CN115651875A - 一株表皮葡萄球菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株表皮葡萄球菌及其应用，涉及微生物技术领域。本发明公开的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)为表皮葡萄球菌LABOFMIC‑316，已于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221399。实验表明，LABOFMIC‑316具有提高皮肤抗菌能力、促进细胞增殖、抗衰老的功能，可用于制备药品、化妆品等。

Description

一株表皮葡萄球菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物的技术领域，具体涉及一株表皮葡萄球菌及其应用。

背景技术

皮肤老化是机体老化的一部分，是衰老过程中表现最为直观的器官。目前将皮肤老化分为自然老化和外源性老化。后者是指在外界因素(如紫外线)长期作用下导致的衰老，又称之为光老化。光老化导致炎症发生，同时细胞增殖降低，细胞凋亡增加，细胞外基质成分随着皮肤衰老而显着减少。此外，多种因素如线粒体损伤、炎症反应等产生的活性氧增加，细胞修复能力下降，氧化应激增加，老化受损细胞无法及时清除，从而导致了皮肤衰老。

人体皮肤通过多种机制主动或被动地保护宿主皮肤，自我保护其中一个重要机制就是分泌抗菌肽。抗菌肽常见的作用方式是通过其自身带有的正电荷与细菌细胞膜上带负电荷的成分(如脂多糖)相作用，从而增加细菌细胞膜的通透性，裂解细菌，造成细菌的死亡。皮肤共生菌可通过调节抗菌肽的生成，从而调控皮肤受损后的炎症反应及参与局部免疫防御。皮肤正常共生菌还可以通过直接分泌或诱导机体自身生成抗菌肽，抑制病原微生物的繁殖。

皮肤固有免疫系统联合皮肤微生物群是人体抵御致病微生物和机会致病菌的屏障。皮肤具有自我更新能力，皮肤微生物分解磷脂、固醇类、角质蛋白也可使皮肤细胞吸收并促进细胞生长、延缓衰老和减少皱纹产生。因此，提供一种利用微生物技术开发的皮肤微生态相关产品，在改善皮肤状态方面具有广大的应用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供了一株表皮葡萄球菌及其应用。

本发明提供了表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，该菌株为表皮葡萄球菌LABOFMIC-316，已于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为CCTCC NO:M20221399。

本发明的另一目的是提供了上述表皮葡萄球菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用。

一些实施方案中，所述改善皮肤状况包括提高皮肤抗菌能力、促进细胞增殖、抗衰老中的至少一种。

一些实施方案中，所述提高皮肤抗菌能力包括上调抗菌肽相关基因的表达，所述抗菌肽相关基因包括S100A8和/或DEFβ4。

一些实施方案中，所述促进细胞增殖包括提高皮肤角质细胞存活和/或促进成纤维细胞增殖。

一些实施方案中，所述抗衰老为上调增益组相关基因的表达及下调减损组相关基因的表达，所述增益组相关基因包括细胞外基质相关基因、抑制细胞凋亡相关基因及细胞抗氧化相关基因，所述减损组相关基因包括讲解细胞外基质相关基因、细胞凋亡相关基因及细胞炎症因子相关基因。

一些实施方案中，所述细胞外基质相关基因包括SPTSSA、SMAD3中的至少一种，所述降解细胞外基质相关基因包括P38MAPK和/或MMP家族中的至少一种，所述细胞凋亡相关基因包括BAX和/或Caspase家族中的至少一种。

一些实施方案中，所述表皮葡萄球菌采用如下分离方法制得：

采样于24岁健康女性面部皮肤，将采样样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于BHI固体平板，37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-316。

一些实施方案中，所述产品为药品或化妆品。

一些实施方案中，所述产品中的表皮葡萄球菌包括如下所示的一种或者两种：

(1)所述表皮葡萄球菌的菌群和/或菌剂；

(2)所述表皮葡萄球菌的培养物、外泌体、裂解物和/或提取物。

本发明公开的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)LABOFMIC-316，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221399。实验表明，因此，表皮葡萄球菌LABOFMIC-316具有提高皮肤抗菌能力、促进细胞增殖、抗衰老的功能，可用于制备药品、化妆品等。

生物保藏说明

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)LABOFMIC-316，于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221399。

具体实施方式

本发明提供了一株表皮葡萄球菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种表皮葡萄球菌LABOFMIC-316，来源于24岁健康女性面部皮肤，经16S rDNA鉴定为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈杆状；在BHI平板上生长，可形成表面光滑不透明的圆形菌落，白色，边缘整齐；在BHI液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度37℃。

