KR20240030480A - 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하는 피부 개선용 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 프로바이오틱스로부터 세포외소포 분비효율을 높일 수 있는 배양조건을 제공하며, 고효율로 분리할 수 있는 공정을 제공하여 효능 물질이 고농도로 함유된 소재를 제공할 수 있으며, 또한, 상기에서 제조된 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하여 유효성분을 캡슐화한 피부 개선용 조성물을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 프로바이오틱스로부터 세포외소포를 고수율로 얻을 수 있는 배양 방법과 분리 방법, 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.
모든 세포들은 다른 세포 또는 외부 환경과의 정보교환을 위해 다양한 물질들을 분비한다. 세포의 분비물질 중 세포외소포(extracellular vesicles, EV)는 지질 이중층으로 둘러싸인 나노크기(30~150 nm)의 소포체로, 유래, 크기, 생성 과정 등에 따라 엑소좀(Exosome), 미세소포체(Micro vesicles), 세포자멸수포체(Apoptotic bodies) 등으로 구분된다. 외관상 차이가 크지 않고, 세포 외로 분비되는 소포라는 공통점이 있어 현재는 “세포외소포”로 통칭하고 있다.
세포외소포 내부에는 단백질, 지질, 핵산(mRNA, miRNA 등), 대사물질 등 생물학적 활성을 가지고 있는 다양한 물질들이 포함되어 있다. 이를 세포외소포 카고(cargo)라 하며, 여기에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되어 있다. 세포외소포 카고를 통해 다른 세포들과 융합하여 내용물을 전달하거나, 다른 세포의 기능(활성화, 성장, 이동, 분화, 사멸, 괴사 등)을 조절할 수 있다.
이러한 특징으로 세포외소포를 진단/치료 등의 목적으로 활용하려는 연구가 이루어지고 있다. 세포외소포와 관련된 연구는 인간을 포함한 포유류 유래 세포외소포에 대한 연구가 주를 이루고 있으며, 최근 세포외소포에 대한 관심이 증가하면서 미생물, 식물, 미세조류 등 다양한 유래의 세포외소포에 대한 연구가 시작되고 있다.
세포외소포는 주로 의약품 분야에 활용되어 왔으나, 기술의 발달로 접근성이 확대되면서 활용범위가 넓어지고 있다. 최근에는 줄기세포유래 세포외소포가 피부의 상처치유 및 재생에 미치는 영향, 피부세포에서 분비되는 세포외소포 역할 등 피부와 세포외소포에 대한 연구가 다방면으로 이루어지고 있다.
향후 세포외소포는 화장품 분야에서 더욱 주목받는 소재가 될 것으로 예상된다. 세포외소포를 이용한 피부 관련 연구, 또는 화장품 분야로의 적용은 한국에서 가장 활발히 이루어지고 있다. 효능소재로의 세포외소포는 인간줄기세포유래로 가장 많이 연구되고 있으며, 미생물과 식물로 점차 범위를 넓혀가고 있다.
세포외소포에 대한 연구 기술이 급속하게 발전하고 있음에도 불구하고, 제품화로 이어지기 위해서는 많은 기술적 장벽들이 존재한다. 세포 내 작은 생리적 변화가 세포외소포의 구성성분에 영향을 줄 수 있기 때문에 안정적으로 배양하는데 어려움이 있으며, 순도 높은 세포외소포를 대량으로 분리하기 위한 경제적, 시간적 소비가 크다. 상용화된 세포외소포 분리 키트는 연구용에는 적합하나 비용과 용량 부분에서 양산에 적용하기에는 어려움이 있다. 세포외소포의 상업화를 위해서는 배양부터 분리 및 정제, 양산, 가공까지 많은 단계에 걸쳐 효율적인 기술 확보가 필요하다.
현재까지 세포외소포의 분리 단계에 적용된 기술은 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초원심분리법(ultracentrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics based isolation), 엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등이 있다. 이들 분리기술은 비용, 시간, 용량, 순도 등에서 각각의 장단점이 존재하며, 세포외소포 기원 세포에 적합한 기술을 선택, 최적화하여 활용할 필요가 있다.
