FR3132436A1 - Procede d’obtention d’extraits vegetaux comprenant une etape d’autofermentation, compositions comprenant de tels extraits et leurs utilisations cosmetiques - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des procédés de préparation d’extraits végétaux comprenant une étape d’autofermentation et optionnellement des étapes d’extraction permettant un enrichissement des extraits en ARN de petits poids moléculaires. L’invention concerne encore des compositions comprenant de tels extraits et leurs utilisations cosmétiques pour lutter contre les signes du vieillissement cutané, la perte de fermeté, améliorer la fonction barrière et l’hydratation ou encore éclaircir la peau. Figure pour l’abrégé : [Fig. 3]

Description

PROCEDE D’OBTENTION D’EXTRAITS VEGETAUX COMPRENANT UNE ETAPE D’AUTOFERMENTATION, COMPOSITIONS COMPRENANT DE TELS EXTRAITS ET LEURS UTILISATIONS COSMETIQUES

L'invention concerne le domaine de la cosmétique et plus particulièrement la préparation d’extraits actifs d’origine végétale entrant dans des formulations cosmétiques pour lutter contre les signes du vieillissement cutané, la perte de fermeté, améliorer la fonction barrière et l’hydratation ou encore éclaircir la peau.

Arrière-plan technique de l’invention

La préparation d’extraits végétaux utilisables en cosmétique fait appel à l’ensemble des techniques de purifications connues en chimie et phytochimie, comme par exemple des méthodes d’extraction utilisant des solvants organiques de type polaire ou apolaire (EP3682865).

Or, on constate une volonté toujours plus grande des consommateurs de se tourner vers des produits naturels renfermant le moins d'ingrédients synthétiques possibles. Pour répondre à cette exigence nouvelle, les extraits décrits dans la présente demande sont 100 % naturels.

Une approche consiste à utiliser les micro-organismes pour orchestrer la biotransformation des végétaux. De nombreux procédés faisant intervenir des micro-organismes sélectionnés ou modifiés sont décrits dans la littérature et sont utilisés en milieu industriel. Les plus répandus reposent sur la fermentation, connue depuis des millénaires comme procédé de conservation des aliments. Les principaux avantages de la fermentation sont la conservation, l’amélioration du goût ou encore de la qualité nutritionnelle des aliments, en raison de la présence d'une quantité plus élevée de molécules bioactives facilement assimilables.

Dans le domaine de la cosmétique, les micro-organismes sont largement utilisés pour leurs effets bénéfiques directs sur la peau ou pour produire des extraits de plantes fermentés ou biotransformés. On peut citer par exemple les documents EP3744339A1 et CN110680774A qui décrivent des procédés de fermentation de plantes, respectivement duCitrus auriantiumet des fleurs de jasmin, impliquant l’inoculation par des levures de l’espèceSaccharomyces cerevisiaeou encore le document CN101243897A qui décrit l’utilisation de bactéries lactiques pour produire des extraits de fleurs cosmétiques ou alimentaires.

Dans le même domaine, le document FR3103826 décrit la préparation d’un consortium de micro-organismes composé d’au moins une bactérie lactique, une levure et une bactérie acétique, pour préparer des extraits végétaux riches en composés actifs, aptes à être utilisés dans les domaines pharmaceutiques, cosmétiques et alimentaires.

Des procédés biotechnologiques mettant en œuvre des micro-organismes sur des milieux nutritifs synthétiques adaptés pour produire des composés d'intérêt comme les vitamines, l'acide citrique, l'acide lactique ou la vanilline (US 20060269632) sont également décrits.

Cependant les procédés cités ci-dessus impliquent l’apport exogène de micro-organismes ou l’apport de nutriments spécifiques pour stimuler la croissance des micro-organismes qui vont assurer la biotransformation des matières végétales.

La fermentation peut aussi reposer sur la microflore endogène présente à la surface ou dans les structures internes des végétaux. Il s’agit d’une communauté de micro-organismes bactériens et fongiques, mutualistes ou symbiotiques appelée phytobiote, hébergée par quasiment tous les végétaux ou partie de végétaux (fruits, feuilles, fleurs, tiges, racines, graines, champignons, algues). On parle alors de fermentation spontanée ou d’autofermentation.

