KR20180080319A - 소형 rna 참나리 추출물을 포함하는 국소 조성물 및 노화의 피부 징후를 감소시키는 미용 관리 방법 - Google Patents

소형 rna 참나리 추출물을 포함하는 국소 조성물 및 노화의 피부 징후를 감소시키는 미용 관리 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 저분자량 RNA가 풍부한 참나리(Lilium tigrinum)의 추출물을 포함하는 국소 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 참나리의 추출물을 생리학적으로 허용되는 매질 중에 포함하는 조성물을 국소 도포하여 노화 및 광-노화의 피부 징후를 감소시킴을 포함하는 미용 관리 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포 생존력을 개선하고, 미립자 물질 및 DNA 손상에 대한 세포 보호를 개선하고, 세포 노쇠를 감소시키는 미용 처리 방법에 관한 것이다.

Description

소형 RNA 참나리 추출물을 포함하는 국소 조성물 및 노화의 피부 징후를 감소시키는 미용 관리 방법
본 발명은 미용 분야, 보다 구체적으로 노화의 피부 징후를 감소시키는 국소 조성물 및 방법의 분야에 관한 것이다.
본 발명은 저분자량 RNA가 풍부한 참나리(Lilium tigrinum)의 추출물을 포함하는 국소 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 소형 RNA 참나리의 추출물을 생리학적으로 허용되는 매질 중에 포함하는 조성물을 국소 도포하여 노화 및 광-노화의 피부 징후를 감소시킴을 포함하는 미용 관리 방법에 관한 것이다.
소형 RNA와 마이크로 RNA는 생리 과정을 조절하는 식물과 포유동물에서 발견되는 세포 성분이다. 피부에서, 주요 생리 과정은 피부 항상성(표피 재생, 피부 색소침착 조절, 진피 매트릭스 발현, 산화 스트레스에 대한 보호)의 조절인자로 작용하는 마이크로 RNA에 의해 조절된다.
실험실에서 수행되는 리보핵산(RNA, 저분자량 RNA)을 추출하기 위한 고전적인 프로토콜은 페놀 및 클로로포름과 같은 용매의 사용을 포함하지만, 독성이 있고 적합한 화장품 용매로 간주되지 않는다(문헌[Zumbo, P. 2014 "Phenol-chloroform Extraction", 2014; kit Sigma, mirPremier™ microRNA Isolation Kit]).
문헌 국제특허공개 제84/03835호는, 예를 들어 공지되어 있고, 순수한 DNA가 풍부한 식물 배아의 수성 추출물을 수득하는 방법을 기술하고 있고, 상기 방법은 음이온성 세제, 및 클로로포름 및 옥탄올을 비롯한 다양한 용매로 처리하는 것을 포함하여 많은 처리 단계를 포함하는데, 수득한 제품에 독성 미량물질을 남기고, 이에 따라 화장품에 사용할 수 없다.
미국특허공개 제2003/0092168호 및 프랑스특허 제2831168호가 또한 공지되어 있고, 이들은 식물 물질, 특히 DNA 또는 RNA가 풍부한 식물 배아 또는 종자로부터 핵산(DNA 및/또는 RNA)이 풍부한 추출물을 수득하는 방법을 기술한다. 상기 방법은 셀룰로스분해 효소의 존재 하에 초기 pH 9 내지 13의 수성 매질에서 식물 물질을 추출하는 단계(이때, pH는 중성이 되는 경향이 있음), 추출물을 프로테아제로 처리하는 단계, 및 불용성 물질을 분리하여 정제된 수성 추출물을 회수하는 단계로 구성된다. 이러한 방식으로 수득된 동결건조 생성물은 특히 탄수화물, 단백질, 미네랄, 비타민 B 및 지질 이외에 0.1 내지 1 중량%의 DNA, 0.2 내지 1.5 중량%의 RNA를 함유할 수 있다. 상기 문헌에 제공된 데이터에 따르면, 이에 따라 수득된 동결건조 생성물은 특히 1 내지 10 mg/L의 DNA 및 10 내지 75 mg/L의 RNA를 함유하는 것으로 보인다.
상기 기술된 상황과 관련하여, 본 발명이 해결하고자 고안된 문제는 핵산 형태의 RNA만을 포함하고 피부 항상성을 개선함으로써 피부의 노화를 방지하는 이점 및 식물 소형 RNA 또는 마이크로 RNA를 공급함으로써 보호를 제공하는 국소 도포를 위한 신규한 조성물을 제공하는 것이다.
상기 도입부는 단지 당해 분야에 직면한 문제의 성질을 더 잘 이해하기 위해 제시된 것이고, 선행 기술에 대한 인정으로서 어떠한 방식으로도 해석되어서는 안 되고, 본원에서의 어떤 참고문헌의 인용도 그러한 참고문헌이 본원에 대한 "선행 기술"을 구성하는 것을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
본 발명자들은 저분자량 RNA가 풍부한 참나리 구근의 추출물이 노화 및 광-노화의 피부 징후를 감소시킬 수 있음을 실제로 입증했다. 보다 구체적으로, 그들은 추출물이 세포 생존력, 미립자 물질 및 DNA 손상에 대한 세포 보호를 개선하고, 피부 세포외 매트릭스를 개선하고, 세포 노쇠를 감소시킬 수 있음을 보여줄 수 있다.
