CN116042418A - 一株亚膜威克汉姆酵母及其应用 - Google Patents

一株亚膜威克汉姆酵母及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116042418A
CN116042418A CN202211456698.9A CN202211456698A CN116042418A CN 116042418 A CN116042418 A CN 116042418A CN 202211456698 A CN202211456698 A CN 202211456698A CN 116042418 A CN116042418 A CN 116042418A
Authority
CN
China
Prior art keywords
expression
yeast
regulating
genes
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211456698.9A
Other languages
English (en)
Inventor
陈盈如
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN202211456698.9A priority Critical patent/CN116042418A/zh
Publication of CN116042418A publication Critical patent/CN116042418A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/165—Yeast isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/062—Ascomycota
    • A61K36/064—Saccharomycetales, e.g. baker's yeast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9728—Fungi, e.g. yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/18—Antioxidants, e.g. antiradicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/02—Local antiseptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A61Q17/005—Antimicrobial preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

本发明公开了一株亚膜威克汉姆酵母及其应用，涉及微生物技术领域。本发明公开的亚膜威克汉姆酵母(Wickerhamomyces subpelliculosus)，该菌株被命名为LABOFMIC‑312，已于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No:M 20221395的亚膜威克汉姆酵母。实验表明，LABOFMIC‑312具有促进皮肤角质细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老、提高细胞抗菌能力的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

Description

一株亚膜威克汉姆酵母及其应用
技术领域
本发明属于微生物的技术领域，具体地涉及一株亚膜威克汉姆酵母及其应用。
背景技术
人体皮肤的表面积约为2平方米，若将毛囊和汗腺考虑在内，表面积可能达到25平方米。在这样一个庞大的器官上，大约每平方厘米就有100万个微生物，它们与皮肤共同构成了一个微型的生态系统。大多数皮肤上的微生物与人体互利共生、相互影响。一方面，我们的皮脂、死亡的角质细胞为微生物提供了充足的养分；另一方面，微生物群维持着皮肤的正常结构，抵御外来病原体的入侵，促进皮肤的免疫反应和伤口的再生修复。
这些微生物，主要存在于皮肤表面，以及皮肤附属器中，比如毛囊、汗腺及皮脂腺等，最有代表性的微生物包括丙酸杆菌属、棒状杆菌属、葡萄球菌属和马拉色菌属。这些常驻微生物可以直接或通过调控皮肤的角质形成细胞而间接分泌抗菌肽，以抵御外界病原菌定殖。抗菌肽是指所有能够杀菌或抑菌的寡肽或多肽，能够接触微生物膜，溶解细胞，具有广谱抗微生物作用。
常驻菌可以产生脂类、固醇类等物质，为肌体细胞提供营养，参与皮肤细胞代谢等，代谢的脂质可以在皮肤上形成一层乳化脂质膜，能防止水分过度蒸发，保持皮肤湿润。皮肤微生态的重要性，体现在整个微生态体系的动态平衡上，当人体的皮肤、环境和菌群处于不协调的状态时，皮肤就会拉起警报，呈现出皮肤问题甚至产生皮肤疾病。因此，提供一种利用皮肤微生物技术开发的益生菌相关产品，具有巨大的商业应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供了一株亚膜威克汉姆酵母及其应用。
本发明的其一目的是提供了亚膜威克汉姆酵母(Wickerhamomycessubpelliculosus)，该菌株被命名为LABOFMIC-312，已于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No:M 20221395的亚膜威克汉姆酵母。
