KR102253418B1 - 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 장내 유산균 유래 엑소좀을 피부 유래 유산균에 처리함으로써, 피부 유래 유산균을 단독으로 배양할 때에 비하여 피부 유래 유산균의 배양 속도가 빨라지며, 세포간 의사소통에 중요한 물질인 엑소좀 수득률이 크게 향상될 뿐만 아니라, 피부 건강에 보다 유용한 효과(세포 분열 속도 향상 효과, 세포 증식 속도 향상 효과, 세포 상처 치유 효과, 세포 광노화 억제 효과 및 미백 효과)가 있어 화장품 및 의약품에 유용하게 적용이 가능하다.
본 발명으로부터 제공되는 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 장내 유산균 유래 엑소좀을 피부 유래 유산균에 처리함으로써, 피부 유래 유산균을 단독으로 배양할 때에 비하여 피부 유래 유산균의 배양 속도가 빨라지며, 세포간 의사소통에 중요한 물질인 엑소좀 수득률이 크게 향상될 뿐만 아니라, 피부 건강에 보다 유용한 효과(세포 분열 속도 향상 효과, 세포 증식 속도 향상 효과, 세포 상처 치유 효과, 세포 광노화 억제 효과 및 미백 효과)가 있어 화장품 및 의약품에 유용하게 적용이 가능하다.
Description
본 발명은 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
사람이 모여 사회를 구성함에 있어 의사소통이 중요한 것처럼, 사람을 구성하는 세포 간의 의사소통은 사람의 건강에 있어 중요한 요소이다. 세포간 의사소통은 엑소좀을 매개로 하는데 이러한 방식은 원핵생물부터 인간에 이르기까지 오랜 진화 과정 속에서도 보존되어온 방식이다.
엑소좀이란 미생물에서부터 인간에 이르는 모든 세포에서 세포 밖으로 분비되는 세포간 의사소통 물질로서 세포밖 소포체(extracellular vesicles)에서 50~200nm 나노 크기의 물질이다. 이러한 나노 크기의 엑소좀은 물에 녹지 않는 막 단백질을 수송할 수 있다. 막 단백질이란 인지질 이중막에 있는 단백질로 소수성이기 때문에 기본적으로는 혈액에 의한 세포간 전달이 어렵다. 이에 반해 엑소좀은 인지질 이중막으로 이루어져 있어 막 단백질을 수송할 수 있다.
또한, 엑소좀은 내용물을 인지질 이중막으로 둘러싸는 것을 통하여 외부의 분해 물질로부터 그 내용물을 보호할 수 있다는 것이다. 대표적인 예로 RNA 수송 기전을 들 수 있다. 세포 밖에 존재하는 RNA는 분해되는 반면에 엑소좀 안에 존재하는 RNA는 이들 물질로부터 보호되어 표적 세포로 원활하게 전달될 수 있다. 또한, 엑소좀은 국소적으로 높은 농도를 유지할 수 있다. 세포는 단순히 적은 단백질을 신호로 인지하지 않고, 일정 수준 이상의 양을 가진 단백질이 한번에 전달되어야 신호로 인지한다. 해당 신호 전달을 용이하게 하기 위하여 세포는 엑소좀을 이용하여 해당 단백질을 한정된 공간에 모아 한번에 수송함으로써, 표적 세포에 신호전달을 효율적으로 할 수 있게 된다. 호르몬류와 같이 혈류 전체를 다 순환해야만 특정 세포에 전달되는 방식이 아니라, 엑소좀 내용물은 포장되어 특정 목표에만 제한적으로 수송이 될 수 있기 때문에 적은 양의 내용물 만으로도 효율적인 전달이 가능하다. 또한, 엑소좀은 관련된 물질을 한번에 수송함으로써 복합적으로 신호를 전달할 수 있다. 세포 성장을 위해서 한 종류의 단백질을 전달하는 것보다는 서로 시너지 효과를 낼 수 있는 단백질 집단이나 다른 물질(핵산, 지질)을 한꺼번에 수송함으로써 신호를 효율적으로 전달할 수 있다.
이러한 특장점에도 불구하고 엑소좀에 대한 연구와 응용된 제품들이 아직까지는 미비한 상태이다. 그 이유 중 한가지로 엑소좀을 수득할 수 있는 방법이 아직까지 제한적이고 그 방법도 전체 엑소좀 중에 극히 소량만으로 추출할 수 있는 효율성이 떨어지는 것으로 연구와 제품 상용화에 있어 그 방법을 개선하는 것이 필수적인 상황이다.