한편, 프로바이오틱스는 인간의 건강에 이로운 작용을 하는 살아있는 미생물을 의미한다. 프로바이오틱스에 대한 연구는 주로 천연물 등의 발효를 위한 재료나 수단으로써 진행되었으나, 최근에는 장내 마이크로바이옴 (microbiome) 조절에 관여하는 등 프로바이오틱스 자체의 역할과 중요성에 대한 인식이 커지고 있다. 인간 마이크로바이옴은 인간의 입, 코, 피부, 장 등 인체 속에 존재하는 100조 개의 미생물과 그에 대한 유전정보를 의미하며, 인간의 건강과 질병의 원인에 관한 정보를 제공하는 중요한 역할을 한다. 이 때문에 의약품, 기능성 식품. 화장품 분야 등 마이크로바이옴에 관한 연구가 증가하고 있다.
미생물을 활용한 화장품 소재는 배양액, 용해물, 발효물의 형태로 피부 흡수도가 낮아 실제 피부에 미치는 효과가 낮으며, 배양액에 포함된 배지성분과 미생물이 생산하는 대사물질(독소 등) 등의 불순물로 인해 효능성분을 고농도로 제조하기 어렵다는 단점이 있다. 또한 화장품 특성 상 시각, 후각, 촉각 등의 관능적 요소는 소비자의 선택에 상당한 영향을 미친다.
미생물 배양액은 특유의 향취로 인해 관능적 요소에 악영향을 줄 수 있어 화장품 원료 적용에 제한이 되고 있다. 작은 입자 크기를 갖는 세포외소포 특성을 이용해 여과 과정에서 불순물을 제거하면 유효성분은 높이면서도 피부 흡수율을 높여 피부세포에 실제 미치는 영향을 극대화할 수 있다.
이에 본 발명에서는 프로바이오틱스로부터 세포외소포 분비효율을 높일 수 있는 배양조건을 찾고, 고효율로 분리할 수 있는 공정을 개발하여 효능 물질이 고농도로 함유된 소재를 개발하고자 한다.
본 발명은 프로바이오틱스로부터 세포외소포 분비효율을 높일 수 있는 배양조건을 찾고, 고효율로 분리할 수 있는 공정을 개발하여 효능 물질이 고농도로 함유된 소재를 개발하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기에서 제조된 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하여 유효성분을 캡슐화한 피부 개선용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 피부 개선용 조성물은 사카로미세스 세레비지에 및 락토바실러스 프란타룸 중 하나 이상으로부터 유래된 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 피부 개선용 조성물은 사카로미세스 세레비지에 및 락토바실러스 프란타룸으로부터 유래된 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 따른 피부 개선용 조성물은 콜라겐 합성 증가, 콜라겐 분해효소 억제 및 마이크로바이옴을 조절하는 것이 바람직하다.
상기 프로바이오틱스 세포외소포의 크기는 30~150 nm인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명에 따른 프로바이오틱스 세포외소포를 제조하는 방법은 사카로미세스 세레비지에 또는 락토바실러스 프란타룸을 YM Broth Basal medium 또는 MRS Broth Basal medium에 트레할로스(TR: Trehalose), 아스코르브산(AS), 시트르산(CI) 및 말산(MA)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 프로바이오틱스 세포외소포를 제조하는 방법은, 상기 배지에서 배양하는 단계에서 제조된 배양액을 원심분리하고, 상층액을 0.22 ㎛ PES로 여과하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 프로바이오틱스 세포외소포를 제조하는 방법은, 30 kDa ~ 0.22 ㎛의 막 여과장치에서 여과하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
상기 피부 개선용 조성물이 부틸렌글리콜, 헥산디올, 에틸헥실글리세린 및 페녹시에탄올로부터 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
상기 피부 개선용 조성물이 화장수, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 팩, 젤, 로션, 연고, 패치 및 분무제로 이루어지는 군으로부턴 선택되는 제형인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구체예로서, 유효성분을 피부 또는 세포 또는 세포외소포 내로 전달하기 위한 전달체로서 상기 프로바이오틱스 세포외소포를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구체예로서, 상기 세포외소포 전달체를 이용하여, 유효성분을 미생물 배양시 세포외소포 내로 투입하여 자연적으로 유효성분을 캡슐화하거나, 유효성분을 미생물 배양시 세포외소포 내로 투입한 후 초음파 처리를 통해 인위적으로 세포외소포 내에서 캡슐화하는 방법이 바람직하다.