본 발명의 주요 양상은 150개 뉴클레오타이드의 최대 길이를 갖는 저분자량 RNA(리보핵산)가 풍부한 참나리의 추출물을 생리학적으로 허용되는 매질 중에 포함하는 국소 조성물에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 저분자량 RNA가 풍부한 참나리 추출물의 효과량을 생리학적으로 허용되는 매질 중에 포함하는 국소 조성물을 도포함을 포함하는, 피부를 처리하여 노화 및 광-노화의 징후를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 또한 저분자량 RNA가 풍부한 참나리의 추출물의 효과량을 생리학적으로 허용되는 매질 중에 포함하는 국소 조성물을 도포함을 포함하는, 세포 생존력을 개선하고, 미립자 물질 및 DNA 손상에 대한 세포 보호을 개선하고, 피부 세포외 매트릭스를 개선하고, 세포 노쇠를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 양태는 첨부된 도면에 의해 이해될 수 있다.
도 1은 환경 스트레스 저항성에 대한 본 발명의 참나리 추출물의 평가(락테이트 데하이드로게나제(LDH) 활성의 투여량으로 측정된 세포 생존력)를 도시한다.
도 2는 자외선(UV) 스트레스 후의 DNA 손상에 대한 본 발명의 참나리 추출물의 평가(DNA 손상은 "코멧(comet) 검정"을 사용하여 정량화됨)를 도시한다.
도 3은 세포외 기질 평가(트로포엘라스틴 발현)에 의한, 노화에 대한 본 발명의 참나리 추출물의 평가를 도시한다.
도 4는 노화 또는 노쇠에 대한 본 발명의 참나리 추출물의 평가(베타-갈락토시다제 활성 노쇠 마커)를 도시한다.
도 5는 광-노화 손상에 대한 피부 보존에 대한 본 발명의 참나리 추출물의 평가(ECM 구조에 관여하는 피브릴린의 평가)를 도시한다.
도 6은 광-노화 손상에 대한 피부 보존에 대한 본 발명의 참나리 추출물의 평가(ECM 구조에 관여하는 트로포엘라스틴의 평가)를 도시한다.
도 7은 세포 배양 및 처리를 위한 프로토콜을 도시한다.
도 8은 본 발명의 참나리 추출물로 처리된 19세 섬유아세포 내의 엘라스틴 부피를 도시한다.
도 9는 본 발명의 참나리 추출물로 처리된 62세 섬유아세포 내의 엘라스틴 부피를 도시한다.
도 10은 본 발명의 참나리 추출물로 처리된 19세 기증자로부터의 섬유아세포에서의 DNA 단편화를 도시한다.
도 11은 본 발명의 참나리 추출물로 처리된 62세 기증자로부터의 섬유아세포에서의 DNA 단편화를 도시한다.
본 발명의 상세한 양태가 본원에 개시되지만, 개시된 양태는 다양한 형태로 구현될 수 있는 본 발명의 단지 예시일 뿐이라는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 본원에 개시된 특정 구조 및 기능의 세부사항은 제한적으로 해석되어서는 안 되고, 당업자가 본 발명을 다양하게 사용하도록 교시하는 대표적인 기초로서만 해석되어야 한다.
본원에 사용된 모든 용어는, 달리 제공되지 않는 한, 일반적인 의미를 갖는 것으로 의도된다. 본 발명을 기술하고 청구할 목적으로, 하기 용어가 정의된다:
"노화 및 광-노화의 피부 징후"는 노화로 인한 피부 외관의 모든 변화, 예를 들어 피부의 엷어짐, 처짐, 수화의 손실 및 이완, 깊은 주름 및 미세 선, 경도 및 색조의 손실, 진피 위축, 피부 색조 균질화의 손실, 자외선 노출에 의해 야기된 피부의 임의의 다른 내부 열화, 검버섯(liver spot) 및 노화 반점(age spot)을 지칭한다. "일광 흑색점(Solar lentigo)", "노인성 색소반(Lentigo senilis)", "노인성 반점(Old age spot)", "노인성 주근깨(Senile freckle)"로도 지칭되는 검버섯은 태양으로부터의 자외선 노출로 인한 노화 및 광-노화와 관련된 피부의 결점이다. 그들은 밝은 갈색에서 빨간색 또는 검정색까지의 색상 범위이고, 태양에 가장 자주 노출되는 영역, 구체적으로 특히 손, 얼굴, 어깨, 팔, 이마, 및 대머리의 경우 두피에 위치한다.
"노화-방지 이점"은 비제한적으로 다음 중 하나 이상을 포함한다: (a) 미세 선 또는 주름의 치료, 감소 및/또는 예방; (b) 피부 모공 크기의 감소; (c) 피부 두께, 두둑함 및/또는 팽팽함의 개선; (d) 피부 유연 및/또는 부드러움의 개선; (e) 피부 색조, 광도 및/또는 선명도의 개선; (f) 프로콜라겐 및/또는 콜라겐 생성의 개선; (g) 피부 질감의 개선 및/또는 리텍스쳐리제이션(retexturization)의 촉진; (h) 피부 장벽 회복 및/또는 기능의 개선; (i) 피부 처짐 또는 위축의 치료 및/또는 예방; (j) 피부 윤곽의 외관 개선; (k) 피부 광택 및/또는 밝기의 복원; (l) 피부 내의 필수 영양소 및/또는 구성성분의 보충; (m) 폐경에 의해 감소된 피부 외관의 개선; (n) 피부 보습 및/또는 수화의 개선; 및 (o) 피부 탄력 및/또는 탄성 및/또는 경도의 개선.
"생리적으로 허용되는"은 본 발명에 따른 활성제 또는 상기 제제를 함유하는 조성물이 독성 또는 불내성 반응을 유발하지 않으면서 피부 또는 점막과 접촉하는데 적합함을 의미한다.
"생리학적으로 허용되는 매질"은 비제한적으로 독성 또는 불내성 반응을 유발하지 않으면서 피부 또는 점막과 접촉하는데 적합한, 미용 분야에서 일반적으로 사용되는 첨가제 또는 조용매, 및 제형, 습윤제, 계면활성제, 에멀젼화제 등에 필요한 보조제를 포함할 수 있는 대략 유체를 의미한다.
