JP6615609B2 - 抗菌ペプチダーゼの合成を活性化する活性剤としての亜麻仁抽出物の使用 - Google Patents
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Description
−植物由来のタンパク質を抽出する工程、
−生物学的に活性なペプチド化合物を放出する、制御された加水分解の工程。
−植物由来のエンドプロテアーゼ類(例えば、パパイン、ブロメライン、フィシンなど)および/または微生物由来のエンドプロテアーゼ類(Aspergillus、Rhizopus、Bacillus、Alcalase(登録商標)など)、
−および/またはセルラーゼもしくはセルラーゼ類の混合物(例えば、Celluclast(登録商標)CL)。
乾燥抽出物の重量として0.1〜5g/lのペプチド化合物、
および、乾燥抽出物の重量として0.1〜2g/lの糖、
を含む。
−乾燥抽出物の重量として1.5〜3.5g/lのペプチド化合物、
−および、乾燥抽出物の重量として約0.3g/lの糖。
第一の工程では、1kgの亜麻仁種子(Linum usitatissimum L.)を穀物粉砕機で粉砕する。得られた粉(1kg)を、10リットルのヘキサンの存在下におく。次いでその混合物を室温で2時間撹拌して、原料の脱脂を行う。濾過および真空乾燥の後、得られた粉末を、1%のポリビニルポリピロリドン(Polyclar V ISP)を含んでいる800mlのアルカリ水溶液(1/10希釈)pH10の中に懸濁する。この混合物を室温で2時間撹拌して、その溶液の画分を可溶化することを可能にする。この抽出段階の後、媒体を遠心分離によって清澄化し、次いでプレート上で濾過する。亜麻仁の可溶性画分を含むこの濾液を、次に、中性または酸性の媒体中でイオン力を変化することによってタンパク質沈殿に供し、これによって、可溶性の炭化水素成分、脂質および核酸を除去することを可能にする。この媒体をpH3.5にする。その上清を取り出して、次にその沈殿物をエタノールで洗浄し、次いでその溶媒を真空乾燥でエバポレートする。
−タンパク質:78%
−炭水化物:20%
−脂質<2%。
本研究の目的は、DEFB1転写発現に対する、およびLL−37転写発現に対する、実施例1による亜麻仁抽出物の影響を決定することである。DEFB1メッセンジャーRNAの発現レベル、およびLL−37メッセンジャーRNAの発現レベルを評価するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)定量を行った。
NHK細胞(正常な初代ヒトケラチン生成細胞)を、実施例1による1%亜麻仁抽出物を用いて、48時間の間に1日に2回処理するか、または処理しない(コントロール)。
DEFB1メッセンジャーRNAの発現レベルの31%の増大およびLL−37メッセンジャーRNAの発現レベルの23%の増大が、未処理の細胞と比較して、実施例1による亜麻仁抽出物での48時間の処理の後に細胞で観察される。
実施例1による亜麻仁抽出物は、DEFB1をコードするメッセンジャーRNAの発現レベルおよびLL−37をコードするメッセンジャーRNAの発現レベルを、正常なヒトケラチン生成細胞において増大する。
本研究の目的は、抗菌性タンパク質DEFB1の発現および抗菌性タンパク質LL−37の発現に対する、実施例1による亜麻仁抽出物の影響を決定することである。このために、DEFB1タンパク質の発現レベルおよびLL−37タンパク質の発現レベルを、実施例1による1%亜麻仁抽出物を用いて24時間処理するか、または処理なし(コントロール)のパラフィン中に包埋したケラチン生成細胞で免疫細胞化学によって評価した。
NHK細胞(正常な初代ヒトケラチン生成細胞)を培養した。次いで、これらの細胞を10%ホルモルで固定し、次いでパラフィン中に包埋する。次いで、細胞ブロックを、ミクロトームナイフを用いて4μmの厚みを有する切片に切断し、次いでスライドに移す。