엑소좀을 수득하기 위한 방법과 관련된 기술로는, 국내의 경우 대한민국 등록특허공보 제10-2125567호「식물 엑소좀의 대량 생산 방법」, 대한민국 등록특허공보 제10-2047768호「중간엽줄기세포 유래 고순도, 고농도 엑소좀을 포함하는 배양액 및 이의 제조방법」, 대한민국 등록특허공보 제10-1895916호「엑소좀 및/또는 세포외 소포체 및 이를 포함하는 조성물의 제조 방법」, 대한민국 등록특허공보 제10-1980482호「엑소좀을 분리하기 위한 다중 컬럼 및 엑소좀 분리 방법」 등이 개시되어 있다.
한편, 장내 미생물 환경이 인간의 건강에 미치는 효과들은 이들 장내 미생물들이 분비하는 엑소좀에서 기인한다. 장내 미생물이 인간의 건강에 미치는 여러가지 영향들이 밝혀지면서, 장내 미생물 환경이 인체에 미치는 영향이 장내에 한정되지 아니하고, 물리적으로 멀리 떨어진 뇌에 영향을 끼친다는 사실이 밝혀졌고, 이러한 Gut-Brain axis 모델과 관련해 활발한 연구가 진행되고 있다. 이와 유사하게 장내 유산균 환경이 피부 건강에 다양한 영향을 준다는 연구 결과들이 Gut-Skin axis 모델로 최근 보고되고 있다. 특히, 피부의 경우 장과 유사하게 유산균이 존재하는 환경으로 이들 유산균 또한 모발과 피부의 건강에 있어 중요한 역할을 하고 있다. 그러나, 기존에 학술적으로 확인된 Gut-skin axis의 경우 체내에서 이루어지는 현상으로 유익한 특정 성분을 분리, 정제, 추출하여 의약품 및 화장품의 조성물로 제공하는데 어려움이 있었다.
이러한 사실들로 인하여, 본 발명의 발명자들은 장내 유산균 환경이 피부 건강에 영향을 준다는 점, 피부와 모발의 건강에 유산균 환경이 중요한 역할을 한다는 점을 착안하여 장내 유산균과 피부 유래 유산균 간에 엑소좀을 매개로 하는 의사소통이 가능한지를 확인하고자 하였다.
이에, 본 발명에서는 장내 유산균으로부터 분리한 엑소좀을 피부 유래 유산균인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)에 처리하여 배양할 경우, 피부 유래 유산균을 단독으로 배양할 때에 비하여 피부 유래 유산균의 배양 속도가 빨라지며, 엑소좀 수득률이 크게 향상될 뿐만 아니라, 피부 건강에 보다 유용한 효과(세포 분열 속도 향상 효과, 세포 증식 속도 향상 효과, 세포 상처 치유 효과, 세포 광노화 억제 효과 및 미백 효과)를 갖는 엑소좀을 수득할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 포함하는 화장품을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a)장내 유산균을 배양하는 단계; (b)장내 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계; (c)장내 유산균 유래 엑소좀을 이용하여 피부 유산균을 배양하는 단계; 및 (d)피부 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 장내 유산균은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus Salivarius) 및 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri)로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 장내 유산균을 배양하는 단계는 장내 유산균을 멸균 우유에서 48시간 동안 배양하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 장내 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계는, (a)장내 유산균 배양액을 원심분리기를 이용하여 1,500~2,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등 배양액만을 취하여 유산균주를 분리 및 제거하는 단계; (b)상등 배양액을 초고속 원심분리기를 이용하여 10,000~15,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등액을 취하여 균주 및 잔여물을 분리 및 제거하는 단계; (c)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계; (d)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 100,000~150,000g로 2~4시간 동안 원심분리 후, 엑소좀을 펠렛층에 가라앉히는 단계; 및 (e)펠렛층을 PBS에 재부유시켜 장내 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 유산균은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 유산균을 배양하는 단계는, (a)장내 유산균 유래 엑소좀을 멸균 우유에 혼합하여 배지를 제조하는 단계; 및 (b)상기 배지를 이용하여 인간 피부에서 분리된 피부 유산균을 48시간 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계는, (a)피부 유산균 배양액을 원심분리기를 이용하여 1,500~2,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등 배양액만을 취하여 유산균주를 분리 및 제거하는 단계; (b)상등 배양액을 초고속 원심분리기를 이용하여 10,000~15,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등액을 취하여 균주 및 잔여물을 분리 및 제거하는 단계; (c)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계; (d)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 100,000~150,000g로 2~4시간 동안 원심분리 후, 엑소좀을 펠렛층에 가라앉히는 단계; 및 (e)펠렛층을 PBS에 재부유시켜 피부 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물의 제조방법으로부터 수득된 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 엑소좀은 세포 분열 속도 향상 효과, 세포 증식 속도 향상 효과, 세포 상처 치유 효과, 세포 광노화 억제 효과 및 미백 효과를 동시에 갖는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 화장품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 의약품을 제공한다.
