CN115747086A - 一株克鲁维毕赤酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株克鲁维毕赤酵母及其应用，涉及微生物技术领域。本发明公开的克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)，该菌株被命名为LABOFMIC‑311，已于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No:M20221394的克鲁维毕赤酵母。实验表明，LABOFMIC‑311具有促进皮肤角质细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老、提高细胞抗菌能力的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

Description

一株克鲁维毕赤酵母及其应用

技术领域

本发明属于微生物的技术领域，具体地涉及一株克鲁维毕赤酵母及其应用。

背景技术

皮肤老化分为内外两种：一种是由于年龄的增长，体内细胞新陈代谢衰退，导致皮肤自然老化；另一种是由于外界环境因素导致的皮肤老化。其中光老化是皮肤外在老化最主要的形式，而导致皮肤光老化的主要原因就是紫外线辐射。在衰老机制的研究中发现，细胞自噬能够延缓器官功能退化，可以通过清除UV辐照细胞内受损的蛋白质和脂质，修复DNA，帮助细胞恢复代谢稳态，为光老化受损的皮肤提供保护作用。

皮肤微生物组与皮肤表面的细胞、汗液、皮脂等物质，以及外界环境共同组成一个生态系统，对于维持宿主皮肤健康有重要作用。这些常驻微生物可以直接或通过调控皮肤的角质形成细胞而间接分泌抗菌肽，以抵御外界病原菌定殖；还可分解角质细胞碎屑或脂质，辅助乳化皮脂膜，维持表皮酸性环境，以抵御外界病原菌定殖。

皮肤微生物组在皮肤表面合成具有活性的代谢产物，如短链脂肪酸、B族维生素等，调节皮肤生理功能。越来越多的研究表明，皮肤微生态失衡(又称菌群失衡)会导致一系列皮肤疾病，如特应性皮炎、痤疮、脂溢性皮炎、银屑病、机会性感染等。当有益菌减少甚至消失时，皮肤会出现抵抗力降低、易发炎、感染、过敏、长痘、水油失衡等多种问题。因此，提供一种利用皮肤微生物技术开发的益生菌相关产品，具有巨大的商业应用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供了一株克鲁维毕赤酵母及其应用。

本发明的其一目的是提供了克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)，该菌株被命名为LABOFMIC-311，已于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNo:M 20221394的克鲁维毕赤酵母。

较佳地，采样于秋月梨果皮，将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于麦芽汁固体平板，28℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-311；

显微镜下呈圆柱形或卵形；在麦芽汁固体平板上生长，可形成乳白色，有或无光泽菌落，边缘整齐；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。

本发明的另一目的是提供了上述克鲁维毕赤酵母在制备改善皮肤状况的产品中的应用，其中，所述改善皮肤状况包括促进皮肤角质细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老、提高细胞抗菌能力中的至少一种。

一些实施方案中，所述修复皮肤屏障包括修复SDS诱导的细胞损伤和/或上调屏障修护基因的表达；所述屏障修护基因由FLG、IVL、OVOL1和OCLN中的至少一种组成。

需要说明的是，本实施方案以HaCaT角质细胞为受试对象，对上述克鲁维毕赤酵母的SDS损伤修复能力进行了研究。结果表明，上述克鲁维毕赤酵母可修复SDS引起的细胞损伤，提高细胞增殖率，并上调非损伤细胞的屏障修护基因的表达。

一些实施方案中，所述保湿为上调保湿基因GBA的表达。

需要说明的是，本实施方案以HaCaT角质细胞为受试对象，研究上述克鲁维毕赤酵母的对皮肤的保湿效果。结果显示，上述克鲁维毕赤酵母可上调保湿基因GBA的表达，促进皮肤细胞保湿。

一些实施方案中，所述抗衰老包括上调细胞外基质基因COL1A1、COL13A1、LN、SPTSSA、MKX中至少一种的表达、上调抑制细胞凋亡基因BCL-2的表达、上调细胞自噬基因LC3B的表达、上调细胞抗氧化基因NRF2、PTEN和SIRT-1中至少一种的表达、上调细胞免疫调节因子基因MOR的表达或上调细胞生长因子基因FGF1、FGF2、FGF7和FGF21中至少一种的表达。