"국소" 또는 "국소적으로"는 본 발명의 참나리 추출물을 포함하는 조성물을 건강한 피부 영역에 도포하는 것을 지칭한다.
"국소 도포"는 피부 또는 점막의 표면 상에 본 발명의 펩타이드 또는 이를 함유하는 조성물의 도포 또는 스프레딩(spreading)을 의미한다.
"소형 RNA"는 150개 뉴클레오타이드의 최대 길이를 갖는 저분자량 비-코팅 RNA(리보핵산), 예컨대 임의 유형의 비-메신저 소형 RNA(단일 또는 이중 가닥), 예컨대 마이크로 RNA, 간섭 RNA, 인트론 RNA, 핵 또는 핵소체 소형 RNA, 또는 RNA의 임의의 단편을 지칭한다.
용어가 범위를 참조하여 식별될 때마다, 그 범위는 모든 요소를 명시적으로 개시하는 것으로 이해된다. 비제한적인 예로서, 1 내지 10%의 범위는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 및 10%, 및 1%와 10% 사이의 모든 값을 포함하는 것으로 이해된다.
2개 이상의 치환체가 열거된 대체물의 군으로부터 "선택되는" 것으로 지칭되는 경우, 이는 각각의 치환체가 다른 치환체의 동일성과는 독립적으로 그 군의 임의의 요소일 수 있음을 의미한다.
"%"는 중량%를 지칭하고, 달리 제공되지 않는 한, 조성물의 총 중량(즉, 피부에 도포하기 전에 첨가된 임의의 담체, 비히클, 용매, 충전제 또는 기타 성분을 포함함)을 기준으로 하는 성분의 중량%이다.
본원에 기재된 것은 150개 뉴클레오타이드의 최대 길이를 갖는 저분자량 RNA(리보핵산)가 풍부한 참나리의 추출물을 생리학적으로 허용되는 매질 중에서 수득하는 방법이다.
소형 RNA는 세포 생물학의 모든 양상에 영향을 미치는 조절 분자를 포함한다. 소형 RNA 및 특히 마이크로 RNA는 생리학적 과정을 조절하는 식물 및 포유동물에서 발견되는 세포 성분이다. 피부에서, 주요 생리 과정은 피부 항상성(표피 재생, 피부 색소침착 조절, 진피 매트릭스 발현, 산화 스트레스에 대한 보호)의 조절인자로 작용하는 마이크로 RNA에 의해 조절된다. 특히 식물성 소형 RNA와 식물성 마이크로 RNA를 함유한 참나리 추출물은 미용 분야에서 신규하다. 저분자량 RNA가 풍부한 참나리 구근의 추출물의 기대 이점은 식물 소형 RNA/마이크로 RNA를 공급하여 피부 항상성과 보호를 개선하고 피부 노화-방지 이점을 제공하는 것이다.
본 발명은 150개 뉴클레오타이드의 최대 길이를 갖는 저분자량 RNA(리보핵산)가 풍부한 참나리의 추출물을 생리학적으로 허용되는 매질 중에 포함하는 국소 조성물에 관한 것이다.
이러한 식물 추출물의 제조 방법은 프랑스특허 제1502361호에 기재되어 있다.
저분자량 RNA가 풍부한 참나리 구근의 추출물 제조
릴리아세아에(Liliaceae) 과의 참나리 구근으로부터 시작하여 저분자량의 소형 RNA(150개 뉴클레오티드의 최대 길이)가 풍부한 수성 추출물이 수득된다.
제1 단계에서, 제상 및 세척 후, 10%(w/w)의 참나리 구근을 증류수와 혼합하고, 예를 들어 100 g의 구근을 1 kg의 증류수에 넣은 후, 구근을 10분 동안 연마하고, 테트라나트륨 EDTA의 10 mM 최종 농도는 1 kg의 최종 부피에 대한 3.8 g에 상응한다. 이 단계에서, pH는 저분자량의 RNA가 풍부한 추출물의 최적 pH에 상응하는 10.5 내지 11로 조정된다.
이어서, 용액을 80℃에서 1시간 동안 진탕한다. 이 단계에서, 온도는 50 내지 80℃로 변할 수 있고, 진탕 시간은 또한 30 내지 1시간일 수 있고, 이러한 종의 경우, 1시간 동안 80℃의 온도는 최종 추출물 내의 저분자량 RNA에 관한 최적의 결과를 수득하기 위한 최적 온도이다. 이 단계의 끝에서, 순차 여과는 20 내지 50 μm에서 7 내지 20 μm까지 감소하는 다공도의 필터로 수행되어 고체 원료를 제거하고, 이어서 수성 추출물을 정화한다.
이 단계에서, pH를 측정하고, 필요에 따라 6 내지 6.5로 조정하여 추출물 중 저분자량 소형 RNA를 보존한다. pH가 너무 높으면 소형 RNA가 침전될 수 있다.
이어서, 0.2 내지 0.3 μm 필터 다공도의 멸균 여과까지 여과를 수행한다. 최종 추출물을, 30%의 글리세린 및 1.5%의 페녹시에탄올을 첨가하여 보존할 수 있다.
수득된 수성 추출물은 황색이고, 10 내지 25 g/kg의 건조 물질, 0.5 내지 5 g/kg의 단백질 단편, 5 내지 20 g/kg의 당, 100 내지 500 mg/kg의 페놀계 화합물, 및 10 내지 100 mg/kg의 저분자량 RNA(150개 뉴클레오타이드의 최대 길이를 가짐)를 함유한다.
그럼에도 불구하고, 동일한 종의 백합(참나리)의 경우, 수득된 추출물은 수확지, 작물 년령, 계절, 기후 조건 등과 같은 외부 인자에 따라 조성의 면에서 중요한 변이성을 나타낼 수 있다.