본 발명으로부터 제공되는 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 장내 유산균 유래 엑소좀을 피부 유래 유산균에 처리함으로써, 피부 유래 유산균을 단독으로 배양할 때에 비하여 피부 유래 유산균의 배양 속도가 빨라지며, 세포간 의사소통에 중요한 물질인 엑소좀 수득률이 크게 향상될 뿐만 아니라, 피부 건강에 보다 유용한 효과(세포 분열 속도 향상 효과, 세포 증식 속도 향상 효과, 세포 상처 치유 효과, 세포 광노화 억제 효과 및 미백 효과)가 있어 화장품 및 의약품에 유용하게 적용이 가능하다.
도 1은 장내 유산균 유래 엑소좀 조성물의 처리 농도에 따른 피부 유산균인 락토바실러스 플랜타럼의 배양 속도 증진 추이를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 단독 배양 엑소좀 조성물의 입도추적분석기(NTA)를 통한 입자 크기 분포도와 입자수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리(1㎍/mL)하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 입도추적분석기(NTA)를 통한 입자 크기 분포도와 입자수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리(3㎍/mL)하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 입도추적분석기(NTA)를 통한 입자 크기 분포도와 입자수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 단백질 농도를 측정한 브래드포드 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 피부 세포 분열 속도 향상 효과를 평가한 라이브 셀 이미징 및 영상 분석(JuLI Br) 결과를 나타낸 이미지이다.
도 7은 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 인체 피부 섬유아세포 증식 능력 향상 효과를 평가한 CCK-8 결과를 나타낸 이미지이다.
도 8은 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 피부 세포 상처 치유 효과 향상을 평가한 라이브 셀 이미징 및 영상 분석(JuLI Br) 결과를 나타낸 이미지이다.
도 9는 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 피부 세포 광노화 억제 효능(자외선 조사 환경에서 피부 세포 생존능 측정)을 평가한 CCK-8 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 피부 각질 세포 광노화 억제 효능(자외선 조사 환경에서 피부 각질 세포 생존능 측정)을 평가한 CCK-8 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 피부 미백 효과를 평가한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 단독 배양 엑소좀 조성물의 입도추적분석기(NTA)를 통한 입자 크기 분포도와 입자수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리(1㎍/mL)하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 입도추적분석기(NTA)를 통한 입자 크기 분포도와 입자수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리(3㎍/mL)하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 입도추적분석기(NTA)를 통한 입자 크기 분포도와 입자수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 단백질 농도를 측정한 브래드포드 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 피부 세포 분열 속도 향상 효과를 평가한 라이브 셀 이미징 및 영상 분석(JuLI Br) 결과를 나타낸 이미지이다.
도 7은 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 인체 피부 섬유아세포 증식 능력 향상 효과를 평가한 CCK-8 결과를 나타낸 이미지이다.
도 8은 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 피부 세포 상처 치유 효과 향상을 평가한 라이브 셀 이미징 및 영상 분석(JuLI Br) 결과를 나타낸 이미지이다.
도 9는 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 피부 세포 광노화 억제 효능(자외선 조사 환경에서 피부 세포 생존능 측정)을 평가한 CCK-8 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 피부 각질 세포 광노화 억제 효능(자외선 조사 환경에서 피부 각질 세포 생존능 측정)을 평가한 CCK-8 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 피부 미백 효과를 평가한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 발명자들은 세포간 의사소통에 중요한 물질인 엑소좀을 이용하여, 장내 유산균과 피부 유래 유산균 간의 의사소통을 일으켜, 보다 인체에 유익한 유산균 엑소좀 조성물을 제공하고자 하였다. 이러한 연구 과정 속에서 장내 유산균 유래 엑소좀을 피부 유래 유산균인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)에 처리하여 배양할 경우, 피부 유래 유산균을 단독으로 배양할 때에 비하여 피부 유래 유산균의 배양 속도가 빨라지며, 엑소좀 수득률이 크게 향상될 뿐만 아니라, 피부 건강에 보다 유용한 효과(세포 분열 속도 향상 효과, 세포 증식 속도 향상 효과, 세포 상처 치유 효과, 세포 광노화 억제 효과 및 미백 효능)를 부여한다는 사실을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.
따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 (a)장내 유산균을 배양하는 단계; (b)장내 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계; (c)장내 유산균 유래 엑소좀을 이용하여 피부 유산균을 배양하는 단계; 및 (d)피부 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 장내 유산균은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus Salivarius) 및 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri)로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 장내 유산균을 배양하는 단계는 장내 유산균을 멸균 우유에서 48시간 동안 배양하는 것을 특징으로 한다.