一些实施方案中，所述抗衰老为下调降解细胞外基质基因MMP家族基因MMP1、MMP3、MMP8、MMP10中的至少一种的表达或下调细胞凋亡基因BAX的表达。

一些实施方案中，所述抗衰老为清除DPPH自由基和抗氧化能力中的至少一种。

需要说明书的是，为了探究上述克鲁维毕赤酵母的抗衰老效果，本实施方案对细胞衰老相关的指标进行了测定，所述指标包括促进皮肤角质细胞增殖、促进细胞外基质合成、细胞外基质降解、细胞抗氧化、细胞免疫调节因子、细胞自噬、抑制细胞凋亡、细胞生长因子、清除DPPH自由基及抗氧化能力中的至少一个。

其中，本实施方案以HaCaT角质细胞为受试对象，对上述克鲁维毕赤酵母的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明，上述克鲁维毕赤酵母可促进可修复SDS引起的HaCaT角质细胞损伤，提高细胞增殖率，促进增殖率为10.83％～16.38％。

其中，本实施方案以HaCaT角质细胞为受试对象，研究上述克鲁维毕赤酵母对HaCaT细胞外基质合成相关基因和降解相关基因的影响。结果表明，上述克鲁维毕赤酵母可上调细胞外基质合成基因COL1A1的表达，促进细胞外基质的合成，下调降解细胞外基质基因MMP1的表达，抑制细胞外基质的降解。

其中，本实施方案以HFF成纤维细胞为受试对象，研究上述克鲁维毕赤酵母对HFF细胞外基质合成相关基因和降解相关基因的影响。结果表明，上述克鲁维毕赤酵母可上调细胞外基质合成基因COL13A1、SPTSSA、LN和MKX的表达，促进细胞外基质的合成，下调降解细胞外基质基因MMP3、MMP8和MMP10的表达，抑制细胞外基质的降解。

其中，本实施方案以HFF成纤维细胞为受试对象，研究上述克鲁维毕赤酵母对HFF细胞抗氧化相关基因的表达的影响。结果表明，上述克鲁维毕赤酵母可上调抗氧化基因PTEN和SIRT-1的表达，增强细胞的抗氧化能力。

其中，本实施以HaCaT角质细胞为受试对象，研究上述克鲁维毕赤酵母对HaCaT细胞抗氧化基因的表达的影响。结果表明，上述克鲁维毕赤酵母可上调抗氧化基因NRF2的表达，增强细胞的抗氧化能力。

其中，本实施方案以HFF成纤维细胞为受试对象，研究上述克鲁维毕赤酵母对HFF细胞免疫调节因子相关基因的表达的影响。结果表明，所述的克鲁维毕赤酵母可上调免疫调节因子基因MOR的表达，增强细胞的免疫调节能力。

其中，本实施方案以HaCaT角质细胞为受试对象，研究上述克鲁维毕赤酵母对HaCaT细胞自噬的影响。结果表明，上述克鲁维毕赤酵母可上调细胞自噬基因LC3B的表达，促进细胞自噬以清除老化细胞。

其中，本实施方案以HFF成纤维细胞为受试对象，研究上述克鲁维毕赤酵母对HFF细胞凋亡的影响。结果表明，上述克鲁维毕赤酵母可下调细胞凋亡相关基因BAX的表达，抑制细胞凋亡。

其中，本实施方案以HFF成纤维细胞为受试对象，研究上述克鲁维毕赤酵母对HFF细胞抑制细胞凋亡的影响。结果表明，上述克鲁维毕赤酵母可上调抑制细胞凋亡基因BCL-2的表达，抑制细胞凋亡。

其中，本实施方案以HFF成纤维细胞为受试对象，研究上述克鲁维毕赤酵母对HFF细胞生长因子基因的表达的影响。结果表明，上述克鲁维毕赤酵母可上调细胞生长因子基因FGF1、FGF2、FGF7和FGF21的表达，增强细胞的生长能力。