Ainsi, le document US20060269632A1 décrit la préparation d’un médicament efficace contre les allergies obtenu en mélangeant des pousses de pin avec de l’eau et des sucres et en laissant se développer une fermentation spontanée pendant plusieurs mois, en conditions anaérobies.

Un problème que se propose de résoudre l’invention est de fournir un nouveau procédé de préparation d’extraits végétaux naturels, simple à mettre en œuvre, sans ajout d’aucun micro-organisme vivant, d’aucune enzyme, ni d’aucun nutriment exogène et présentant néanmoins une efficacité biologique remarquable, ainsi qu’une absence de toxicité.

Les inventeurs ont dans ce but développé un procédé comprenant une étape d’autofermentation contrôlée conduite essentiellement à partir du phytobiote des matières végétales et notamment les fleurs, les fruits, les feuilles, les racines et les champignons, sans aucun apport exogène.

Dans ces conditions, une quantité importante d’acides organiques et d’acides phénoliques sont générés. Les extraits végétaux obtenus contiennent alors une large gamme de phytomolécules leur conférant une efficacité biologique prouvée.

Les extraits ainsi obtenus peuvent être utilisés en cosmétique pour le soin de la peau et plus particulièrement pour lutter contre les signes du vieillissement cutané, la perte de fermeté ou de tonicité, améliorer la fonction barrière et l’hydratation, éclaircir la peau ou encore améliorer les défenses immunitaires innées de la peau et le bien-êtrein vivo.

L’invention a pour objet un procédé d’obtention d’extraits végétaux enrichi en acides organiques et en acides phénoliques, comprenant les étapes suivantes :

a) on met en présence la matière végétale avec de l’eau,

b) on ajuste si nécessaire le pH à une valeur comprise entre 4 et 9,

c) on maintien le mélange sous agitation douce pendant un temps compris entre 6 heures et 48 heures, à une température comprise entre 20 et 60°C, à un pH compris entre 4 et 7, pour permettre le processus d’autofermentation, dans une enceinte permettant les échanges gazeux avec l’atmosphère.

Optionnellement poursuivi par les étapes suivantes :

d) on purifie le mélange obtenu en c) pour éliminer la matière végétale solide résiduelle et récolter la partie liquide,

e) on réalise au moins une filtration de la partie liquide obtenue à l’étape précédente,

f) on contrôle et réajuste le pH du filtrat, si nécessaire, à une valeur comprise entre 4 et 8,

g) on stérilise le filtrat,

h) on dilue l’extrait par un solvant physiologiquement acceptable.

L’invention a encore pour objet un procédé de préparation d’extraits enrichis en acides organiques et en composés phénoliques, obtenus à partir de fleurs de jasmin de l’espèceJasminum grandiflorumou de violette de l’espèceViola odoratacomprenant les étapes a) et c) précédentes suivantes poursuivi par les étapes suivantes :

Au mélange obtenu à l’étape c) on ajoute de l'acide phytique à une concentration comprise entre 1 et 5 mM, à un pH compris entre 10 et 11, on ajuste le pH du mélange obtenu à une valeur comprise entre 6 et 8, on sépare ensuite la matière végétale résiduelle, on purifie la fraction liquide obtenue par des filtrations successives pour clarifier l’extrait et optionnellement, on dilue l’extrait par un solvant physiologiquement acceptable.

L’invention a encore pour objet des extraits végétaux dilués obtenus par un des procédés précédents, ayant de 2 à 40 g/kg de poids sec ; 0,2 à 30 g/kg de sucres ; 10 à 4000 mg/kg d’acides organiques ; 10 à 4000 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 2000 mg/L d’acides aminés.

L’invention a encore pour objet une composition comprenant une quantité efficace d’extrait obtenu par un des procédés précédents et un milieu physiologique.

