CN116694504A - 一株地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株地衣芽孢杆菌及其应用，涉及微生物技术领域。本发明公开的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为地衣芽孢杆菌ProfMIC‑220，已于2022年07月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221154。实验表明，ProfMIC‑220具有修护皮肤屏障、促进细胞增殖、提高细胞抗菌能力、抑制皮肤病原菌、保湿、抗衰老的功能，可用于制备药品、化妆品等。

Description

一株地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物的技术领域，具体涉及一株地衣芽孢杆菌及其应用。
背景技术
皮肤屏障是由角质层的表皮形成细胞和角质间的脂质形成的结构性的屏障。角质间结构性脂质神经酰胺，在基底层向角质分化过程中含量逐渐增加，到达角质层排至细胞间隙，构成防止水分丢失的屏障。角质层本身的亲水、屏障功能，以及角质层中所含有的天然保湿因子即氨基酸类、乳酸盐及糖类等作用，使得角质层具有保湿功能。但随着年龄的增长，角质层的含水量会逐渐减少，进而引起皮肤的各种问题；光老化是皮肤外在老化最主要的形式，而导致皮肤光老化的主要原因就是紫外线辐射。皮肤在老化的过程中，细胞增殖降低，细胞凋亡增加，细胞外基质成分(胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖等)随着皮肤衰老而显着减少。此外，多种因素如线粒体损伤、炎症反应等产生的活性氧增加，使得氧化应激增加，老化受损细胞无法及时清除，从而导致了皮肤衰老。
在衰老机制的研究中发现，细胞自噬能够延缓器官功能退化，可以通过清除UV辐照细胞内受损的蛋白质和脂质，修复DNA，帮助细胞恢复代谢稳态，为光老化受损的皮肤提供保护作用。另外，减少细胞凋亡，降低细胞炎症，增加细胞外基质的合成以及减少其降解，提升细胞的抗氧化能力等都已被证实能够减缓皮肤细胞衰老。如果能够同时针对不同皮肤老化途径起到抑制作用并且提升皮肤细胞状态就能最大程度抵御衰老进程，寻求多层次多维度的抗衰老物质是目前的研究热点。
皮肤上共生微生物的存在会导致其对皮肤上营养和空间的竞争，从而极大地影响病原微生物进入皮肤表面。这些常驻微生物可以直接或通过调控皮肤的角质形成细胞而间接分泌抗菌肽，以抵御外界病原菌定殖；还可分解角质细胞碎屑或脂质，辅助乳化皮脂膜，维持表皮酸性环境，以抵御外界病原菌定殖。皮肤微生物群落的生态失衡与多种炎症和自身免疫性疾病有关。有研究表明，银屑病患者皮肤上的微生物群落与健康皮肤上的有很大不同，银屑病皮肤微生物组的多样性增加，但稳定性降低。群落稳定性的丧失及表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌等免疫调节细菌的减少，可能导致金黄色葡萄球菌等病原体的定殖增多，加剧皮肤炎症。
皮肤常驻微生物与宿主之间不仅存在共生关系，还能激发宿主适当的保护性免疫反应，使宿主更强有力地对抗病原体的感染。在成年小鼠皮肤中，微生物的定殖可调控局部炎症环境和免疫细胞的功能。皮肤微生物分解磷脂、固醇类、角质蛋白也可使皮肤细胞吸收并促进细胞生长、延缓衰老和减少皱纹产生。因此，提供一种利用微生态技术开发的益生菌相关产品，具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供了一株地衣芽孢杆菌及其应用。
本发明提供了保藏编号为CCTCC NO:M 20221154的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ProfMIC-220。
本发明的另一目的是提供了上述地衣芽孢杆菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用。
较佳地，所述改善皮肤状况包括促进细胞增殖、修护皮肤屏障、提高细胞抗菌能力、抑制皮肤病原菌、保湿、抗衰老中的至少一种。
一些实施方案中，所述修复皮肤屏障包括上调屏障修护相关基因IVL和/或OVOL1的表达。
一些实施方案中，所述促进细胞增殖包括促进皮肤成纤维细胞增殖，所述促进皮肤成纤维细胞增殖的增值率为110.59％～114.45％。
一些实施方案中，所述提高细胞抗菌能力包括上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、DEFB4的表达。
一些实施方案中，所述抑制皮肤病原菌为抑制金黄色葡萄球菌金黄亚种生长，所述金黄色葡萄球菌金黄亚种生长的抑制率为26.39％～29.87％。
一些实施方案中，所述保湿包括上调保湿相关基因AQP3和/或GBA的表达。
一些实施方案中，所述抗衰老包括上调增益组相关基因的表达、下调减益组相关基因的表达及清除DPPH自由基，所述增益组相关基因包括细胞外基质相关基因、细胞抗氧化相关基因、免疫调节因子相关基因，所述减益组相关基因包括降解细胞外基质相关基因及细胞炎症因子相关基因。
一些实施方案中，所述产品为药品或化妆品。
本发明公开的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ProfMIC-220，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221154。实验表明，地衣芽孢杆菌ProfMIC-220具有促进细胞增殖、修护皮肤屏障、提高细胞抗菌能力、抑制皮肤病原菌、保湿、抗衰老的功能，可用于制备药品、化妆品等。
生物保藏说明