이러한 예에서, 본 발명자들은 보다 특히 17.9 g/kg의 건조 중량, 2.1 g/kg의 단백질 단편, 11.4 g/kg의 당, 200 mg/kg의 페놀계 화합물 및 54 mg/kg의 저분자량 RNA(150개 뉴클레오타이드의 최대 길이를 가짐)를 함유하는 수성 추출물을 수득하였다. 이어서, 추출물을 희석하고, 30%의 글리세린 및 1.5%의 페녹시에탄올을 첨가함으로써 보존하여 10 내지 12 g/kg의 최종 건조 중량 추출물, 4 내지 8 g/kg의 당 농도, 0.5 내지 1.5 g/kg의 단백질 단편 농도, 50 내지 200 mg/kg의 페놀계 화합물 농도, 15 내지 45 mg/kg의 저분자량 소형 RNA(150개 뉴클레오타이드의 최대 길이를 가짐) 함량을 수득한다.
최종 추출물에 대해 수행된 물리-화학적 분석은, 이러한 예에서, 참나리 추출물이 10 g/kg의 건조 중량을 갖고, 1 g/kg의 단백질 단편, 5.8 g/kg의 당, 100 mg/kg의 페놀계 화합물 및 30 ㎎/㎏의 저분자량 RNA(150개 뉴클레오타이드의 최대 길이를 가짐)를 함유함을 나타냈다. 추출물의 핵산 함량을 분석하기 위해 수행된 겔 전기영동은 RNA가 150개 뉴클레오티드 길이 이하의 분자량을 갖고, 추출물이 DNA(데옥시리보핵산)를 전혀 갖지 않음을 나타냈다.
본 발명의 주된 목적은 참나리 구근의 소형 RNA 추출물을 생리학적으로 허용되는 매질 중에 포함하는 국소 도포를 위한 미용 조성물이고, 이때 상기 참나리의 추출물은 30%의 글리세린 및 1.5%의 페녹시에탄올 중에서, 10 내지 12 g/kg의 건조 중량, 4 내지 8 g/kg의 당 농도, 0.5 내지 1.5 g/kg의 단백질 단편 농도, 50 내지 200 mg/kg의 페놀계 화합물 농도 및 15 내지 45 mg/kg의 150개 뉴클레오타이드의 최대 길이를 갖는 RNA 함량을 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 소형 RNA 참나리 추출물은 10 g/kg의 건조 중량을 갖고, 1 g/kg의 단백질 단편, 5.8 g/kg의 당, 100 mg/kg의 페놀계 화합물 및 30 mg/kg의 150개 뉴클레오타이드의 최대 길이를 갖는 저분자량 RNA를 함유한다.
다른 양태에서, 본 발명의 저분자량 RNA가 풍부한 참나리의 추출물은 본 발명의 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1 내지 5%, 바람직하게는 0.2 내지 2.5%의 농도로 본 발명의 조성물에 존재한다.
본 발명의 국소 조성물은 특히 수성, 수-알코올성 또는 유성 용액; 수중유 또는 유중수 에멀젼 또는 다중 에멀젼; 수성 또는 무수 겔; 콜로이드의 형태일 수 있다. 이러한 조성물은 또한 피부, 점막, 입술 및/또는 피부 부속기관 상의 도포에 적합한 크림, 현탁액 또는 분말의 형태일 수 있다. 이러한 조성물은 대략 유체일 수 있거나, 크림, 로션, 밀크, 세럼, 포마드, 크림, 페이스트 또는 폼의 외관을 가질 수 있다. 이들은 또한 막대와 같은 고체 형태일 수 있거나, 에어로졸 형태로 피부에 도포될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 조성물은 미용 관리 조성물이다.
본 발명의 국소 조성물은 미용 분야에 통상적으로 사용되는 임의의 첨가제, 및 이러한 제형에 필요한 보조제, 예컨대 조용매(에탄올, 글리세롤, 벤질 알코올, 보습제 등), 증점제, 희석제, 에멀젼화제, 산화방지제, 착색제, 선스크린, 안료, 충전제, 보존제, 향수, 냄새 흡수제, 정유, 미량 원소, 필수 지방산, 계면활성제, 필름-형성 중합체, 화학 또는 미네랄 필터, 수화제 또는 열수 등을 포함한다. 예를 들어, 천연 유형의 수용성 중합체, 예컨대 다당류 또는 폴리펩타이드, 메틸 셀룰로스 또는 하이드록시프로필 셀룰로스 유형의 셀룰로스계 유도체, 또는 합성 중합체, 폴록사머, 카보머, 실록산, PVA 또는 PVP, 및 ISP 회사에서 시판 중인 중합체를 인용하는 것이 가능하다.
임의의 경우에, 당업자는 이들 보조제 및 이들의 비율이 본 발명에 따른 조성물에서 요구되는 유리한 성질을 방해하지 않도록 선택할 수 있다. 이러한 보조제는, 예를 들어 조성물의 총 중량의 0.01 내지 20%의 농도로 존재할 수 있다. 본 발명의 조성물이 에멀젼인 경우, 지방 상은 조성물의 총 중량에 대하여 5 내지 80 중량%, 바람직하게는 5 내지 50 중량%를 나타낼 수 있다. 조성물에 사용되는 에멀젼화제 및 공-에멀젼화제는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 것으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 이들은 조성물의 총 중량에 대하여 0.3 내지 30 중량%의 비율로 사용될 수 있다.