较佳地，采样于秋月梨果皮，将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于麦芽汁琼脂平板，28℃恒温培养12h～16h后，挑取乳白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-312；
显微镜下呈单细胞，卵圆形或球形；在麦芽汁平板上生长，可形成表面光滑不透明的圆形菌落，乳白色，边缘整齐；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长。
本发明的另一目的是提供了上述亚膜威克汉姆酵母在制备改善皮肤状况的产品中的应用，其中，所述改善皮肤状况包括促进皮肤角质细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老、提高细胞抗菌能力中的至少一种。
一些实施方案中，所述修复皮肤屏障包括修复SDS诱导的细胞损伤和/或上调屏障修护相关基因FLG的表达。
需要说明的是，本实施方案以HaCaT角质细胞为受试对象，对上述亚膜威克汉姆酵母的SDS损伤修复能力进行了研究。结果表明，上述亚膜威克汉姆酵母可修复SDS引起的细胞损伤，提高细胞增殖率，并上调非损伤细胞的屏障修护基因的表达。
一些实施方案中，所述保湿为上调保湿基因AQP3和/或GBA的表达。
需要说明的是，本实施方案以HaCaT角质细胞为受试对象，研究上述亚膜威克汉姆酵母的对皮肤的保湿效果。结果显示，上述亚膜威克汉姆酵母可上调保湿基因AQP3和/或GBA的表达，促进皮肤细胞保湿。
一些实施方案中，所述抗衰老包括上调细胞外基质基因SPTSSA、SMAD3、LN、MKX、COL1A1、COL3A1、COL13A1中至少一种的表达、上调抑制细胞凋亡基因BCL-2的表达、上调细胞自噬基因LC3B的表达、上调细胞抗氧化基因NRF2、SIRT-3中至少一种的表达、上调细胞免疫调节因子基因MOR的表达或上调细胞生长因子基因FGF2、FGF21、HGF中至少一种的表达。
一些实施方案中，所述抗衰老为下调降解细胞外基质MMP家族基因MMP1、MMP3中的至少一种的表达，或下调细胞凋亡基因BAX和/或Caspase家族Caspase-3中的至少一种的表达。
一些实施方案中，所述抗衰老为抑制胶原蛋白酶活性、清除DPPH自由基和抗氧化能力中的至少一种。
需要说明书的是，为了探究上述亚膜威克汉姆酵母的抗衰老效果，本实施方案对细胞衰老相关的指标进行了测定，所述指标包括促进皮肤角质细胞增殖、促进细胞外基质合成、细胞外基质降解、细胞抗氧化、细胞免疫调节因子、细胞自噬、抑制细胞凋亡、细胞生长因子、抑制胶原蛋白酶活性、清除DPPH自由基及抗氧化能力中的至少一个。
其中，本实施方案以HaCaT角质细胞为受试对象，对上述亚膜威克汉姆酵母的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明，上述亚膜威克汉姆酵母可促进可修复SDS引起的HaCaT角质细胞损伤，提高细胞增殖率，促进增殖率为11.90％～13.21％。
其中，本实施方案以HaCaT角质细胞为受试对象，研究上述亚膜威克汉姆酵母对HaCaT角质细胞细胞外基质合成相关基因和降解相关基因的影响。结果表明，上述亚膜威克汉姆酵母可上调细胞外基质合成相关基因COL1A1的表达，促进细胞外基质的合成，下调降解细胞外基质相关基因MMP1的表达，抑制细胞外基质的降解。
其中，本实施方案以HFF成纤维细胞为受试对象，研究上述亚膜威克汉姆酵母对HFF细胞外基质合成相关基因和降解相关基因的影响。结果表明，所述的亚膜威克汉姆酵母可上调细胞外基质合成相关基因SPTSSA、SMAD3、LN、MKX、COL3A1、COL13A1的表达，促进细胞外基质的合成，下调降解细胞外基质相关基因MMP3的表达，抑制细胞外基质的降解。
其中，本实施方案以HaCaT角质细胞为受试对象，研究上述亚膜威克汉姆酵母对HaCaT角质细胞抗氧化相关基因的表达的影响。结果表明，上述亚膜威克汉姆酵母可上调抗氧化相关基因NRF2的表达，增强细胞的抗氧化能力。
其中，本实施方案以HFF成纤维细胞为受试对象，研究上述亚膜威克汉姆酵母对HFF成纤维细胞抗氧化相关基因的表达的影响。结果表明，上述亚膜威克汉姆酵母可上调抗氧化相关基因SIRT-3的表达，增强细胞的抗氧化能力。
其中，本实施方案以HFF成纤维细胞为受试对象，研究上述亚膜威克汉姆酵母对HFF成纤维细胞免疫调节因子相关基因的表达的影响。结果表明，上述亚膜威克汉姆酵母可上调免疫调节因子相关基因MOR的表达，增强细胞的免疫调节能力。
其中，本实施方案以HaCaT角质细胞为受试对象，研究上述亚膜威克汉姆酵母对HaCaT角质细胞细胞自噬的影响。结果表明，上述亚膜威克汉姆酵母可上调细胞自噬相关基因LC3B的表达，促进细胞自噬以清除老化细胞。
其中，本实施方案以HFF成纤维细胞为受试对象，研究上述亚膜威克汉姆酵母对HFF细胞凋亡的影响。结果表明，上述亚膜威克汉姆酵母可下调细胞凋亡相关基因BAX和Caspase-3的表达，抑制细胞凋亡。
其中，本实施方案以HFF成纤维细胞为受试对象，研究上述亚膜威克汉姆酵母对HFF成纤维细胞抑制细胞凋亡的影响。结果表明，上述亚膜威克汉姆酵母可上调抑制细胞凋亡相关基因BCL-2的表达，抑制细胞凋亡。
其中，本实施方案以HFF成纤维细胞为受试对象，研究上述亚膜威克汉姆酵母对HFF细胞生长因子相关基因的表达的影响。结果表明，上述亚膜威克汉姆酵母可上调细胞生长因子相关基因FGF2、FGF21和HGF的表达，增强细胞的生长能力。
其中，本实施方案以胶原蛋白酶为受试对象，研究上述亚膜威克汉姆酵母影响胶原蛋白酶活性的检测。结果表明，上述亚膜威克汉姆酵母可抑制胶原蛋白酶活性，减少胶原蛋白降解。