이때, 배양 시간이 상기 범위를 벗어나게 되면 경제적인 측면 및 오염의 위험성을 초래하기 때문에 바람직하지 않다. 이는, 도 1과 같이 48시간 전후에서 배지 환경 내에서 장내 유산균의 수가 포화점에 이르기 때문에 48시간에서 배양을 멈추는 것이 경제적인 측면에서 타당하다, 또한, 포화점에서 배양을 장시간 지속하면, 배지 내 영양소 고갈로 유산균이 죽기 시작하면서 독소 생성 및 오염 위험성이 증가되기 때문에 바람직하지 않다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 장내 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계는, (a)장내 유산균 배양액을 원심분리기를 이용하여 1,500~2,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등 배양액만을 취하여 유산균주를 분리 및 제거하는 단계; (b)상등 배양액을 초고속 원심분리기를 이용하여 10,000~15,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등액을 취하여 균주 및 잔여물을 분리 및 제거하는 단계; (c)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계; (d)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 100,000~150,000g로 2~4시간 동안 원심분리 후, 엑소좀을 펠렛층에 가라앉히는 단계; 및 (e)펠렛층을 PBS에 재부유시켜 장내 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것이 순도 및 오염 방지 측면에서 바람직하다.
상기와 같이,(d)공정에서 매우 높은 중력가속도(100,000~150,000g)로 원심분리 하기 전에, (a)공정에서 가장 낮은 중력가속도(1,500~2,000g)로 분리하고, (b)공정에서 낮은 중력가속도(10,000~15,000g)로 분리한 다음, (c)공정에서 여과하는 과정을 수행하여 잔여물을 걸러내어 엑소좀의 순도를 높이는 것이 바람직하다.
상기와 같이 장내 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하여 수득된 장내 유산균 유래 엑소좀은 피부 유산균을 배양하기 위해 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 피부 유산균은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)인 것이 바림직하다. 본 발명에서 사용한 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)(수탁번호 KCCM12765P)은 20대 피부에서 동정한 본사 독자적인 균주로서, Skin-gut axis 모델을 위해 skin 유래 균을 스크리닝 하던 중 가장 우수한 것으로 나타나 적용하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 피부 유산균을 배양하는 단계는, (a)장내 유산균 유래 엑소좀을 멸균 우유에 혼합하여 배지를 제조하는 단계; 및 (b)상기 배지를 이용하여 인간 피부에서 분리된 피부 유산균을 48시간 배양하는 단계를 포함하는 것이 측면에서 바림직하다.
이때, 배양 시간이 상기 범위를 벗어나게 되면 경제적인 측면 및 오염의 위험성을 초래하기 때문에 바람직하지 않다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 피부 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계는, (a)피부 유산균 배양액을 원심분리기를 이용하여 1,500~2,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등 배양액만을 취하여 유산균주를 분리 및 제거하는 단계; (b)상등 배양액을 초고속 원심분리기를 이용하여 10,000~15,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등액을 취하여 균주 및 잔여물을 분리 및 제거하는 단계; (c)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계; (d)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 100,000~150,000g로 2~4시간 동안 원심분리 후, 엑소좀을 펠렛층에 가라앉히는 단계; 및 (e)펠렛층을 PBS에 재부유시켜 피부 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것이 순도 및 오염 방지 측면에서 바람직하다.
상기와 같이,(d)공정에서 매우 높은 중력가속도(100,000~150,000g)로 원심분리 하기 전에, (a)공정에서 가장 낮은 중력가속도(1,500~2,000g)로 분리하고, (b)공정에서 낮은 중력가속도(10,000~15,000g)로 분리한 다음, (c)공정에서 여과하는 과정을 수행하여 잔여물을 걸러내어 엑소좀의 순도를 높이는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 수득된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
상기 엑소좀은 피부 유래 유산균을 단독으로 배양할 때에 비하여 피부 유래 유산균의 배양 속도가 빨라지며, 엑소좀 수득률이 크게 향상될 뿐만 아니라, 피부 건강에 보다 유용한 효과(세포 분열 속도 향상 효과, 세포 증식 속도 향상 효과, 세포 상처 치유 효과, 세포 광노화 억제 효과 및 미백 효능)를 부여하여 보다 높은 유효성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 화장품 또는 의약품에 관한 것이다.