물론, 본 발명의 참나리의 소형 RNA 추출물은 단독으로 또는 다른 활성 성분과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 미용 관리 조성물은 또한 피부의 생리 기능(예컨대, 재생)을 개선하도록 의도되는 하나 이상의 다른 활성 성분, 노화-방지, 주름-방지, 증점, 항-유리 라디칼, 당화-방지, 수화, 살균, 살진균, 각질용해, 근육 이완, 박리 및 조색 성분, 진피 거대분자의 합성 또는 에너지 대사를 자극하는 성분, 피부 분화, 색소침착 또는 탈색소를 조절하는 성분, 마이크로순환을 자극하는 성분, 선스크린 또는 메탈로프로테이나제 억제 성분을 함유한다.
한 양태에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 참나리의 소형 RNA 추출물 이외에 하기 성분을 포함할 수 있다:
- 선스크린, 자외선 및 적외선 스크린,
- 유리 라디칼-방지 성분,
- DHEA(데하이드로에피안드로스테론),
- 데하이드로아세트산(DHA),
- 천연 또는 합성 피토스테롤,
- 알파- 및 베타-하이드록시산, 실라놀,
- 당 아민, 글루코사민, D-글루코사민, N-아세틸-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민, 만노사민, N-아세틸 만노사민, 갈락토사민, N-아세틸 갈락토사민,
- 폴리페놀, 이소플라본, 플라보노이드, 예컨대 포도 추출물, 소나무 추출물, 올리브 추출물,
- 지질, 예컨대 세라마이드 또는 인지질,
- 동물성 오일, 예컨대 스쿠알렌 또는 스쿠알란,
- 식물성 오일, 예컨대 아몬드유, 코코넛유, 피마자유, 호호바유, 올리브유, 유채씨유, 땅콩유, 해바라기유, 밀배아유, 옥수수배아유, 대두유, 면화유, 알팔파유, 양귀비유, 호박씨유, 달맞이꽃유, 밀레유, 보리유, 호밀유, 잇꽃유, 패션유, 헤이즐넛유, 야자유, 살구씨유, 아보카도유, 금잔화유, 에톡실화 식물성 오일 또는 시어 버터,
상기 화합물은 천연물, 예컨대 식물의 펩타이드 가수분해물, 또는 또한 합성물, 예컨대 펩타이드일 수 있다.
본 발명은 또한 노화 및 광-노화의 피부 징후를 감소시키기 위한, 저분자량 RNA가 풍부한 참나리의 추출물의 효과량을 포함하는 국소 조성물의 미용 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 저분자량 RNA가 풍부한 참나리의 추출물의 효과량을 생리학적으로 허용되는 매질 중에 포함하는 국소 조성물을 도포함을 포함하는, 노화 및 광-노화의 피부 징후를 감소시키는 피부 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 저분자량 RNA가 풍부한 참나리의 추출물의 효과량을 생리학적으로 허용되는 매질 중에 포함하는 국소 조성물을 도포함을 포함하는, 세포 생존력을 개선하고, 미립자 물질 및 DNA 손상에 대한 세포 보호를 개선하고, 세포 노쇠를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본 발명은 오염에 대한 세포 보호 및 미립자 물질에 대한 세포 보호를 개선하는 미용 관리 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 UV 유도된 DNA 손상에 대한 세포 보호를 개선하는 미용 관리 방법의 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 이점 및 특징은 예시적이고 비제한적인 목적을 위해 제공되는 하기 실시예를 고려하여 더욱 명확해질 것이다.
실시예 1: 환경 스트레스 저항성(세포 생존력)에 대한 소형 RNA 참나리 추출물의 평가
이 연구의 목적은 환경 스트레스 후에 참나리의 추출물이 세포 생존력에 대한 효과를 나타내는 것이다. 환경 스트레스는 오염 미립자 물질 도포(PM<4 μm, NIST2786)에 의해 유발된다. 세포 생존력은 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 활성제의 투여량으로 측정된다. LDH는 락테이트에서 피루베이트의 전환을 촉진하는 옥시도리덕타제 효소이다. 이의 활성은 조직 및 세포에서 병변 및 독성의 존재와 연관된다.
프로토콜: 정상 인간 각질형성 세포를 배양 배지에서 1/500 eme로 희석된 본 발명에 따른 참나리 추출물의 용액으로 48시간 동안 하루에 2회 처리하여 0.2% 부피/부피의 최종 농도를 야기하였다. 치료가 끝나기 24시간 전에, PM<4 μm가 70 μg/mL로 도포되었다.
처리 후, LDH 활성 검정을 공급자 권장사항에 따라 수행하였다: "락테이트 데하이드로게나제 활성 검정 키트"(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, 등록상표), MAK066).
결과: 도 1에 도시된 바와 같이, 48시간 동안 0.2%의 참나리 추출물에 의한 처리는 LDH 활성 및 이에 따른 세포 생존력에 대한 어떠한 영향도 나타내지 않았다. 24시간 동안 70 μg/mL의 PM<4 μM의 도포는 LDH 활성의 매우 유의한(스튜턴트(Student) t-시험) 증가를 유도하였고, 이는 세포 생존력의 강한 감소의 근본이다. PM<4 μm 도포와 동시에 48시간 동안 0.2%의 참나리 추출물에 의한 처리는 환경 스트레스에 의해 유도된 LDH 활성을 유의하게 감소시킨다.
결론: 0.2%의 참나리 추출물은 각질세포의 생존력에 대한 환경 스트레스의 영향을 감소시켰다.
실시예 2: UV 스트레스 후 DNA 손상에 대한 소형 RNA 참나리 추출물의 평가
이 연구의 목적은 자외선 스트레스 후 DNA 손상에 대한 참나리 추출물의 긍정적인 효과를 나타내는 것이다. DNA 손상은 "단일 세포 겔 전기영동(SCGE)"으로도 공지된 "코멧 검정"을 사용하여 정량화되고, 이는 개별 세포에서 단일 및 이중 가닥 DNA 파괴의 검출을 가능하게 하는 마이크로 전기영동 기술이다.