其中，本实施方案以亚膜威克汉姆酵母为受试对象，研究上述亚膜威克汉姆酵母对清除DPPH自由基和总抗氧化力的检测。结果表明，上述亚膜威克汉姆酵母可清除DPPH自由基且具抗氧化能力，减少细胞的氧化损伤。
一些实施方案中，所述提高细胞抗菌能力为上调抗菌肽基因的表达，所述抗菌肽基因有S100A7、S100A8和DEFB4中的至少一种组成。
其中，本实施方案以HaCaT角质细胞为受试对象，研究上述亚膜威克汉姆酵母对HaCaT角质细胞抗菌肽相关基因的表达的影响。结果表明，上述鲁维毕赤酵母可上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8和DEFB4的表达，提高细胞抗菌能力。
本发明的另一目的是提供了一种改善皮肤状况的产品，由包括上述亚膜威克汉姆酵母原料制成；所述产品为食品、药品或化妆品，所述产品中的亚膜威克汉姆酵母包括如下所示的至少一种：
(1)亚膜威克汉姆酵母的菌群和/或菌剂；
(2)亚膜威克汉姆酵母的培养物、外泌体、溶胞物和/或提取物。
进一步的，所述产品还包括含有上述亚膜威克汉姆酵母的菌群。
进一步的，所述产品包括含有上述亚膜威克汉姆酵母及其溶胞物、提取物、代谢产物制成的菌剂，或者含有上述亚膜威克汉姆酵母的菌群制成的菌剂。
进一步的，所述产品的剂型包括膏霜类、乳液类、油剂类、水剂类、凝胶类、粉剂类、冻干类中的至少一种。
本发明的另一目的是提供了一种改善肌肤状态的方法，其包括使用本发明所述从产品。所述使用的方法包括涂抹、外敷、熏蒸或注射。
本发明公开的亚膜威克汉姆酵母(Wickerhamomyces subpelliculosus)LABOFMIC-312，其保藏编号为CCTCC No:M 20221395的亚膜威克汉姆酵母。实验表明，LABOFMIC-312具有抗衰老、提升皮肤抗菌能力的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。
生物保藏说明
亚膜威克汉姆酵母(Wickerhamomyces subpelliculosus)LABOFMIC-312，于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为CCTCC No:M20221395。
具体实施方式
本发明提供了亚膜威克汉姆酵母及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的亚膜威克汉姆酵母菌株LABOFMIC-312，采样于山东省莱阳市秋月梨果皮，经26S rDNA鉴定为亚膜威克汉姆酵母(Wickerhamomyces subpelliculosus)。菌株LABOFMIC-312，显微镜下呈单细胞，卵圆形或球形；在麦芽汁平板上生长，可形成表面光滑不透明的圆形菌落，乳白色，边缘整齐；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长，最适生长温度28℃。
亚膜威克汉姆酵母(Wickerhamomyces subpelliculosus)LABOFMIC-312，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2022年9月9日，保藏编号为CCTCC NO:M 20221395。
本发明提供的亚膜威克汉姆酵母LABOFMIC-312在本发明所述应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为溶胞物和/或提取物的形式，或为酵母产物的形式或为发酵产物形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：发酵产物、溶胞物。
本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1LABOFMIC-312的分离
采样于秋月梨果皮上采样，将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于麦芽汁琼脂平板，28℃恒温培养12-16h后，挑取乳白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-312。
镜检：菌株LABOFMIC-312，显微镜下呈单细胞，卵圆形或球形；在麦芽汁平板上生长，可形成表面光滑不透明的圆形菌落，乳白色，边缘整齐；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长。
实施例2LABOFMIC-312的核酸鉴定
1、26S rDNA基因序列分析：
挑取单菌落置麦芽汁液体培养基中，28℃培养过夜后，12000r/min转速离心2min收集菌体，按照酵母基因组DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用酵母菌通用引物NL1、NL4，PCR扩增体系为50μL体系，95℃预变性5min；94℃、1min，52℃、1min，72℃、90s，36个循环，72℃延伸10min。
2、结果
PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出LABOFMIC-312菌株为亚膜威克汉姆酵母(Wickerhamomyces subpelliculosus)。
实施例3LABOFMIC-312促进SDS诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT损伤修复实验
