CN115820485A - 一株瑞士乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株瑞士乳杆菌及其应用,涉及微生物技术领域。本发明公开的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)为瑞士乳杆菌ProfMIC‑226,已于2022年8月3日保藏在中国典型培养物保藏中心,其保藏编号为CCTCC NO:M20221224。实验表明,ProfMIC‑226具有抗衰老、促进细胞增殖、保湿、修护皮肤屏障的功能,可用于制备食品、药品、化妆品等。
Description
技术领域
本发明属于微生物的技术领域,具体涉及一株瑞士乳杆菌及其应用。
背景技术
皮肤屏障是由角质层的表皮形成细胞和角质间的脂质形成的结构性的屏障。皮肤屏障防止人体过多水分释放,并防止如化学物质或微生物的有害物质进入我们的身体。组成死亡的角质细胞的表面的角质细胞外皮在细胞间脂质的稳定性中起重要作用。
角质间结构性脂质神经酰胺,在基底层向角质分化过程中含量逐渐增加,到达角质层排至细胞间隙,构成防止水分丢失的屏障。角质层本身的亲水、屏障功能,以及角质层中所含有的天然保湿因子即氨基酸类,乳酸盐及糖类等作用,使得角质层通常含有10~30%的水分,这种环境成为了皮肤自身微生物菌落生长的摇篮。但随着年龄的增长,角质层的含水量会逐渐减少,当水分含量低于10%的时候,就会引起皮肤的各种问题。皮肤屏障受损将引起皮肤干燥、皮肤老化及皮肤的炎症,进而将导致皮肤衰老。
最新的研究证明皮肤微生物群调节各种先天因子的表达,皮肤驻留细菌不仅仅是被动驻留菌;它们通过完整的皮肤屏障主动参与宿主免疫。皮肤固有免疫系统联合皮肤微生物群是人体抵御致病微生物和机会致病菌的屏障。皮肤具有自我更新能力,皮肤微生物分解磷脂、固醇类、角质蛋白也可使皮肤细胞吸收并促进细胞生长、延缓衰老和减少皱纹产生。因此,提供一种利用微生态技术开发的益生菌相关产品,具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的是提供了一株瑞士乳杆菌及其应用。
本发明提供了瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus),该菌株为瑞士乳杆菌ProfMIC-226,已于2022年8月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,地址为:武汉市武昌区八一路299号,武汉大学,邮编430072),其保藏编号为CCTCC NO:M 20221224。
本发明的另一目的是提供了上述瑞士乳杆菌在制备改善皮肤细胞状况的产品中的应用。
较佳地,所述改善皮肤细胞状况包括抗衰老、促进细胞增殖、保湿、修护皮肤屏障中的至少一种。
一些实施方案中,所述抗衰老为上调细胞外基质相关基因的表达、上调细胞自噬相关基因LC3B的表达、上调免疫调节因子相关基因MOR的表达和/或上调细胞生长因子相关基因的表达,所述细胞外基质相关基因包括SPTSSA和/或COL1A1,所述细胞生长因子相关基因包括FGF2和/或FGF21。
一些实施方案中,所述抗衰老为下调降解细胞外基质相关基因的表达和/或下调细胞凋亡相关因子BAX的表达,所述降解细胞外基质相关基因包括MMP家族中的至少一种。
一些实施方案中,所述促进细胞增殖包括促进皮肤角质细胞增殖和/或促进成纤维细胞增殖。
一些实施方案中,所述保湿包括上调保湿相关基因GBA的表达。
一些实施方案中,所述修护皮肤屏障包括恢复细胞活力及上调屏障修护相关基因的表达中的至少一种。
一些实施方案中,所述产品为食品、药品或化妆品。
一些实施方案中,所述产品中的瑞士乳杆菌包括如下所示的一种或者两种:
(1)瑞士乳杆菌的活菌和/或灭活菌;
(2)瑞士乳杆菌的培养物、外泌体、裂解物和/或提取物。
本发明公开的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)ProfMIC-226,其保藏编号为CCTCC NO:M 20221224。实验表明,瑞士乳杆菌ProfMIC-226具有促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老的功能,可用于制备食品、药品、化妆品等。
生物保藏说明
瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)ProfMIC-226,于2022年8月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,地址为:武汉市武昌区八一路299号,武汉大学,邮编430072),其保藏编号为CCTCC NO:M 20221224。
具体实施方式
本发明提供了一株瑞士乳杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种瑞士乳杆菌ProfMIC-226,七岁健康男童粪便,经16S rDNA鉴定为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)。该菌株革兰氏阳性,显微镜下呈杆状;在MRS平板上生长,可形成表面光滑半透明的圆形菌落,白色,边缘整齐;在MRS液体培养基中呈均匀浑浊生长,久置菌体呈白色沉淀,最适生长温度37℃。
瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus),保藏单位:中国典型培养物保藏中心,地址:武汉市武昌区八一路299号,武汉大学,保藏日期:2022年8月3日,保藏编号为CCTCCNO:M 20221224。
本发明中,为了探究所述的瑞士乳杆菌的抗衰老效果,本发明对细胞衰老相关的指标进行了测定,所述的指标包括细胞外基质合成、细胞外基质降解、细胞凋亡及细胞自噬中的至少一个。
本发明以HaCaT角质细胞为受试对象,研究所述的瑞士乳杆菌对HaCaT角质细胞细胞外基质合成相关基因和降解相关基因的影响。结果表明,所述的瑞士乳杆菌可上调细胞外基质合成相关基因COL1A1的表达,促进细胞外基质的合成,下调降解细胞外基质相关基因MMP1的表达,抑制细胞外基质的降解。
本发明以HaCaT角质细胞为受试对象,研究所述的瑞士乳杆菌对HaCaT角质细胞细胞自噬的影响。结果表明,所述的瑞士乳杆菌可上调细胞自噬相关基因LC3B的表达,促进细胞自噬以清除老化细胞。
本发明以HFF成纤维细胞为受试对象,研究所述的瑞士乳杆菌对HFF细胞细胞外基质合成相关基因的影响。结果表明,所述的瑞士乳杆菌可上调细胞外基质合成相关基因SPTSSA的表达,促进细胞外基质的合成。
本发明以HFF成纤维细胞为受试对象,研究所述的瑞士乳杆菌对HFF细胞凋亡的影响。结果表明,所述的瑞士乳杆菌可下调细胞凋亡相关基因BAX的表达,抑制细胞凋亡。
本发明以HFF成纤维细胞为受试对象,研究所述的瑞士乳杆菌对HFF角质细胞免疫调节因子相关基因的表达的影响。结果表明,所述的瑞士乳杆菌可上调免疫调节因子相关基因的表达,促进细胞增长。
本发明以HFF成纤维细胞为受试对象,研究所述的瑞士乳杆菌对HFF角质细胞生长因子相关基因的表达的影响。结果表明,所述的瑞士乳杆菌可上调免疫调节因子相关基因MOR的表达,增强细胞的免疫调节能力。
进一步地,本发明中,所述促进细胞增殖包括促进皮肤角质细胞增殖和/或促进成纤维细胞增殖。本发明以HaCaT角质细胞为受试对象,对所述的瑞士乳杆菌的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明,所述的瑞士乳杆菌可促进可修复SDS引起的HaCaT角质细胞损伤,提高细胞增殖率,促进增殖率为127.25~150.75%。本发明以HFF成纤维细胞为受试对象,对所述的瑞士乳杆菌的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明,所述的瑞士乳杆菌可促进HFF成纤维细胞,促进增殖率为107.44%~155.48%。
进一步地,本发明中,所述的保湿包括但不限于上调保湿相关基因的表达,所述的保湿相关基因包括但不限于GBA。本发明以HaCaT角质细胞为受试对象,研究所述的瑞士乳杆菌的对皮肤的保湿效果,结果显示,所述的瑞士乳杆菌可上调保湿相关基因GBA的表达,促进皮肤细胞保湿。
进一步地,本发明中,所述的修护皮肤屏障包括恢复细胞活力及上调屏障修护相关基因的表达中的至少一种;所述恢复细胞活力为修复SDS诱导的细胞损伤,所述所述屏障修护相关基因包括FLG、IVL、OCLN和OVOL1中的至少一种。进一步的,本发明以HaCaT角质细胞为受试对象,对所述的瑞士乳杆菌的SDS损伤修复能力进行了研究,结果表明,所述的瑞士乳杆菌可修复SDS引起的细胞损伤,即所述的瑞士乳杆菌可恢复细胞活力,提高细胞增殖率,并上调非损伤细胞的屏障修护相关基因的表达。
本发明还提供了上述技术方案中所述的瑞士乳杆菌ProfMIC-226在制备改善皮肤细胞状况的产品中的应用,所述瑞士乳杆菌在所述的应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的,或为裂解物和/或提取物的形式,或为细菌产物的形式或为上清液形式或衍生物形式,所述衍生物形式优选地选自:代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖,和含有免疫原性成分的化合物,优选地选自:上清液、灭活菌体。
进一步的,所述产品包括所述瑞士乳杆菌;
进一步地,所述产品包括所述瑞士乳杆菌的裂解物、提取物、代谢产物;
进一步地,所述产品包括含有所述瑞士乳杆菌的菌群;
进一步地,所述产品包括含有所述瑞士乳杆菌及其裂解物、提取物、代谢产物制成的菌剂或含有所述瑞士乳杆菌的菌群制成的菌剂。本发明对此不做限定。
所述产品的剂型包括但不限于膏霜类、乳液类、油剂类、水剂类、凝胶类、粉剂类、冻干类中的至少一种,本发明对此不做限定。
本发明还提供了一种改善肌肤状态的方法,包括使用上述技术方案中所述的产品进行涂抹、外敷、熏蒸或注射,本发明对此不做限定。
本发明采用的试材皆为普通市售品,均可市售购买得到,下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1 ProfMIC-226的分离
于七岁健康男童粪便中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀,取上清划线于MRS固体平板,37℃恒温培养48h后,挑取白色菌落反复接种筛选,直至得到均匀的单个菌落,命名为ProfMIC-226。
革兰氏染色镜检:菌株ProfMIC-226为革兰氏染色阳性,显微镜下呈杆状;在MRS平板上生长,可形成白色、表面光滑圆润半透明圆形小菌落,边缘整齐;在MRS液体培养基中呈均匀浑浊生长,久置菌体呈白色沉淀。
实施例2 ProfMIC-226的核酸鉴定
1、16S rDNA基因序列分析
挑取单菌落置MRS液体培养基中,37℃培养过夜后,12000转离心1min收集菌体,按照DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27F,1492R,PCR扩增体系为50μL体系,95℃预变性5min;94℃15s,57℃15s,72℃40s,35个循环;72℃延伸10min。
2、结果
PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出ProfMIC-226菌株为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)。
实施例3ProfMIC-226促进SDS诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT损伤修复实验
1、ProfMIC-226上清液制备
挑取瑞士乳杆菌ProfMIC-226单菌落于MRS液体培养基,37℃培养箱静置培养16~18h,酶标仪检测并以PBS稀释调整OD600=0.2,121℃,30min高压灭活,12000转离心2min,经0.22μm滤膜过滤为上清液。
2、促进HaCaT细胞修复实验
接种HaCaT细胞(5×104cells/孔)至96孔板,过夜培养至细胞贴壁。配制50μg/mlSDS,每孔加入100μl,5%二氧化碳培养箱37℃培养8h。各孔添加5%上清液(对照组以等体积PBS替代上清液)培养24h。向每孔加入10μl的CCK-8溶液,培养4h,检测450nm处吸亮度A。
细胞增殖率计算公式及结果如下表:
上表结果可知,ProfMIC-226上清液可修复SDS引起的HaCaT角质细胞损伤,即促进皮肤角质细胞增殖,其增殖率为127.25~150.75%。
实施例4 ProfMIC-226上调HaCaT保湿相关基因表达实验
1、ProfMIC-226上清液制备
制备方法参照实施例3。
2、上调HaCaT保湿相关基因表达实验
接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔,内含5×105细胞)至6孔板,5%二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。加入上清液5%(V/V)(对照组以等体积PBS替代),培养24h后,加入裂解液,提取细胞总RNA,检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA,以GAPDH为内参基因,采用实时qPCR检测GBA基因的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F=1),利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
公式:F=2-ΔΔCT,其中:
△CT实验=CT实验-CT内参(实验);
△CT对照=CT对照-CT内参(对照);
△△CT=△CT实验-△CT对照。
结果见下表:
体外细胞实验表明,本发明的瑞士乳杆菌ProfMIC-226具有上调保湿相关的葡萄糖脑苷脂酶基因GBA表达的作用,基因表达量上调1.31~1.62。表明ProfMIC-226具有促进皮肤保湿的作用。
实施例5 ProfMIC-226促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验
1、ProfMIC-226上清液和灭活菌体制备
挑取瑞士乳杆菌ProfMIC-226单菌落于MRS液体培养基,37℃培养箱静置培养16~18h,酶标仪检测并以PBS稀释调整OD600=0.2,121℃,30min高压灭活,12000转离心2min,经0.22μm滤膜过滤为上清液。离心沉淀以适量PBS重悬,稀释调整OD600=0.2,为灭活菌体。
2、促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验
接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔,内含5×105细胞)至6孔板,5%二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。分别加入上清液5%(V/V),灭活菌体10%(V/V)(对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体),培养24h后,加入裂解液,提取细胞总RNA,检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA,以GAPDH为内参基因,采用实时qPCR检测FLG、IVL、OCLN和OVOL1基因的表达。分别以添加等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F=1),利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
结果见下表:
体外细胞实验表明,本发明的瑞士乳杆菌ProfMIC-226上清液和灭活菌体具有上调皮肤屏障修护相关因子丝聚合蛋白基因FLG、外皮蛋白基因IVL、紧密连接蛋白OCLN和OVO样转录因子1基因OVOL1表达的作用,基因表达量上调1.12~2.69倍。表明ProfMIC-226具有促进皮肤屏障修护的作用。
实施例6 ProfMIC-226调节光老化HaCaT细胞外基质/细胞自噬相关基因表达实验
1、ProfMIC-226上清液及灭活菌体制备
制备方法参照实施例5。
2、HaCaT细胞制备及紫外线损伤
将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×105细胞)接种至24孔板,5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm2的紫外线UVB照射损伤。
3、ProfMIC-226添加
将上清液5%(V/V)、灭活菌体10%(V/V)分别加入刺激过的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体)。每组3平行,37℃培养过夜。
4、qPCR法检测细胞外基质/细胞自噬相关基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后,加入裂解液,提取细胞总RNA,检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA,以GAPDH为内参基因,采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因COL1A1,细胞自噬相关基因LC3B,以及降解细胞外基质相关基因MMP1的表达。以对照组基因相对表达倍数F=1,利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
上清液上调细胞自噬相关基因LC3B;下调降解细胞外基质相关基因MMP1。结果见下表:
灭活菌体上调细胞外基质基因COL1A1。结果见下表:
体外细胞实验表明,本发明的瑞士乳杆菌ProfMIC-226具有上调I型胶原α1链基因COL1A1和细胞自噬相关基因LC3B表达的作用,基因相对表达倍数1.27~3.97;具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP1表达的作用,基因相对表达倍数0.63~0.84。
实施例7 ProfMIC-226促进人成纤维细胞HFF的增殖
1、ProfMIC-226上清液及灭活菌体制备
制备方法参照实施例5。
2、HFF细胞制备及ProfMIC-226添加
接种以DMEM培养的HFF细胞,以100ul/孔(每孔含3×104细胞)转接至96孔板,过夜培养至细胞贴壁。配制200μM H2O2,每孔加入100μl,5%二氧化碳培养箱37℃培养1h。弃掉原培养基,PBS清洗两次,加入100μl新培养基,各孔分别添加上清液5%(V/V)、灭活菌体10%(V/V),(对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体)。培养24h。向每孔加入10μl的CCK-8溶液,培养4h,检测450nm处吸亮度A,其计算公式及结果如下表:
体外细胞实验表明,本发明的瑞士乳杆菌ProfMIC-226具有促进人成纤维细胞HFF增殖的作用,增殖率107.44%~155.48%。
实施例8 ProfMIC-226调节氧化损伤HFF细胞外基质/免疫调节因子/细胞生长因子/细胞凋亡相关基因表达实验
1、ProfMIC-226上清液及灭活菌体制备
制备方法参照实施例5。
2、HFF细胞制备及H2O2诱导氧化损伤
将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×105细胞)接种至24孔板,5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H2O2进行刺激,37℃静置1h。
3、ProfMIC-226添加
将上清液5%(V/V)、灭活菌体10%(V/V)分别加入刺激过的HFF细胞(对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体)。每组3平行,37℃培养过夜。
4、qPCR法检测细胞外基质/免疫调节因子/细胞生长因子/细胞凋亡相关基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后,加入裂解液,提取细胞总RNA,检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA,以GAPDH为内参基因,采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因SPTSSA,免疫调节因子相关基因MOR,细胞生长因子相关基因FGF2和FGF21;以及细胞凋亡相关基因BAX的表达。以对照组基因相对表达倍数F=1,利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