L’invention a encore pour objet l’utilisation cosmétique de la composition précédente pour lutter contre les signes du vieillissement cutané, la perte de fermeté, améliorer la fonction barrière et l’hydratation, éclaircir la peau, atténuer la diminution liée à l’âge du nombre ou de l'activité des récepteurs mécano-sensoriels du toucher (Piezo1) et des récepteurs à l’ocytocine (OXTR), ou encore, améliorer les défenses immunitaires innées de la peau et le bien-êtrein vivo.

Profils protéique des extraits de jasmin par HPLC

Evolution des composés phénoliques dans l’extrait de jasmin par HPLC

Analyse de l’acide shikimique dans l’extrait de jasmin par HPLC

Analyse du taux de sucres totaux de l’extrait de violette

Analyse des acides organiques de l’extrait de violette par HPLC

Evaluation de l’extrait de jasmin sur l’expression du récepteur piezo1 dans des épidermes reconstruits

Evaluation de l’extrait de jasmin sur l’expression du récepteur à l’ocytocine (OXTR) sur des biopsies de peau humaine

Evaluation de l’extrait de jasmin sur l’expression des ARN messagers du récepteur à l’ocytocine (OXTR) dans des kératinocytes en culture

Evaluation de l’extrait de jasmin sur l’expression de la vipérine dans des kératinocytes en culture

Evaluation de l’extrait de jasmin sur le niveau d’expression de la E-cadhérine, sur des biopsies de peau humaine prétraitées avec un bloqueur de l’activité de piezo1 (Dooku1)

Evaluation de l’extrait de jasmin sur le taux d’expression des ARN messagers de l’enzyme 11β-HSD1, dans des kératinocytes en culture

Description détaillée de l’invention Définitions

Tous les termes utilisés dans la présente description ont le sens le plus largement connus sauf mention contraire. Pour les besoins de l’invention les termes suivants sont définis comme suit :

On entend par « extrait », le résultat de tous procédés d’extraction aqueuse de la matière végétale.

Par « phytobiote » on entend l’ensemble des micro-organismes présents à la surface ou à l’intérieur de la matière végétale.

Dans la présente description, on entend par « matière végétale » ou « végétal », un organisme vivant appartenant au règne végétal et pourvu d’un phytobiote, incluant, entre autres, les plantes, les champignons, les mousses, les lichens et les algues.

On entend par « matière végétale fraîche » que la matière végétale utilisée dans le procédé d’extraction n’a subie aucun traitement chimique ou mécanique susceptible d’altérer son phytobiote. Par exemple, la matière végétale a été récoltée peu de temps avant son engagement dans le procédé ou elle a été congelée rapidement après sa récolte ou encore elle a été séchée dans des conditions permettant une bonne préservation du phytobiote, par exemple à basse température. La matière végétale fraîche peut inclure des résidus de plante obtenus après transformation.

On entend par « autofermentation » un processus de fermentation résultant du propre phytobiote naturellement présent dans ou à la surface des matières végétales engagées dans le procédé d’extraction décrit dans la présente demande.

Par « protéines », on entend des molécules de grande taille composées de chaînes d’acides aminés, mais aussi les polypeptides et peptides de taille inférieure à 20 kDa (ou 20 kg/mol).

Par « petits ARN » ou « ARN de petits poids moléculaires » on entend un mélange d’ARN (acides ribonucléiques) non codants, de petit poids moléculaire, d’une longueur d’au maximum 150 nucléotides, tels que tous types de petits ARN non-messagers, simples et/ou doubles brins, par exemple les micro-ARN, les ARN interférents, les introns, les petits ARN nucléaires ou encore tout fragment d’ARN.

Par « acides organiques » on entend des dérivés du catabolisme des acides aminés, des acides gras et des sucres comprenant une fonction acide. Ce groupe comprend les acides carboxyliques α-hydroxylés (AHA) ou polyhydroxylés tels que les acides glycolique, lactique, malique, citrique, tartarique, shikimique, les acides carboxyliques dérivés de sucres de fruits ou de toutes autres parties de plantes tels que les acides uroniques, ou encore les diacides tels que l’acide succinique.