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)LABOFMIC-316，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏日期：2022年9月9日，保藏编号为CCTCC NO:M 20221399。

进一步地，本发明提供的表皮葡萄球菌LABOFMIC-316在本发明所述的应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，其存在形式还可为裂解物和/或提取物的形式，亦或是细菌产物、上清液或衍生物的形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，进一步地选自：上清液、灭活菌体。

体外细胞实验表明，本发明的LABOFMIC-316具有上调抗菌肽相关基因钙粒蛋白A基因S100A8和β防御素4基因DEFβ4表达的作用，基因相对表达倍数1.33～7.49。

体外细胞实验表明，本发明的副干酪乳杆菌LABOFMIC-316具有促进表皮细胞HaCaT修复的作用，LABOFMIC-316提升SDS损伤的HaCaT细胞存活，提升存活率14.06％～18.27％。

体外细胞实验表明，本发明的表皮葡萄球菌LABOFMIC-316具有促进人成纤维细胞HFF增殖的作用，增殖率119.77％～128.33％。

体外细胞实验表明，本发明的表皮葡萄球菌LABOFMIC-316具有上调HaCaT细胞外基质相关的丝氨酸棕榈酰转移酶基因SPTSSA、信号转导蛋白基因SMAD3，抗氧化相关的核因子E2相关因子2基因NRF-2表达的作用，基因相对表达倍数1.21～2.33；具有下调降解细胞外基质相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白酶激酶基因P38MAPK和基质金属蛋白酶家族基因MMP1，以及细胞炎症因子相关的肿瘤坏死因子α基因TNF-α和白介素6基因IL-6，基因相对表达倍数0.38～0.81。

体外细胞实验表明，本发明的表皮葡萄球菌LABOFMIC-316具有上调抑制细胞凋亡相关的B淋巴细胞瘤-2基因BCL-2表达的作用，基因相对表达倍数2.38～2.51；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP3、MMP8，细胞凋亡相关的BCL2-Associated X蛋白基因BAX和半胱氨酸蛋白酶家族基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9，以及细胞炎症因子相关的白介素6基因IL-6，基因相对表达倍数0.17～0.80。

本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1LABOFMIC-316的分离

于24岁健康女性面部皮肤采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于BHI固体平板，37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-316。

革兰氏染色镜检：菌株LABOFMIC-316为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在BHI平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在BHI液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。

实施例2LABOFMIC-316的核酸鉴定

1、16S rDNA基因序列分析

挑取单菌落置BHI液体培养基中，37℃培养过夜后，12000转离心1min收集菌体，按照DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27F,1492R，PCR扩增体系为50μL体系，95℃预变性5min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。

2、结果

PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出LABOFMIC-316菌株为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。

实施例3LABOFMIC-316促进SDS诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT损伤修复实验

1、LABOFMIC-316灭活菌体制备

挑取表皮葡萄球菌LABOFMIC-316单菌落于BHI液体培养基，37℃培养箱静置培养16～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD₆₀₀＝0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，移除上清液后其离心沉淀菌体以PBS清洗两次后以适量PBS重悬，稀释调整OD₆₀₀＝0.2，为灭活菌体。

2、促进HaCaT细胞修复实验

接种HaCaT细胞(5×10⁴cells/孔)至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制50μg/mlSDS，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养8h。各孔分别添加10％灭活菌体(对照组分别以等体积PBS替代灭活菌体)培养24h。向每孔加入10μl的CCK-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度A。

细胞存活率计算公式及结果见下表：

上表结果可知，LABOFMIC-316灭活菌体对HaCaT细胞SDS损伤具有修复作用，提升的存活率为14.06～18.27％。

实施例4LABOFMIC-316调节光老化HaCaT细胞外基质/抗氧化/炎症因子相关基因表达实验

1、LABOFMIC-316上清液和灭活菌体制备

挑取表皮葡萄球菌LABOFMIC-316单菌落于BHI液体培养基，37℃培养箱静置培养16～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD₆₀₀＝0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。离心沉淀菌体以PBS清洗两次后以适量PBS重悬，稀释调整OD₆₀₀＝0.2，为灭活菌体。

2、促进HaCaT细胞制备及紫外线损伤

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm²的紫外线UVB照射损伤。

3、LABOFMIC-316添加

将上清液5％(V/V)、灭活菌体10％(V/V)分别加入刺激过的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/抗氧化/细胞自噬相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因SPTSSA和SMAD3，抗氧化相关基因NRF-2，以及降解细胞外基质相关基因MMP1和P38MAPK，炎症因子相关基因TNF-α和IL-6的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