その結果によって、24時間後に実施例1による1%亜麻仁抽出物で処理したケラチン生成細胞では、未処理のケラチン生成細胞と比較して、抗菌性タンパク質DEFB1の発現の118%の増大、および抗菌性タンパク質LL−37の発現の136%の増大があることが示される。
実施例1による亜麻仁抽出物は、ケラチン生成細胞中の、抗菌性タンパク質DEFB1の発現、および抗菌性タンパク質LL−37の発現を刺激する。
本発明の目的は、DEFB1の発現に対する、およびLL−37の発現に対する、実施例1による亜麻仁抽出物の影響を決定することである。DEFB1およびLL−37の発現レベルを評価するために、エキソビボの皮膚切片に対するDEFB1およびLL−37の免疫標識を行った。
ヒトの皮膚生検を、エキソビボにおいて培養物中で保持し、次いで、実施例1による亜麻仁抽出物の1%溶液の20μlの局所適用によって24時間の間に1日2回処理するか、または処理しない。
ヒト皮膚生検に対する実施例1による亜麻仁抽出物での処置の結果として、抗菌性タンパク質DEFB1の発現に対する、および抗菌性タンパク質LL−37の発現に対するポジティブな効果が得られる。
本研究の目的は、顆粒層および角質層の境界に存在する抗菌性タンパク質貯蔵部位である層状体の数に対する実施例1による亜麻仁抽出物の影響を決定することである。層状体を観察するために、エキソビボ皮膚切片から得られる電子顕微鏡画像を撮った。
ヒト皮膚生検を、エキソビボの培養物中で保持し、次いで、実施例1による亜麻仁抽出物の1%溶液の20μlの局所適用によって24時間の間に1日1回処置するか、または処置しない。
電子顕微鏡画像の観察によって、実施例1による亜麻仁抽出物で処理された皮膚生検が、未処置の皮膚生検と比較して顆粒層および角質層の境界でより多数の層状体を有することが示される。
抗菌性ペプチド貯蔵部位である層状体の数に対するポジティブな影響が、ヒト皮膚生検に対して実施例1による亜麻仁抽出物での処理の結果として観察される。
本研究の目的は、Staphylococcus aureusの細菌増殖に対して、実施例1による亜麻仁抽出物による刺激の結果としてケラチン生成細胞で得られた抗菌性タンパク質の合成の増大の影響を決定することである。このために、放射状拡散試験を行った。
NHK細胞(正常な初代ヒトケラチン生成細胞)を、実施例1による亜麻仁抽出物を用いて、24時間の間に1日2回処理するか、または処理しない(コントロール)。ネガティブコントロールを得るために、細胞となんら接触のないNHK培養培地を用いる。次いで、細胞の上清を回収し、150μlを用いて、6mmの直径を有するディスクを浸漬する。次いで、このディスクを塊で播種したS.aureus培養物上に置く(各々の条件について4つのディスクおよびペトリ皿)。48時間後、放射拡散領域が観察される。阻害エリアの写真をQImaging Micropublisher 3.3 RTVカメラを用いて撮って、それらの直径をQ−キャプチャー Pro7(商標)ソフトウェアプログラムによって算出する。
その結果によって、未処理のケラチン生成細胞と比較して、24時間後、実施例1による1%の亜麻仁抽出物で処理したケラチン生成細胞の培養物から得られた上清の適用後、細菌増殖阻害エリアの直径は19%増大していることが示される。
実施例1による亜麻仁抽出物によって、細菌増殖の阻害が可能になる。
本研究の目的は、Staphylococcus aureusの細菌増殖に対する、実施例1による亜麻仁抽出物による刺激の結果としてケラチン生成細胞によって得られた抗菌性タンパク質の合成増大の効果を決定することである。このために、細菌増殖阻害試験を行った。
NHK細胞(正常な初代ヒトケラチン生成細胞)を、実施例1による亜麻仁抽出物を用いて48時間の間に1日に2回処理するか、または処理しない(コントロール)。ネガティブコントロールを得るために、細胞とはなんら接触していないNHK培養培地を用いる。次いで、細胞の上清を回収して、200μlを用いて、S.aureusの溶液を混入させる。この上清/S.aureusの混合物を、37℃で3時間インキュベートし、次いでTSA寒天ディッシュ上に展開する。48時間後、S.aureusコロニーが発達し、裸眼で見える。ディッシュの写真をQImaging Micropublisher 3.3RTVで撮る。