1、LABOFMIC-312溶胞物制备：
挑取亚膜威克汉姆酵母LABOFMIC-312单菌落于麦芽汁液体培养基，28℃摇床培养16h～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD600＝0.2，12000r/min转速离心2min使菌体分离沉淀，其离心沉淀菌体以PBS清洗两次后加入液氮研磨破碎，收集破碎菌泥以PBS重悬至离心时体积，再以超声波破碎20min，121℃，30min，0.28Mpa灭活，即得溶胞物。
2、促进HaCaT细胞修复实验
接种HaCaT细胞(5×104ceLLs/孔)至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制50μg/mLSDS，每孔加入100μL，5％二氧化碳培养箱37℃培养8h。各孔分别添加10％溶胞物(对照组以等体积PBS替代溶胞物)培养24h。向每孔加入10μL的CCK-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度A。
细胞增殖率计算公式及结果如下表：
Figure BDA0003953264440000071
上表结果可知，LABOFMIC-312溶胞物均可促进SDS引起的HaCaT角质细胞损伤，提高细胞增殖率，促进增殖率为11.90％～13.21％。
实施例4LABOFMIC-312促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验
1、LABOFMIC-312发酵产物制备：
挑取亚膜威克汉姆酵母LABOFMIC-312单菌落于麦芽汁液体培养基，28℃摇床培养16h～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD600＝0.2，12000r/min转速离心2min使菌体分离沉淀,取出上清液以121℃，30min，0.28Mpa灭活，经0.22μm滤膜过滤为发酵产物。
2、促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验
接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2mL/孔，内含5×105细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。加入发酵产物5％(V/V)(对照组以等体积PBS替代发酵产物)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测FLG基因的表达。分别以添加等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
公式：F＝2-ΔΔCT，其中：
△CT实验＝CT实验-CT内参(实验)；
△CT对照＝CT对照-CT内参(对照)；
△△CT＝△CT实验-△CT对照。
结果见下表：
Figure BDA0003953264440000081
体外细胞实验表明，本发明的亚膜威克汉姆酵母LABOFMIC-312发酵产物具有上调皮肤屏障修护相关因子丝聚合蛋白基因FLG表达的作用，基因表达量上调1.40～2.11倍。表明LABOFMIC-312具有促进皮肤屏障修护的作用。
实施例5LABOFMIC-312上调HaCaT保湿相关基因表达实验
1、LABOFMIC-312发酵产物和溶胞物制备：
挑取亚膜威克汉姆酵母LABOFMIC-312单菌落于麦芽汁液体培养基，28℃摇床培养16h～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD600＝0.2，12000r/min转速离心2min使菌体分离沉淀,取出上清液以121℃，30min，0.28Mpa灭活，经0.22μm滤膜过滤为发酵产物。其离心沉淀菌体以PBS清洗两次后加入液氮研磨破碎，收集破碎菌泥以PBS重悬至离心时体积，再以超声波破碎20min，121℃、30min、0.28Mpa灭活，即得溶胞物。
2、上调HaCaT保湿相关基因表达实验
接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2mL/孔，内含5×105细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。分别加入发酵产物5％(V/V)、溶胞物10％(V/V)(对照组分别以等体积PBS替代发酵产物/溶胞物)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测AQP3和GBA基因的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
结果见下表：
Figure BDA0003953264440000082
Figure BDA0003953264440000091
体外细胞实验表明，本发明的亚膜威克汉姆酵母LABOFMIC-312具有上调保湿相关的水通道蛋白3基因AQP3和葡萄糖脑苷脂酶基因GBA表达的作用，基因表达量上调1.12～1.67倍。表明LABOFMIC-312具有促进皮肤保湿的作用。
实施例6LABOFMIC-312调节光老化HaCaT细胞外基质/抗氧化/细胞自噬相关基因表达实验
1、LABOFMIC-312发酵产物及溶胞物制备：
制备方法参照实施例5。
2、HaCaT细胞制备及紫外线损伤
