CN115678814A

CN115678814A - 一种唾液乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN115678814A
Application number: CN202211490104.6A
Authority: CN
Inventors: 廖梅香
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2022-11-25
Filing date: 2022-11-25
Publication date: 2023-02-03

Abstract

本发明公开了一种唾液乳杆菌及其应用，涉及微生物技术领域。本发明公开的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，该菌株为唾液乳杆菌ProfMIC‑230，已于2022年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO:M 20221353。实验表明，ProfMIC‑230具有抗衰老、提高皮肤抗菌能力的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

Description

一种唾液乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种唾液乳杆菌及其应用。

背景技术

皮肤屏障是由角质层的表皮形成细胞和角质间的脂质形成的结构性的屏障。角质间结构性脂质神经酰胺，在基底层向角质分化过程中含量逐渐增加，到达角质层排至细胞间隙，构成防止水分丢失的屏障。但随着年龄的增长，角质层的含水量会逐渐减少，进而引起皮肤的各种问题。

光老化是皮肤外在老化最主要的形式，而导致皮肤光老化的主要原因就是紫外线辐射。皮肤在老化的过程中，细胞增殖降低，细胞凋亡增加，细胞外基质成分(胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖等)随着皮肤衰老而显着减少。

在衰老机制的研究中发现，细胞自噬能够延缓器官功能退化，清除细胞内受损的蛋白质和脂质，修复DNA，帮助细胞恢复代谢稳态，为光老化受损的皮肤提供保护作用。另外，减少细胞凋亡，降低细胞炎症，增加细胞外基质的合成以及减少其降解，提升细胞的抗氧化能力等都已被证实能够减缓皮肤细胞衰老，寻求多层次多维度的抗衰老物质是目前的研究热点。

皮肤微生物在皮肤免疫的成熟和稳态中发挥着重要作用，大多数生活在皮肤上的微生物在稳态条件下表现为共生或互利共生，最新的研究证明皮肤微生物群调节各种先天因子的表达。当皮肤因为外部原因的侵害，例如空气污染、化妆品过度使用或使用了含激素的化妆品后，就可能导致皮肤表面菌群失调，从而造成各种肌肤问题。研究表明，当益生菌减少甚至消失时，皮肤会出现抵抗力降低、易发炎、感染、过敏、长痘、水油失衡等多种问题。因此，提供一种利用皮肤微生物技术开发的益生菌相关产品，具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种唾液乳杆菌及其应用。

本发明提供了唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，该菌株为唾液乳杆菌ProfMIC-230，已于2022年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221353的唾液乳杆菌；

本发明的另一目的在于提供了上述唾液乳杆菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用。

所述改善皮肤状况为抗衰老、提高皮肤抗菌能力中的至少一种。

在一些实施方式中，所述抗衰老为上调细胞外基质相关基因的表达；所述细胞外基质相关基因包括COL1A1、LN、FN和MKX中的至少一种；

所述抗衰老为上调抑制细胞凋亡相关基因BCL-2的表达；

所述抗衰老为上调细胞自噬相关基因LC3B的表达；

所述抗衰老为上调细胞抗氧化相关基因NRF2和/或SIRT-1的表达；

所述抗衰老为抑制胶原蛋白酶活性。

在一些实施方式中，所述抗衰老为下调降解细胞外基质相关基因的表达；所述降解细胞外基质相关基因包括MMP家族和/或P38MAPK中的至少一种；

所述抗衰老为下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因包括Caspase家族的至少一种。

在一些实施方式中，所述提升皮肤抗菌能力为上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、DEFB4和LL-37的表达。

在一些实施方式中，所述产品为食品、药品或化妆品。

本发明的另一目的在于提供了一种改善皮肤状况的产品，由包括上述的唾液乳杆菌的原料制成。

在一些实施方式中，所述产品中的唾液乳杆菌包括如下(1)或(2)所示的一种或两种：

(1)上述的唾液乳杆菌的活菌和/或灭活菌；

(2)上述的唾液乳杆菌的培养物、外泌体、裂解物和/或提取物。

本发明公开的唾液乳杆菌ProfMIC-230，其保藏编号为CCTCC NO:M20221353。实验表明，ProfMIC-230具有抗衰老、提高皮肤抗菌能力的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

生物保藏说明

唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)ProfMIC-230，于2022年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221353。

具体实施方式

本发明提供了唾液乳杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的唾液乳杆菌菌株ProfMIC-230，来源于2岁健康男童粪便，经16SrDNA鉴定为唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)。该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈杆状；在MRS平板上生长，可形成表面光滑不透明的圆形菌落，白色，边缘整齐；在MRS液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度37℃。

唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)ProfMIC-230，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2022年8月31日，保藏编号为CCTCC NO:M 20221353。

进一步，本发明提供的唾液乳杆菌ProfMIC-230在本发明所述的应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为裂解物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为上清液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：上清液、灭活菌体。

