JP6826597B2

JP6826597B2 - 低分子ｒｎａオニユリ抽出物を含む局所組成物および加齢に関する皮膚の徴候を低減するための美容ケア方法

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Publication number: JP6826597B2
Application number: JP2018525436A
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Inventors: オジェ，エロディ; シャベール，ラシェル; アンベール，イザベル; ボット，ジャン‐マリー; ドムロゲ，ヌーハ; ペルノデ，ナディーヌ; ドング，ケリー; マントゥラン，ジョエル; チェン，チア‐ウェン
Original assignee: アイエスピー・インヴェストメンツ・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー; イーエルシーマネージメントエルエルシー
Priority date: 2015-11-17
Filing date: 2016-11-10
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Description

本発明は、化粧品の分野、より詳しくは加齢に関する皮膚の徴候を低減させるための局所組成物および方法の分野におけるものである。

本発明は、低分子量ＲＮＡが濃縮されたオニユリ（リリウムティグリヌム（Ｌｉｌｉｕｍｔｉｇｒｉｎｕｍ））抽出物を含む局所組成物に関する。

本発明はまた、皮膚における加齢および光加齢の徴候を低減させるための、生理的に許容される媒体中に低分子ＲＮＡオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物を含む組成物の局所適用を含む美容ケアの方法にも関する。

低分子ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡは、植物および哺乳動物において見出され、生理的プロセスを調節する細胞成分である。皮膚において、主な生理的プロセスは、皮膚の恒常性、すなわち、表皮の再生、皮膚の色素沈着の調節、真皮基質発現、酸化的ストレスに対する保護の制御因子として作用するマイクロＲＮＡによって調節される。

研究室で実施されるリボ核酸（ＲＮＡ、低分子量ＲＮＡ）を抽出するための古典的プロトコールは、フェノールおよびクロロホルムなどの溶媒の使用を伴うが、これらは毒性を有し、適切な化粧品溶媒ではないと考えられている（Ｚｕｍｂｏ，Ｐ．２０１４”Ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ”，２０１４；キットＳｉｇｍａ，ｍｉｒＰｒｅｍｉｅｒ（商標）マイクロＲＮＡ単離キット）。

例えば、国際公開第８４０３８３５号公報が公知であり、この公報は、純粋なＤＮＡが濃縮された植物胚の水性抽出物を得るための方法を記述しているが、この方法は、得られた産物におそらく毒性の影響を残し得、したがって化粧品において使用することができない陰イオン性洗浄剤ならびにクロロホルムおよびオクタノールを含む様々な溶媒による処理を含む多数の処理ステップを含む。

米国特許出願公開第２００３／００９２１６８号およびフランス国特許第２８３１１６８号も同様に公知であり、これらは、植物材料、特にＤＮＡまたはＲＮＡに富む植物胚または種子から、核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）に富む抽出物を得る方法を記述している。この方法は、ｐＨが中性に向かう傾向があることから初期ｐＨ９〜１３の水性媒体中にセルロース分解酵素の存在下で植物材料を抽出するステップと、抽出物をプロテアーゼによって処置するステップと、精製された水性抽出物を回収するために不溶性物質を分離するステップとによる。このようにして得られた凍結乾燥産物は特に、炭水化物、タンパク質、ミネラル、ビタミンＢおよび脂質の他に、０．１〜１重量％のＤＮＡ、０．２〜１．５重量％のＲＮＡを含み得る。上記公報において提供されたデータに従うと、それによって得た凍結乾燥産物は、結果として、特に１〜１０ｍｇ／ＬのＤＮＡおよび１０〜７５ｍｇ／ＬのＲＮＡを含むと思われる。

上記の状況において、本発明が解決しようとする課題は、核酸の形態のＲＮＡのみを含み、植物低分子ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを供給することによって皮膚の恒常性および保護を改善することによって皮膚の加齢に対処する利点を提供する、局所適用のための新規組成物を提供することである。

前述の緒言は、当技術分野が直面する問題の本質のよりよい理解を提供するためにのみ提示しており、先行技術であると認めたとは決して解釈してはならず、または本明細書におけるいかなる参考文献の引用も、そのような参照が本出願の「先行技術」を構成することを認めたと解釈してはならない。

本発明者らは、実際に、低分子量ＲＮＡが濃縮されたオニユリ（リリウムティグリヌム）の球根の抽出物が、皮膚における加齢および光加齢の徴候を低減させることができることを証明した。より具体的には、本発明者らは、抽出物が細胞生存率を改善することができ、微粒子状物質およびＤＮＡ損傷に対する細胞保護を改善することができ、皮膚の細胞外基質を改善することができ、ならびに細胞老化を低減させることができることを示し得る。

本発明の主な態様は、生理的に許容される媒体中で、最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡ（リボ核酸）が濃縮されたオニユリ（リリウムティグリヌム）の抽出物を含む局所組成物に関する。

別の態様において、本発明は、生理的に許容される媒体中で、低分子量ＲＮＡが濃縮されたオニユリ（リリウムティグリヌム）の抽出物の有効量を含有する局所組成物を適用するステップを含む、皮膚における加齢および光加齢の徴候を低減させるために皮膚を処置する方法に関する。

さらに別の態様において、本発明はまた、生理的に許容される媒体中で、低分子量ＲＮＡが濃縮されたオニユリ（リリウムティグリヌム）の抽出物の有効量を含有する局所組成物を適用するステップを含む、細胞生存率を改善する方法、微粒子状物質およびＤＮＡ損傷に対する細胞保護を改善する方法、皮膚の細胞外基質を改善する方法、ならびに細胞老化を低減させる方法にも関する。