将HaCaT细胞消化后以0.5mL/孔(内含2×105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm2的紫外线UVB照射损伤。
3、LABOFMIC-312添加
将发酵产物5％(V/V)、溶胞物10％(V/V)分别加入刺激过的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵产物/溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。
4、qPCR法检测细胞外基质/细胞自噬/抗氧化相关基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因COL1A1，抗氧化相关基因NRF2，细胞自噬相关基因LC3B，以及降解细胞外基质相关基因MMP1的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
发酵产物上调细胞外基质相关基因COL1A1，细胞自噬基因LC3B。结果见下表：
Figure BDA0003953264440000092
Figure BDA0003953264440000101
溶胞物上调抗氧化基因NRF2，细胞自噬基因LC3B；下调降解细胞外基质相关基因MMP1。结果见下表：
Figure BDA0003953264440000102
体外细胞实验表明，本发明的亚膜威克汉姆酵母LABOFMIC-312具有上调HaCaT细胞外基质相关的I型胶原α1链基因COL1A1、抗氧化相关基因NRF2、细胞自噬相关基因LC3B表达的作用，基因相对表达倍数1.21～1.88；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP1表达的作用，基因相对表达倍数0.58～0.78。
实施例7LABOFMIC-312调节氧化损伤HFF细胞外基质/细胞凋亡/抗氧化/免疫调节因子/细胞生长因子相关基因表达实验
1、LABOFMIC-312发酵产物及溶胞物制备：
制备方法参照实施例5。
2、HFF细胞制备及H2O2诱导氧化损伤
将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5mL/孔(内含2×105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H2O2进行刺激，37℃静置1h。
3、LABOFMIC-312添加
将发酵产物5％(V/V)、溶胞物10％(V/V)分别加入刺激过的HFF细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵产物/溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。
4、qPCR法检测细胞外基质/细胞凋亡/抗氧化/免疫调节因子/炎症因子相关基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因LN、MKX、COL3A1和COL13A1，抑制细胞凋亡相关基因BCL-2，抗氧化相关基因SIRT-3，免疫调节因子相关基因MOR，细胞生长因子FGF2、FGF21和HGF；以及降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因Caspase家族和BAX的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
发酵产物上调细胞外基质相关基因LN、SMAD3、SPTSSA、MKX和COL13A1，抑制细胞凋亡基因BCL-2，免疫调节因子相关基因MOR，细胞生长因子FGF2、FGF21和HGF；下调降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因BAX，结果见下表：
Figure BDA0003953264440000111
溶胞物上调抑制细胞外基质相关基因SMAD3、SPTSSA、MKX和COL3A1，抗氧化相关基因SIRT-3，免疫调节因子相关基因MOR，抑制细胞凋亡基因BCL-2，细胞生长因子FGF21和HGF；下调降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因Caspase-3。结果见下表：
Figure BDA0003953264440000121
体外细胞实验表明，本发明的亚膜威克汉姆酵母LABOFMIC-312具有上调HFF细胞外基质相关的层粘连蛋白LN、莫霍克蛋白基因MKX、信号转导蛋白基因SMAD3、丝氨酸棕榈酰转移酶基因SPTSSA、III型胶原α1链COL3A1和XIII型胶原α1链基因COL13A1，免疫调节因子相关的β-内啡肽受体基因MOR，抗氧化相关的Sirtuins蛋白家族基因SIRT-1，抑制细胞凋亡相关的B淋巴细胞瘤-2基因BCL-2，以及细胞生长因子相关的成纤维细胞生长因子基因FGF2、FGF21、肝细胞生长因子基因HGF表达的作用，基因相对表达倍数1.13～5.12；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP，细胞凋亡相关的BCL2-AssociatedX蛋白基因BAX和半胱氨酸蛋白酶家族基因Caspase，以及细胞炎症因子相关的白介素6基因IL-6，基因相对表达倍数0.34～0.85。
实施例8LABOFMIC-312抑制胶原蛋白酶活性实验
1、LABOFMIC-312发酵产物制备：
制备方法参照实施例5。
2、胶原蛋白酶活性抑制率检测