体外细胞实验表明，本发明的唾液乳杆菌ProfMIC-230具有上调HaCaT细胞外基质相关的I型胶原α1链基因COL1A1和细胞自噬相关基因LC3B，以及抗氧化相关的核因子E2相关因子2基因NRF2，表达的作用，基因相对表达倍数1.14～1.50；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP1和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因P38MAPK，基因相对表达倍数0.36～0.80。

体外细胞实验表明，本发明的唾液乳杆菌ProfMIC-230具有上调HFF细胞外基质相关的层粘连蛋白LN、莫霍克蛋白基因MKX和纤维连接蛋白基因FN，抗氧化相关的Sirtuins蛋白家族基因SIRT-1，以及抑制细胞凋亡相关的B淋巴细胞瘤-2基因BCL-2表达的作用，基因相对表达倍数1.26～2.25倍；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP，细胞凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶家族基因Caspase，基因相对表达倍数0.39～0.80。

体外细胞实验表明，本发明的ProfMIC-230具有抑制胶原蛋白酶活性的功能，抑制率为14.17％～21.82％。

体外细胞实验表明，本发明的ProfMIC-230具有上调抗菌肽相关基因银屑病素基因S100A7、钙粒蛋白A基因S100A8、β防御素4基因DEFB4、cathelicidin家族抗菌肽LL-37表达的作用，基因相对表达倍数1.25～2.78。

本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：ProfMIC-230的分离

于2岁健康男童粪便中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于MRS固体平板，37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为ProfMIC-230。

革兰氏染色镜检：菌株ProfMIC-230为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在MRS平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在MRS液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。

实施例2：ProfMIC-230的核酸鉴定

1、16S rDNA基因序列分析：

挑取单菌落置MRS液体培养基中，37℃培养过夜后，12000转离心1min收集菌体，按照DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27F,1492R，PCR扩增体系为50μL体系，95℃预变性5min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。

2、结果

PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出ProfMIC-230菌株为唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)。

实施例3：ProfMIC-230调节光老化HaCaT细胞外基质/细胞自噬/抗氧化相关基因表达实验

1、ProfMIC-230上清液及灭活菌体制备：

挑取唾液乳杆菌ProfMIC-230单菌落于MRS液体培养基，37℃培养箱静置培养16～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD₆₀₀＝0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。离心沉淀以适量PBS重悬，稀释调整OD₆₀₀＝0.2，为灭活菌体。

2、HaCaT细胞制备及紫外线损伤

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm²的紫外线UVB照射损伤。

3、ProfMIC-230添加

将上清液5％(V/V)、灭活菌体10％(V/V)分别加入刺激过的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/细胞自噬/抗氧化相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因COL1A1，细胞自噬相关基因LC3B，抗氧化相关基因NRF2以及降解细胞外基质相关基因MMP1和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因P38MAPK的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

公式：F＝2^-ΔΔCT，其中：

△CT_实验＝CT_实验-CT_{内参(实验)}；

△CT_对照＝CT_对照-CT_{内参(对照)}；

△△CT＝△CT_实验-△CT_对照。

上清液下调降解细胞外基质相关基因MMP1和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因P38MAPK。结果见下表：

灭活菌体上调细胞外基质基因COL1A1，细胞自噬相关基因LC3B，抗氧化相关基因NRF2。结果见下表：

结果显示加入ProfMIC-230具有促进HaCaT细胞外基质合成和细胞自噬、增加细胞抗氧化、减少细胞外基质降解的抗衰老作用。

实施例4：ProfMIC-230调节氧化损伤HFF细胞外基质/细胞凋亡/抗氧化相关基因表达实验

1、ProfMIC-230上清液及灭活菌体制备：

制备方法参照实施例3。

2、HFF细胞制备及H₂O₂诱导氧化损伤

将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H₂O₂进行刺激，37℃静置1h。

3、ProfMIC-230添加

将上清液5％(V/V)、灭活菌体10％(V/V)分别加入刺激过的HFF细胞(对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/细胞凋亡/抗氧化/炎症因子相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因LN、MKX和FN，抑制细胞凋亡相关基因BCL-2，抗氧化相关基因SIRT-1；以及降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因Caspase家族的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

上清液上调细胞外基质相关基因LN，抑制细胞凋亡基因BCL-2，抗氧化相关基因SIRT-1；下调降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因Caspase家族，结果见下表：