本発明のさらなる実施形態は、添付の図面によって理解することができる。

環境ストレス抵抗性（乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性の用量によって測定した細胞生存率）に関する本発明のオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物の評価を示す図である。ＵＶストレス後のＤＮＡ損傷（ＤＮＡ損傷は「コメットアッセイ」を使用して定量する）に関する本発明のオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物の評価を示す図である。細胞外基質の評価（トロポエラスチン発現）による、加齢に関する本発明のオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物の評価を示す図である。老化（β−ガラクトシダーゼ活性老化マーカー）における、加齢に関する本発明のオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物の評価を示す図である。光加齢損傷に対する皮膚の維持（ｓｋｉｎｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）に関する本発明のオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物の評価（ＥＣＭ構造に関係するフィブリリンの評価）を示す図である。光加齢損傷に対する皮膚の維持に関する本発明のオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物の評価（ＥＣＭ構造に関係するトロポエラスチンの評価）を示す図である。細胞培養および処置のプロトコールを示す図である。本発明のリリウムティグリヌム抽出物によって処置した１９年齢（１９ｙ）の線維芽細胞におけるエラスチン量を示す図である。本発明のリリウムティグリヌム抽出物によって処置した６２年齢（６２ｙ）の線維芽細胞におけるエラスチン量を示す図である。本発明のリリウムティグリヌム抽出物によって処置した１９歳（１９ｙ）ドナー由来の線維芽細胞におけるＤＮＡ断片化を示す図である。本発明のリリウムティグリヌム抽出物によって処置した６２歳（６２ｙ）ドナー由来の線維芽細胞におけるＤＮＡ断片化を示す図である。

本発明の詳細な実施形態を本明細書に開示する。しかし、開示の実施形態は、様々な形態で具体化され得る本発明の単なる例示であると理解すべきである。したがって、本明細書において開示される特定の構造および機能の詳細は、制限的であると解釈すべきではなく、単に本発明の様々な使用を当業者に教示するための代表的な基本として解釈すべきである。

本明細書において使用する用語は全て、特に明記していない限り、その通常の意味を有すると意図される。本発明を説明および特許請求する目的で、以下の用語を定義する。

「皮膚における加齢および光加齢の徴候」は、加齢による皮膚の外観の全ての変化、例えば皮膚の薄化、たるみ、水分および無緊張の喪失、深いしわおよび小じわ、ハリおよび色合いの喪失、皮膚の萎縮、皮膚の色合いの均質化の喪失、または紫外線照射への曝露に起因する皮膚の他の任意の内部分解、肝斑、およびシミを指す。「日光黒子」、「老年性黒子」、「シミ」、「老年性色素斑」としても知られる肝斑は、太陽からの紫外線照射への曝露による加齢および光加齢に関連する皮膚上の傷である。それらは、薄茶から赤または黒の色の範囲に渡り、太陽に曝露されることが最も多い場所、特に手、顔、肩、腕、および額、ならびに毛髪がない場合は頭皮に存在する。

「アンチエイジング効果（Ａｎｔｉ−ＡｇｉｎｇＢｅｎｅｆｉｔ）」アンチエイジング効果には、これらに限定されないが、（ａ）小じわまたはしわの処置、低減、および／または予防、（ｂ）皮膚の毛穴のサイズの縮小、（ｃ）皮膚の厚み、ふくよかさ、および／または緊縮の改善、（ｄ）皮膚の柔軟性および／または柔らかさの改善、（ｅ）皮膚の色合い、輝き、および／または透明度の改善、（ｆ）プロコラーゲンおよび／またはコラーゲン産生の改善、（ｇ）皮膚のきめおよび／または再組織化の促進の改善、（ｈ）皮膚バリアの修復および／または機能の改善、（ｉ）皮膚のたるみまたは萎縮の処置および／または予防、（ｊ）皮膚輪郭の外観の改善、（ｋ）皮膚の光沢および／または明るさの回復、（ｌ）皮膚の必須栄養素および／または構成要素の補充、（ｍ）閉経によって減少した皮膚外観の改善、（ｎ）皮膚の保湿および／または水和の改善、ならびに（ｏ）皮膚の弾力性および／または回復力および／またはハリの改善のうちの１つまたは複数を含む。

「生理的に許容される」とは、本発明による活性剤または前記活性剤を含む組成物が、毒性または不寛容反応を誘発することなく、皮膚または粘膜に接触させるために適していることを意味する。

「生理的に許容される媒体」は、製剤、保湿剤、界面活性剤、乳化剤等に必要な補助剤と同様に、化粧品の分野で一般的に使用される任意の添加剤もしくは共溶媒に限定されないが、毒性または不寛容反応を誘発することなく、皮膚または粘膜に接触させるために適した、その処方に必要な補助剤、保湿剤、界面活性剤、乳化剤等を含み得る多少の流動性を有するものを意味する。

「局所」または「局所に」は、本発明のオニユリ抽出物を含む組成物を、皮膚の健康な表面に適用することを指す。

「局所適用」は、皮膚または粘膜の表面上に、本発明のペプチドまたはそれを含む組成物を適用または広げることを指す。

「低分子ＲＮＡ」は、一本鎖または二本鎖の任意のタイプの非メッセンジャー低分子ＲＮＡ、例えばマイクロＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、イントロンＲＮＡ、核もしくは核小体低分子ＲＮＡ、または任意のＲＮＡ断片を含む、最大長１５０ヌクレオチドの低分子量非コードＲＮＡ（リボ核酸）を指す。