본 발명의 프로바이오틱스 세포외소포를 포함하는 피부 개선용 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물 피부의 상태를 개선하는 미용방법에 사용될 수 있다.
상기 미용방법은, (a) 상기 피부 개선용 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 피부 개선용 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것이 바람직하다.
또한, (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 피부 개선용 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명은 프로바이오틱스로부터 세포외소포 분비효율을 높일 수 있는 배양조건을 제공하며, 고효율로 분리할 수 있는 공정을 제공하여 효능 물질이 고농도로 함유된 소재를 제공할 수 있으며, 또한, 상기에서 제조된 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하여 유효성분을 캡슐화한 피부 개선용 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 1-1 및 실시예 1-2의 2DE 분석 결과를 도시한 것이다.
도 2는 실시예 1-2의 콜라겐 생합성 평가 결과를 도시한 것이다.
도 3은 실시예 1-1의 콜라겐 분해효소 저해능 평가 결과를 도시한 것이다.
도 4는 실시예 1-2의 콜라겐 분해효소 저해능 평가 결과를 도시한 것이다.
도 5는 실시예 2-3 내지 실시예 2-6의 콜라겐 분해효소 저해능 평가 결과를 도시한 것이다.
도 6은는 실시예 2-3의 피부장벽 개선율 평가 결과를 도시한 것이다.
도 7은 실시예2-6의 피부장벽 개선율 평가 결과를 도시한 것이다.
도 2는 실시예 1-2의 콜라겐 생합성 평가 결과를 도시한 것이다.
도 3은 실시예 1-1의 콜라겐 분해효소 저해능 평가 결과를 도시한 것이다.
도 4는 실시예 1-2의 콜라겐 분해효소 저해능 평가 결과를 도시한 것이다.
도 5는 실시예 2-3 내지 실시예 2-6의 콜라겐 분해효소 저해능 평가 결과를 도시한 것이다.
도 6은는 실시예 2-3의 피부장벽 개선율 평가 결과를 도시한 것이다.
도 7은 실시예2-6의 피부장벽 개선율 평가 결과를 도시한 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 단계가 다른 단계와 “상에” 또는 “전에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 단계가 다른 단계와 직접적 시계열적인 관계에 있는 경우뿐만 아니라, 각 단계 후의 혼합하는 단계와 같이 두 단계의 순서에 시계열적 순서가 바뀔 수 있는 간접적 시계열적 관계에 있는 경우와 동일한 권리를 포함할 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용 오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본 발명은 사카로미세스 세레비지에 및 락토바실러스 프란타룸 중 하나 이상으로부터 유래된 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하는 피부 개선용 조성물을 제공한다.
보다 바람직하게는, 본 발명은 사카로미세스 세레비지에 및 락토바실러스 프란타룸으로부터 유래된 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하는 피부 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 피부 개선용 조성물은 이하 실시예 및 실험예에서 확인하였듯이 콜라겐 합성 증가, 콜라겐 분해효소 억제 및 마이크로바이옴을 조절하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명에 따른 프로바이오틱스 세포외소포를 제조하는 방법은 사카로미세스 세레비지에 또는 락토바실러스 프란타룸을, YM Broth Basal medium 또는 MRS Broth Basal medium에 트레할로스(TR: Trehalose), 아스코르브산(AS), 시트르산(CI) 및 말산(MA)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
세포외소포의 제조 방법으로써는 초원심분리 방법이 주로 이루어지고 있으나, 양산을 고려하였을 때 아래 분리 방법이 바람직하다.
본 발명에 따른 프로바이오틱스 세포외소포를 제조하는 방법은, 상기 배지에서 배양하는 단계에서 제조된 배양액을 원심분리하고, 상층액을 0.22 ㎛ PES로 여과하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 프로바이오틱스 세포외소포를 제조하는 방법은, 30 kDa ~ 0.22 ㎛의 막 여과장치에서 여과하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 분리한 세포외소포는 30~150 nm에 해당하는 것으로, 프로바이옥틱스 유래 세포외소포는 천연유래 나노구조체라 볼 수 있다. 프로바이오틱스 유래 세포외소포는 그 자체로 피부 주름 예방 및 개선 효과가 있으므로 제품으로 활용 가능하다.