其中，本实施方案以克鲁维毕赤酵母为受试对象，研究上述克鲁维毕赤酵母对清除DPPH自由基和总抗氧化力的检测。结果表明，上述克鲁维毕赤酵母可清除DPPH自由基且具抗氧化能力，减少细胞的氧化损伤。

一些实施方案中，所述提高细胞抗菌能力为上调抗菌肽基因的表达，所述抗菌肽基因由S100A7、S100A8、DEFB4和LCN-2中的至少一种组成。

其中，本实施方案以HaCaT角质细胞为受试对象，研究上述克鲁维毕赤酵母对HaCaT角质细胞抗菌肽相关基因的表达的影响。结果表明，上述鲁维毕赤酵母可上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、DEFB4和LCN-2的表达，提高细胞抗菌能力。

本发明的另一目的是提供了一种改善皮肤状况的产品，由包括上述克鲁维毕赤酵母原料制成；所述产品为食品、药品或化妆品，所述产品中的克鲁维毕赤酵母包括如下所示的至少一种：

(1)克鲁维毕赤酵母的菌群和/或菌剂；

(2)克鲁维毕赤酵母的培养物、外泌体、溶胞物和/或提取物。

进一步的，所述产品还包括含有上述克鲁维毕赤酵母的菌群。

进一步的，所述产品包括含有上述克鲁维毕赤酵母及其溶胞物、提取物、代谢产物制成的菌剂，或者含有上述克鲁维毕赤酵母的菌群制成的菌剂。

进一步的，所述产品的剂型包括膏霜类、乳液类、油剂类、水剂类、凝胶类、粉剂类、冻干类中的至少一种。

本发明的另一目的是提供了一种改善肌肤状态的方法，其包括使用本发明所述从产品。所述使用的方法包括涂抹、外敷、熏蒸或注射。

本发明公开的克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)LABOFMIC-311，其保藏编号为CCTCC No:M 20221394的克鲁维毕赤酵母。实验表明，LABOFMIC-311具有抗衰老、提升皮肤抗菌能力的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

生物保藏说明

克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)LABOFMIC-311，于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为CCTCC No:M 20221394。

具体实施方式

本发明提供了克鲁维毕赤酵母及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的克鲁维毕赤酵母菌株LABOFMIC-311，采样于山东省莱阳市秋月梨果皮，经26S rDNA鉴定为克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)。菌株LABOFMIC-311，显微镜下呈圆柱形或卵形；在麦芽汁固体平板上生长，可形成乳白色，有或无光泽菌落，边缘整齐；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度28℃。

克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)LABOFMIC-311，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2022年9月9日，保藏编号为CCTCC NO:M 20221394。

本发明提供的克鲁维毕赤酵母LABOFMIC-311在本发明所述应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为溶胞物和/或提取物的形式，或为酵母产物的形式或为发酵产物形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：发酵产物、溶胞物。

本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1LABOFMIC-311的分离

采样于秋月梨果皮上采样，将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于麦芽汁固体平板，28℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-311。

镜检：菌株LABOFMIC-311，显微镜下呈圆柱形或卵形；在麦芽汁固体平板上生长，可形成乳白色，有或无光泽菌落，边缘整齐；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。

实施例2LABOFMIC-311的核酸鉴定

1、26S rDNA基因序列分析：

挑取单菌落置麦芽汁液体培养基中，28℃培养过夜后，12000r/min转速离心2min收集菌体，按照酵母基因组DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用酵母菌通用引物NL1、NL4，PCR扩增体系为50μl体系，95℃预变性5min；94℃、1min，52℃、1min，72℃、90s，36个循环，72℃延伸10min。

2、结果

PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出LABOFMIC-311菌株为克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)。

实施例3LABOFMIC-311促进SDS诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT损伤修复实验