用語が範囲を参照することによって特定されている場合は常に、範囲は、そのあらゆる要素を明白に開示すると理解される。非制限的な例として、１〜１０％の範囲は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、および１０％、ならびに１〜１０％の間の全ての値を含むと理解される。

２つ以上の置換基が、列挙された代替物の群から「選択される」と言及されている場合、それぞれの置換基は、他の置換基の同一性とは独立に、その群の任意の要素であり得ることを意味する。

「％」は、特に明記していない限り、重量％、すなわち組成物（すなわち、任意の担体、ビヒクル、溶媒、充填剤、または皮膚に適用する前に添加される他の成分を含む）の全量に関連する成分の重量％を指す。

本明細書において記述される内容は、生理的に許容される媒体中で、最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡ（リボ核酸）が濃縮されたオニユリ（リリウムティグリヌム）の抽出物を得るプロセスである。

低分子ＲＮＡは、細胞生物学の全ての態様に影響を及ぼす調節分子を構成する。低分子ＲＮＡおよび特にマイクロＲＮＡは、植物および哺乳動物において見出され、生理的プロセスを調節する細胞成分である。皮膚において、主要な生理的プロセスは、皮膚の恒常性、すなわち、表皮の再生、皮膚の色素沈着の調節、真皮基質発現、酸化的ストレスに対する保護の調節因子として作用するマイクロＲＮＡによって調節される。特に植物性の低分子ＲＮＡおよび植物性のマイクロＲＮＡを含むオニユリ抽出物は、化粧品の分野において新規である。低分子量ＲＮＡが濃縮されたオニユリ（リリウムティグリヌム）の球根の抽出物の予想される効果は、植物低分子ＲＮＡ／マイクロＲＮＡを供給し、それによって皮膚のアンチエイジング効果を提供することによって、皮膚の恒常性および保護を改善することである。

本発明は、生理的に許容される媒体中に、最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡ（リボ核酸）が濃縮されたオニユリ（リリウムティグリヌム）の抽出物を含む局所組成物に関する。

そのような植物抽出物の調製プロセスは、フランスでの特許出願番号第１５０２３６１号に記述されている。

＜低分子量ＲＮＡが濃縮されたオニユリ（リリウムティグリヌム）の球根の抽出物の調製＞
低分子量（最大長１５０ヌクレオチド）の低分子ＲＮＡが濃縮された水性抽出物を、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）のオニユリ球根（リリウムティグリヌム）から得る。

第一のステップにおいて、解凍および洗浄後、１０重量％のユリ球根を蒸留水と混合し、例えば球根１００ｇを蒸留水１ｋｇに入れた後、球根は、最終濃度１０ｍＭのＥＤＴＡ四ナトリウム（最終量１ｋｇあたり３．８ｇに対応する）と共に、１０分間粉砕される。このステップにおいて、ｐＨは、抽出物を低分子量ＲＮＡに関して濃縮するために最適なｐＨに対応する１０．５〜１１の間に調節される。

次に、溶液を８０℃で１時間攪拌する。この段階において、温度は５０℃〜８０℃まで変更し得、攪拌時間は３０分間〜１時間までであり得るが、この種に関して、温度８０℃での１時間が、最終抽出物中の低分子量ＲＮＡの含有量に関して最善の結果を得るために最適な温度である。このステップの終了時、固形原料を除去して水性抽出物を透明化するために、２０〜５０μｍから７〜２０μｍの漸減する多孔性の濾紙によって連続的な濾過を行う。

このステップで、ｐＨを測定し、抽出物中の低分子量の低分子ＲＮＡを保存するために、必要に応じて６〜６．５の間に調節する。酸性が強いｐＨは、低分子ＲＮＡを沈殿させ得る。

次に、０．２〜０．３μｍの多孔性の濾紙での濾過滅菌まで濾過を継続する。最終抽出物は、３０％グリセリンおよび１．５％フェノキシエタノールを添加することによって保存することができる。

得られた水性抽出物は黄色であり、１０〜２５ｇ／ｋｇの乾燥物、０．５〜５ｇ／ｋｇのタンパク質断片、５〜２０ｇ／ｋｇの糖、１００〜５００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および１０〜１００ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡを含む。

それにもかかわらず、同じ種のユリ（リリウムティグリヌム）に関して、得られた抽出物は、採取場所、収穫年度、季節、気候条件等などの外的要因に応じて組成物に関して重要な変動を示し得る。

本実施例において、本発明者らは、より詳しくは、１７．９ｇ／ｋｇの乾燥重量、２．１ｇ／ｋｇのタンパク質断片、１１．４ｇ／ｋｇの糖、２００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および５４ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡを含む水性抽出物を得た。次に、３０％グリセリンおよび１．５％フェノキシエタノールを添加することによって、抽出物を希釈して保存し、最終乾燥重量１０〜１２ｇ／ｋｇの抽出物、４〜８ｇ／ｋｇの糖濃度、０．５〜１．５ｇ／ｋｇのタンパク質断片濃度、５０〜２００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物濃度、１５〜４５ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量の低分子ＲＮＡ含有量を得る。