상기 방법으로 수득된 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본 발명에서 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔,시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 장내 유산균 유래 엑소좀 준비
1) 장내 유산균(락토바실러스 애시도필러스（KCTC 3171), 비피도박테리움 락티스（KCTC 5854), 락토바실러스 람노서스(KCTC 3237), 비피도박테리움 롱검（KCTC 3128), 비피도박테리움 브레브（KCTC 3220), 락토바실러스 카제이（KCTC 3110), 락토바실러스 살리바리우스（KCTC 3600)) 및 락토바실러스 루테리 (KCTC 3594)을 멸균 우유에서 48시간동안 배양하였다. 이후 커드 층이 생겨나 층분리가 일어나면, 커드 층과 배양액을 함께 회수한 다음, 원심분리기를 사용하여, 2000 x g로 20분간 4℃에서 원심분리 후, 상등 배양액만을 취하여 유산균주를 분리 제거하였다. 취득한 상등 배양액을 초고속 원심분리기를 이용하여 10,000 x g로 30분간 4℃에서 원심분리 후, 상등액을 취하여 균주 및 잔여물들을 분리 제거하였다. 원심분리 후 얻은 상등액을 0.22㎛ 바틀 탑 필터를 통해 여과하여 기타 잔여물들을 제거하였다. 필터한 상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 120,000 x g로 3시간 동안 초원심분리하여 엑소좀을 펠렛층에 가라앉힌다. 파이펫 및 볼텍스를 이용해 펠렛층을 PBS에 재부유시켜 장내 유산균 유래 엑소좀을 획득하였다.
<실시예 2> 장내 유산균 유래 엑소좀을 이용한 피부 유산균 배양
상기 실시예 1에서 수득한 장내 유산균 유래 엑소좀을 0.22㎛ 주사기 필터 처리한 다음, 농도별(미처리군, 1㎍/mL, 3㎍/mL)로 나누어 각각 멸균 우유에 혼합한 후, 이를 배지로 사용하여 인간 피부에서 분리해낸 락토바실러스 플랜타럼 균(KCCM12765P)를 48시간 동안 배양하여 최종 피부 유산균(락토바실러스 플랜타럼) 배양액을 수득하였다.
<실험예 1> 장내 유산균 엑소좀 처리 농도에 따른 락토바실러스 플랜타럼 배양속도 증진 추이
상기 실시예 2에서 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리(1㎍/mL, 3㎍/mL)한 락토바실러스 플랜타럼이 미처리군(0㎍/mL)에 비해 빨리 커드 층을 생성한다는 점을 확인하였다. 이는, 장내 유산균 엑소좀을 락토바실러스 플랜타럼에 처리하여 배양하였을 때, 락토바실러스 플랜타럼의 배양속도가 증진됨을 의미한다. 본 발명자들은 위 사실을 보다 명확히 하기 위하여, 도 1과 같이 평판 도말법을 통해 집락형성단위(CFU)를 측정하여, 장내 유산균 엑소좀 처리 농도에 따른 락토바실러스 플랜타럼의 배양 속도 및 유산균의 수를 판단하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 본 실험은 Log CFU/mL을 측정하여 각 실험군별 배양속도 차이를 보는 실험으로서, 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물(3ug/mL) 실험군에서 가장 먼저 포화점에 도달하는 양상을 보였고, 세 실험군 모두 48시간에서 큰 차이는 없었다. 이를 통해 장내 유산균 유래 엑소좀이 락토바실러스 플랜타럼의 초기 배양속도를 증가시켜 준다는 것과, 48시간 배양시 균의 수가 배양 속도에 비례하여 늘어나지 않는다는 것을 알 수 있었다. 이와 같은 결과를 통해 도 2~5는 엑소좀 수율의 증가가 배양단계에서 균의 숫자의 증가로 인한 것이 아니라, 장내 유산균 유래 엑소좀과 락토바실러스 플랜타럼 사이의 cell to cell communication으로 인한 것으로 추측할 수 있다.
<실시예 3> 장내 유산균 유래 엑소좀을 이용한 락토바실러스 플랜타럼 배양액에서의 엑소좀 분리
상기 실시예 2로부터 수득한 피부 유산균 배양액에서 배양액과 커드층의 분리가 일어나면, 각각의 배양액을 회수한 다음, 원심분리기를 이용하여 2000 x g로 20분간 4℃에서 원심 분리한 후, 상등 배양액만을 취하여, 커드 층과 플랜타럼 균주를 분리 제거하였다. 취득한 각각의 상등 배양액을 초고속 원심분리기를 이용하여 10,000 x g로 30분간 4℃에서 원심분리 후, 상등액을 취하여 잔여 락토바실러스 플랜타럼 균주 및 기타 잔여물들을 분리 제거하였다. 원심분리 후 얻은 각각의 상등액을 0.22㎛ 바틀 탑 필터를 통해 여과하여 기타 잔여물들을 제거하였다. 필터한 각각의 상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 150,000 x g로 3시간 동안 초원심분리하여 엑소좀을 펠렛으로 가라앉힌다. 파이펫 및 볼텍스를 이용해 PBS에 펠렛층을 재부유시켜 각각의 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물을 회수하였다.
<실험예 2> 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 수율 증대 효과
상기 실시예 4에서 수득한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 정량적, 분자생물학적, 물리적 평가를 위하여 브래드포드 방법과 입도추적 분석기(NTA: Nano Tracking Analyzer)를 이용하여 분석을 실시하였다.