その結果によって、実施例1による1%亜麻仁抽出物で処理したケラチン生成細胞の培養物から上清を得た条件下で発達したS.aureusのコロニーの数は24時間後に、未処理のケラチン生成細胞と比較して、79%低下していることが示される。
実施例1による亜麻仁抽出物によって、細菌コロニーの数を低下することが可能になる。
保護用の鎮静デイ・クリーム
Claims (11)
- 微生物のストレスによって生じる皮膚、毛包、皮脂腺および汗腺の炎症の治療用の薬学的組成物の製造のための、亜麻仁タンパク質の加水分解物の使用であって、前記亜麻仁タンパク質の加水分解物は、抗菌ペプチドであるディフェンシン及び/又はカテリシジンの発現レベルを増大させることにおける活性な抗菌剤として使用される、亜麻仁タンパク質の加水分解物の使用。
- 前記亜麻仁タンパク質の加水分解物が、乾燥抽出物の重量として少なくとも0.1〜5g/lのペプチド化合物、乾燥抽出物の重量として0.1〜2g/lの糖を含み、かつ5kDa未満の分子量を有するペプチド化合物を含む、請求項1に記載の亜麻仁タンパク質の加水分解物の使用。
- 皮膚の免疫防御を刺激するために抗菌ペプチドであるディフェンシン及び/又はカテリシジンの発現レベルを増大させることにおける使用のための請求項1〜2のいずれか1項に記載の亜麻仁タンパク質の加水分解物の使用。
- 皮膚、体毛、まつげ、眉毛、爪および髪のStaphylococcus aureus感染の処置において抗菌ペプチドであるディフェンシン及び/又はカテリシジンの発現レベルを増大させることにおける使用のための請求項1〜3のいずれか1項に記載の亜麻仁タンパク質の加水分解物の使用。
- 前記ディフェンシンがDEFB1であり前記カテリシジンがLL−37である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の亜麻仁タンパク質の加水分解物の使用。
- 前記亜麻仁タンパク質の加水分解がシステインエンドペプチターゼによりなされる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の亜麻仁タンパク質の加水分解物の使用。
- 抗菌ペプチドであるディフェンシン及び/又はカテリシジンの発現レベルを増大させることにより皮膚、体毛、まつげ、眉毛、爪および髪の片利共生微生物叢を保護する薬学的組成物の製造のための、亜麻仁タンパク質の加水分解物の使用。
- 前記亜麻仁タンパク質の加水分解物が、乾燥抽出物の重量として少なくとも0.1〜5g/lのペプチド化合物、乾燥抽出物の重量として0.1〜2g/lの糖を含み、かつ5kDa未満の分子量を有するペプチド化合物を含む、請求項7に記載の亜麻仁タンパク質の加水分解物の使用。
- 前記ディフェンシンがDEFB1であり前記カテリシジンがLL−37である、請求項7〜8のいずれか1項に記載の亜麻仁タンパク質の加水分解物の使用。
- 前記亜麻仁タンパク質の加水分解がシステインエンドペプチターゼによりなされる、請求項7〜9のいずれか1項に記載の亜麻仁タンパク質の加水分解物の使用。
- 抗菌ペプチドであるディフェンシン及び/又はカテリシジンの発現レベルを増大させることにより皮膚、体毛、まつげ、眉毛、爪および髪の片利共生微生物叢を保護する薬学的組成物の製造のための、亜麻仁タンパク質の加水分解物の使用であって、前記薬学的組成物は、生理学的に許容される媒体を含み、皮膚への局所投与のためのものである、請求項7〜10のいずれか一項に記載の亜麻仁タンパク質の加水分解物の使用。
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