最終抽出物について実施した物理化学分析では、本実施例において、オニユリ抽出物が１０ｇ／ｋｇの乾燥重量を有し、１ｇ／ｋｇのタンパク質断片、５．８ｇ／ｋｇの糖、１００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および３０ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡを含むことを示した。抽出物の核酸含有量を分析するために実施したゲル電気泳動では、ＲＮＡが、長さが１５０ヌクレオチドに等しいかまたはそれ未満の分子量のＲＮＡであること、および抽出物がＤＮＡ（デオキシリボ核酸）を全く含まないことを示した。

本発明の主目的は、生理的に許容される媒体中でオニユリ（リリウムティグリヌム）の球根の低分子ＲＮＡ抽出物を含む、局所適用のための化粧品組成物であって、前記オニユリの抽出物が３０％グリセリンおよび１．５％フェノキシエタノール中に、１０〜１２ｇ／ｋｇの乾燥重量、４〜８ｇ／ｋｇの糖濃度、０．５〜１．５ｇ／ｋｇのタンパク質断片濃度、５０〜２００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物濃度、および１５〜４５ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドのＲＮＡ含有量を含む、化粧品組成物である。

好ましい実施形態において、本発明による低分子ＲＮＡオニユリ抽出物は、１０ｇ／ｋｇの乾燥重量を有し、１ｇ／ｋｇのタンパク質断片、５．８ｇ／ｋｇの糖、１００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および３０ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡを含む。

別の実施形態において、本発明の低分子量ＲＮＡが濃縮されたオニユリ（リリウムティグリヌム）の抽出物は、組成物の総重量を基準として、本発明の組成物中に０．１〜５％の濃度、好ましくは０．２〜２．５％の濃度で存在する。

本発明の局所組成物は、特に水性、水−アルコール、または油性溶液；水中油型乳剤、または油中水型乳剤、または多層乳剤；水性または無水ゲル；コロイドの形態であり得る。これらの組成物はまた、皮膚、粘膜、唇、および／または皮膚付属器に適用するために適した、クリーム、懸濁液、または粉末の形態であり得る。これらの組成物は、多少の流動性を有し、クリーム、ローション、乳液、セラム、ポマード、クリーム、ペースト、またはフォームの外観を有し得る。それらはまた、スティックなどの固体の形態でもあり得るか、またはそれらをエアロゾルの形態で皮膚に適用することもできる。一実施形態において、本発明の組成物は美容ケア組成物である。

本発明の局所組成物は、化粧品の分野において一般的に使用される任意の添加剤ならびにそれらの処方に必要な補助剤、例えば、共溶媒（エタノール、グリセロール、ベンジルアルコール、保湿剤等）、増粘剤、希釈剤、乳化剤、抗酸化剤、着色剤、日焼け止め、顔料、増量剤、保存剤、香料、消臭剤、精油、微量元素、必須脂肪酸、界面活性剤、被膜生成ポリマー、化学または無機濾過剤、水和剤または温泉水等を含む。例えば、多糖類もしくはポリペプチドのような天然型の水溶性ポリマー、メチルセルロースもしくはヒドロキシプロピルセルロース型のセルロース誘導体、または合成ポリマー、ポロキサマー、カルボマー、シロキサン、ＰＶＡもしくはＰＶＰ、および特にＩＳＰ社から販売されているポリマーを挙げることが可能である。

いずれにせよ、当業者は、これらの補助剤ならびにその割合を、本発明に従う組成物において求められる有利な特性を妨害しないように選択することを確認するだろう。これらの補助剤は、例えば組成物の総重量の０．０１〜２０％の範囲の濃度で存在し得る。本発明の組成物が乳液である場合、脂肪相は、組成物の総重量に関して５〜８０重量％、好ましくは５〜５０重量％を表し得る。組成物に使用される乳化剤および共乳化剤は、検討される分野において通常使用されるものから選択される。例えば、それらは、組成物の総重量に関して０．３〜３０重量％の範囲の割合で使用することができる。

当然、本発明のオニユリの低分子ＲＮＡ抽出物は、単独で、または他の活性成分と会合した形で使用することができる。例えば、本発明の美容ケア組成物は、さらに、皮膚の生理機能を改善することが意図される少なくとも１つの他の活性成分、例えば、再生剤、アンチエイジング剤、抗しわ剤、増粘剤、抗フリーラジカル剤、抗糖化剤、水和剤、抗菌剤、抗真菌剤、角質溶解剤、筋弛緩剤、スクラブ剤、およびトーニング成分、真皮の高分子の合成またはエネルギー代謝を刺激する成分、皮膚の分化、色素沈着、または色素脱失を調節する成分、微小循環を刺激する成分、日焼け止め、またはメタロプロテナーゼ阻害成分を含む。

一実施形態において、本発明の組成物は、本発明のオニユリの低分子ＲＮＡ抽出物に加えて、
− 日焼け止め、紫外線および赤外線スクリーン、
− 抗フリーラジカル成分、
− ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、
− デヒドロ酢酸（ＤＨＡ）、
− 天然または合成フィトステロール、
− αおよびβヒドロキシ酸、シラノール、
− 糖アミン、グルコサミン、Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、
− ポリフェノール、イソフラボン、フラボノイド、例えばブドウ抽出物、マツ抽出物、オリーブ抽出物、
− 脂質、例えばセラミドまたはリン脂質、
− 動物油、例えばスクアレンまたはスクアラン
− 植物油、例えばアーモンド油、ココナツ油、ヒマシ油、ホホバ油、オリーブ油、ナタネ油、落花生油、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、トウモロコシ胚芽油、ダイズ油、綿実油、アルファルファ油、ケシ油、カボチャ種子油、月見草オイル、キビ油、オオムギ油、ライムギ油、ベニバナ油、パッションオイル、ヘーゼルナッツ油、パーム油、杏仁油、アボカド油、カレンデュラオイル、エトキシル化植物油、またはシアバター、
を含む。