Par « composés phénoliques », on entend l’ensemble des molécules possédant un ou plusieurs cycles aromatiques portant eux-mêmes un ou plusieurs groupements hydroxyles, tels que les acides phénoliques, les flavonoïdes ou leurs dérivés, les tannins ou tous autres polyphénols.

Par « acides phénoliques », on entend les composés phénoliques dérivés de l’acide benzoïque et de l’acide cinnamique, molécules possédant un seul cycle aromatique.

Par « flavonoïdes » on entend les composés phénoliques partageant tous une même structure de base formée par deux cycles aromatiques reliés par trois carbones.

Par « flavonoïdes glycosylés » on entend les flavonoïdes liés à un ou plusieurs sucres.

Par « sucres » on entend tous les glucides tels que les mono- et disaccharides ainsi que les oligo- et polysaccharides contenus dans l’extrait.

Par « phytomolécules d’intérêt », on entend l’ensemble des molécules présentes dans les extraits de l’invention et notamment, les protéines, les sucres, les composés phénoliques, les acides organiques, les acides aminés, les petits ARN d’une longueur d’au maximum 150 nucléotides.

Quand une gamme de valeur est décrite, les bornes de cette gamme doivent être comprises comme incluant explicitement toutes les valeurs intermédiaires de la gamme. Par exemple, une gamme de valeur comprise entre 1 % et 10 % doit être comprise comme incluant 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, et 10 %, ainsi que toutes les valeurs décimales entre 1 % et 10 %.

Les valeurs numériques en pourcentage sont des pourcentages en poids, c’est-à-dire le poids d’un composé par rapport au poids total du mélange envisagé, sauf spécifié autrement.

Les compositions décrites dans la présente demande peuvent « comprendre », « consister en » ou « consister essentiellement en » les composés essentiels ou les ingrédients optionnels.

« Consister essentiellement en » signifie que la composition ou le composant peut inclure des ingrédients additionnels, mais seulement si les ingrédients additionnels ne modifient pas les caractéristiques de bases ou les nouvelles caractéristiques de la composition ou de l’utilisation décrite dans la présente demande.

Un « milieu physiologiquement acceptable » désigne un véhicule adapté pour une mise en contact avec les couches externes de la peau ou des muqueuses, sans provoquer de toxicité, d’irritation, de réponse allergique indue et similaire ou de réaction d’intolérance, et proportionné à un rapport avantage/risque raisonnable.

« Peau » désigne la peau du visage et du corps y compris le cuir chevelu (incluant les follicules pileux et les espaces cutanés inter-folliculaires) et les phanères (cheveux, poils et ongles).

Par « quantité efficace » on désigne la quantité minimum d’extrait selon l’invention qui est nécessaire pour obtenir au moins une des activités biologiques recherchées, sans que cette quantité soit toxique.

Par « hydratation de la peau », on entend le contenu et la répartition en eau des couches supérieures de l’épiderme.

Par « signes du vieillissement cutané » on entend toutes modifications de l'aspect extérieur de la peau dues au vieillissement comme, par exemple, les rides et ridules, les crevasses, les poches sous les yeux, les cernes, le flétrissement, la perte d'élasticité, de fermeté et/ou de tonus de la peau, les désordres pigmentaires tels que le lentigo sénile ou lentigo solaire, mais également toutes modifications internes de la peau qui ne se traduisent pas systématiquement par un aspect extérieur modifié comme, par exemple, la diminution du nombre ou de l'activité des récepteurs mécano-sensoriels du toucher (Piezo1) et des récepteurs à l’ocytocine (OXTR), l’amincissement de la peau, ou toutes dégradations internes de la peau consécutives à des stress environnementaux tels que la pollution et les rayonnements solaires incluant les UV.

Par « bien êtrein vivo» on entend l’état émotionnel d’une personne, le sentiment subjectif de bien-être, la production physiologique d’ocytocine et la mesure du comportement ou de l’expression émotionnelle.

Il est bien entendu que l’invention concerne les mammifères et plus particulièrement l’être humain.

