CN115806914A - 一种植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌及其应用,涉及微生物技术领域。本发明公开的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),该菌株为植物乳杆菌ProfMIC‑215,已于2022年7月14日保藏在中国典型培养物保藏中心,其保藏编号为CCTCCNO:M 20221109。实验表明,ProfMIC‑215具有美白、更新老化角质、改善脱发的功能,可用于制备食品、药品、化妆品等。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,特别涉及一种植物乳杆菌及其应用。
背景技术
光老化是皮肤外在老化最主要的形式,而导致皮肤光老化的主要原因就是紫外线辐射。皮肤在老化的过程中,细胞增殖降低,细胞凋亡增加,细胞外基质成分随着皮肤衰老而显着减少。此外,在紫外线照射下,角质形成细胞会释放内皮素,当内皮素与黑色素细胞膜上的受体结合后,会刺激黑色素细胞的增殖,激活酪氨酸酶的活性,加快黑色素细胞树枝状突起的增长,从而加快黑色素的合成和黑色素体向角质形成细胞的迁移。
一般皮肤的更新周期是28天,但由于外界环境、紫外线、饮食不均衡、生活作息不规律等各种因素的影响,使得角质更新的速度减缓,不正常的代谢会让角质细胞无法自然脱落,形成厚厚的一层角质。光老化以及外界环境等各种因素會造成皮肤就会失去光泽、變黑或者灰暗同時產生脱皮、生皱、长痘等现象,对护肤品中的一些有效成分也难以吸收。
皮肤微生物在皮肤的稳态中发挥着重要作用,大多数生活在皮肤上的微生物在稳态条件下表现为共生或互利共生,最新的研究证明皮肤微生物群调节各种先天因子的表达。因此,提供一种利用皮肤微生物技术开发的益生菌相关产品,具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种植物乳杆菌及其应用。
本发明提供了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),该菌株为植物乳杆菌ProfMIC-215,已于2022年7月14日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,地址为:武汉市武昌区八一路299号,武汉大学,邮编430072),其保藏编号为CCTCC NO:M 20221109的植物乳杆菌);
本发明的另一目的在于提供了上述植物乳杆菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用。
在一些实施方式中,所述改善皮肤状况包括美白、更新老化角质、改善脱发中的至少一种。
在一些实施方式中,所述美白包括抑制酪氨酸酶活性的作用。
在一些实施方式中,所述美白包括如下a)~f)所示的至少一种:
a)、下调黑色素合成相关基因MITF、AKT、GSK3β、PI3K的表达;
b)、下调褐黑素生成相关基因ASIP的表达;
c)、下调黑色素转运相关基因RAB27A、Va、HMGB1的表达;
d)、下调黑色素小体成熟相关基因OA1、MATP的表达;
e)、下调黑色素细胞迁移相关基因E-cadherin的表达;
f)、上调促进黑色素细胞凋亡相关基因Caspase-3的表达。
在一些实施方式中,所述更新老化角质为上调降解桥粒蛋白相关基因KLK5的表达;上调促进更新角质细胞相关基因CD44、CDSN的表达;下调桥粒蛋白相关基因DSC1、DSG3的表达。
在一些实施方式中,所述改善脱发包括如下a)~f)所示的至少一种:
a)、上调毛囊细胞生长期相关基因β-catenin、LEF1的表达;
b)、上调毛囊细胞生长因子相关基因VEGF、IGF-1、FGF-2的表达;
c)、上调毛囊细胞外基质相关基因CSPG4、HSPG2的表达;
d)、上调抑制毛囊细胞凋亡相关基因HSP27的表达;
e)、上调毛囊细胞周期调控因子相关基因c-Myc、Cyclin D1、PP2A的表达;
f)、下调毛囊休止期BMP4的表达。
在一些实施方式中,所述产品为食品、药品或化妆品。
本发明的另一目的在于提供了一种改善皮肤状况的产品,由包括上述的植物乳杆菌的原料制成。
在一些实施方式中,所述产品中的植物乳杆菌包括如下(1)或(2)所示的一种或两种:
(1)上述的植物乳杆菌的菌群和/或菌剂;
(2)上述的植物乳杆菌的培养物、外泌体、溶胞物和/或提取物。
本发明公开的植物乳杆菌ProfMIC-215,其保藏编号为CCTCC NO:M20221109。实验表明,ProfMIC-215具有美白、更新老化角质、改善脱发的功能,可用于制备食品、药品、化妆品等。
生物保藏说明
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ProfMIC-215,于2022年7月14日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,地址为:武汉市武昌区八一路299号,武汉大学,邮编430072),其保藏编号为CCTCC NO:M 20221109。
具体实施方式