上記の化合物は、植物のペプチド加水分解物などの天然物であり得るか、またはペプチド化合物などの合成物でもあり得る。

本発明はまた、皮膚における加齢および光加齢の徴候を低減するための、低分子量ＲＮＡが濃縮されたオニユリ（リリウムティグリヌム）の抽出物の有効量を含有する局所組成物の化粧品での使用にも関する。

本発明はまた、生理的に許容される媒体中に、低分子量ＲＮＡが濃縮されたオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物の有効量を含有する局所組成物を適用するステップを含む、皮膚における加齢および光加齢の徴候を低減させるために皮膚を処置する方法にも関する。

本発明はまた、生理的に許容される媒体中に、低分子量ＲＮＡが濃縮されたオニユリ（リリウムティグリヌム）の抽出物の有効量を含有する局所組成物を適用するステップを含む、細胞生存率を改善する、微粒子状物質およびＤＮＡ損傷に対する細胞保護を改善する、ならびに細胞老化を低減する方法にも関する。

特定の実施形態において、本発明は、汚染に対する細胞保護および微粒子状物質に対する細胞保護を改善するための美容ケアの方法を提供する。

別の実施形態において、本発明はＵＶにより誘発されるＤＮＡ損傷に対する細胞保護を改善するための美容ケアの方法を提供する。

本発明の他の利点および特徴は、説明のためにおよび非制限的目的のために提供される
以下の実施例を見ればより明らかとなるであろう。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［実施形態１］オニユリ（リリウムティグリヌム（Ｌｉｌｉｕｍｔｉｇｒｉｎｕｍ））の球根の抽出物、および生理的に許容される媒体を含む、局所適用のための化粧品組成物であって、前記オニユリの抽出物が、１０〜１２ｇ／ｋｇの乾燥重量、４〜８ｇ／ｋｇの糖濃度、０．５〜１．５ｇ／ｋｇのタンパク質断片濃度、５０〜２００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物濃度、および１５〜４５ｍｇ／ｋｇ濃度の最大長１５０ヌクレオチドのＲＮＡの含有量を有する、化粧品組成物。
［実施形態２］前記オニユリ（リリウムティグリヌム）の球根の抽出物がＤＮＡを全く含まない、実施形態１に記載の化粧品組成物。
［実施形態３］前記オニユリ（リリウムティグリヌム）の球根の抽出物が、本発明の前記組成物中に、前記組成物の総重量を基準として、０．１〜５％の間、好ましくは０．２〜２．５％の間の濃度で存在する、実施形態１に記載の化粧品組成物。
［実施形態４］皮膚における加齢および光加齢の徴候を低減するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物の局所適用を含む美容ケアの方法。
［実施形態５］細胞生存率を改善するための、実施形態１〜３のいずれかに記載の組成物の局所適用を含む美容ケアの方法。
［実施形態６］汚染に対する細胞保護および微粒子状物質に対する細胞保護を改善するための、実施形態１〜３のいずれかに記載の組成物の局所適用を含む美容ケアの方法。
［実施形態７］ＵＶにより誘発されるＤＮＡ損傷に対する細胞保護を改善するための、実施形態１〜３のいずれかに記載の組成物の局所適用を含む美容ケアの方法。
［実施形態８］細胞の老化を低減するための、実施形態１〜３のいずれかに記載の組成物の局所適用を含む美容ケアの方法。

［実施例１］
＜環境ストレス抵抗性（細胞生存率）に及ぼす低分子ＲＮＡオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物の評価＞
本試験の目的は、環境ストレス後の細胞生存率に及ぼすオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物の効果を示すことである。環境ストレスは、汚染微粒子状物質（ＰＭ（＜４μｍ）；ＮＩＳＴ２７８６）の適用によって誘発する。細胞生存率を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性の用量によって測定する。ＬＤＨは、ピルビン酸塩の乳酸塩への変換を触媒するオキシドレダクターゼ酵素である。その活性は、組織および細胞における病変および毒性の存在に関連している。

プロトコール：正常なヒトケラチノサイトを、培養培地で１／５００倍に希釈した、最終濃度０．２容積％の本発明におけるオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物溶液によって、１日２回４８時間処置した。処置終了の２４時間前に、ＰＭ（＜４μｍ）を７０μｇ／ｍＬで適用した。

処置後、ＬＤＨ活性アッセイを、「乳酸デヒドロゲナーゼ活性アッセイキット」（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）；ＭＡＫ０６６）における供給元の推奨に従って実施した。

結果：図１に示すように、０．２％オニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物による４８時間の処置は、ＬＤＨ活性に対していかなる影響も示さず、したがって、細胞生存率に対していかなる影響も示さなかった。７０μｇ／ｍＬのＰＭ（＜４μｍ）を２４時間適用すると、ＬＤＨ活性の非常に有意な増加（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−検定）を誘発し、細胞生存率の強い減少の根拠となった。ＰＭ（＜４μｍ）の適用と平行して実施した０．２％オニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物による４８時間の処置は、環境ストレスによって誘発されるＬＤＨ活性を有意に減少させる。

結論：０．２％オニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物は、ケラチノサイトの生存率に及ぼす環境ストレスの影響を低減させた。

