CN115820516A - 一株枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其应用，涉及微生物技术领域。本发明公开的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为枯草芽孢杆菌ProfMIC‑219，已于2022年07月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M20221156。实验表明，ProfMIC‑219具有抗衰老、美白、促进细胞增殖、修护皮肤屏障、促进老化角质更新的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物的技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

光老化是皮肤外在老化最主要的形式，而导致皮肤光老化的主要原因就是紫外线辐射。在衰老机制的研究中发现，细胞自噬能够延缓器官功能退化，清除细胞内受损的蛋白质和脂质，修复DNA，帮助细胞恢复代谢稳态，为光老化受损的皮肤提供保护作用。另外，减少细胞凋亡，降低细胞炎症，增加细胞外基质的合成以及减少其降解，提升细胞的抗氧化能力等都已被证实能够减缓皮肤细胞衰老，寻求多层次多维度的抗衰老物质是目前的研究热点。

皮肤微生物在皮肤免疫的成熟和稳态中发挥着重要作用，大多数生活在皮肤上的微生物在稳态条件下表现为共生或互利共生，最新的研究证明皮肤微生物群调节各种先天因子的表达。皮肤微生物分解磷脂、固醇类、角质蛋白也可使皮肤细胞吸收并促进细胞生长、延缓衰老和减少皱纹产生。

当皮肤因为外部原因的侵害，例如空气污染、化妆品过度使用或使用了含激素的化妆品后，就可能导致皮肤表面菌群失调，从而造成各种肌肤问题。研究表明，皮肤微生态的变化与银屑病、特应性皮炎、痤疮和慢性伤口等多种炎症性和感染性疾病的发生和发展相关。当益生菌减少甚至消失时，皮肤会出现抵抗力降低、易发炎、感染、过敏、长痘、水油失衡等多种问题。因此，提供一种利用皮肤微生物技术开发的益生菌相关产品，具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供了一株枯草芽孢杆菌及其应用。

本发明提供了保藏编号为CCTCC NO:M 20221156的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ProfMIC-219。

本发明的另一目的是提供了上述枯草芽孢杆菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用。

较佳地，所述改善皮肤状况包括抗衰老、美白、促进细胞增殖、修护皮肤屏障、促进老化角质更新中的至少一种。

一些实施方案中，所述抗衰老包括上调细胞外基质合成相关基因SPTSSA的表达、下调降解细胞外基质相关基因的表达、下调细胞凋亡相关基因Casapse-9的表达、下调细胞炎症因子相关基因IL-6的表达及清除DPPH自由基，所述降解细胞外基质相关基因包括P38MAPK和/或MMP家族中的至少一种。

一些实施方案中，所述美白包括下调黑色素合成相关基因MITF和/或TRP-2的表达、下调黑色素分泌相关基因EDN的表达、下调黑色素转运相关基因RAB27A和/或Va的表达、下调黑色素小体成熟相关基因OA1的表达及抑制黑色素细胞增殖。

一些实施方案中，所述促进细胞增殖包括促进成纤维细胞增殖。

一些实施方案中，所述修护皮肤屏障为上调屏障修护相关基因OVOL1的表达。

一些实施方案中，所述促进老化角质更新包括上调降解桥粒蛋白相关基因KLK5和/或KLK7的表达、上调促进角质细胞分化相关基因CD44的表达及下调桥粒蛋白相关基因DSG3的表达。

一些实施方案中，所述产品为食品、药品或化妆品。

一些实施方案中，所述产品中的枯草芽孢杆菌包括如下所示的一种或者两种：

(1)枯草芽孢杆菌的菌群和/或菌剂；

(2)枯草芽孢杆菌的培养物、外泌体、裂解物和/或提取物。

本发明公开的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ProfMIC-219，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221156。实验表明，枯草芽孢杆菌ProfMIC-219具有抗衰老、美白、促进细胞增殖、修护皮肤屏障、促进老化角质更新的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

生物保藏说明

枯草芽孢杆菌ProfMIC-219/Bacillus subtilis ProfMIC-219，于2022年07月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221156。