将50μL 0.2％的明胶(胶原蛋白)溶液和50μL、0.1moL/L、pH7.5Tris-HCL(含50mmoL/L CaCL2)溶液混合，加入发酵产物25μL(对照组以等体积麦芽汁液体培养基替代发酵产物)，加入胶原蛋白酶液25μL在37℃反应0.5h。终止反应后以茚三酮显色在593nm下测定各组胶原蛋白酶活性，进而计算胶原蛋白酶抑制率。
胶原蛋白酶活性抑制率计算公式及结果见下表：
Figure BDA0003953264440000131
体外细胞实验表明，本发明的亚膜威克汉姆酵母LABOFMIC-312具有抑制胶原蛋白酶活性的作用，抑制率10.63％～11.77％。
实施例9:LABOFMIC-312清除自由基的作用
1、LABOFMIC-312发酵产物制备：
挑取亚膜威克汉姆酵母LABOFMIC-312单菌落于麦芽汁液体培养基，28℃摇床培养16h～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD600＝2，12000r/min转速离心2min使菌体分离沉淀,取出上清液以121℃，30min，0.28Mpa灭活，经0.22μm滤膜过滤为发酵产物。
2、LABOFMIC-312发酵产物DPPH自由基清除能力检测
试剂配制和检测方法按照索莱宝DPPH自由基清除能力检测试剂盒说明书进行。测定各样品536nm吸亮度，求平均值并计算各样品清除率。
计算公式及结果如下表：
Figure BDA0003953264440000132
体外细胞实验表明，本发明的亚膜威克汉姆酵母LABOFMIC-312具有清除DPPH自由基的作用，自由基清除率80.32％～83.47％。
实施例10:LABOFMIC-312总抗氧化能力测定实验
1、LABOFMIC-312发酵产物制备：
制备方法参照实施例9。
2、总抗氧化能力测定
试剂配制和检测方法按照索莱宝总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒说明书进行，其中反应总体积为0.204mL，反应中样本体积0.006mL。测定各样品593nm吸亮度A，根据公式:A测-A空白＝6.1464X-0.0009,计算得到X值，进而计算得到总抗氧化能力。
总抗氧化能力计算公式及结果见下表：
Figure BDA0003953264440000141
体外细胞实验表明，本发明的亚膜威克汉姆酵母LABOFMIC-312具有抗氧化的作用，总抗氧化能力2.890μmoL/mL～3.128μmoL/mL。
实施例11LABOFMIC-312上调HaCaT抗菌肽相关基因表达实验
1、LABOFMIC-312发酵产物及溶胞物制备：
制备方法参照实施例5。
2、HaCaT细胞制备
将HaCaT细胞消化后以0.5mL/孔(内含2×105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
3、LABOFMIC-312添加及LPS刺激
将发酵产物5％(V/V)、溶胞物10％(V/V)分别加入培养过夜的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵产物/溶胞物)。2h后添加0.5mL浓度为0.2μg/mL的LPS溶液，诱导细胞发炎，5％二氧化碳培养箱37℃培养20h。
4、qPCR法检测抗菌肽相关基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测S100A7、S100A8、LCN-2基因的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
发酵产物上调抗菌肽相关基因S100A7、DEFB4，结果见下表：
Figure BDA0003953264440000151
溶胞物上调抗菌肽相关基因S100A8、DEFB4。结果见下表：
Figure BDA0003953264440000152
体外细胞实验表明，本发明的亚膜威克汉姆酵母LABOFMIC-312具有促进抗菌肽相关基因银屑病素S100A7、钙粒蛋白A S100A8、β防御素4DEFB4表达的作用，基因相对表达倍数1.19～1.88。表明LABOFMIC-312具有提高细胞抗菌能力的作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株亚膜威克汉姆酵母(Wickerhamomyces subpelliculosus)，该菌株被命名为LABOFMIC-312，已于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNo:M 20221395的亚膜威克汉姆酵母。
2.根据权利要求1所述的亚膜威克汉姆酵母，其特征在于，采样于秋月梨果皮，将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于麦芽汁琼脂平板，28℃恒温培养12-16h后，挑取乳白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-312；
显微镜下呈单细胞，卵圆形或球形；在麦芽汁平板上生长，可形成表面光滑不透明的圆形菌落，乳白色，边缘整齐；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长。