프로토콜: 정상 인간 섬유아세포를 배양 배지에서 1/500 eme로 희석된 본 발명에 따른 참나리 추출물의 용액으로 48시간 동안 하루 2회 처리하여 0.2% 부피/부피의 최종 농도를 유도하였다. 처리 종료 24시간 전에, 세포에 100 mJ/㎠ UVB를 조사하였다.
처리 후, 세포를 아가로스 겔에 넣고, 세제 및 소금을 함유하는 완충액에 용해시켰다. DNA가 변성되고 짧은 전기영동이 수행된다(25 V, 300 mA, 30분). 프로피듐 요오다이드 염색 후, 파괴되지 않은 미생물 DNA는 직경이 25 내지 35 μm인 구처럼 보인다. 손상된 세포의 DNA는 파괴 횟수에 비례하여 애노드 쪽으로 뻗어있다. 검출된 병변은 가닥 파괴 및 알칼리 불안정 부위를 포함한다. 올리브 등(문헌[Olive et al. (1990)])은 코멧 길이(μm) 및 원위 부분의 DNA 비율을 고려한 "테일 모멘트(Tail Moment)" 매개 변수를 정의하였다.
결과: 도 2에 도시된 바와 같이, UV 스트레스는 DNA 손상의 매우 유의한 증가(윌콕슨(Wilcoxon) 시험)를 유발하였다. UV 조사와 동시에 48시간 동안 0.2% 참나리 추출물에 의한 치료는 UV에 의한 DNA 손상을 유의하게 감소시켰다.
결론: 0.2%로 도포된 참나리 추출물은 UVB에 의해 유발된 DNA 손상으로부터 세포를 보호하였다.
실시예 3: 세포외 기질 평가에 의한 노화 및 노쇠에 대한 소형 RNA 참나리 추출물의 평가
이 연구의 목적은 먼저 노화(트로포엘라스틴 발현에 관해 세포외 매트릭스(ECM) 평가에 의함) 및 노쇠(베타-갈락토시다제 활성 노화 마커를 사용함)에 대한 참나리 추출물의 효과를 나타내는 것이다.
프로토콜:
트로포엘라스틴의 평가:
정상 인간 섬유아세포를 P15까지 복제적 노쇠에 의해 노화시켰다.
P6 및 P15의 세포를 배양 배지에서 1/500 eme로 희석된 본 발명에 따른 참나리 추출물로 48시간 동안 하루 2회 처리하여 0.2% 부피/부피의 최종 농도를 야기하였다.
항-트로포엘라스틴 항체에 의한 면역표지를 위해, 세포를 세척하고 차가운 메탄올로 고정시켰다. 이어서, 세포를 형광 염료와 커플링된 특정 항-트로포엘라스틴(압캠(Abcam) 참조번호 ab21605, 토끼 다클론성) 및 이어서 적합한 2차 항체의 존재 하에 항온처리하였다. 특정 배지에 장착한 후, 슬라이드를 형광 현미경(제이스 악시오버트(Zeiss Axiovert) 200M 현미경)으로 관찰하였다. 볼로시티(Volocity, 등록상표) 6.3 소프트웨어(퍼킨엘머 인코포레이티드(PerkinElmer, Inc.))를 사용하여 이미지를 분석함으로써, 형광 강도를 정량화시켰다.
노쇠 평가:
정상 인간 섬유아세포를 P15까지 복제적 노쇠에 의해 노화시켰다.
P15의 세포를 배양 배지에서 1/500 eme로 희석된 본 발명에 따른 참나리 추출물로 48시간 동안 하루 2회 처리하여 0.2% 부피/부피의 최종 농도를 야기하였다. 젊은 대조군인 미처리된 P8을 첨가하였다.
SA 베타-갈 활성 염색을 위해, 세포를 먼저 세척하고, 고정하였다. 이어서, 베타-갈락토시다제 염색 용액으로 밤새 항온처리하였다. 특정 배지에 장착한 후, 슬라이드를 광학 현미경(니콘 이클립스(Nikon Eclipse) E600 현미경)으로 관찰하였다. 블루 강도는 볼로시티(등록상표) 6.3 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석함으로써 정량화시켰다. 세포 수에 의한 정규화를 수행하였다.
결과:
트로포엘라스틴의 평가(도 3):
48시간 동안 0.2%의 참나리의 용액에 의한 처리는 섬유아세포, 비-노쇠(P6) 및 노쇠(P15)에 대한 트로포엘라스틴 발현에서 유의하게 높은 증가를 나타냈다(스튜던트 t-시험).
노쇠의 평가(도 4):
예상대로, 베타-갈락토시다제 활성은 젊은 세포(P8)에 비해 복제된 노화 섬유아세포(P15)에서 증가하였다. 48시간 동안 0.2%의 참나리 추출물에 의한 처리는 유발된 노쇠를 유의하게 감소시켰다(스튜던트 t-시험).
결론: 0.2%의 참나리 추출물은 비-노쇠 및 노쇠 세포에서 트로포엘라스틴 발현의 자극에 의해 ECM을 노화로부터 보존하였고, 복제 노쇠를 감소시켰다.
실시예 4:
광-노화 손상에 대한 피부 보존에 대한 소형 RNA 참나리 추출물의 평가
이 연구의 목적은 UV 스트레스에 의해 유발된 광-노화 손상에 대한 피부에 대한 참나리 추출물의 긍정적인 효과를 나타내는 것이다. ECM 구조와 관련된 피브릴린과 트로포엘라스틴을 평가한다.