具体实施方式

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌ProfMIC-219，来源于长白山天池水第一漂景区漂流河道水，经16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈杆状；在BHI平板上生长，可形成乳白色、黄色至褐色圆形或不规则菌落，表面干燥不平整，边缘有波皱；最适生长温度37℃。

枯草芽孢杆菌ProfMIC-219/Bacillus subtilis ProfMIC-219，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏日期：2022年07月25日，保藏编号为CCTCC NO:M 20221156。

进一步，本发明提供的枯草芽孢杆菌ProfMIC-219在本发明所述的应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为裂解物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为上清液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：上清液。

体外细胞实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌ProfMIC-219具有上调HFF细胞外基质相关的丝氨酸棕榈酰转移酶基因SPTSSA，基因相对表达倍数1.20～1.43倍；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP7和MMP8，细胞凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶9基因Caspase-9表达的作用，基因相对表达倍数0.30～0.79。

体外细胞实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌ProfMIC-219具有下调HaCaT细胞降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP1、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因P38MAPK，炎症因子相关基因白介素6基因IL-6表达的作用，基因相对表达倍数0.29～0.85。

体外实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌ProfMIC-219具有抗自由基的功能，清除率80.37％～81.60％。

体外细胞实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌ProfMIC-219具有下调黑色素合成相关基因小眼畸形相关转录因子基因MITF和酪氨酸酶相关蛋白2基因TRP-2、黑色素分泌相关基因内皮素基因EDN、黑色素转运相关基因GTPase家族蛋白基因RAB27A、肌球蛋白基因Va、黑色素小体成熟相关基因黑色素小体膜蛋白基因OA1表达的作用，基因表达量下调0.19～0.80倍。

体外细胞实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌ProfMIC-219具有抑制UVB诱导的A875黑色素细胞增殖，细胞抑制率为10.41～17.43％。

体外细胞实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌ProfMIC-219具有促进人成纤维细胞HFF增殖的作用，增殖率107.82％～112.14％。

体外细胞实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌ProfMIC-219具有上调皮肤屏障修护相关因子Ovo样转录因子1(Ovo Like Transcriptional Repressor 1)OVOL1表达的作用，基因表达量上调1.24～1.27倍。

体外细胞实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌ProfMIC-219具有上调降解桥粒蛋白相关基因激肽释放酶5基因KLK5和/或激肽释放酶7基因KLK7的表达、促进角质细胞分化相关基因跨膜粘附糖蛋白基因CD44表达的作用，基因表达量上调1.12～1.35倍，具有下调桥粒蛋白相关基因桥粒芯蛋白3基因DSG3表达的作用，基因表达量下调0.74～0.77倍。

可以理解地，本发明中所述的产品，由包括本发明中所述的枯草芽孢杆菌的原料制成。

本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1ProfMIC-219的分离

用灭菌采样瓶于长白山天池水第一漂景区漂流河道水中采样，在距水面10-15cm的水层打开瓶塞取样，盖上盖子后再从水中取出，水样采集后立即放在冰水浴中，置于暗箱保存。低温运回实验室后取适当量水样以低速离心去除杂质，取上清划线于BHI固体平板，37℃恒温培养16h后，挑取菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为ProfMIC-219。

革兰氏染色镜检：菌株ProfMIC-219为革兰氏染色阳性，无荚膜，周生鞭毛，显微镜下呈杆状，芽孢位于菌体中央或稍偏两侧；在BHI平板上生长，可形成圆形或不规则菌落，菌落表面干燥不平整，边缘有波皱，不透明，呈乳白色；在BHI液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。

实施例2ProfMIC-219的核酸鉴定

1、16S rDNA基因序列分析

挑取单菌落置BHI液体培养基中，37℃摇床培养过夜后，12000转离心1min收集菌体，按照DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27F,1492R，PCR扩增体系为50μL体系，95℃预变性5min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。

2、结果

PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出ProfMIC-219菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

实施例3ProfMIC-219促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验

1、ProfMIC-219上清液制备

挑取枯草芽孢杆菌ProfMIC-219单菌落于BHI液体培养基，37℃摇床培养16～18h，酶标仪检测并以BHI稀释调整OD₆₀₀＝0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。