3.权利要求1～2任一项所述的亚膜威克汉姆酵母在制备改善皮肤状况的产品中的应用，其中，所述改善皮肤状况包括促进皮肤角质细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老、提高细胞抗菌能力中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述修复皮肤屏障包括修复SDS诱导的细胞损伤和/或上调屏障修护基因FLG的表达。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述保湿为上调保湿基因AQP3和/或GBA的表达。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老包括上调细胞外基质基因SPTSSA、SMAD3、LN、MKX、COL1A1、COL3A1、COL13A1中至少一种的表达、上调抑制细胞凋亡基因BCL-2的表达、上调细胞自噬基因LC3B的表达、上调细胞抗氧化基因NRF2、SIRT-3中至少一种的表达、上调细胞免疫调节因子基因MOR的表达或上调细胞生长因子基因FGF2、FGF21、HGF中至少一种的表达。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为下调降解细胞外基质MMP家族基因MMP1、MMP3中的至少一种的表达，或下调细胞凋亡基因BAX和/或Caspase家族中Caspase-3的至少一种的表达。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为抑制胶原蛋白酶活性、清除DPPH自由基和抗氧化能力中的至少一种。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提高细胞抗菌能力为上调抗菌肽基因的表达，所述抗菌肽基因由S100A7、S100A8和DEFB4中的至少一种组成。
10.一种改善皮肤状况的产品，其特征在于，由包括权利要求1～2任一项所述的亚膜威克汉姆酵母原料制成；所述产品为食品、药品或化妆品，所述产品中的亚膜威克汉姆酵母包括如下所示的至少一种：
(1)亚膜威克汉姆酵母的菌群和/或菌剂；
(2)亚膜威克汉姆酵母的培养物、外泌体、溶胞物和/或提取物。
CN202211456698.9A 2022-11-21 2022-11-21 一株亚膜威克汉姆酵母及其应用 Pending CN116042418A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211456698.9A CN116042418A (zh) 2022-11-21 2022-11-21 一株亚膜威克汉姆酵母及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211456698.9A CN116042418A (zh) 2022-11-21 2022-11-21 一株亚膜威克汉姆酵母及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116042418A true CN116042418A (zh) 2023-05-02

Family

ID=86120713

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211456698.9A Pending CN116042418A (zh) 2022-11-21 2022-11-21 一株亚膜威克汉姆酵母及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116042418A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114081901B (zh) 一种益生菌组合物、制备方法及其应用
CN115094011A (zh) 一株加氏乳杆菌及其应用
CN115261273A (zh) 一株詹氏乳杆菌及其应用
CN116333939A (zh) 一株短双歧杆菌及其应用
CN115044519B (zh) 解淀粉乳杆菌及其应用
CN115505550A (zh) 一株副干酪乳杆菌及其应用
CN115584333A (zh) 罗伊氏乳杆菌及其应用
CN116555070A (zh) 一株双歧双歧杆菌及其应用
CN115491334A (zh) 一株鼠李糖乳杆菌及其应用
CN115678814A (zh) 一种唾液乳杆菌及其应用
CN116042418A (zh) 一株亚膜威克汉姆酵母及其应用
CN115369047A (zh) 一种马克斯克鲁维酵母菌株及其应用
CN115058373A (zh) 清酒乳杆菌及其应用
CN115806914A (zh) 一种植物乳杆菌及其应用
CN116445306B (zh) 粟酒裂殖酵母及其改善皮肤状况的应用
CN114645002A (zh) 一种用于皮肤抗炎和治疗痤疮的副干酪乳杆菌及其应用
CN116286415B (zh) 一株橙红色掷孢酵母及其应用
CN116218716A (zh) 一株假小链双歧杆菌及其应用
CN115927024A (zh) 酿酒酵母及其应用
CN115725428A (zh) 一种近平滑假丝酵母菌株及其应用
CN115197883A (zh) 解淀粉乳杆菌及其皮肤修复抗衰老应用
CN115786147A (zh) 一株皱状假丝酵母及其应用
CN115747086A (zh) 一株克鲁维毕赤酵母及其应用
CN116555055A (zh) 一种近平滑假丝酵母菌株及其应用
CN116355770B (zh) 一种汉逊德巴利酵母及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination