CN116948921A - 植物乳杆菌及其外泌体的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌及其外泌体的应用，涉及一株植物乳杆菌及其外泌体的应用领域。本发明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Zz‑2022，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.27069。该菌株外泌体在洗护用品、在制备伤口愈合药物中的应用。本发明植物乳杆菌Zz‑2022的外泌体能够促进表皮细胞增殖，从而恢复皮肤弹性、减少皱纹，达到延缓皮肤老化的作用；能够促进表皮划痕愈合。皮肤创面的再上皮化主要依赖于表皮细胞从创缘向创面中心的迁移，植物乳杆菌Zz‑2022的外泌体可以促进表皮细胞的迁移能力，修复皮肤创面、加速创面愈合。
Description
技术领域
本发明涉及一株植物乳杆菌及其外泌体的应用。
背景技术
外泌体是细胞外囊泡（Extracellularvesicles,EVs）的一种，1983年外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。外泌体中包含了复杂RNA和蛋白质，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。
尽管所有动物、植物、微生物等生命个体，在正常的生命活动及病理状态中均产生外泌体。但由于物种、组织细胞、状态的差异，其分泌的外泌体中的内含物（尤其是生物大分子及其种类、浓度）组成差异明显；致使不同来源的外泌体具有不同的功能。
外泌体被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，现如今对外泌体在人体皮肤护理、修复领域的研究兴趣日益高涨。但目前该领域所使用的外泌体都是采用人体干细胞来源的外泌体。
人体干细胞的来源和获取仍存在伦理争议，获得途径也受限，导致人体皮肤护理、修复领域所使用的外泌体难以满足产业化大规模生产的需要，且价格昂贵。
发明内容
本发明为了改变人体皮肤护理领域外泌体来源都受限于人体干细胞的局面，提供了植物乳杆菌外泌体在多个领域中的应用。
本发明植物乳杆菌其为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Zz-2022，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 27069。
本发明植物乳杆菌的外泌体在洗护用品中的应用，以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Zz-2022的外泌体做为洗护用品中的活性成分。
进一步的，以植物乳杆菌Zz-2022的外泌体做为护肤品中的活性成分。
进一步的，以植物乳杆菌Zz-2022的外泌体做为护肤品中促进表皮细胞增殖的活性成分。
进一步的，以植物乳杆菌Zz-2022的外泌体做为护肤品中肌肤修复的活性成分。
本发明植物乳杆菌外泌体在制备伤口愈合药物中的应用，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Zz-2022的外泌体为伤口愈合药物中的活性成分。
进一步的，植物乳杆菌Zz-2022的外泌体为手术伤口愈合药物中的活性成分。
有益效果：本发明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Zz-2022外泌体纯，且均一，直径在114nm~130nm。
本发明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Zz-2022的外泌体能够促进表皮细胞增殖，从而恢复皮肤弹性、减少皱纹，达到延缓皮肤老化的作用。
而且，通过本发明植物乳杆菌Zz-2022的外泌体促进表皮细胞增殖，皮肤屏障得以逐渐恢复，物理性屏障对紫外线的防御力增强之后，皮肤黑色素的含量自然逐渐减少，可明显减少黄褐斑的产生。
本发明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Zz-2022的外泌体能够促进表皮划痕愈合。皮肤创面的再上皮化主要依赖于表皮细胞从创缘向创面中心的迁移，本发明植物乳杆菌Zz-2022的外泌体可以促进表皮细胞的迁移能力，具有修复皮肤创面、加速创面愈合的效果。
本发明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Zz-2022的外泌体能大幅提升成纤维细胞中Collagen I的表达，提升Fibronectin-1（构建纤连蛋白-1）和α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）的表达量，对于伤口，特别是手术伤口的愈合具有积极作用。
本发明采用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Zz-2022来源的外泌体，因植物乳杆菌为人类益生菌，在皮肤、肠道等黏膜表面广泛存在，并具有抗菌、抗炎、提高免疫力，促进代谢等多种生物学功能，所以其分泌的外泌体与人有很好的生物相容性，具有生物安全性。
与人体干细胞来源的外泌体相比较，利用植物乳杆菌Zz-2022培养分泌外泌体，具有培养工艺简单、方法成熟、生产周期短、成本低等诸多优点。
本发明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Zz-2022来源的外泌体在CCK-8细胞增殖、细胞划痕愈合、表皮细胞迁移能力、伤口愈合等实验中都表现优异的效果，突破了相关领域目前均采用人体干细胞来源外泌体的局限性。
本发明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Zz-2022为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，属于乳杆菌属（Lactobacillus）；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2023年4月12日，保藏号为CGMCC No. 27069。
附图说明
图1是具体实施方式1所获得的植物乳杆菌Zz-2022外泌体的透射电镜观察图（之一）；
图2是具体实施方式1所获得的植物乳杆菌Zz-2022外泌体的透射电镜观察图（之二）；
图3是具体实施方式1所获得的植物乳杆菌Zz-2022外泌体的透射电镜观察图（之三）；
图4是具体实施方式1所获得的植物乳杆菌Zz-2022外泌体纳米粒径分析图；
图5是具体实施方式3植物乳杆菌Zz-2022的外泌体的CCK-8人表皮细胞增殖实验效果图；
图6是具体实施方式4植物乳杆菌Zz-2022的外泌体的人表皮细胞划痕实验效果图；
图7是具体实施方式5植物乳杆菌Zz-2022的外泌体的人表皮细胞Transwell迁移实验效果图；
图8是具体实施方式6植物乳杆菌Zz-2022的外泌体对成纤维细胞collagen I表达量的影响图；
图9是具体实施方式6植物乳杆菌Zz-2022的外泌体对成纤维细胞Fibronectin-1表达量的影响图；
图10是具体实施方式6植物乳杆菌Zz-2022的外泌体对成纤维细胞α-SMA表达量的影响图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明中所述“洗护用品”包括但不仅限于洁面产品、护肤产品、洗发产品、护发产品等。
本发明中所述“护肤品”包括但不仅限于面膜、眼霜、面霜、精华素、洁面乳、原液、爽肤水、防晒霜。
本发明中所述“伤口愈合药物”包括但不仅限于创可贴、喷剂、贴剂、冷敷凝胶、生物膜、伤口粘合剂。
实施例1：本实施例植物乳杆菌Zz-2022的外泌体的分离制备方法：
S1、植物乳杆菌Zz-2022经MRS固体斜面培养基传代活化恢复活力后，接入灭菌后的MRS液体培养基中，置于37 ℃恒温培养箱培养 12h，得到植物乳杆菌植物乳杆菌Zz-2022的种子液；
S2、以1%的量再次接种入灭菌后 MRS 液体培养基中，继续培养至对数生长期后期，得到植物乳杆菌Zz-2022菌液；
S3、将植物乳杆菌Zz-2022菌液离心弃去上清，然后加入TY液体培养基中，30℃孵育6 h；
S4、外泌体的收集：将经过6 h孵育的悬浊液，3000g 转速离心10min，弃去菌体，收集上清液；
S5、差速离心：
5.1、300g，4℃，离心10min，弃沉淀；
5.2、2000g，4℃，离心10min，弃沉淀；
5.3、10,000g，4℃，离心30min，弃沉淀，收集上清液，用孔径0.45 μm过滤器过滤；
5.4、滤液110000g，4℃，离心70min，弃上清液；
5.5、沉淀用PBS重悬沉淀，用孔径0.22 μm膜过滤器过滤，滤液110000g，4℃，离心70min，弃上清液，得到初步植物乳杆菌Zz-2022外泌体；
S6、将步骤S5得到的初步植物乳杆菌Zz-2022外泌体加入PBS，然后加入碘克沙醇制成体积为3mL的含外膜囊泡的40%碘克沙醇悬液；
S7、用灭菌水和碘克沙醇溶液，配置浓度为5%、10%、20%的碘克沙醇溶液；然后将步骤S6制备的3mL的含外泌体的40%碘克沙醇悬液加入到超速离心管中，然后依次加入3mL 浓度为20%的碘克沙醇溶液、3mL 浓度为10%的碘克沙醇溶液和3mL 浓度为5%的碘克沙醇溶液，之后100000g离心18 h；
S8、步骤S7超速离心后将超速离心管中的悬液分12层，每层1mL，从上至下依次吸取1mL并保证移液器枪头每次不插入下一层；收集第4~6管，即得到植物乳杆菌Zz-2022外泌体。
植物乳杆菌Zz-2022于2022年4月于哈尔滨市新生儿肠道粪便中提取获得。
植物乳杆菌Zz-2022分离、纯化、鉴定方法：
1、将粪便按照1：50加入到无菌水中，并且进行梯度稀释；
2、取合适的梯度稀释液100uL加入到固体MRS（含CaCO3）培养集中，进行平板涂布，37℃培养；
3、选取融钙圈明显的单菌落进行三区划线，37℃培养，纯化菌株；
4、同样选取融钙圈明显的单菌落进行三区划线，37℃培养，继续纯化；
5、从纯化好的的平板中挑单菌落加入到液体MRS培养基中扩大培养，用菌悬液进行PCR测序，鉴定种属；
6、种属鉴定后，按照菌悬液与50%灭菌甘油1：1混合，-80℃冻藏；另外接种斜面，送菌种保藏中心保藏。
本发明中植物乳杆菌Zz-2022的培养不限于本实施方式中记载的方法和步骤。
本发明中植物乳杆菌Zz-2022外泌体的分离获取方法不限于本实施方式中记载的方法和步骤。
实施例2：对实施例1所获得的植物乳杆菌Zz-2022外泌体做透射电镜观察，如图1~3所示，在电镜下能直观的看到大量呈凹型双膜结构的囊泡样富集，肯定了实施例1提取的外泌体形态。
对实施例1获得的植物乳杆菌Zz-2022外泌体进行纳米粒径分析，从纳米粒径的结果
（如图4所示）可以看到植物乳杆菌Zz-2022外泌体很纯，很均一，直径在114nm~130nm。
实施例3：本实施例采用Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒）检测植物乳杆菌Zz-2022外泌体对人表皮细胞增殖的效果。
检测方法：
1、向各孔中加入100 μl人表皮细胞悬液；人表皮细胞悬液中人表皮细胞的浓度为2000个/ml；
2、在37℃下预孵育培养板；
3、实验组向各孔中加入浓度为4×105个/ml的植物乳杆菌Zz-2022外泌体溶液10μl；植物乳杆菌Zz-2022外泌体溶液由实施例1制备的植物乳杆菌Zz-2022外泌体加生理盐水稀释制成。对照组各孔中加入10μl生理盐水；
4、37℃下孵育；
5、向各孔中加入10 μl的CCK-8溶液；
6、37℃下孵育1~4小时；
7、测定450 nm处的OD值。
细胞活力计算
细胞活力*(％)=[A(外泌体)-A(空白)]/[A(对照)-A(空白)] ×100
A(加药)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度
A(空白)：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度
A(对照)：具有细胞、CCK-8溶液而没有外泌体溶液（加生理盐水）的孔的吸光度
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力
实验结果如图5所示。证实植物乳杆菌Zz-2022外泌体对人的表皮细胞有促进增殖的效果，且无毒性。本发明植物乳杆菌Zz-2022的外泌体能够促进表皮细胞增殖，从而可恢复皮肤弹性、减少皱纹，达到延缓皮肤老化的作用。而且，通过本发明植物乳杆菌Zz-2022的外泌体促进表皮细胞增殖，皮肤屏障得以逐渐恢复，物理性屏障对紫外线的防御力增强之后，皮肤黑色素的含量自然逐渐减少，可明显减少黄褐斑的产生。
实施例4：体外培养皿中当人表皮细胞生长到融合单层状态时，在人表皮细胞的融合单层细胞上用划痕工具（枪头或其它硬物）制造一个空白区域，空白区域的人表皮细胞被机械力去除，然后继续培养人表皮细胞至实验设定的时间（24h）。依据划痕边缘细胞逐渐进入空白区域使“划痕”愈合的能力，判断细胞生长迁移能力。
实验分为2组，一组为对照组，在人表皮细胞的体外培养皿中加入10μl生理盐水；一组为实验组，在人表皮细胞的体外培养皿中加入10μl的植物乳杆菌Zz-2022外泌体溶液，植物乳杆菌Zz-2022外泌体溶液中植物乳杆菌Zz-2022外泌体的浓度为Zz-2022×105个/ml。
观察人表皮细胞向无细胞空白区域迁移的情况来判定愈合能力，如图6所示。结果显示植物乳杆菌Zz-2022外泌体的存在可以促进人表皮细胞的划痕愈合能力。