本发明提供了植物乳杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明的植物乳杆菌菌株ProfMIC-215,来源于广西省来宾市老坛酸菜浆水,经16S rDNA鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌株革兰氏阳性,显微镜下呈杆状;在MRS平板上生长,可形成表面光滑不透明的圆形菌落,白色,边缘整齐;在MRS液体培养基中呈均匀浑浊生长,久置菌体呈白色沉淀,最适生长温度37℃。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ProfMIC-215,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,地址:湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内,保藏日期:2022年7月14日,保藏编号为CCTCC NO:M 20221109。
进一步,本发明提供的植物乳杆菌ProfMIC-215在本发明所述的应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的,或为裂解物和/或提取物的形式,或为细菌产物的形式或为上清液形式或衍生物形式,所述衍生物形式优选地选自:代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖,和含有免疫原性成分的化合物,优选地选自:上清液、灭活菌体。
本发明采用的试材皆为普通市售品,均可市售购买得到,下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1ProfMIC-215的分离
于酸菜浆水中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀,取上清划线于MRS固体平板,37℃恒温培养48h后,挑取白色菌落反复接种筛选,直至得到均匀的单个菌落,命名为ProfMIC-215。
革兰氏染色镜检:菌株ProfMIC-215为革兰氏染色阳性,显微镜下呈杆状;在MRS平板上生长,可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落,边缘整齐;在MRS液体培养基中呈均匀浑浊生长,久置菌体呈白色沉淀。
实施例2ProfMIC-215的核酸鉴定
1、16S rDNA基因序列分析:
挑取单菌落置MRS液体培养基中,37℃培养过夜后,12000转离心1min收集菌体,按照DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27F,1492R,PCR扩增体系为50μL体系,95℃预变性5min;94℃15s,57℃15s,72℃40s,35个循环;72℃延伸10min。
2、结果
PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出PROFMIC-215菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
实施例3ProfMIC-215抑制酪氨酸酶活性实验
1、ProfMIC-215上清液制备:
挑取植物乳杆菌ProfMIC-215单菌落于MRS液体培养基,37℃培养箱静置培养16~18h,酶标仪检测并以MRS液体培养基稀释调整OD600=2,121℃,30min高压灭活,12000转离心2min,经0.22μm滤膜过滤为上清液。
2、酪氨酸酶活性抑制率检测
配制250U/mL酪氨酸酶,6.0mM左旋多巴和80mM的PBS。在96孔板每孔内依次加入50μl PBS+20μl上清液+50μl酪氨酸酶+50μl左旋多巴(对照组以等体积MRS替代上清液)。反应体系混匀后室温避光静置15min,使用酶标仪检测475nm吸光度A。
酪氨酸酶活性抑制率计算公式及结果见下表:
上表结果可知,ProfMIC-215可抑制体外酪氨酸酶活性,抑制率为26.56~30.77%。
实施例4ProfMIC-215调节A875人黑色素瘤细胞黑色素合成/褐黑素生成/黑色素转运/黑色素小体成熟/黑色素细胞迁移/细胞凋亡相关基因的表达实验
1、ProfMIC-215上清液和灭活菌体制备:
植物乳杆菌ProfMIC-215单菌落于MRS液体培养基,37℃培养箱静置培养16~18h,酶标仪检测并以PBS稀释调整OD600=0.2,121℃,30min高压灭活,12000转离心2min,经0.22μm滤膜过滤为上清液。离心沉淀以适量PBS重悬,稀释调整OD600=0.2,为灭活菌体。
2、A875人黑色素瘤细胞制备及紫外线损伤
将A875人黑色素瘤细胞消化后以0.5mL/孔(内含8.5×104细胞)接种至24孔板,5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为1J/cm2的紫外线UVB照射损伤。
3、ProfMIC-215添加
将上清液5%(V/V)、灭活菌体10%(V/V)分别加入刺激过的A875人黑色素瘤细胞(对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体)。每组3平行,37℃培养过夜。