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ProfMIC-220，于2022年07月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221154。
具体实施方式
本发明提供了一株地衣芽孢杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种地衣芽孢杆菌ProfMIC-220，来源于长白山天池水第一漂景区漂流河道水，经16S rDNA鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈长杆状；在BHI平板上生长，可形成表面光滑半透明的圆形菌落，白色或淡黄色，边缘整齐；在BHI液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ProfMIC-220，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏日期：2022年07月25日，保藏编号为CCTCC NO:M 20221154。
进一步，本发明提供的地衣芽孢杆菌ProfMIC-220在本发明所述的应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为裂解物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为上清液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：上清液。
体外细胞实验表明，本发明的地衣芽孢杆菌ProfMIC-220具有上调皮肤屏障修护相关因子外皮蛋白(Involucrin)IVL、OvO样转录因子1(OvO Like TranscriptionalRepressor 1)OVOL1表达的作用，基因表达量上调2.34～6.35倍。
体外细胞实验表明，本发明的地衣芽孢杆菌ProfMIC-220具有促进人成纤维细胞HFF增殖的作用，增殖率110.59％～114.45％。
体外细胞实验表明，本发明的地衣芽孢杆菌ProfMIC-220具有上调抗菌肽相关基因S100A7、钙粒蛋白A基因S100A8、β防御素4基因DEFB4表达的作用，基因相对表达倍数3.71～14.99。
体外实验表明，本发明的地衣芽孢杆菌ProfMIC-220具有抑制金黄色葡萄球菌金黄亚种生长的作用，其抑制率为26.39％～29.87％。
体外细胞实验表明，本发明的地衣芽孢杆菌ProfMIC-220具有上调保湿因子水通道蛋白3(Aquaporin 3)AQP3和葡萄糖脑苷脂酶基因GBA表达的作用，基因表达量上调1.31～2.47倍。
体外细胞实验表明，本发明的地衣芽孢杆菌ProfMIC-220具有抗DPPH自由基的功能，清除率86.14％～87.94％。
体外细胞实验表明，本发明的地衣芽孢杆菌ProfMIC-220具有上调HaCaT细胞外基质相关的组织金属蛋白酶抑制物1基因TIMP1基因表达的作用，基因相对表达倍数1.95～2.20；具有下调降解炎症因子基因IL-6表达的作用，基因相对表达倍数0.52～0.66。
体外细胞实验表明，本发明的地衣芽孢杆菌ProfMIC-220具有上调HFF细胞外基质相关的层粘连蛋白LN、XIII型胶原α1链基因COL13A1、丝氨酸棕榈酰转移酶基因SPTSSA，免疫调节因子相关的β-内啡肽受体基因MOR，以及抗氧化相关的Sirtuins蛋白家族基因SIRT-3表达的作用，基因相对表达倍数1.17～3.56倍；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP表达的作用，基因相对表达倍数0.51～0.75。
可以理解地，本发明中所述的产品，由包括本发明中所述的地衣芽孢杆菌的原料制成。
进一步地，所述产品中的地衣芽孢杆菌包括如下所示的一种或者两种：
(1)地衣芽孢杆菌的菌群和/或菌剂；
(2)地衣芽孢杆菌的培养物、外泌体、裂解物和/或提取物。
本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1ProfMIC-220的分离
用灭菌采样瓶于长白山天池水第一漂景区漂流河道水中采样，在距水面10-15cm的水层打开瓶塞取样，盖上盖子后再从水中取出，水样采集后立即放在冰水浴中，置于暗箱保存。随同冰包保持较低温度运回实验室后取适当量水样以6000r/min转速离心3min去除杂质，取上清划线于BHI固体平板，37℃恒温培养16h后，挑取菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为ProfMIC-220。
革兰氏染色镜检：菌株ProfMIC-220为革兰氏染色阳性，显微镜下呈长杆状，芽孢位于菌体中央或稍偏两侧；在BHI平板上生长，可形成圆形或不规则菌落，菌落呈粘稠蜡油状，边缘光滑，半透明，呈淡黄色；在BHI液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
实施例2ProfMIC-220的核酸鉴定
1、16S rDNA基因序列分析
挑取单菌落置BHI液体培养基中，37℃摇床培养过夜后，12000转离心1min收集菌体，按照DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27F,1492R，PCR扩增体系为50μL体系，95℃预变性5min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。
2、结果
PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出ProfMIC-220菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