2、促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验

接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔，内含5×10⁵细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。加入上清液5％(对照组以等体积BHI替代上清液)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测OVOL1基因的表达。以添加等体积BHI处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

公式：F＝2^-ΔΔCT，其中：

△CT_实验＝CT_实验-CT_{内参(实验)}；

△CT_对照＝CT_对照-CT_{内参(对照)}；

△△CT＝△CT_实验-△CT_对照。

结果如下表：

结果显示，ProfMIC-219具有修护皮肤屏障的作用。

实施例4ProfMIC-219促进人成纤维细胞HFF的增殖

1、ProfMIC-219上清液制备

制备方法参照实施例3；

2、HFF细胞制备及ProfMIC-219添加

接种以DMEM培养的HFF细胞，以100ul/孔(每孔含3×10⁴细胞)转接至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制200μM H₂O₂，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养1h。弃掉原培养基，BHI清洗两次，加入100μl新培养基，各孔分别添加上清液5％(V/V)，(对照组以等体积BHI替代上清液)，培养24h。向每孔加入10μl的CCK-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度A。

计算公式及结果如下表：

结果显示ProfMIC-219具有促进HFF细胞增殖的作用。

实施例5ProfMIC-219调节光老化HaCaT降解细胞外基质/炎症因子相关基因表达实验

1、ProfMIC-219上清液制备

制备方法参照实施例3。

2、HaCaT细胞制备及紫外线损伤

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm²的紫外线UVB照射损伤。

3、ProfMIC-219添加

将上清液5％(V/V)加入刺激过的HaCaT细胞(对照组以等体积BHI替代上清液)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测降解细胞外基质/炎症因子相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测降解细胞外基质相关基因MMP1和P38MAPK，以及炎症因子相关基因IL-6的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

上清液下调降解细胞外基质相关基因MMP1、P38MAPK，炎症因子相关基因IL-6。结果见下表：

结果显示，加入ProfMIC-219上清液具有减少HaCaT细胞外基质降解、减少炎症因子的抗衰老作用。

实施例6ProfMIC-219调节氧化损伤HFF细胞外基质/细胞凋亡/降解细胞外基质相关基因表达实验

1、ProfMIC-219上清液制备

制备方法参照实施例3。

2、HFF细胞制备及H₂O₂诱导氧化损伤

将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H₂O₂进行刺激，37℃静置1h。

3、ProfMIC-219添加

将上清液5％(V/V)加入刺激过的HFF细胞(对照组以等体积BHI替代上清液)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/细胞凋亡/降解细胞外基质相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因SPTSSA，抑降解细胞外基质相关基因MMP7和MMP8，细胞凋亡相关基因Caspase-9的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

上清液上调细胞外基质相关基因SPTSSA，下调降解细胞外基质相关基因MMP7和MMP8，细胞凋亡相关基因Caspase-9，结果见下表：

结果显示加入ProfMIC-219具有促进HFF细胞外基质合成、减少细胞外基质降解，减少细胞凋亡的抗衰老作用。

实施例7ProfMIC-219DPPH自由基清除能力实验

1、ProfMIC-219上清液制备

制备方法参照实施例3。

2、DPPH自由基清除能力检测

试剂配制和检测方法按照索莱宝DPPH自由基清除能力检测试剂盒说明书进行。在96孔板中，首先测定组和对照组分别加入10μl上清液(空白组用等体积BHI液体培养基替代上清液)，测定组和空白组加入190μl DPPH工作液，对照组加入190μl无水乙醇，漩涡混匀后，室温避光静置30min，测定各样品515nm吸亮度，求平均值并计算各样品自由基清除率。

计算公式及结果如下表：

结果显示ProfMIC-219上清液具有良好的清除DPPH自由基的抗衰老作用。

实施例8ProfMIC-219抑制人黑色素瘤细胞A875的增殖

1、ProfMIC-219上清液制备

制备方法参照实施例3；

2、A875细胞制备及紫外线损伤

将A875细胞消化后以0.1ml/孔(内含1.5×10⁴细胞)接种至96孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为1J/cm2的紫外线UVB照射损伤。