프로토콜: 직경 6 mm의 정상 인간 피부 생검을 특정 배양 배지(1 g/L의 DMEM, HAMF12, 송아지 태아 혈청 및 항생제)에서 생체 외에서 유지하였다. 생검을 PBS 중 1/200 eme 및 1/500 eme로 희석된 본 발명에 따른 참나리 추출물의 용액으로 48시간 동안 하루 2회 처리하여 각각 0.5% 및 0.2% 부피/부피의 최종 농도를 야기하였다. 대조 조건을 PBS 1X로 수행한다. 치료 종료 24시간 전에, 100 mJ/cm2으로 UV 풀 스펙트럼 램프(멀티포트 601 드 솔라 라이트 앤 코(multiport 601 de solar light and co))를 사용하여 생검을 조사하였다.
피브릴린의 평가:
항-피브릴린 항체에 의한 면역표지를 위해, 조직을 동결시켰다. 이어서, 동결된 피부 생검을 절단하고, 절편을 차가운 아세톤에 고정시켰다. 특정 항-피브릴린 항체(압캠, ab3090, 마우스 단클론성) 및 이어서 형광 염료와 커플링된 적합한 2차 항체를 도포하였다. 특정 배지에 장착한 후, 슬라이드를 형광 현미경(제이스 악시오버트 200M 현미경)으로 관찰하였다.
트로포엘라스틴의 평가:
항-트로토엘라스틴 항체에 의한 면역표지를 위해, 조직을 고정시키고 파라핀에 끼웠다. 이어서, 끼워진 피부 생검을 절단하고, 절편을 탈파라핀화시키고, 재수화하였다. 이어서, 특정 항-트로토엘라스틴 항체(압캠, ab3090, 토끼 다클론성), 및 이어서 형광 염료와 커플링된 적합한 2차 항체를 도포하기 전에 탈마스크화(unmasking) 프로토콜을 수행하였다. 특정 배지에 장착한 후, 슬라이드를 형광 현미경(제이스 악시오버트 200M 현미경)으로 관찰하였다.
결과:
피브릴린의 평가(도 5):
자외선 스트레스 후, 도 5에 도시된 바와 같이, 피브릴린 섬유의 해체가 관찰되었다. 스트레스와 동시에 0.5%의 참나리 추출물의 용액에 의한 처리는 섬유 조직에 대한 UV 영향을 눈에 띄게 감소시켰다.
트로포엘라스틴의 평가(도 6):
자외선 스트레스 후, 도 6에 도시된 바와 같이, 트로포엘라스틴 섬유의 해체가 관찰되었다. 스트레스와 동시에 0.2% 및 0.5%의 참나리 추출물의 용액에 의한 처리는 섬유 조직에 대한 UV 영향을 눈에 띄게 감소시켰다.
결론: 자외선 스트레스 후, 트로포엘라스틴 및 피브릴린 섬유의 해체가 관찰되었다. 48시간 동안 참나리 추출물에 의한 처리는 피브릴린에 대해 0.2%, 및 트로포엘라스틴에 대해 0.2% 및 0.5%에서 섬유 조직 변경을 감소시킴으로써 UV 스트레스로부터 ECM을 보호하였다.
실시예 5: 소형 RNA 참나리 추출물로 처리된 섬유아세포에서 엘라스틴 부피의 측정
프로토콜: 프로토콜의 도식은 도 7에 도시된다. p10의 19세 기증자 및 p8의 62세 기증자로부터의 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF)를 접시 당 11,000 세포의 농도로 35 mm 유리 바닥 접시에서 평판배양하고, 24시간 동안 항온처리하였다. 5.2 mL 배지(10% 우아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 갖는 DMEM)에서 희석하고, 이어서 0.2 μM PVDF 필터로 여과함으로써, 참나리의 20% 원액을 제조하였다. 상기 원액을 배지에서 0.2% 및 2%까지 희석함으로써 참나리 처리 용액을 제조하였다. 세포를 참나리로 24시간 동안 처리하였다. 세포를 PBS로 1회 세척하고 PBS의 박층(1 mL)으로 덮었다. 닥터 그뢰벨(Dr. Groebel) 조사 챔버에서 10 J/cm2 UVA + 40 mJ/cm2 UVB로 세포를 조사하였다. 조사 후, 세포를 참나리로 24시간 동안 처리하였다.
처리 종료시, 세포를 PBS로 세정하고, PBS에서 제조된 4% 파라포름알데하이드에 15분 동안 고정하고, PBS 중 0.1% 트리톤으로 5분 동안 천공시켰다. 세포를 5% 염소 혈청 및 PBS에서 제조된 0.1% 트리톤으로 구성된 블록에서 40분 동안 블로킹(blocking)하였다. 세포를 4℃에서 밤새 블록에서 제조된 트로포엘라스틴에 대한 토끼 항체의 1:100 용액(압캠, 카탈로그 번호 ab21600)에서 항온처리하고, 이어서 실온에서 블록으로 제조된 알렉사플루오르(AlexaFluor) 594 염소 항-토끼 IgG(H+L)의 1:500 용액(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 카탈로그 번호 A11012)으로 항온처리함으로써, 세포를 엘라시틴에 대해 염색하였다. 세포를 각각 실온에서 20분 동안 PBS에서 제조된, 1:200의 팔로이딘(Phalloidin) 488의 용액(라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 A12379) 및 1:36300의 DAPI의 용액(라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 D3571)에서 항온처리함으로써, 세포의 액틴 및 핵을 염색하였다. 염색된 세포를 4℃의 PBS에 저장하였다. 이미지를 니콘 A1 공초점 현미경 및 60x 오일 침지 대물렌즈로 캡쳐하였다. 분석을 니콘 엘레먼츠(Elements) AR 소프트웨어로 수행하였다.