［実施例２］
＜ＵＶストレス後のＤＮＡ損傷に及ぼす低分子ＲＮＡオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物の評価＞
本試験の目的は、ＵＶストレス後のＤＮＡ損傷に及ぼすオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物の好ましい効果を示すことである。ＤＮＡ損傷を、個々の細胞における一本鎖および二本鎖ＤＮＡ切断の検出を可能にする微小電気泳動技術である「単細胞ゲル電気泳動」（ＳＣＧＥ）としても知られる「コメットアッセイ」を使用して定量する。

プロトコール：正常なヒト線維芽細胞を、培養培地で１／５００倍に希釈した、最終濃度０．２容積％の本発明におけるオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物溶液によって、１日２回４８時間処置した。処置終了の２４時間前に、細胞に１００ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶＢを照射した。

処置後、細胞をアガロースゲルに封入し、洗浄剤および塩を含む緩衝液中で溶解した。ＤＮＡを変性させて、短時間の電気泳動（２５Ｖ、３００ｍＡ、３０分間）を実施する。ヨウ化プロピジウム染色後、非切断ＤＮＡは、直径２５〜３５μｍの球体のように見える。損傷した細胞のＤＮＡは、切断数に比例して陽極に向かって伸びる。検出された病変は、鎖の切断およびアルカリ不安定部分を含む。Ｏｌｉｖｅら（１９９０）は、コメットの長さ（μｍ）およびその遠位部分でのＤＮＡの百分率を考慮に入れるパラメータである「テールモーメント」を定義した。

結果：図２に示すように、ＵＶストレスは、ＤＮＡ損傷の非常に有意な増加（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）を誘発した。ＵＶ照射と平行して実施した０．２％オニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物による４８時間の処置は、ＵＶ誘発性のＤＮＡ損傷を有意に減少させる。

結論：０．２％で適用したオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物は、ＵＶＢ誘発ＤＮＡ損傷に対して細胞を保護した。

［実施例３］
＜細胞外基質評価による加齢に関する、および老化に関する低分子ＲＮＡオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物の評価＞
本試験の目的は、トロポエラスチン発現に関する細胞外基質（ＥＣＭ）の評価に基づく、加齢に及ぼすオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物の効果、およびβ−ガラクトシダーゼ活性老化マーカーを使用することによる、老化に及ぼすオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物の効果を初めて示すことである。

プロトコール：
トロポエラスチンの評価：
正常なヒト線維芽細胞をＰ１５まで複製老化によって老化させた。

Ｐ６およびＰ１５の細胞を、培養培地で１／５００倍に希釈した、最終濃度０．２容積％の本発明におけるオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物溶液によって、１日２回４８時間処置した。

抗トロポエラスチン抗体による免疫標識に関して、細胞を洗浄して、冷メタノールで固定した。次に、細胞を特異的抗トロポエラスチン抗体（Ａｂｃａｍ，ｒｅｆ．ａｂ２１６０５、ウサギポリクローナル）の存在下でインキュベートし、次いで蛍光色素に結合させた適切な二次抗体の存在下でインキュベートした。特定の媒体中で標本を作製した後、スライドガラスを落射蛍光顕微鏡（ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ顕微鏡）によって観察した。蛍光強度を、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ（登録商標）６．３ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用して画像を解析することにより定量した。

老化の評価：
正常なヒト線維芽細胞をＰ１５まで複製老化によって老化させた。

Ｐ１５の細胞を、培養培地で１／５００倍に希釈した、最終濃度０．２容積％の本発明におけるオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物溶液によって、１日２回４８時間処置した。無処置の若い対照Ｐ８を加えた。

ＳＡ−β−ｇａｌ活性の染色のために、細胞を最初に洗浄して固定した。次に、細胞をβ−ガラクトシダーゼ染色溶液と共に一晩インキュベートした。特定の媒体中で標本を作製した後、スライドガラスを光学顕微鏡（ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＥ６００顕微鏡）によって観察した。青色の強度を、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ（登録商標）６．３ソフトウェアを使用して画像を解析することにより定量した。細胞数による標準化を実施した。

結果：
トロポエラスチンの評価（図３）：
０．２％オニユリ（リリウムティグリヌム）溶液による４８時間の処置は、老化していない（非老化）（Ｐ６）の線維芽細胞および老化（Ｐ１５）の線維芽細胞においてトロポエラスチン発現の非常に有意な増加（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−検定）を示した。

老化の評価（図４）：
予想されたように、β−ガラクトシダーゼ活性は、若い細胞（Ｐ８）と比較して複製老化線維芽細胞（Ｐ１５）において増加した。０．２％オニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物溶液による４８時間の処置は、誘発された老化を有意に低減させた（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−検定）。

結論：０．２％オニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物は、非老化細胞および老化細胞においてトロポエラスチン発現の刺激によって加齢からＥＣＭを保護し、複製老化を低減させた。

［実施例４］
＜光老化損傷に対する皮膚の維持に関する低分子ＲＮＡオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物の評価＞
本試験の目的は、ＵＶストレスによって誘発された光加齢損傷に対してオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物が皮膚に及ぼす好ましい効果を示すことである。ＥＣＭ構造に関係するフィブリリンおよびトロポエラスチンを評価する。