일반적으로, 유산균 유래 엑소좀은 50~200nm 크기로 받아들여지고 있다. 실시예 4로부터 분리된 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀의 크기는 도 2~4에 나타난 바와 같이, 평균 120nm 전후로 측정되어 고순도의 엑소좀을 얻을 수 있다는 것을 확인하였다. 구체적으로, NTA 분석을 통해 측정한 엑소좀의 입자수를 분석한 결과, 락토바실러스 플랜타럼을 단독 배양한 엑소좀 조성물에 비해, 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 입자수가 3배 가량 증가된 것을 확인하였다.
또한, 엑소좀의 단백질 농도 분석을 위해 브래드포드 방법을 이용하여 측정하였다. 실험 방법은 Bio Rad 사 제품에서 제공하는 사용법에 따랐다. 상기 실시예 4로부터 획득한 엑소좀 샘플 40μL과 BioRad社 Protein Assay Dye 시약 160μL을 96well Plate에서 잘 섞어준 후, 빛을 차단한 상태에서 5분간 방치하였다. 이후, BioTek社 Synergy HT microplate reader 장비를 이용하여 595nm에서의 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 단백질 농도로 환산하기 위하여 BioRad 사 Protein Assay Kit II로 Standard curve를 만들어 사용하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 플랜타럼을 단독 배양한 엑소좀 조성물의 단백질 농도는 95.22 ㎍/mL, 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리(1㎍/mL)하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 단백질 농도는 161.33 ㎍/mL, 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리(3㎍/mL)하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 단백질 농도는 199.11 ㎍/mL로 측정되었다. 즉, 락토바실러스 플랜타럼을 단독 배양한 엑소좀 조성물에 비해, 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 단백질 농도가 2배 가량 증가된 것을 확인하였다.
상기 사실들로, 락토바실러스 플랜타럼을 단독 배양한 엑소좀 조성물 대비 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물에서 고수율의 엑소좀을 얻을 수 있음을 확인하였다.
<실험예 3> 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 인간 피부 세포 분열 속도 향상 효과 평가
상기 실시예 4에서 수득한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물이 인간 피부에 미치는 유효성을 평가하기 위해, 인체 피부 섬유아세포(HDF cells)에 실시예 4에서 수득한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물을 각각 10㎍/mL의 농도로 배지에 첨가하여 배양하였다.
구체적으로, 24 well 플레이트에 인체 피부 섬유아세포를 3 x 104 cells/well으로 분주하고 FBS 10%를 Alpha MEM 배지에 첨가하여 배양하였다. 추가적으로, 실시예 4에서 수득한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물을 각각 10㎍/mL의 농도로 첨가하였다. 엑소좀 조성물의 유효성을 판단하기 위해 비교군에는 엑소좀 조성물을 넣지 않고, 동일한 배지와 조건에서 배양하였다. 12시간 경과 후, 나노엔텍 社 라이브 셀 이미징 및 영상분석기(JuLI Br)을 사용하여, 배양중인 인체 피부 섬유아세포의 세포 분열을 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물을 인체 피부 섬유아세포에 처리하였을 때, 더 많은 세포 분열 단계의 세포가 관찰되었고, 이를 통해, 인체 피부세포의 증식 향상 효과가 있음을 확인하였다. 그 중에서도 락토바실러스 플랜타럼을 단독 배양한 엑소좀 조성물 대비 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물이 처리농도에 비례하여 향상된 세포 분열 속도 향상 효과를 나타냄을 확인하였다.
<실험예 4> 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 인간 피부 세포 증식 속도 향상 효과 평가
상기 실시예 4에서 수득한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물이 인간 피부 세포 증식 속도에 미치는 유효성을 평가하기 위해, 인체 피부 섬유아세포(HDF cells)에 실시예 4에서 수득한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물을 각각 10㎍/mL의 농도로 배지에 첨가하여 세포 분열에 미치는 영향을 관찰하였다.
구체적으로, 24 well 플레이트에 인체 피부 섬유아세포를 3 x 104 cells/well으로 분주하고 FBS 10%를 Alpha MEM 배지에 첨가하였다. 실시예 4에서 수득한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물을 각각 10㎍/mL의 농도로 처리하여 배양하였다. 엑소좀 조성물의 유효성을 판단하기 위해, 대조군에는 엑소좀 조성물을 넣지 않고, PBS를 첨가하여 동일한 조건에서 배양하였다. 24시간 동안 배양 후, 도진도社의 CCK-8 키트를 이용하여 엑소좀 조성물이 인체 피부 섬유아세포의 증식능력에 미치는 영향을 평가하였다.