또한, 나노크기의 구조체는 주름을 제거하거나 노화를 방지하는 기능을 하는 생리활성물질과 쉽게 결합하는 특징이 있다. 이러한 나노구조체를 전달체 역할로써 화장품에 응용하여 나노화장품이 개발되고 있으며, 크기가 피부 세포의 간격보다 훨씬 작기 때문에 피부에 쉽게 흡수된다. 즉, 나노 구조체는 화장품의 유효성분을 피부내로 또는 세포내로 또는 세포외소포 내로 쉽게 전달하는 전달체 역할을 할 수 있다.
이러한 나노 구조체를 전달체로서 이용하여, 상기 유효성분을 미생물 유래 세포외소포에 넣으면, 더 많은 제품으로 파생 가능할 것이다. 예를 들어, 미생물 배양시 프로바이오틱스 세포외소포 전달체를 통해 유효성분을 첨가하여 자연적으로 유효성분을 캡슐화하는 방법이나, 초음파 처리를 통해 순간적으로 세포외소포의 구조적 변화를 유도하여 인위적으로 유효성분을 캡슐화하는 방법을 사용할 수 있다.
상기 피부 개선용 조성물은 부틸렌글리콜, 헥산디올, 에틸헥실글리세린 및 페녹시에탄올로부터 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 후속하는 제형의 형성을 위해 필요하며, 이에 제한되는 것이 아니다.
상기 피부 개선용 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 팩, 젤, 로션, 연고, 패치 및 분무제로 이루어지는 군으로부턴 선택되는 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것이 아니다.
또한, 본 발명의 프로바이오틱스 세포외소포를 포함하는 피부 개선용 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물 피부의 상태를 개선하는 미용방법에 사용될 수 있다.
상기 미용방법은, (a) 상기 피부 개선용 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 피부 개선용 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것이 바람직하다.
또한, (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 피부 개선용 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 또는 실험예를 통해 예시적으로 보다 상세히 설명하고자 한다.
실시예 1. 세포외소포 제조
실시예 1-1. 효모 세포외소포
YM Broth Basal medium에 트레할로스(TR: Trehalose), 아스코르브산(AS), 시트르산(CI) 및 말산(MA)을 0~0.1% 첨가하여 배지를 제조하고, 사카로미세스세레비지에 효모 균주를 접종하여 배양하였다. 배양액을 4 ℃에서 4000 rpm으로 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 0.22 ㎛ PES로 여과하였다. Total exosome isolation reagent을 반응시킨 뒤, 4 ℃에서 10,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하여 세포외소포를 회수하여 나노입자추적분석기(NS300)를 이용해 세포외소포의 입자분포와 농도를 분석하였다. 상기 분석 결과를 아래 표 1에 개시하였다.
| 비교예/실시예 | 배지조성(%) | 현탁 조건 |
세포외소포 농도 (Particles/ml) |
||||
| YM | TR | AS | CI | MA | RPM | ||
| 비교예1-1-1 | 100 | - | - | - | - | 0 | 1.75e+10 |
| 비교예1-1-2 | 100 | - | - | - | - | 100 | 2.08e+10 |
| 비교예1-1-3 | 100 | - | - | - | - | 200 | 1.37e+11 |
| 비교예1-1-4 | 99.9 | 0.1 | - | - | 200 | 1.28e+11 | |
| 비교예1-1-5 | 99.95 | - | 0.05 | - | 200 | 6.6e+10 | |
| 비교예1-1-6 | 99.95 | - | - | 0.05 | 200 | 8.28e+10 | |
| 실시예1-1 | 99.95 | - | - | - | 0.05 | 200 | 6.44e+10 |
실시예 1-2. 유산균 세포외소포
MRS Broth Basal medium에 트레할로스(TR: Trehalose), 아스코르브산(AS), 시트르산(CI) 및 말산(MA)을 0~0.1% 첨가하여 배지를 제조하고, 락토바실러스 플란타룸 유산균 균주를 접종하여 배양하였다. 배양액을 4 ℃에서 4000 rpm으로 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 0.22 ㎛ PES로 여과하였다. Total exosome isolation reagent을 반응시킨 뒤, 4 ℃에서 10,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하여 세포외소포를 회수하여 나노입자추적분석기(NS300)를 이용해 세포외소포의 입자분포와 농도를 분석하였다. 상기 분석 결과를 아래 표 2에 개시하였다.