1、LABOFMIC-311发酵产物制备：

挑取克鲁维毕赤酵母LABOFMIC-311单菌落于麦芽汁液体培养基，28℃摇床培养16h～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD₆₀₀＝0.2，12000r/min转速离心2min使菌体分离沉淀,取出上清液以121℃，30min，0.28Mpa灭活，经0.22μm滤膜过滤为发酵产物。

2、促进HaCaT细胞修复实验

接种HaCaT细胞(5×10⁴cells/孔)至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制50μg/mlSDS，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养8h。各孔添加5％(V/V)发酵产物，(对照组分别以等体积PBS替代)培养24h。向每孔加入10μl的CCK-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度A。

细胞增殖率计算公式及结果如下表：

上表结果可知，LABOFMIC-311发酵产物可促进可修复SDS引起的HaCaT角质细胞损伤，提高细胞增殖率，促进增殖率为10.83％～16.38％。

实施例4LABOFMIC-311促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验

1、LABOFMIC-311发酵产物和溶胞物制备：

挑取克鲁维毕赤酵母LABOFMIC-311单菌落于麦芽汁液体培养基，28℃摇床培养16h～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD₆₀₀＝0.2，12000r/min转速离心2min使菌体分离沉淀,取出上清液以121℃，30min，0.28Mpa灭活，经0.22μm滤膜过滤为发酵产物。其离心沉淀菌体以PBS清洗两次后加入液氮研磨破碎，收集破碎菌泥以PBS重悬至离心时体积，再以超声波破碎20min，121℃，30min，0.28Mpa灭活，即得溶胞物。

2、促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验

接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔，内含5×10⁵细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。分别加入5％(V/V)发酵产物，10％(V/V)溶胞物(对照组分别以等体积PBS替代发酵产物/溶胞物)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测FLG、IVL、OVOL1和OCLN基因的表达。分别以添加等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

公式：F＝2^-ΔΔCT，其中：

△CT_实验＝CT_实验-CT_{内参(实验)}；

△CT_对照＝CT_对照-CT_{内参(对照)}；

△△CT＝△CT_实验-△CT_对照。

发酵产物上调修复相关基因FLG的表达。结果见下表：

溶胞物上调修复相关基因FLG、IVL、OVOL1、OCLN的表达。结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的克鲁维毕赤酵母LABOFMIC-311发酵产物和溶胞物具有上调皮肤屏障修护相关因子丝聚合蛋白基因FLG、内皮蛋白基因IVL、OVO样转录因子1基因OVOL1和紧密连接蛋白基因OCLN表达的作用，基因表达量上调1.27～3.21倍。表明LABOFMIC-311具有促进皮肤屏障修护的作用。

实施例5LABOFMIC-311上调HaCaT保湿相关基因表达实验

1、LABOFMIC-311溶胞物制备：

制备方法参照实施例4。

2、上调HaCaT保湿相关基因表达实验

接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔，内含5×10⁵细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。加入10％(V/V)溶胞物(对照组以等体积PBS替代)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测GBA基因的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的克鲁维毕赤酵母LABOFMIC-311具有上调保湿相关的葡萄糖脑苷脂酶基因GBA表达的作用，基因表达量上调1.39～1.77倍。表明LABOFMIC-311具有促进皮肤保湿的作用。

实施例6LABOFMIC-311调节光老化HaCaT细胞外基质/抗氧化/细胞自噬/降解细胞外基质相关基因表达实验

1、LABOFMIC-311发酵产物及溶胞物制备：

制备方法参照实施例4。

2、HaCaT细胞制备及紫外线损伤

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm²的紫外线UVB照射损伤。

3、LABOFMIC-311添加

将5％(V/V)发酵产物、10％(V/V)溶胞物分别加入刺激过的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵产物/溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/抗氧化/细胞自噬/降解细胞外基质相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因COL1A1，抗氧化相关基因NRF2，细胞自噬相关基因LC3B，以及降解细胞外基质相关基因MMP1的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

