调节光老化HaCaT角质细胞外基质/细胞自噬/抗氧化相关基因表达实验
1、SEUNEU-114上清液及灭活菌体制备：
挑取马克斯克鲁维酵母SEUNEU-114单菌落于马铃薯葡萄糖液体培养基，置于摇床28℃、160r/min培养12-16h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD600=0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。离心沉淀以适量PBS重悬，稀释调整OD600=0.2，为灭活菌体。
2、HaCaT细胞制备及紫外线损伤
将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔（内含2×105细胞）接种至24孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm2的紫外线UVB照射损伤。
3、SEUNEU-114添加
将上清液5%(V/V)、灭活菌体10%(V/V)分别加入刺激过的HaCaT细胞（对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体）。每组3平行，37℃培养过夜。
4、qPCR法检测细胞外基质/细胞自噬/抗氧化/炎症因子相关基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因TIMP1和SMAD3，细胞自噬相关基因LC3B，以及抗氧化相关基因NRF2的表达。以对照组基因相对表达倍数F=1，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
上清液上调细胞外基质基因TIMP1和下调炎症因子IL-6，结果见表1所示。
表1 SEUNEU-114 上清液调节细胞外基质/炎症因子相关基因的表达
灭活菌体上调细胞外基质基因SMAD3、细胞自噬基因LC3B以及抗氧化基因NRF2，结果见表2。
表2 SEUNEU-114灭活菌体调节细胞衰老相关基因的表达
结果显示加入SEUNEU-114具有促进HaCaT角质细胞外基质合成、减少细胞外基质降解、促进细胞自噬以清除老化细胞、增加抗氧化能力以及减少炎症因子的抗衰老作用。
实施例4 SEUNEU-114促进HFF细胞的增殖
1、SEUNEU-114上清液及灭活菌体制备：
制备方法参照实施例3。
2、HFF细胞制备及SEUNEU-114添加
将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5ml/孔（每孔含1.5×105细胞）接种至24孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。将10%(V/V)上清液和灭活菌体分别加入HFF细胞（对照组以等体积PBS替代）。每组3平行，37℃培养过夜。
3、HFF细胞转接及染色计数
将24孔板内的HFF细胞计数后适当稀释，以2ml/孔（每孔含2.0×103细胞）转接6孔板，每组3平行，5%二氧化碳培养箱37℃培养7~10天。对孔内细胞用三聚甲醛固定后结晶紫染色计数。根据公式计算细胞增殖率，计算结果如表3所示。计算公式为：细胞增殖率=（实验组克隆数-对照组克隆数）/对照组克隆数×100%。
结果显示添加SEUNEU-114具有促进HFF细胞增殖的作用。
实施例5 SEUNEU-114调节氧化损伤人成纤维细胞外基质/细胞外基质凋亡/细胞凋亡相关基因表达实验
1、SEUNEU-114上清液及灭活菌体制备：
制备方法参照实施例3。
2、HFF人成纤维细胞制备及H2O2诱导氧化损伤
将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5ml/孔（内含2×105细胞）接种至24孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H2O2进行刺激，37℃静置1h。
3、SEUNEU-114添加
将上清液5%(V/V)、灭活菌体10%(V/V)分别加入刺激过的HFF细胞（对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体）。每组3平行，37℃培养过夜。
4、qPCR法检测细胞外基质/细胞凋亡/降解细胞外基质/炎症因子基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质、细胞外基质降解、细胞凋亡相关基因的表达。以对照组基因相对表达倍数F=1，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。上清液调节HFF人成纤维细胞相关基因结果见表4所示。
表4 SEUNEU-114上清液调节细胞外基质/细胞凋亡/炎症因子相关基因的表达
灭活菌体调节HFF人成纤维细胞相关基因结果见表5。
表5 SEUNEU-114灭活菌体调节细胞外基质/炎症因子相关基因的表达
结果显示加入SEUNEU-114具有促进HFF人成纤维细胞外基质合成、减少细胞外基质降解、减少细胞凋亡以及减少炎症因子的抗衰老作用。
实施例6 SEUNEU-114下调HaCaT细胞炎症因子相关基因的表达
1、SEUNEU-114上清液制备：
制备方法参照实施例3。
2、HaCaT细胞制备
将Raw264.7细胞消化后以0.5ml/孔（内含2×105细胞）接种至24孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
3、SEUNEU-114上清液添加
将SEUNEU-114上清液以5%(V/V)加入LPS刺激过的HaCaT细胞培养液中，每组3平行，37℃培养过夜。
4、qPCR法检测细胞炎症因子基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测IL-22和TRPV1基因的表达。以等体积PBS处理组为对照（基因相对表达倍数F=1），利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。结果如表6所示。
结果显示SEUNEU-114能够下调LPS诱导HaCaT细胞炎症因子相关基因表达量至0.66~0.88倍。因此，SEUNEU-114具有抗炎作用。
实施例7 SEUNEU-114清除自由基的作用
1、SEUNEU-114上清液制备：
挑取马克斯克鲁维酵母SEUNEU-114单菌落于马铃薯葡萄糖液体培养基，置于摇床28℃、160r/min培养12-16h，酶标仪检测并以液体培养基稀释调整OD600=0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。
2、SEUNEU-114上清液羟自由基清除能力检测
试剂配制和检测方法按照索莱宝羟自由基清除能力检测试剂盒说明书进行。测定各样品536nm吸亮度，求平均值并计算各样品的羟自由基清除率。计算公式：D%=（A测定-A对照）÷（A空白-A对照）×100%。计算结果如表7所示。
3、SEUNEU-114上清液ABTS自由基清除能力检测
试剂配制和检测方法按照索莱宝ABTS自由基清除能力检测试剂盒说明书进行。测定各样品405nm吸亮度，求平均值并计算各样品的ABTS自由基清除率。计算公式：D%=（A空白-（A测定-A对照））÷A空白×100%，计算结果如表8所示。
结果显示SEUNEU-114具有清除羟自由基和ABTS自由基的作用，自由基清除率14.04%~22.47%。
综合以上结果显示SEUNEU-114能够改善肌肤状况包括抗衰老、促进细胞增殖和抗自由基。
实施例8 SEUNEU-114灭活菌体啫喱制备实例
SEUNEU-114啫喱的制备，配方如表9所示。
表9
制备工艺：取实施例3制备的SEUNEU-114灭活菌体液，加热至80℃，加入聚丙烯酸、甘油、 1,3-丁二醇、木糖醇、透明质酸钠，彻底分散均匀后作为A相备用；以去离子水加入A相并分散均匀，以适量三乙醇胺加入搅拌调节至pH6-7，后冷却到50℃、再加入甲基异噻唑琳酮搅拌后冷却至35℃完成。所得SEUNEU-114灭活菌体啫喱涂抹后感觉水润清爽滋润。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.一种马克斯克鲁维酵母菌株（Kluyveromyces marxianus），其特征在于，所述菌株为马克斯克鲁维酵母菌株SEUNEU-114，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO: M 2022690。
2.权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母菌株在制备改善肌肤状况的化妆品中的应用。
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