| 비교예/실시예 | 배지조성(%) | 현탁 조건 |
세포외소포 농도 (Particles/ml) |
||||
| MRS | TR | AS | CI | MA | RPM | ||
| 비교예1-2-1 | 100 | - | - | - | - | 0 | 2.45e+10 |
| 비교예1-2-2 | 100 | - | - | - | - | 100 | 4.36e+10 |
| 비교예1-2-3 | 100 | - | - | - | - | 200 | 2.52e+10 |
| 비교예1-2-4 | 99.9 | 0.1 | - | - | 200 | 3.48e+10 | |
| 비교예1-2-5 | 99.95 | - | 0.05 | - | 100 | 1.05e+10 | |
| 비교예1-2-6 | 99.95 | - | - | 0.05 | 200 | 3.31e+10 | |
| 실시예1-2 | 99.95 | - | - | - | 0.05 | 200 | 3.43e+10 |
실험예 1. 세포외소포 효능물질 분석
실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 제조된 세포외소포에 RIPA Buffer을 처리하여 30분간 저온 반응하였다. 4 ℃에서 12,000 rpm으로 30분 동안 원심분리 후, 상층액을 취하여 2DE/MS을 이용해 효능물질을 분석하였다. 상기 분석 결과를 도 1 및 아래 표 3에 개시하였다.
| 실시예 | 효능물질 (Protein hits) |
| 실시예 1-1 | gi|296178361 |
| gi|226790 | |
| gi|171332 | |
| 실시예 1-2 | gi|2073333746 |
| gi|2172108857 |
실험예 2. 콜라겐 합성능 평가
피부노화가 진행됨에 따라 콜라겐과 엘라스틴 발현을 담당하는 섬유아세포의 기능이 감소한다. 그 결과 주름이 발생하고 탄력이 떨어지며, 피부장벽의 기능이 떨어지게 된다. 본 발명의 조성물이 피부노화개선 및 장벽개선에 미치는 영향을 확인하기 위해 섬유아세포에서 시료 처리에 의한 콜라겐 합성능을 평가하였다.
인간유래 섬유아세포 (Human Dermal Fibroblast)를 24 well plate에 6 x 104 cells/ml의 농도로 접종하고, 24시간 동안 배양한 뒤, 시료를 처리하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배지를 회수하고 ELISA(Enzyme-linked immuosorbent assay) 방법을 이용해 세포외로 분비된 PIP(Procollagen Type I C-terminal Peptide)을 확인하여 콜라겐 합성율을 계산하였다.
도 2에 도시된 바와 같이 실시예 1-2에서 제조된 세포외소포가 섬유아세포에서 콜라겐 합성 증가에 유효한 것으로 확인하였다.
실험예 3. 콜라겐 분해효소 저해능 평가
피부노화가 진행됨에 따라 섬유아세포에서 콜라겐분해효소의 분비가 증가하여 콜라겐이 분해되고, 주름발생, 탄력감소, 피부장벽기능 약화에 영향을 주게 된다. 본 발명의 조성물이 피부노화개선 및 장벽개선에 미치는 영향을 확인하기 위해 섬유아세포에서 시료 처리에 의한 콜라겐 분해효소 저해능을 평가하였다.
인간유래 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast)를 24 well plate에 6 x 104 cells/ml의 농도로 접종하고, 24시간 동안 배양한 뒤, 시료를 처리하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배지를 회수하여 세포외로 분비된 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)을 ELISA(Enzyme-linked immuosorbent assay)로 확인하여 콜라겐분해효소 저해율을 계산하였다.
도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 실시예 1-1과 실시예 1-2는 섬유아세포에서 콜라겐 분해효소의 분비를 줄이는데 유효한 것으로 확인하였다.
실험예 4. 마이크로바이옴 조절능 평가
피부 유익균(Lactobacillus plantarum) 및 피부유해균(Staphylococcus aureus) 균주를 배양하여 시료를 처리하기 전과 후에 각 미생물의 생장 변화를 확인하였다. 대조군 대비 유익균을 증가시키거나, 유해균을 감소시키면 마이크로바이옴 조절 효능이 있는 것으로 판단하였다.