发酵产物上调细胞自噬相关基因LC3B；下调降解细胞外基质相关基因MMP1。结果见下表：

溶胞物上调细胞外基质相关基因COL1A1，抗氧化相关基因NRF2，细胞自噬基因LC3B。结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的克鲁维毕赤酵母LABOFMIC-311具有上调HaCaT细胞外基质相关的I型胶原α1链基因COL1A1，抗氧化相关的核因子E2相关因子2基因NRF2，细胞自噬相关的微管相关蛋白1轻链3β基因LC3B表达的作用，基因相对表达倍数1.25～2.89；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP1表达的作用，基因相对表达倍数0.38～0.72。

实施例7LABOFMIC-311调节氧化损伤HFF细胞外基质/抗氧化/免疫调节因子/抑制细胞凋亡/细胞生长因子/降解细胞外基质/细胞凋亡相关基因表达实验

1、LABOFMIC-311发酵产物及溶胞物制备：

制备方法参照实施例4。

2、HFF细胞制备及H₂O₂诱导氧化损伤

将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H₂O₂进行刺激，37℃静置1h。

3、LABOFMIC-311添加

将5％(V/V)发酵产物、10％(V/V)溶胞物分别加入刺激过的HFF细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵产物/溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/抗氧化/免疫调节因子/抑制细胞凋亡/细胞生长因子/降解细胞外基质/细胞凋亡相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因COL13A1、SPTSSA、MKX和LN，抗氧化相关基因PTEN和SIRT-1，免疫调节因子MOR，抑制细胞凋亡相关基因BCL-2，细胞生长因子相关基因FGF1、FGF2、FGF7和FGF21，降解细胞外基质相关基因MMP3、MMP8和MMP10，以及细胞凋亡相关基因BAX的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

发酵产物上调细胞外基质相关基因COL13A1、LN、SPTSSA和MKX，抗氧化相关基因PTEN和SIRT-1，免疫调节因子相关基因MOR，细胞生长因子相关基因FGF7和FGF21；下调降解细胞外基质相关基因MMP3和MMP10，细胞凋亡相关基因BAX，结果见下表：

溶胞物上调细胞外基质相关基因MKX和SPTSSA，免疫调节因子相关基因MOR，抗氧化相关基因SIRT-1，抑制细胞凋亡相关基因BCL-2，细胞生长相关基因FGF1、FGF2、FGF7和FGF21；下调降解细胞外基质相关基因MMP8。结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的克鲁维毕赤酵母LABOFMIC-311具有上调HFF细胞外基质相关的类胶原膜蛋白13α链基因COL13A1、层黏连蛋白基因LN，丝氨酸棕榈酰转移酶基因SPTSSA和莫霍克蛋白基因MKX，免疫调节因子相关的β-内啡肽受体基因MOR，抗氧化相关的10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因PTEN和Sirtuins蛋白家族基因SIRT-1，抑制细胞凋亡相关的B淋巴细胞瘤-2基因BCL-2，以及细胞生长因子相关的成纤维细胞生长因子基因FGF1、FGF2、FGF21和角质细胞生长因子基因FGF7表达的作用，基因相对表达倍数1.15～5.19倍；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP3、MMP8和MMP10，以及细胞凋亡相关的BCL2-Associated X蛋白基因BAX，基因相对表达倍数0.40～0.72。

实施例8LABOFMIC-311清除自由基的作用

1、LABOFMIC-311发酵产物制备：

挑取克鲁维毕赤酵母LABOFMIC-311单菌落于麦芽汁液体培养基，28℃摇床培养16h～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD₆₀₀＝2，12000r/min转速离心2min使菌体分离沉淀,取出上清液以121℃，30min，0.28Mpa灭活，经0.22μm滤膜过滤为发酵产物。