4、qPCR法检测黑色素合成/褐黑素生成/黑色素转运/黑色素小体成熟/黑色素细胞迁移/细胞凋亡相关基因的相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后,加入裂解液,提取细胞总RNA,检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA,以GAPDH为内参基因,采用实时qPCR检测黑色素合成相关基因MITF、AKT、GSK3β、PI3K、褐黑素生成相关基因ASIP、黑色素转运相关基因RAB27A、Va、HMGB1、黑色素小体成熟相关基因OA1、MATP、黑色素细胞迁移相关基因E-cadherin、细胞凋亡相关基因Caspase-3的表达。以对照组基因相对表达倍数F=1,利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
公式:F=2-ΔΔCT,其中:
△CT实验=CT实验-CT内参(实验);
△CT对照=CT对照-CT内参(对照);
△△CT=△CT实验-△CT对照。
上清液下调黑色素小体成熟相关基因OA1、MATP,黑色素转运相关基因RAB27A、Va、HMGB1,黑色素合成相关基因GSK3β的表达,结果见下表:
灭活菌体上调细胞凋亡相关基因Caspase-3的表达,下调黑色素合成相关基因MITF、AKT、GSK3β和PI3K、褐黑素生成相关基因ASIP、黑色素转运相关基因RAB27A、Va和HMGB1、黑色小体成熟相关基因OA1、MATP、黑色素细胞迁移相关基因E-cadherin的表达,结果见下表:
体外细胞实验表明,本发明的植物乳杆菌ProfMIC-215上清液和灭活菌体具有上调促进黑色素瘤细胞凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶3基因Caspase-3的表达,基因表达量上调1.41~1.73倍;下调黑色素合成相关的小眼畸形相关转录因子基因MITF、蛋白激酶B基因AKT、糖原合成酶激酶3β基因GSK3β和磷脂酰肌醇3-激酶基因PI3K、褐黑素生成相关的刺鼠信号蛋白基因ASIP、黑色素转运相关的GTPase家族蛋白基因RAB27A、肌球蛋白基因Va和高迁移率族蛋白B1基因HMGB1、黑色小体成熟相关的黑色素小体膜蛋白基因OA1、膜相关转运蛋白基因MATP、黑色素细胞迁移相关钙黏蛋白基因E-cadherin表达的作用,基因表达量下调0.51~0.86倍。表明ProfMIC-215具有美白的作用。
实施例5ProfMIC-215调节HaCaT更新老化角质相关基因表达实验
1、ProfMIC-215上清液和灭活菌体制备:
制备方法参照实施例4。
2、HaCaT细胞制备及紫外线光老化
将HaCaT细胞消化后以0.5mL/孔(内含2×105细胞)接种至24孔板,5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm2的紫外线UVB光老化。
3、ProfMIC-215添加
将上清液5%(V/V)、灭活菌体10%(V/V)分别加入刺激过的HaCaT细胞(对照组加入等体积PBS替代上清液/灭活菌体)。每组3平行,37℃培养过夜。
4、qPCR法检测更新老化角质相关基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后,加入裂解液,提取细胞总RNA,检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA,以GAPDH为内参基因,采用实时qPCR检测解桥粒蛋白相关基因KLK5;促进更新角质细胞相关基因CDSN、CD44;桥粒蛋白相关基因DSC1、DSG3的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F=1),利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
上清液调节去除老化角质相关基因CDSN、CD44、DSC1、DSG3的表达,结果见下表:
ProfMIC-215上清液调节更新老化角质相关基因的表达
灭活菌体调节去除老化角质相关基因KLK5、CD44、DSC1、DSG3的表达,结果见下表:
ProfMIC-215灭活菌体调节更新老化角质相关基因的表达
结果显示,ProfMIC-215具有上调降解桥粒蛋白相关基因激肽释放酶5KLK5,促进更新角质细胞相关角膜锁链基因CDSN,跨膜粘附糖蛋白基因CD44的表达,基因表达量上调1.08~1.33倍;并下调桥粒蛋白相关基因角质粘蛋白DSC1、桥粒芯蛋白3DSG3表达的作用,基因表达量下调0.56~0.88倍;因此ProfMIC-215具有更新老化角质的作用。
实施例10:ProfMIC-215调节氧化损伤HDPCs人毛囊乳头细胞生长因子/毛囊细胞凋亡/毛囊细胞周期调控因子/毛囊休止期相关基因表达实验
1、ProfMIC-215上清液和灭活菌体制备:
制备方法参照实施例4。
2、HDPCs人毛囊乳头细胞制备及H2O2诱导氧化损伤
将成纤维细胞培养基培养的HDPCs消化后以2mL/孔(内含3×105细胞)接种至6孔板,5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H2O2进行刺激,37℃静置1h后,PBS清洗两次并更换细胞培养基。
3、ProfMIC-215添加
将上清液5%(V/V)、灭活菌体10%(V/V)分别加入刺激过的HDPCs(对照组以等体积PBS替代上清液/灭活菌体),5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