아래 표 4 및 표 5에 개시한 바와 같이, 실시예 1-1과 실시예 1-2는 피부 유익균을 증가시키고 피부유해균을 감소시켜 마이크로바이옴 조절에 유효한 것으로 확인하였다.
| 비교예/실시예 | 농도 | Lactobacillus plantarum 생장 변화 (% of Control) |
|
| 8시간 | 24시간 | ||
| 무처리 | - | 100.00 | 100.00 |
| 실시예1-1 | 0.2% | 97.43 | 86.04 |
| 0.5% | 82.16 | 110.17 | |
| 실시예1-2 | 0.2% | 108.92 | 90.14 |
| 0.5% | 106.06 | 117.60 | |
| 비교예/실시예 | 농도 | Staphylococcus aureus 생장 변화 (% of Control) |
||
| 8시간 | 24시간 | 48시간 | ||
| 무처리 | - | 100.00 | 100.00 | 100.00 |
| 실시예1-1 | 0.2% | 99.51 | 102.35 | 75.26 |
| 0.5% | 101.11 | 140.39 | 95.66 | |
| 실시예1-2 | 0.2% | 107.76 | 140.78 | 78.06 |
| 0.5% | 115.64 | 77.65 | 72.45 | |
실시예 2. 세포외소포 분리 조건 확립
MRS Broth Basal medium에 말산 0.1%를 첨가하여 배지를 제조하고, 락토바실러스 플란타룸 유산균 균주를 접종하여 배양하였다. 배양액을 4 ℃에서 4000 rpm으로 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 0.22 ㎛ PES로 여과하였다.
배양 여과액을 Total exosome isolation reagent을 반응시킨 뒤, 4 ℃에서 10,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하여 세포외소포를 회수하여 비교예 2-1을 제조하고, 배양 여과액을 100 kDa, 30 kDa, 5kDa 및 2kDa의 막 여과장치에 각각 또는 단계별로 주입한 후, 여과하여 세포외소포를 회수하여 비교예 2-2 ~ 2-6과 실시예 2-1 ~ 2-2을 제조하였다.
나노입자추적분석기(NS300)를 이용해 세포외소포의 입자분포와 농도를 분석하여 비교예 2-1에 대한 세포외소포 회수율(%)을 계산하였다. 상기 결과를 아래 표 6에 개시하였다.
| 비교예/실시예 | 균주 | 여과장치 조건 | 세포외소포 회수율(%) |
| 비교예 2-1 | 락토바실러스 | - | 100.0 |
| 비교예 2-2 | 락토바실러스 | < 0.22 ㎛ | 109.8 |
| 실시예 2-1 | 락토바실러스 | 100 kDa < < 0.22 ㎛ | 168.8 |
| 비교예 2-3 | 락토바실러스 | < 100 kDa | 79.5 |
| 실시예 2-2 | 락토바실러스 | 30 kDa < < 100 kDa | 130.2 |
| 비교예 2-4 | 락토바실러스 | < 30 kDa | 32.4 |
| 비교예 2-5 | 락토바실러스 | 5 kDa < < 30 kDa | 42.9 |
| 비교예 2-6 | 락토바실러스 | < 5 kDa | 10.2 |
MRS Broth Basal medium에 말산 0.1%를 첨가하여 배지와 YM Broth Basal medium에 말산(MA) 0.1%를 첨가한 배지에 락토바실러스 플란타룸 유산균 균주와 사카로미세스세레비지에 효모 균주를 각각 접종하여 배양하였다. 배양액을 4 ℃에서 4000 rpm으로 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 0.22 ㎛ PES로 여과하였다. 배양 여과액을 100 kDa, 30 kDa의 막 여과장치에 각각 또는 단계별로 주입한 후, 여과하여 세포외소포를 회수하여 실시예 2-3 ~ 2-6을 제조하였다. 상기 내용을 표 7에 개시하였다.
| 실시예 | 균주 | 여과장치 조건 |
| 실시예 2-3 | 사카로미세스 | 30 kDa < < 100 kDa |
| 실시예 2-4 | 사카로미세스 | 100 kDa < < 0.22 ㎛ |
| 실시예 2-5 | 락토바실러스 | 30 kDa < < 100 kDa |
| 실시예 2-6 | 락토바실러스 | 100 kDa < < 0.22 ㎛ |
실험예 5. 콜라겐 분해효소 저해능 평가
피부노화가 진행됨에 따라 섬유아세포에서 콜라겐분해효소의 분비가 증가하여 콜라겐이 분해되고, 주름발생, 탄력감소, 피부장벽기능 약화에 영향을 주게 된다. 본 발명의 조성물이 피부노화개선 및 장벽개선에 미치는 영향을 확인하기 위해 섬유아세포에서 시료 처리에 의한 콜라겐 분해효소 저해능을 평가하였다.