| 시료명 | 장내 유산균 유래 엑소좀 처리농도(㎍/mL) | 시료 처리농도(㎍/mL) | 세포 증식력 | P value |
| 대조군(-) | 10 | 100±0.70 | ||
| 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물 | - | 10 | 106.68±0.62 | +++ |
| 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물 | 1.0 | 10 | 111.69±0.98 | * |
| 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물 | 3.0 | 10 | 123.45±0.47 | *** |
그 결과, 표 1 및 도 7에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물을 인체 피부 섬유아세포에 처리하였을 때, 대조군(PBS 처리군)에 비해 인체 피부 섬유아세포의 증식 속도가 증가됨을 확인하였다. 그 중에서도 락토바실러스 플랜타럼을 단독 배양한 엑소좀 조성물 대비 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물이 처리농도에 비례하여 향상된 세포 증식 속도 향상 효과를 나타냄을 확인하였다.
<실험예 5> 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 인간 피부 세포 상처 치유 효과 평가
상기 실시예 4에서 수득한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물이 인간 피부에 미치는 유효성을 평가하기 위해, 성인 피부 각질 세포(HaCat cells)에 상처를 낸 뒤, 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물을 배지에 첨가(10 ㎍/mL)후 배양하여, 상처 치유에 미치는 영향을 관찰하였다.
구체적으로, 24 well 플레이트에 성인 피부 각질 세포를 3x104 cells/well으로 분주하고, DMEM 배지에 FBS 10%를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 200μL 파이펫 팁을 이용하여, 성인 피부 각질 세포를 배양 중인 well 중앙에 세로로 상처부위를 만들었다. 상처 부위를 만든 후, 실험군에는 상기 실시예 4에서 수득한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물을 각각 10 ㎍/mL의 농도로 처리하여 배양하였고, 대조군에는 상기 배지와 동일한 배지에 PBS를 첨가하여, 배지를 교환해 배양하였다. 상처 부위의 회복속도 차이를 분석하기 위해, 나노엔텍 社 라이브 셀 이미징 및 영상분석기(JuLI Br)을 사용하였다. 48시간 동안 배양하며 상처 회복 속도를 관찰하였고, 정량적인 분석을 위해 Image J 프로그램을 사용하여, 상처 부위의 비어있는 면적을 계산하여 그래프로 나타내었다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물이 대조군(PBS 처리군)에 비해 상처 치유 효과가 증대됨을 확인하였다. 그 중에서도 락토바실러스 플랜타럼을 단독 배양한 엑소좀 조성물 대비 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물이 처리농도에 비례하여 향상된 세포 상처 치유 효과를 나타냄을 확인하였다.
<실험예 6> 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 인간 피부 세포 광노화 억제 효능 평가
상기 실시예 4에서 수득한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물이 인간 피부의 광노화 억제 효능을 평가하기 위해, 인체 피부 섬유아세포(HDF cells)에 상기 실시예 4에서 수득한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물을 배지에 첨가(10 ㎍/mL)하여 자외선(UVB) 처리 후, 인체 피부 섬유아세포의 생존능(Cell viability)을 CCK-8 방법을 이용해 평가하였다.
구체적으로, 인체 피부 섬유아세포(HDF cells)을 24 well 플레이트에 성인 피부 각질 세포를 3x104 cells/well으로 분주하고, DMEM 배지에 FBS 10%를 첨가하였다. 실험군에는 상기 실시예 4에서 수득한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물을 각각 10 ㎍/mL의 농도로 처리하고, 대조군(양성, 음성)에는 PBS를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이때, 음성 대조군는 별도의 24 well 플레이트에서 배양하였다. 배양 후, 자외선(UVB) 광선(40mJ/cm2)을 양성대조군와 실험군을 배양한 24 well 플레이트에 조사하여 광노화 환경을 만들어 주었다. 광노화 환경에서 인체 피부 섬유아세포의 생존능을 CCK-8 방법을 이용하여 측정하였다.
| 자외선(UVB) 조사 | 시료명 | 시료 처리농도(㎍/mL) | 세포 생존능 | P value |
| UVB(-) | 음성대조군 | - | 100±0.56 | |
| UVB(+) | 양성대조군 | - | 57.9±1.12 | +++ |
| UVB(+) | 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물 | - | 62.2±1.81 | * |
| UVB(+) | 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물 | 1.0 | 64.6±2.10 | * |
| UVB(+) | 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물 | 3.0 | 70.8±1.19 | *** |
그 결과, 표 2 및 도 9에 나타난 바와 같이, 자외선에 노출되지 않은 음성 대조군 대비, 자외선에 노출된 광노화 환경의 양성 대조군에서 인체 피부 섬유아세포의 생존능은 57.9%로 감소하였다. 이와 같은 자외선으로 인한 피부 세포의 생존능 저하는 인체에서 광노화의 원인이 된다.