实施例3ProfMIC-220促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验
1、ProfMIC-220第一上清液制备
挑取地衣芽孢杆菌ProfMIC-220单菌落于BHI液体培养基，37℃摇床培养16～18h，酶标仪检测并以BHI液体培养基稀释调整OD600＝0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为第一上清液。
2、促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验
接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔，内含5×105细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。加入第一上清液5％(V/V)(对照组以等体积BHI液体培养基替代第一上清液)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测IVL和OVOL1基因的表达。以添加等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
公式：F＝2-ΔΔCT，其中：
△CT实验＝CT实验-CT内参(实验)；
△CT对照＝CT对照-CT内参(对照)；
△△CT＝△CT实验-△CT对照。
结果如下表：
结果显示，ProfMIC-220具有修护皮肤屏障的作用。
实施例4ProfMIC-220促进人成纤维细胞HFF的增殖
1、ProfMIC-220第一上清液制备
制备方法参照实施例3；
2、HFF细胞制备及ProfMIC-220添加
接种以DMEM培养的HFF细胞，以100ul/孔(每孔含3×104细胞)转接至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制200μM H2O2，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养1h。弃掉原培养基，PBS清洗两次，加入100μl新培养基，各孔分别添加第一上清液5％(V/V)(对照组以等体积BHI液体培养基替代第一上清液)，培养24h。向每孔加入10μl的CCK-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度A。
计算公式及结果如下表：
结果显示ProfMIC-220具有促进HFF细胞增殖的作用。
实施例5ProfMIC-220上调HaCaT抗菌肽相关基因表达实验
1、ProfMIC-220第一上清液制备
制备方法参照实施例3；
2、HaCaT细胞制备
将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
3、ProfMIC-220添加及LPS刺激
将第一上清液5％(V/V)加入培养过夜的HaCaT细胞中(对照组以等体积BHI液体培养基替代第一上清液)，2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的LPS溶液，诱导细胞发炎，5％二氧化碳培养箱37℃培养20h。
4、qPCR法检测抗菌肽相关基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测S100A7、S100A8、DEFB4基因的表达。以等体积BHI液体培养基处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
结果见下表：
结果显示，ProfMIC-220第一上清液具有促进抗菌肽基因表达的作用。
实施例6ProfMIC-220抑制金黄色葡萄球菌的作用
1、ProfMIC-220第二上清液制备
挑取地衣芽孢杆菌ProfMIC-220单菌落于BHI液体培养基，37℃培养16～18h，酶标仪检测，并以BHI液体培养基稀释调整OD600＝2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为第二上清液。
2、金黄色葡萄球菌金黄亚种菌液制备
将金黄色葡萄球菌金黄亚种(Staphylococcus aureus subsp.aureus)CGMCC1.8721挑取单菌落于BHI液体培养基，37℃培养箱静置培养过夜，检测并以BHI液体培养基稀释调整OD600＝0.2。
3、抑制金黄色葡萄球菌实验
将灭活上清液以添加量10％加入病原菌菌液中，以添加等体积BHI液体培养基为对照，37℃培养2h，检测菌液浓度(OD600)并计算病原菌抑制率。
计算公式及结果如下表：
实验表明，本发明的地衣芽孢杆菌ProfMIC-220具有抑制金黄色葡萄球菌生长的作用，抑制率26.39％～29.87％。
实施例7ProfMIC-220上调HaCaT保湿相关基因表达实验
1、ProfMIC-220第一上清液制备
制备方法参照实施例3。
2、上调HaCaT保湿相关基因表达实验
接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔，内含5×105细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。加入第一上清液5％(V/V)(对照组以等体积BHI液体培养基替代)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测AQP3和GBA基因的表达。以等体积BHI液体培养基处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
结果见下表：
结果显示ProfMIC-220具有促进皮肤保湿的作用。