4、qPCR法检测毛囊细胞外基质/抑制毛囊细胞凋亡/毛囊细胞周期调控因子/毛囊休止期相关基因相对表达倍数将上述细胞弃去培养基后,加入裂解液,提取细胞总RNA,检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA,以GAPDH为内参基因,采用实时qPCR检测毛囊生长期相关基因β-catenin、LEF1,毛囊细胞生长因子相关基因VEGF、IGF-1、FGF-2,毛囊细胞外基质相关基因CSPG4、HSPG2,抑制毛囊细胞凋亡相关基因HSP27,毛囊细胞周期调控因子相关基因c-Myc、Cyclin D1、PP2A;以及毛囊休止期相关基因BMP4的表达。以对照组基因相对表达倍数F=1,利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
上清液上调毛囊细胞外基质相关基因CSPG4、HSPG2,抑制毛囊细胞凋亡相关基因HSP27,毛囊细胞周期调控因子相关基因c-Myc、Cyclin D1、PP2A的表达;下调毛囊休止期相关基因BMP4的表达,结果见下表:
灭活菌体上调毛囊生长期相关基因β-catenin、LEF1,毛囊细胞外基质相关基因HSPG2,毛囊细胞生长因子相关基因VEGF、IGF-1、FGF-2,抑制毛囊细胞凋亡相关基因HSP27,毛囊细胞周期调控因子相关基因c-Myc的表达,结果见下表:
体外细胞实验表明,本发明的植物乳杆菌ProfMIC-215具有上调HDPCs毛囊生长期相关基因β-连环蛋白基因β-catenin、淋巴细胞结合增强因子1基因LEF1,毛囊细胞生长因子相关的血管内皮细胞生长因子基因VEGF、胰岛素样生长因子1基因IGF-1、成纤维细胞生长因子2基因FGF-2,毛囊细胞外基质相关基因硫酸软骨素蛋白聚糖基因CSPG4、硫酸肝素蛋白聚糖基因HSPG2,抑制毛囊细胞凋亡相关的热休克蛋白27基因HSP27,毛囊细胞周期调控因子相关的Myc家族蛋白基因c-Myc、细胞周期蛋白D1基因Cyclin D1、蛋白磷酸酶2A基因PP2A,基因相对表达倍数1.11~1.59;下调毛囊发育休止期相关骨形态发生蛋白4基因BMP4的表达,基因相对表达倍数为0.59~0.77。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),该菌株为植物乳杆菌ProfMIC-215,已于2022年7月14日保藏在中国典型培养物保藏中心,其保藏编号为CCTCC NO:M20221109。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述改善皮肤状况包括美白、更新老化角质、改善脱发中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述美白包括抑制酪氨酸酶活性的作用。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述美白包括如下a)~f)所示的至少一种:
a)、下调黑色素合成相关基因MITF、AKT、GSK3β、PI3K的表达;
b)、下调褐黑素生成相关基因ASIP的表达;
c)、下调黑色素转运相关基因RAB27A、Va、HMGB1的表达;
d)、下调黑色素小体成熟相关基因OA1、MATP的表达;
e)、下调黑色素细胞迁移相关基因E-cadherin的表达;
f)、上调促进黑色素细胞凋亡相关基因Caspase-3的表达。
6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述更新老化角质为上调降解桥粒蛋白相关基因KLK5的表达;上调促进更新角质细胞相关基因CD44、CDSN的表达;下调桥粒蛋白相关基因DSC1、DSG3的表达。
7.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述改善脱发包括如下a)~f)所示的至少一种:
a)、上调毛囊细胞生长期相关基因β-catenin、LEF1的表达;
b)、上调毛囊细胞生长因子相关基因VEGF、IGF-1、FGF-2的表达;
c)、上调毛囊细胞外基质相关基因CSPG4、HSPG2的表达;
d)、上调抑制毛囊细胞凋亡相关基因HSP27的表达;
e)、上调毛囊细胞周期调控因子相关基因c-Myc、Cyclin D1、PP2A的表达;
f)、下调毛囊休止期BMP4的表达。
8.根据权利要求1~7任一项所述的应用,其特征在于,所述产品为食品、药品或化妆品。
9.一种改善皮肤状况的产品,其特征在于,由包括权利要求1所述植物乳杆菌的原料制成。
10.根据权利要求9所述的产品,其特征在于,所述产品中的植物乳杆菌包括如下(1)或(2)所示的一种或两种:
(1)权利要求1所述的植物乳杆菌的菌群和/或菌剂;
(2)权利要求1所述的植物乳杆菌的培养物、外泌体、溶胞物和/或提取物。
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- 2022-12-16 CN CN202211626376.4A patent/CN115806914A/zh active Pending
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