公式：F＝2^-ΔΔCT，其中：

△CT_实验＝CT_实验-CT_{内参(实验)}；

△CT_对照＝CT_对照-CT_{内参(对照)}；

△△CT＝△CT_实验-△CT_对照。

上清液下调降解细胞外基质相关基因MMP1和P38MAPK，炎症因子相关基因TNF-α和IL-6。结果见下表：

灭活菌体上调细胞外基质基因SPTSSA和SMAD3，抗氧化相关基因NRF-2。结果见下表：

结果显示加入LABOFMIC-316具有促进HaCaT细胞外基质合成、增加抗氧化、减少细胞外基质降解和炎症因子的抗衰老作用。

实施例5LABOFMIC-316促进人成纤维细胞HFF的增殖

1、LABOFMIC-316上清液及灭活菌体制备

制备方法参照实施例4。

2、HFF细胞制备及LABOFMIC-316添加

接种以DMEM培养的HFF细胞，以100ul/孔(每孔含3×10⁴细胞)转接至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制200μM H₂O₂，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养1h。弃掉原培养基，PBS清洗两次，加入100μl新培养基，各孔分别添加上清液5％(V/V)、灭活菌体10％(V/V)，(对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体)。培养24h。向每孔加入10μl的CCK-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度A，其计算公式及结果如下表：

结果显示添加LABOFMIC-316具有促进HFF细胞增殖的作用。

实施例6LABOFMIC-316调节氧化损伤HFF细胞外基质/细胞凋亡/炎症因子相关基因表达实验

1、LABOFMIC-316上清液及灭活菌体制备

制备方法参照实施例4。

2、HFF细胞制备及H₂O₂诱导氧化损伤

将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H₂O₂进行刺激，37℃静置1h。

3、LABOFMIC-316添加

将上清液5％(V/V)、灭活菌体10％(V/V)分别加入刺激过的HFF细胞(对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/细胞凋亡/炎症因子相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测抑制细胞凋亡相关基因BCL-2，以及降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因BAX和Caspase家族，炎症因子相关基因IL-6的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

上清液下调降解细胞外基质相关基因MMP-8，细胞凋亡相关基因BAX和Caspase家族，炎症因子相关基因IL-6。结果见下表：

灭活菌体上调抑制细胞凋亡相关基因BCL-2；下调降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因Caspase家族。结果见下表：

结果显示加入LABOFMIC-316具有减少HFF细胞凋亡、细胞外基质降解和炎症因子的抗衰老作用。

实施例7LABOFMIC-316上调HaCaT抗菌肽相关基因表达实验

1、LABOFMIC-316灭活菌体制备

制备方法参照实施例3。

2、HaCaT细胞制备

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。

3、LABOFMIC-316添加及LPS刺激

将灭活菌体10％(V/V)分别加入培养过夜的HaCaT细胞中(对照组分别以等体积PBS替代灭活菌体)，2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的LPS溶液，诱导细胞发炎，5％二氧化碳培养箱37℃培养20h。

4、qPCR法检测抗菌肽相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测S100A8和DEFβ4基因的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

结果见下表：

结果显示LABOFMIC-316灭活菌体具有提高细胞抗菌能力的作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，该菌株为表皮葡萄球菌LABOFMIC-316，已于2022年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO:M 20221399。

2.权利要求1所述的表皮葡萄球菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述改善皮肤状况包括提高皮肤抗菌能力、促进细胞增殖、抗衰老中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提高皮肤抗菌能力包括上调抗菌肽相关基因的表达，所述抗菌肽相关基因包括S100A8和/或DEFβ4。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述促进细胞增殖包括提高皮肤角质细胞存活和/或促进成纤维细胞增殖。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为上调增益组相关基因的表达及下调减损组相关基因的表达，所述增益组相关基因包括细胞外基质相关基因、抑制细胞凋亡相关基因及细胞抗氧化相关基因，所述减损组相关基因包括降解细胞外基质相关基因、细胞凋亡相关基因及细胞炎症因子相关基因。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞外基质相关基因包括SPTSSA、SMAD3中的至少一种，所述降解细胞外基质相关基因包括P38MAPK和/或MMP家族中的至少一种，所述细胞凋亡相关基因包括BAX和/或Caspase家族中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的表皮葡萄球菌，其特征在于，采用如下分离方法制得：

采样于24岁健康女性面部皮肤，将采样样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于BHI固体平板，37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-316。

9.根据权利要求2～7任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为药品或化妆品。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品中的表皮葡萄球菌包括如下所示的一种或者两种：

(1)所述表皮葡萄球菌的菌群和/或菌剂；

(2)所述表皮葡萄球菌的培养物、外泌体、裂解物和/或提取物。