결과: 참나리는 19세 및 62세 기증자의 비-조사된 세포에서 엘라스틴의 용량 의존적 증가를 야기하였다(도 8 및 9). 달성된 가장 큰 증가는 각각 2% 참나리가 사용될 때, 19세 및 62세 기증자로부터의 세포에서 67% 및 38%였다. 참나리는 또한 두 기증자로부터의 조사된 세포에서 엘라스틴을 증가시켰지만, 효과는 용량 의존적이지 않았다. 가장 큰 증가는 0.2% 참나리가 사용되었을 때 19세 기증자의 세포에서 79%이었고, 2% 참나리가 사용되었을 때 62세 기증자의 세포에서 46%였다.
결론: 참나리는 젊은 기증자 및 노인 기증자 둘 다로부터의 조사된 세포 및 비-조사된 세포 둘 다에서 엘라스틴을 증가시켰다.
실시예 6: 소형 RNA 참나리 추출물로 처리된 섬유아세포에서 DNA 단편화의 평가
프로토콜: p10에서 19세 기증자 및 p8에서 62세 기증자로부터의 NHDF는 접시 당 80,000 세포의 농도로 60 mm 접시에서 평판배양되고, 24시간 동안 항온처리되었다. 세포를 PBS로 1회 세척하고 PBS의 박층(2 mL)으로 덮었다. 세포를 닥터 그뢰벨 조사 챔버에서 10 J/cm2 UVA + 40 mJ/cm2 UVB로 조사하였다. 조사 후, 세포를 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조된 0.2% 또는 2% 참나리로 6시간 동안 처리하였다.
세포를 트립신처리하고, PBS로 세척하고, 1x105 세포/mL로 PBS에 현탁하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 1:10의 비로 용융된 아가로스에 분산시켰다. 75 μL의 세포/아가로스 혼합물을 코멧 슬라이드의 각 지점에 고르게 분주하고, 4℃에서 10분 동안 항온처리하였다. 슬라이드를 차가운 용해 용액(트레비겐(Trevigen), 카탈로그 번호 4250-050-01)에 4℃에서 밤새 침지시켰다. 슬라이드를 용해 용액으로부터 제거하고, 실온에서 30분 동안 알칼리 용액(300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH>13)에 위치시켰다. 이어서, 슬라이드를 얼음에서 냉각된 전기영동 장치에 위치시켜 전극과 등거리가 되도록 하였다. 차가운 알칼리성 전기영동 용액(300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH>13)을 장치에 부어서 슬라이드를 단지 덮도록 하였다. 전기영동은 23 V에서 30분 동안 실행되었다. 전기영동 후, 슬라이드를 H2O에서 세정하고, 70% EtOH에 5분 동안 침지시켰다. 슬라이드를 EtOH 용액으로부터 제거하고, 수건에 놓아 밤새 공기 건조하였다. SYBR 골드(써모(Thermo), 카탈로그 번호 11494)를 TE 완충액(10 mM 트리스(Tris)-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) 1:30000에 희석하였다. 100 μL의 희석된 SYBR 골드를 각 지점에 분주하였다. 슬라이드를 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 이어서, 슬라이드로부터 과량의 SYBR 그린을 제거하고 H2O에서 세정한 후, 슬라이드를 다시 건조하였다. 이미지를 EVOS 현미경으로 20x 대물렌즈가 장착된 FITC 필터를 사용하여 켭쳐하였다. 테일 모멘트는 트라이 테크(Tri Tek)의 코멧 스코어(Comet Score) 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.
결과: 각각의 용량의 참나리에 의한 처리는 19세 기증자의 세포에서 UV 유발된 DNA 단편화를 감소시켰다(도 10). 가장 큰 감소는 0.2% 참나리가 사용되었을 때 32%였다. 단지 2% 용량의 참나리가 62세 기증자의 세포에서 UV 유발된 DNA 단편화를 감소시킬 수 있었다(도 11). DNA 단편화는 42%만큼 감소되었다.
결론: 참나리는 기증자 둘 다의 세포에서 UV 유발된 DNA 단편화를 감소시킬 수 있었지만, 노인 기증자의 세포에서 효과적이기 위해서는 더 높은 용량의 참나리가 필요하였다.

Claims (8)

  1. 참나리(Lilium tigrinum) 구근의 추출물 및 생리학적으로 허용되는 매질을 포함하는 국소 도포를 위한 미용 조성물로서,
    상기 참나리 구근의 추출물이 10 내지 12 g/kg의 건조 중량, 4 내지 8 g/kg의 당 농도, 0.5 내지 1.5 g/kg의 단백질 단편 농도, 50 내지 200 mg/kg의 페놀계 화합물 농도, 및 15 내지 45 mg/kg의 150개 뉴클레오타이드의 최대 길이를 갖는 RNA의 함량을 갖는, 미용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    참나리 구근의 추출물이 DNA를 전혀 갖지 않는, 미용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    참나리 구근의 추출물이 미용 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1 내지 5%, 바람직하게는 0.2 내지 2.5%의 농도로 미용 조성물에 존재하는, 미용 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 미용 조성물을 국소 도포하여 노화 및 광-노화의 피부 징후를 감소시킴을 포함하는 미용 관리 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 미용 조성물을 국소 도포하여 세포 생존력을 개선함을 포함하는 미용 관리 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 미용 조성물을 국소 도포하여 오염에 대한 세포 보호 및 미립자 물질에 대한 세포 보호를 개선함을 포함하는 미용 관리 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 미용 조성물을 국소 도포하여 자외선(UV)-유도된 DNA 손상에 대한 세포 보호를 개선함을 포함하는 미용 관리 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 미용 조성물을 국소 도포하여 세포 노쇠를 감소시킴을 포함하는 미용 관리 방법.
KR1020187016820A 2015-11-17 2016-11-10 소형 rna 참나리 추출물을 포함하는 국소 조성물 및 노화의 피부 징후를 감소시키는 미용 관리 방법 KR102268324B1 (ko)

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