3、ProfMIC-219的添加

各孔分别添加上清液5％(V/V)(对照组以等体积BHI替代灭活菌体)，每组3平行，37℃培养过夜。向每孔加入10μl的CCK-8溶液，培养3h，检测450nm处吸亮度A。

计算公式及结果如下表：

结果显示，ProfMIC-219可抑制UVB诱导的黑色素细胞增殖，即起到美白的作用。

实施例9ProfMIC-219调节A875人黑色素瘤黑色素合成/黑色素分泌/黑色素转运/黑色素小体成熟相关基因的表达实验

1、ProfMIC-219上清液制备

制备方法参照实施例3。

2、A875人黑色素瘤细胞制备及紫外线损伤

将A875人黑色素瘤细胞消化后以0.5mL/孔(内含8.5×10⁴细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为1J/cm²的紫外线UVB照射损伤。

3、ProfMIC-219添加

将上清液5％(V/V)加入刺激过的A875人黑色素瘤细胞，对照组分别以等体积BHI替代上清液，每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测黑色素合成/黑色素分泌/黑色素转运/黑色素小体成熟相关基因的相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测黑色素合成相关基因MITF、TRP-2、黑色素分泌相关基因EDN、黑色素转运相关基因RAB27A、Va、黑色素小体成熟相关基因OA1的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

上清液下调黑色素合成相关基因MITF、TRP-2；黑色素分泌相关基因EDN；黑色素转运相关基因RAB27A、Va；黑色素小体成熟相关基因OA1的表达，结果见下表：

结果显示，本发明的枯草芽孢杆菌ProfMIC-219具有下调黑色素合成、黑色素分泌、黑色素转运、黑色素小体成熟相关基因表达的美白的作用。

实施例10ProfMIC-219调节HaCaT促进老化角质更新相关基因表达实验

1、ProfMIC-219上清液制备：

制备方法参照实施例3。

2、HaCaT细胞制备及紫外线光老化

将HaCaT细胞消化后以0.5mL/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm²的紫外线UVB光老化。

3、ProfMIC-219添加

将上清液5％(V/V)加入刺激过的HaCaT(对照组以等体积BHI替代上清液)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测促进老化角质更新相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测降解桥粒蛋白相关基因KLK5和KLK7，促进更新角质细胞相关基因CD44，桥粒蛋白相关基因DSG3基因的表达。以等体积BHI处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

上清液上调降解桥粒蛋白相关基因KLK5、KLK7、促进角质细胞分化相关基因CD44，下调桥粒蛋白相关基因DSG3的表达，结果见下表：

结果显示ProfMIC-219具有上调降解桥粒蛋白相关基因、促进角质细胞分化相关基因及下调桥粒蛋白相关基因表达的作用。因此ProfMIC-219具有促进老化角质更新的作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，该菌株为枯草芽孢杆菌ProfMIC-219，已于2022年07月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221156。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述改善皮肤状况包括抗衰老、美白、促进细胞增殖、修护皮肤屏障、促进老化角质更新中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老包括上调细胞外基质合成相关基因SPTSSA的表达、下调降解细胞外基质相关基因的表达、下调细胞凋亡相关基因Casapse-9的表达、下调细胞炎症因子相关基因IL-6的表达及清除DPPH自由基，所述降解细胞外基质相关基因包括P38MAPK和/或MMP家族中的至少一种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述美白包括下调黑色素合成相关基因MITF和/或TRP-2的表达、下调黑色素分泌相关基因EDN的表达、下调黑色素转运相关基因RAB27A和/或Va的表达、下调黑色素小体成熟相关基因OA1的表达及抑制黑色素细胞增殖。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述促进细胞增殖包括促进成纤维细胞增殖。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述修护皮肤屏障包括上调屏障修护相关基因OVOL1的表达。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述促进老化角质更新包括上调降解桥粒蛋白相关基因KLK5和/或KLK7的表达、上调促进角质细胞分化相关基因CD44的表达及下调桥粒蛋白相关基因DSG3的表达。

9.根据权利要求2～8任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、药品或化妆品。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品中的枯草芽孢杆菌包括如下所示的一种或者两种：

(1)枯草芽孢杆菌的菌群和/或菌剂；

(2)枯草芽孢杆菌的培养物、外泌体、裂解物和/或提取物。