인간유래 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast)를 24 well plate에 6 x 104 cells/ml의 농도로 접종하고, 24시간 동안 배양한 뒤, 시료를 처리하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배지를 회수하여 세포외로 분비된 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)을 ELISA(Enzyme-linked immuosorbent assay)로 확인하여 콜라겐분해효소 저해율을 계산하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, 실시예 2-3, 실시예 2-4, 실시예 2-5 및 실시예 2-6은 섬유아세포에서 콜라겐 분해효소의 분비를 줄이는데 유효한 것으로 확인하였다.
실험예 6. 피부장벽 개선 평가
20명의 피시험자를 대상으로, 피부에 SLS(소듐라우릴설페이트, Sodium lauryl sulfate)를 처리하고, 시료를 사용하기 전과 사용한 후에 동일한 부위 피부의 수분손실량(g/h/m2)을 경피수분손실량측정기(Tewameter: Courage + Khazaka electronic사)로 측정하여 피부장벽 개선을 확인하였다. 대조군 대비 수분손실량이 감소하면 피부장벽 강화 효능이 있는 것으로 판단하였다.
도 6 및 도 7에 도시한 바와 같이, 실시예 2-3과 실시예 2-6에서 제조된 세포외소포는 손상된 피부장벽을 개선하는 효과가 있는 것으로 확인하였다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
Claims (14)
- 사카로미세스 세레비지에 및 락토바실러스 프란타룸 중 하나 이상으로부터 유래된 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하는 피부 개선용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 사카로미세스 세레비지에 및 락토바실러스 프란타룸으로부터 유래된 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하는 피부 개선용 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 콜라겐 합성 증가, 콜라겐 분해효소 억제 및 마이크로바이옴을 조절하는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하는 피부 개선용 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 세포외소포의 크기가 30~150 nm인 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하는 피부 개선용 조성물.
- 사카로미세스 세레비지에 또는 락토바실러스 프란타룸을 YM Broth Basal medium 또는 MRS Broth Basal medium에 트레할로스(TR: Trehalose), 아스코르브산(AS), 시트르산(CI) 및 말산(MA)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하여, 프로바이오틱스 세포외소포를 제조하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 배지에서 배양하는 단계에서 제조된 배양액을 원심분리하고, 상층액을 0.22 ㎛ PES로 여과하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 세포외소포를 제조하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 30 kDa ~ 0.22 ㎛의 막 여과장치에서 여과하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 세포외소포를 제조하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 피부 개선용 조성물이 부틸렌글리콜, 헥산디올, 에틸헥실글리세린 및 페녹시에탄올로부터 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하는 피부 개선용 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 피부 개선용 조성물이 화장수, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 팩, 젤, 로션, 연고, 패치 및 분무제로 이루어지는 군으로부턴 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하는 피부 개선용 조성물.
- 유효성분을 피부 또는 세포 또는 세포외소포 내로 전달하기 위한 제 1 항에 따른 프로바이오틱스 세포외소포를 함유하는 세포외소포 전달체.
- 제 10 항에 따른 상기 세포외소포 전달체를 이용하여, 유효성분을 미생물 배양시 세포외소포 내로 투입하여 자연적으로 유효성분을 캡슐화하거나, 또는 유효성분을 미생물 배양시 세포외소포 내로 투입한 후 초음파 처리를 통해 인위적으로 세포외소포 내에서 캡슐화하는, 유효성분의 캡슐화 방법.
- 제 1 항에 따른 프로바이오틱스 세포외소포를 포함하는 피부 개선용 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물 피부의 상태를 개선하는 미용방법.
- 제 12 항에 있어서, (a) 상기 피부 개선용 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 피부 개선용 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함하는, 미용방법.
- 제 13 항에 있어서, (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 피부 개선용 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함하는, 미용방법.
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-
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