2、LABOFMIC-311发酵产物DPPH自由基清除能力检测

试剂配制和检测方法按照索莱宝DPPH自由基清除能力检测试剂盒说明书进行。测定各样品536nm吸亮度，求平均值并计算各样品清除率。

计算公式及结果如下表：

体外细胞实验表明，本发明的克鲁维毕赤酵母LABOFMIC-311具有清除DPPH自由基的作用，自由基清除率81.36％～87.19％。

实施例9LABOFMIC-311总抗氧化能力测定实验

1、LABOFMIC-311发酵产物制备：

制备方法参照实施例8。

2、总抗氧化能力测定

试剂配制和检测方法按照索莱宝总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒说明书进行，其中反应总体积为0.204ml，反应中样本体积0.006ml。测定各样品593nm吸亮度A，根据公式：A测-A空白＝6.1464X-0.0009计算得到X值，进而计算得到总抗氧化能力。

总抗氧化能力计算公式及结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的克鲁维毕赤酵母LABOFMIC-311具有抗氧化的作用，总抗氧化能力3.366μmol/ml～3.536μmol/ml。

实施例10LABOFMIC-311上调HaCaT抗菌肽相关基因表达实验

1、LABOFMIC-311发酵产物及溶胞物制备：

制备方法参照实施例4。

2、HaCaT细胞制备

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。

3、LABOFMIC-311添加及LPS刺激

将发酵产物5％(V/V)、溶胞物10％(V/V)分别加入培养过夜的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵产物/溶胞物)。2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的LPS溶液，诱导细胞发炎，5％二氧化碳培养箱37℃培养20h。

4、qPCR法检测抗菌肽相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测S100A7、S100A8、DEFB4、LCN-2基因的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

发酵产物上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8，结果见下表：

溶胞物上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、DEFB4、LCN-2。结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的克鲁维毕赤酵母LABOFMIC-311具有促进抗菌肽相关基因银屑病素S100A7、钙粒蛋白A S100A8、β防御素4DEFB4、脂质运载蛋白-2LCN-2表达的作用，基因相对表达倍数1.26～2.58。表明LABOFMIC-308具有提高细胞抗菌能力的作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)，该菌株被命名为LABOFMIC-311，已于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No:M 20221394的克鲁维毕赤酵母。

2.根据权利要求1所述的克鲁维毕赤酵母，其特征在于，采样于秋月梨果皮，将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于麦芽汁固体平板，28℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-311；

显微镜下呈圆柱形或卵形；在麦芽汁固体平板上生长，可形成乳白色，有或无光泽菌落，边缘整齐；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。

3.权利要求1～2任一项所述的克鲁维毕赤酵母在制备改善皮肤状况的产品中的应用，其中，所述改善皮肤状况包括促进皮肤角质细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老、提高细胞抗菌能力中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述修复皮肤屏障包括修复SDS诱导的细胞损伤和/或上调屏障修护基因的表达；所述屏障修护基因由FLG、IVL、OVOL1和OCLN中的至少一种组成。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述保湿为上调保湿基因GBA的表达。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老包括上调细胞外基质基因COL1A1、COL13A1、LN、SPTSSA、MKX中至少一种的表达、上调抑制细胞凋亡基因BCL-2的表达、上调细胞自噬基因LC3B的表达、上调细胞抗氧化基因NRF2、PTEN和SIRT-1中至少一种的表达、上调细胞免疫调节因子基因MOR的表达或上调细胞生长因子基因FGF1、FGF2、FGF7和FGF21中至少一种的表达。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为下调降解细胞外基质MMP家族基因MMP1、MMP3、MMP8、MMP10中的至少一种的表达或下调细胞凋亡基因BAX的表达。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为清除DPPH自由基和抗氧化能力中的至少一种。

9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提高细胞抗菌能力为上调抗菌肽基因的表达，所述抗菌肽基因由S100A7、S100A8、DEFB4和LCN-2中的至少一种组成。

10.一种改善皮肤状况的产品，其特征在于，由包括权利要求1～2任一项所述的克鲁维毕赤酵母原料制成；所述产品为食品、药品或化妆品，所述产品中的克鲁维毕赤酵母包括如下所示的至少一种：

(1)克鲁维毕赤酵母的菌群和/或菌剂；

(2)克鲁维毕赤酵母的培养物、外泌体、溶胞物和/或提取物。