プロトコール：直径６ｍｍの正常なヒト皮膚生検を、特定の培養培地（ＤＭＥＭ１ｇ／Ｌ、ＨＡＭＦ１２、ウシ胎仔血清、および抗生物質）中、エクスビボで維持した。生検を、ＰＢＳで１／２００倍および１／５００倍に希釈した、それぞれ、最終濃度０．５容積％および０．２容積％の本発明におけるオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物溶液によって、１日２回４８時間処置した。対照条件を、１×ＰＢＳによって実施する。処置終了の２４時間前に、ＵＶフルスペクトルランプを使用して、生検に１００ｍＪ／ｃｍ^２（マルチポート６０１ｄｅｓｏｌａｒｌｉｇｈｔａｎｄｃｏ）を照射した。

フィブリリンの評価：
抗フィブリリン抗体による免疫標識のために、組織を凍結した。凍結した皮膚生検を切断して、切片を冷アセトン中で固定した。特異的抗フィブリリン抗体（Ａｂｃａｍ，ｒｅｆ．ａｂ３０９０、マウスモノクローナル）を適用した後、蛍光色素に結合させた適切な二次抗体を適用した。特定の媒体中で標本を作製した後、スライドガラスを落射蛍光顕微鏡（ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ顕微鏡）によって観察した。

トロポエラスチンの評価：
抗トロポエラスチン抗体による免疫標識に関して、組織を固定してパラフィンに包埋した。包埋した皮膚生検を切断し、切片のパラフィンを除去して再度水和した。次に、抗原賦活化プロトコールを実施した後、特異的抗トロポエラスチン抗体（Ａｂｃａｍ，ｒｅｆ．ａｂ３０９０、ウサギポリクローナル）を適用し、次いで蛍光色素に結合させた適切な二次抗体を適用した。特定の媒体中で標本を作製した後、スライドガラスを落射蛍光顕微鏡（ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ顕微鏡）によって観察した。

結果：
フィブリリンの評価（図５）：
ＵＶストレス後、図５に記載のようにフィブリリン線維の崩壊が観察された。ストレスと平行して実施した０．５％オニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物溶液による処置は、線維の組織化に及ぼすＵＶの影響を可視的に低減させた。

トロポエラスチンの評価（図６）：
ＵＶストレス後、図６に記載のようにトロポエラスチン線維の崩壊が観察された。ストレスと平行して実施した０．２％および０．５％のオニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物溶液による処置は、線維の組織化に及ぼすＵＶの影響を可視的に低減させた。

結論：ＵＶストレス後、トロポエラスチンおよびフィブリリン線維の崩壊が観察された。オニユリ（リリウムティグリヌム）抽出物による４８時間の処置は、フィブリンに関しては０．２％で、ならびにトロポエラスチンに関しては０．２％および０．５％で、線維組織化の変化を低減させることによって、ＵＶストレスに対してＥＣＭを保護した。

［実施例５］
＜低分子ＲＮＡリリウムティグリヌム抽出物によって処置した線維芽細胞におけるエラスチン量の評価＞
プロトコール：プロトコールのスキームを図７に示す。１９歳のドナーから得たＰ１０および６２歳のドナーから得たＰ８の正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、３５ｍｍガラス底培養皿に細胞１１，０００個／皿の濃度で播種して、２４時間インキュベートした。オニユリ（リリウムティグリヌム）の２０％保存溶液を、オニユリ（リリウムティグリヌム）１．３ｍＬを培地（１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ）５．２ｍＬで希釈した後、０．２μｍのＰＶＤＦフィルターを通して濾過することによって調製した。オニユリ（リリウムティグリヌム）処置溶液は、保存溶液を培地で０．２％および２％となるように希釈することによって調製した。細胞をオニユリ（リリウムティグリヌム）によって２４時間処置した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳの薄層（１ｍＬ）で覆った。Ｇｒｏｂｅｌ照射チャンバー内で細胞に１０Ｊ／ｃｍ^２のＵＶＡ＋４０ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶＢを照射した。照射後、細胞を、オニユリ（リリウムティグリヌム）によって２４時間処置した。

処置の終了時に、細胞をＰＢＳによってすすぎ、ＰＢＳで調製した４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、ＰＢＳで調製した０．１％Ｔｒｉｔｏｎによって５分間穿孔した。細胞を、ＰＢＳで調製した５％ヤギ血清および０．１％Ｔｒｉｔｏｎで構成されるブロック溶液中で４０分間ブロックした。細胞を、ブロック溶液で調製したトロポエラスチンに対するウサギ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ２１６００）の１：１００溶液中、４℃で一晩インキュベートした後、ブロック溶液で調製したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１１０１２）の１：５００溶液中、室温で１時間インキュベートすることによって、細胞をエラスチンに関して染色した。ＰＳＢで調製したファロイジン４８８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１２３７９）の１：２００溶液およびＤＡＰＩ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｄ３５７１）の１：３６３００溶液中で、それぞれ室温で２０分間、細胞をインキュベートすることによって、細胞をアクチンおよび核に関して染色した。染色した細胞をＰＢＳ中、４℃で保存した。ＮｉｋｏｎＡ１共焦点顕微鏡および６０倍油浸対物レンズによって画像を得た。体積測定ツールを使用してＮｉｋｏｎＥｌｅｍｅｎｔｓＡＲソフトウェアによって解析を行った。

結果：オニユリ（リリウムティグリヌム）は、１９歳および６２歳ドナーからの非照射細胞においてエラスチンの用量依存的な増加を引き起こした（図８および９）。達成された最大の増加は、２％オニユリ（リリウムティグリヌム）を使用した場合に、１９歳および６２歳ドナーからの細胞においてそれぞれ、６７％および３８％であった。オニユリ（リリウムティグリヌム）はまた、両方の年齢のドナーからの照射細胞においてもエラスチンを増加させたが、効果は用量依存的ではなかった。最大の増加は、０．２％オニユリ（リリウムティグリヌム）を使用した場合の１９歳ドナーからの細胞における７９％、および２％オニユリ（リリウムティグリヌム）を使用した場合の６２歳ドナーからの細胞における４６％であった。