实施例8ProfMIC-220DPPH自由基清除能力实验
1、ProfMIC-220第一上清液制备
制备方法参照实施例3。
2、DPPH自由基清除能力检测
试剂配制和检测方法按照索莱宝DPPH自由基清除能力检测试剂盒说明书进行。在96孔板中，首先测定组和对照组分别加入10μl第一上清液(空白组用等体积BHI液体培养基替代第一上清液)，测定组和空白组加入190μl DPPH工作液，对照组加入190μl无水乙醇，漩涡混匀后，室温避光静置30min，测定各样品515nm吸亮度，求平均值并计算各样品自由基清除率。
计算公式及结果如下表：
结果显示ProfMIC-220具有良好的DPPH自由基清除率。
实施例9ProfMIC-220调节氧化损伤HFF细胞外基质/抗氧化/免疫调节因子相关基因表达实验
1、ProfMIC-220第一上清液制备
制备方法参照实施例3。
2、HFF细胞制备及H2O2诱导氧化损伤
将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H2O2进行刺激，37℃静置1h。
3、ProfMIC-220添加
将第一上清液5％(V/V)加入刺激过的HFF细胞(对照组以等体积BHI液体培养基替代第一上清液)。每组3平行，37℃培养过夜。
4、qPCR法检测细胞外基质/抗氧化/免疫调节因子/降解细胞外基质相关基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因LN、SPTSSA、COL13A1，抗氧化相关基因SIRT-3，免疫调节因子MOR；以及降解细胞外基质相关基因MMP家族的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
上清液上调细胞外基质相关基因LN、SPTSSA、COL13A1，抗氧化相关基因SIRT-3，免疫调节因子MOR；下调降解细胞外基质相关基因MMP家族，结果见下表：
结果显示加入ProfMIC-220具有促进HFF细胞外基质合成、增加抗氧化及免疫调节因子、减少炎症因子的抗衰老作用。
实施例10ProfMIC-220调节光老化HaCaT细胞外基质/炎症因子相关基因表达实验
1、ProfMIC-220第一上清液制备
制备方法参照实施例3；
2、HaCaT细胞制备及紫外线损伤
将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm2的紫外线UVB照射损伤。
3、ProfMIC-220的添加
将第一上清液5％(V/V)加入刺激过的HaCaT细胞(对照组以等体积BHI液体培养基替代第一上清液)。每组3平行，37℃培养过夜。
4、qPCR法检测细胞外基质/炎症因子相关基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因TIMP1，以及炎症因子相关基因IL-6的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
公式：F＝2-ΔΔCT，其中：
△CT实验＝CT实验-CT内参(实验)；
△CT对照＝CT对照-CT内参(对照)；
△△CT＝△CT实验-△CT对照。
第一上清液上调细胞外基质相关基因TIMP1,下调炎症因子IL-6的表达。结果见下表：
结果显示加入ProfMIC-220具有促进HaCaT细胞外基质合成、抑制炎症因子的抗衰老作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，该菌株为地衣芽孢杆菌ProfMIC-220，已于2022年07月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M20221154。
2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述改善皮肤状况包括修护皮肤屏障、促进细胞增殖、提高细胞抗菌能力、抑制皮肤病原菌、保湿、抗衰老中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述修复皮肤屏障包括上调屏障修护相关基因IVL和/或OVOL1的表达。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述促进细胞增殖包括促进皮肤成纤维细胞增殖，所述促进皮肤成纤维细胞增殖的增值率为110.59％～114.45％。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提高细胞抗菌能力包括上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、DEFB4的表达。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制皮肤病原菌为抑制金黄色葡萄球菌金黄亚种生长，所述金黄色葡萄球菌金黄亚种生长的抑制率为26.39％～29.87％。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述保湿包括上调保湿相关基因AQP3和/或GBA的表达。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老包括上调增益组相关基因的表达、下调减益组相关基因的表达及清除DPPH自由基，所述增益组相关基因包括细胞外基质相关基因、细胞抗氧化相关基因、免疫调节因子相关基因，所述减益组相关基因包括降解细胞外基质相关基因及细胞炎症因子相关基因。
10.根据权利要求2～9任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为药品或化妆品。
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