灭活菌体上调细胞外基质相关基因MKX和FN，以及抑制细胞凋亡基因BCL-2。结果见下表：

结果显示加入ProfMIC-230具有促进HFF细胞外基质合成、减少细胞凋亡、增加细胞抗氧化、减少细胞外基质降解的抗衰老作用。

实施例5:ProfMIC-230抑制胶原蛋白酶活性实验

1、ProfMIC-230上清液制备：

制备方法参照实施例3。

2、胶原蛋白酶活性抑制率检测

将50μL 0.2％的明胶(胶原蛋白)溶液和50μL 0.1mol/L，pH7.5，Tris-HCL(含50mmol/L CaCl₂)溶液混合，加入上清液25μL(对照组以等体积MRS替代上清液)，加入胶原蛋白酶液25μL在37℃反应0.5h。终止反应后以茚三酮显色在593nm下测定各组胶原蛋白酶活性，进而计算胶原蛋白酶抑制率。

胶原蛋白活性抑制率计算公式及结果见下表：

结果显示ProfMIC-230具有抑制胶原蛋白酶活性的作用。

实施例6：ProfMIC-230上调HaCaT抗菌肽相关基因表达实验

1、ProfMIC-230上清液及灭活菌体制备：

制备方法参照实施例3。

2、HaCaT细胞制备

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。

3、ProfMIC-230添加及LPS刺激

将上清液5％(V/V)、灭活菌体10％(V/V)分别加入培养过夜的HaCaT细胞中(对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体)，2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的LPS溶液，诱导细胞发炎，5％二氧化碳培养箱37℃培养20h。

4、qPCR法检测抗菌肽相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测S100A7、S100A8、DEFB4、LL-37基因的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

上清液上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8和LL-37，结果见下表：

ProfMIC-230上清液上调抗菌肽相关基因的表达

灭活菌体上调上调抗菌肽相关基因DEFB4，结果见下表：

ProfMIC-230灭活菌体上调抗菌肽相关基因的表达

结果显示ProfMIC-230上清液和灭活菌体均具有促进抗菌肽基因表达的作用。

实施例7:唾液乳杆菌ProfMIC-230上清液冲剂制备实例

ProfMIC-230上清液冲剂的制备，组方如下表所示

原料	质量比例(％)
		ProfMIC-230发酵粉	50
胶原蛋白肽粉	30
		蔓越莓果汁粉	18.8
维生素C	0.8
		二氧化硅	0.4

制备工艺：取实施例3制备的ProfMIC-230上清液，喷雾干燥后制成ProfMIC-230发酵粉，加入胶原蛋白肽粉、维生素C、蔓越莓果汁粉、二氧化硅，搅拌分散均匀即完成冲剂。所得ProfMIC-230冲剂以水冲泡后味道酸甜，适口性佳，携带方便，可做为皮肤保养的口服饮品。

实施例8:唾液乳杆菌ProfMIC-230灭活菌体乳液制备实例ProfMIC-230灭活菌体乳液的制备，组方如下表所示

原料	质量比例(％)
		ProfMIC-230灭活菌液	50.00
环戊硅氧烷	12.00
		甘油	12
凡士林	5.00
		1,3-丁二醇	1.5
吐温-80	0.75
		维生素E醋酸酯	0.20
汉生胶	0.15
		Carbopol Ultrez 10	0.15
三乙醇胺	0.05
		去离子水	至100

制备工艺：将环戊硅氧烷、凡士林、吐温-80、维生素E醋酸酯、甘油一起混合加热至75℃，作为A相；再取实施例3制备的ProfMIC-230灭活菌液，加入汉生胶、Carbopol Ultrez10、1,3-丁二醇、去离子水一起混合分散均匀并加热至75℃，作为B相；将预热的A相缓慢加入到预热的B相中并均质完全，加入三乙醇胺调节至pH6-7，搅拌冷却至35℃即完成。所得ProfMIC-230灭活菌乳液体感润滑舒适。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，该菌株为唾液乳杆菌ProfMIC-230，已于2022年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M20221353。

2.权利要求1所述的唾液乳杆菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述改善皮肤状况为抗衰老、提高皮肤抗菌能力中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为上调细胞外基质相关基因的表达；所述细胞外基质相关基因包括COL1A1、LN、FN和MKX中的至少一种；

所述抗衰老为上调抑制细胞凋亡相关基因BCL-2的表达；

所述抗衰老为上调细胞自噬相关基因LC3B的表达；

所述抗衰老为抑制胶原蛋白酶活性。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为下调降解细胞外基质相关基因的表达；所述降解细胞外基质相关基因包括MMP家族和/或P38MAPK中的至少一种；

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提升皮肤抗菌能力为上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、DEFB4和LL-37的表达。

7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、药品或化妆品。

8.根据权利要求1～7任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、药品或化妆品。

9.一种改善皮肤状况的产品，其特征在于，由包括权利要求1所述唾液乳杆菌的原料制成。

10.根据权利要求12所述的产品，其特征在于，所述产品中的唾液乳杆菌包括如下(1)或(2)所示的一种或两种：

(1)权利要求1所述的唾液乳杆菌的活菌和/或灭活菌；

(2)权利要求1所述的唾液乳杆菌的培养物、外泌体、裂解物和/或提取物。