락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물은 양성 대조군에 비하여 인체 피부 섬유아세포의 생존능이 최대 70% 이상으로 증가되는 것을 확인하였다. 그 중에서도 락토바실러스 플랜타럼을 단독 배양한 엑소좀 조성물 대비 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물이 처리농도에 비례하여 향상된 광노화 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.
또한, 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 인간 피부 세포 광노화 억제 효능을 보다 명확히 검증해보고자, 성인 피부 각질 세포(HaCat cells)에서 상기 인체 피부 섬유아세포에서 진행한 실험과 동일한 과정을 통해, 피부 각질 세포에서의 광노화 억제 효능을 확인하였다.
그 결과, 표 2 및 도 10에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물은 성인 피부 각질 세포에서도 광노화 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 그 중에서도 락토바실러스 플랜타럼을 단독 배양한 엑소좀 조성물 대비 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물이 처리농도에 비례하여 향상된 광노화 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.
<실험예 7> 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물의 인간 피부 세포 미백 효능 평가
상기 실시예 4에서 수득한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물이 인간 피부의 미백 효능을 평가하기 위해, B16F10 세포의 멜라닌 생성량을 ELISA(405nm파장)를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 24 well 플레이트에 2.0x104 cells/well로 분주하고, DMEM 배지에 10% FBS를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 멜라닌의 생합성을 유도하기 위해 실험군 및 양성대조군에 α-MSH 200nM을 포함하는 배지로 배양액을 교환하여 24시간 동안 배양하였다. 음성대조군에는 동일한 양의 PBS를 포함하는 배지로 배양액을 교환하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, PBS를 이용하여 세포를 세척해 준 다음, trypsin-EDTA 시약을 사용하여 세포를 튜브에 회수하였다. 회수한 세포에 1N의 NaOH를 200μL 처리해 준 후, 80℃ 수조에서 1시간 동안 두어 세포내의 melanin이 녹아나오도록 하였다. 이후 1시간 동안 튜브를 얼음에 넣어 냉각시켜준 후, ELISA를 이용하여 405nm 흡광도를 측정하여, B16F10 세포 내의 멜라닌 생성량 측정량을 비교 분석하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 피부 세포의 멜라닌 분비 감소는 피부를 더 밝게 하는 미백효과를 나타내는데, 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물은 피부 세포의 멜라닌 분비를 감소시켜, 미백 효과가 있음을 확인하였다. 그 중에서도 락토바실러스 플랜타럼을 단독 배양한 엑소좀 조성물 대비 장내 유산균 유래 엑소좀을 처리하여 배양한 락토바실러스 플랜타럼 유래 엑소좀 조성물이 처리농도에 비례하여 향상된 미백 효과를 나타냄을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (11)
- (a)락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus Salivarius) 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)를 포함하는 장내 유산균을 멸균 우유에서 48시간 동안 배양하는 단계;
(b)장내 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;
(c)장내 유산균 유래 엑소좀을 멸균 우유에 혼합하여 배지를 제조한 다음, 상기 배지를 이용하여 인간 피부에서 분리된 피부 유산균인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)을 48시간 배양하는 단계; 및
(d)피부 유산균인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 장내 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계는,
(a)장내 유산균 배양액을 원심분리기를 이용하여 1,500~2,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등 배양액만을 취하여 유산균주를 분리 및 제거하는 단계;
(b)상등 배양액을 초고속 원심분리기를 이용하여 10,000~15,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등액을 취하여 균주 및 잔여물을 분리 및 제거하는 단계;
(c)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계;
(d)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 100,000~150,000g로 2~4시간 동안 원심분리 후, 엑소좀을 펠렛층에 가라앉히는 단계; 및
(e)펠렛층을 PBS에 재부유시켜 장내 유산균 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 피부 유산균인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계는,
(a)피부 유산균인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 배양액을 원심분리기를 이용하여 1,500~2,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등 배양액만을 취하여 유산균주를 분리 및 제거하는 단계;
(b)상등 배양액을 초고속 원심분리기를 이용하여 10,000~15,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등액을 취하여 균주 및 잔여물을 분리 및 제거하는 단계;
(c)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계;
(d)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 100,000~150,000g로 2~4시간 동안 원심분리 후, 엑소좀을 펠렛층에 가라앉히는 단계; 및
(e)펠렛층을 PBS에 재부유시켜 피부 유산균인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 제조방법.
- 제1항, 제4항 및 제7항 중 어느 한 항의 조성물의 제조방법으로부터 수득된 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 엑소좀은 세포 분열 속도 향상 효과, 세포 증식 속도 향상 효과, 세포 상처 치유 효과, 세포 광노화 억제 효과 및 미백 효과를 동시에 갖는 것을 특징으로 하는 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물.
- 제8항의 조성물을 포함하는 화장품.
- 제8항의 조성물을 포함하는 의약품.
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