本发明植物乳杆菌Zz-2022的外泌体能够促进表皮划痕愈合。
实施例5：Transwell迁移实验
孔径为8微米的Transwell小室底部是一层多孔膜，在小室里加入人表皮细胞悬液（浓度为2000个/ml），而在小室外提供包含实施例1制备的植物乳杆菌Zz-2022外泌体溶液的培养基（培养基中植物乳杆菌Zz-2022外泌体的浓度为1×105个/ml）。Transwell迁移实验在37℃、5 %CO2条件下培养24 h。其中，对照组（CN-1、CN-2、CN-3）在小室外提供不包含实施例1制备的植物乳杆菌Zz-2022外泌体溶液的培养基。
观察人表皮细胞迁移情况和数量，如图7所示，CN-1、CN-2、CN-3为对照组；外泌体-1、外泌体-2、外泌体-3为实验组，提供含植物乳杆菌Zz-2022外泌体溶液的培养基。实验结果显示，植物乳杆菌Zz-2022外泌体可以促进表皮细胞的迁移能力。
皮肤创面的再上皮化主要依赖于表皮细胞从创缘向创面中心的迁移，本发明植物乳杆菌Zz-2022的外泌体可以促进表皮细胞的迁移能力，具有修复皮肤创面、加速创面愈合的效果。
实施例6：将成纤维细胞（fibroblast）接种于25cm2的细胞培养瓶，使细胞密度为1×106个/瓶。贴壁后换无血清的RPMI-1640培养液培养24h后分为：①对照组（加入单纯培养液5ml）；②实验组（加5ml培养液，培养液中植物乳杆菌Zz-2022外泌体的浓度为1×105个/ml）。孵育24小时后，提取纤维细胞蛋白和RNA，用QRT-PCR法检测细胞中collagen I及Fibronectin-1、α-SMA mRNA的表达。
Collagen I及Fibronectin-1、α-SMA mRNA的表达结果如图8~10所示。
从图8中可以看到经过植物乳杆菌Zz-2022外泌体干预后成纤维细胞中CollagenⅠ的表达量明显上升。CollagenⅠ基因位于真表皮连接处，含量增加则可达到一定抵抗皱纹产生的作用，在皮肤衰老过程中起着重要的作用。
从图9中可以看到经过植物乳杆菌Zz-2022外泌体干预后成纤维细胞中Fibronectin-1的表达量上升。Fibronectin-1是胶原蛋白或肝素生成不可缺少的组分，Fibronectin-1作为长链蛋白分子可以促进细胞黏附和铺展；属于细胞外大分子非胶原糖蛋白的一种，可在维持细胞形态、炎症损伤修复、细胞基质黏连、肿瘤细胞转移等过程中发挥多项生物学功能。
从图10中可以看到经过植物乳杆菌Zz-2022外泌体干预后成纤维细胞中α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）的表达量明显升高。α-SMA是一种异常的纤维细胞-肌纤维母细胞，与创面收缩关系密切。α-SMA的表达使肌成纤维细胞的收缩能力增加，使肉芽组织纤维化，促进结缔组织的形成。
本发明植物乳杆菌Zz-2022的外泌体能大幅提升成纤维细胞中Collagen I、Fibronectin-1和α-SMA的表达量，对于伤口，特别是手术伤口的愈合具有积极作用。
Claims (7)
1.一株植物乳杆菌，其为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Zz-2022，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 27069。
2.权利要求1所述植物乳杆菌的外泌体在洗护用品中的应用，其特征在于，以植物乳杆菌Zz-2022的外泌体做为洗护用品中的活性成分。
3.根据权利要求2所述的植物乳杆菌的外泌体在洗护用品中的应用，其特征在于，植物乳杆菌外泌体在护肤品中的应用，以植物乳杆菌Zz-2022的外泌体做为护肤品中的活性成分。
4.根据权利要求3所述的植物乳杆菌外泌体在洗护用品中的应用，其特征在于，以植物乳杆菌Zz-2022的外泌体做为护肤品中促进表皮细胞增殖的活性成分。
5.根据权利要求3所述的植物乳杆菌外泌体在洗护用品中的应用，其特征在于，以植物乳杆菌Zz-2022的外泌体做为护肤品中肌肤修复的活性成分。
6.权利要求1所述植物乳杆菌的外泌体在制备伤口愈合药物中的应用，其特征在于，植物乳杆菌Zz-2022的外泌体为伤口愈合药物中的活性成分。
7.根据权利要求6所述的植物乳杆菌的外泌体在制备伤口愈合药物中的应用，其特征在于，植物乳杆菌Zz-2022的外泌体为手术伤口愈合药物中的活性成分。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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