結論：オニユリ（リリウムティグリヌム）は、若齢のドナーおよび老齢のドナーの両方からの照射細胞および非照射細胞の両方においてエラスチンを増加させた。

［実施例６］
＜低分子ＲＮＡリリウムティグリヌム抽出物によって処置した線維芽細胞におけるＤＮＡ断片化の評価＞
プロトコール：
１９歳ドナーから得たＰ１０および６２歳のドナーから得たＰ８のＮＨＤＦを、６０ｍｍ培養皿に細胞８０，０００個／皿の濃度で播種して、２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳの薄層（２ｍＬ）で覆った。Ｇｒｏｂｅｌ照射チャンバー内で細胞に１０Ｊ／ｃｍ^２のＵＶＡ＋４０ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶＢを照射した。照射後、細胞を、実施例５に記載のように調製した０．２％または２％オニユリ（リリウムティグリヌム）によって６時間処置した。

細胞をトリプシン処理して、ＰＢＳで洗浄し、１×１０^５個／ｍＬでＰＢＳに浮遊させた。次に細胞を、融解したアガロースに３７℃で１：１０の比率で分散させた。細胞／アガロース混合物７５μＬを、コメットスライドガラスの各スポット上にピペットで均一に滴下し、４℃で１０分間インキュベートした。スライドガラスを冷溶解溶液（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、カタログ番号４２５０−０５０−０１）中、４℃で一晩浸した。スライドガラスを溶解溶液から取り出し、アルカリ溶液（３００ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＞１３）に室温で３０分間入れた。次に、スライドガラスを、それらが電極から等距離となるように、氷で冷却した電気泳動装置に入れた。冷アルカリ電気泳動溶液（３００ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＞１３）を、スライドがちょうど覆われるように装置に注いだ。電気泳動を２３Ｖで３０分間実施した。電気泳動後、スライドガラスをＨ_２Ｏですすぎ、７０％ＥｔＯＨに５分間浸した。スライドガラスをＥｔＯＨ溶液から取り出して、タオルの上に載せて一晩風乾させた。ＳＹＢＲｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号１１４９４）をＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で１：３００００に希釈した。希釈したＳＹＢＲｇｏｌｄ１００μＬを各スポットにピペットで滴下した。スライドガラスを室温で３０分間インキュベートした。過剰量のＳＹＢＲｇｒｅｅｎをスライドガラスから除去してＨ_２Ｏですすいだ後に、スライドガラスを再度乾燥させた。画像を、ＦＩＴＣフィルターと共に２０倍の対物レンズを使用してＥＶＯＳ顕微鏡によって取得した。ＴｒｉＴｅｋ社のコメットスコアソフトウェアによってテールモーメントを決定した。

結果：オニユリ（リリウムティグリヌム）のいずれかの用量による処置は、１９歳ドナーからの細胞においてＵＶ誘発性のＤＮＡ断片化を低減させた（図１０）。最大の減少は、０．２％オニユリ（リリウムティグリヌム）を使用した場合の３２％であった。６２歳ドナーからの細胞では、２％用量のオニユリ（リリウムティグリヌム）のみがＵＶ誘発性のＤＮＡ断片化を低減させることができた（図１１）。ＤＮＡ断片化は４２％低減された。

結論：オニユリ（リリウムティグリヌム）は、両方の年齢のドナーからの細胞においてＵＶにより誘発されるＤＮＡ断片化を低減することができたが、老齢のドナーからの細胞において有効となるためには、オニユリ（リリウムティグリヌム）の高用量が必要であった。

Claims

オニユリ（リリウムティグリヌム（Ｌｉｌｉｕｍｔｉｇｒｉｎｕｍ））の球根の抽出物、および生理的に許容される媒体を含む、局所適用のための化粧品組成物であって、前記オニユリの抽出物が、該抽出物の重量に基づいて、１０〜１２ｇ／ｋｇの乾燥重量を有し、４〜８ｇ／ｋｇの濃度の糖、０．５〜１．５ｇ／ｋｇの濃度のタンパク質成分、５０〜２００ｍｇ／ｋｇの濃度のフェノール化合物、および１５〜４５ｍｇ／ｋｇ濃度の最大長１５０ヌクレオチドのＲＮＡを含み、前記オニユリの球根の抽出物がＤＮＡを全く含まない、化粧品組成物。
前記オニユリ（リリウムティグリヌム）の球根の抽出物が、前記組成物中に、前記組成物の総重量を基準として、０．１〜５％の間の濃度で存在する、請求項１に記載の化粧品組成物。
皮膚における加齢および光加齢の徴候を低減するための、請求項１または２に記載の組成物の局所適用を含む美容ケアの方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
細胞生存率を改善するための、請求項１または２に記載の組成物の局所適用を含む美容ケアの方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
汚染に対する細胞保護および微粒子状物質に対する細胞保護を改善するための、請求項１または２に記載の組成物の局所適用を含む美容ケアの方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
ＵＶにより誘発されるＤＮＡ損傷に対する細胞保護を改善するための、請求項１または２に記載の組成物の局所適用を含む美容ケアの方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
細胞の老化を低減するための、請求項１または２に記載の組成物の局所適用を含む美容ケアの方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。