上清液上调免疫调节因子相关基因MOR,细胞生长因子相关基因FGF21;下调细胞凋亡相关基因BAX。结果见下表:
灭活菌体上调抑制细胞外基质相关基因SPTSSA,免疫调节因子相关基因MOR,细胞生长因子相关基因FGF2。结果见下表:
体外细胞实验表明,本发明的瑞士乳杆菌ProfMIC-226具有上调HFF细胞外基质相关的丝氨酸棕榈酰转移酶基因SPTSSA,免疫调节因子相关的β-内啡肽受体基因MOR,细胞生长因子相关的成纤维细胞生长因子基因FGF2和FGF21表达的作用,基因相对表达倍数1.13~8.12;具有下调细胞凋亡相关的BCL2-Associated X蛋白基因BAX表达的作用,基因相对表达倍数0.22~0.74。
实施例9瑞士乳杆菌ProfMIC-226上清液冲剂制备实例
ProfMIC-226上清液冲剂的制备,组方如下表所示:
原料 | 质量比例(%) |
ProfMIC-226发酵粉 | 35.0 |
红豆薏米粉 | 40.0 |
红枣粉 | 24.6 |
二氧化硅 | 0.4 |
制备工艺:取实施例3制备的ProfMIC-226上清液,喷雾干燥后制成ProfMIC-226发酵粉,加入红豆薏米粉、红枣粉、二氧化硅,搅拌分散均匀即完成冲剂。所得ProfMIC-226冲剂携带方便,冲剂以水冲泡后味道天然,适口性佳,可做为皮肤保养的口服饮品。
实施例10瑞士乳杆菌ProfMIC-226灭活菌体精华水制备实例
ProfMIC-226灭活菌体精华水的制备,组方如下表所示:
原料 | 质量比例(%) |
ProfMIC-226灭活菌体液 | 65 |
甘油 | 24.5 |
1,3-丁二醇 | 10 |
苯氧乙醇 | 0.4 |
香兰素 | 0.1 |
制备工艺:取实施例5制备的ProfMIC-226灭活菌体液,加热至50℃,加入甘油、1,3-丁二醇、苯氧乙醇、香兰素,搅拌分散均匀直至清澈,冷却至35℃即完成。所得ProfMIC-226灭活菌体精华水气味清新,使用前摇晃以重悬菌体,涂抹肤感润滑不粘腻感。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一株瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus),该菌株为瑞士乳杆菌ProfMIC-226,已于2022年8月3日保藏在中国典型培养物保藏中心,其保藏编号为CCTCC NO:M 20221224。
2.保藏编号为CCTCC NO:M 20221224的瑞士乳杆菌在制备改善皮肤细胞状况的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述改善皮肤细胞状况包括抗衰老、促进细胞增殖、保湿、修护皮肤屏障中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述抗衰老为上调细胞外基质相关基因的表达、上调细胞自噬相关基因LC3B的表达、上调免疫调节因子相关基因MOR的表达和/或上调细胞生长因子相关基因的表达,所述细胞外基质相关基因包括SPTSSA和/或COL1A1,所述细胞生长因子相关基因包括FGF2和/或FGF21。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述抗衰老为下调降解细胞外基质相关基因的表达和/或下调细胞凋亡相关因子BAX的表达,所述降解细胞外基质相关基因包括MMP家族中的至少一种。
6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述促进细胞增殖包括促进皮肤角质细胞增殖和/或促进成纤维细胞增殖。
7.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述保湿包括上调保湿相关基因GBA的表达。
8.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述修护皮肤屏障包括恢复细胞活力及上调屏障修护相关基因的表达中的至少一种。
9.根据权利要求2~8任一项所述的应用,其特征在于,所述产品为食品、药品或化妆品。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述产品中的瑞士乳杆菌包括如下所示的一种或者两种:
(1)瑞士乳杆菌的活菌和/或灭活菌;
(2)瑞士乳杆菌的培养物、外泌体、裂解物和/或提取物。
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CN202211435935.3A CN115820485A (zh) | 2022-11-16 | 2022-11-16 | 一株瑞士乳杆菌及其应用 |
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