Procédés d’autofermentation et d’extraction

L’invention a pour premier objet un procédé d’obtention d’extraits végétaux enrichis en acides organiques et en acides phénoliques comprenant les étapes suivantes :

a) on met en présence la matière végétale avec de l’eau,

b) on ajuste si nécessaire le pH à une valeur comprise entre 4 et 9,

c) on maintient le mélange sous agitation douce pendant un temps compris entre 6 heures et 48 heures, à une température comprise entre 20 et 60°C, à un pH compris entre 4 et 7, pour permettre le processus d’autofermentation, dans une enceinte permettant les échanges gazeux avec l’atmosphère.

C’est la matière végétale fraîche mise en présence d’eau qui apporte les éléments nutritifs nécessaires à la croissance du phytobiote. La ressource en éléments nutritifs est suffisante pour permettre le développement et la survie du phytobiote pendant plusieurs jours.

Le procédé de l’invention est mis en œuvre sans apport d’éléments nutritifs exogènes et n’utilise pas de détergents ni de solvants potentiellement toxiques en cosmétique. Il présente donc un impact réduit sur l’environnement.

Une agitation modérée permet de maintenir les micro-organismes du phytobiote en suspension dans le mélange.

Le procédé d’autofermentation selon l’invention est réalisé en milieu ouvert pour permettre les échanges gazeux avec l'atmosphère, sans contrainte particulière pour assurer la stérilité, mais peut alternativement être mis en œuvre dans un fermenteur afin de contrôler les échanges gazeux.

L’autofermentation a lieu quand les micro-organismes du phytobiote, par le biais de leurs enzymes, métabolisent les éléments nutritifs d’origine végétale, tels que les sucres, les protéines, les polyphénols pour produire un extrait riche en diverses familles de composés plus simples et plus facilement assimilables comme les acides aminés, les acides organiques, les peptides et les acides phénoliques.

Des essais analytiques, menés en parallèle à une étude de la cinétique de la croissance microbienne, ont permis d’observer une modification significative du milieu au cours de l’autofermentation comme une baisse de la concentration en flavonoïdes, une baisse de la concentration en sucres, et l’apparition de marqueurs de fermentation comme les acides phénoliques et organiques attestant de l’activité fermentative des micro-organismes.

Dans un mode de réalisation particulier, les matières végétales utilisées sont des plantes de la famille des oleaceae, poaceae, fabaceae ou des champignons de la famille des tuberaceae.

Dans un autre mode de réalisation particulier, les matières végétales utilisées sont des plantes de la famille des oleaceae telles que le jasmin de l’espèceJasminum grandiflorum, et des violaceae telles que l’espèceViola odorata.

Dans un mode de réalisation particulier, les parties de plantes utilisées sont choisies parmi les fleurs, les fruits, les feuilles et les racines.

Dans un mode de réalisation préféré, les parties de plantes utilisées sont les fleurs.

Dans un autre mode de réalisation, les matières végétales utilisées sont des champignons de la famille des tuberaceae et préférentiellement les matières végétales utilisées sont choisies parmi les espècesTuber melanosporumetTuber magnatum. Dans ce cas, les parties de champignons utilisées sont choisies parmi le mycélium et les parties fructifiantes, et plus preférentiellement les parties fructifiantes.

Dans un autre mode de réalisation, les matières végétales utilisées sont des algues.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la matière végétale est un résidu de plante obtenu après transformation comme les tourteaux ou les drèches.

A l’étape a) on utilise de l’eau distillée, déminéralisée ou riche en sels minéraux et/ou oligo-éléments. L’eau préférentiellement utilisée est de l’eau distillée.

La matière végétale utilisée à l’étape a) peut être entière ou broyée de façon mécanique à l’aide d’un broyeur à lame par exemple pour diminuer la granulométrie de 0,5 mm à quelques centimètres sans affecter la viabilité des micro-organismes. Le broyage peut être réalisé à sec ou dans l’eau.

Lorsque la matière végétale est composée de fleur, de préférence elle est utilisée entière, c’est-à-dire non broyée. En effet, des extractions comparatives réalisées avec ou sans broyage ont montré que la diffusion passive des composés contenus dans les fleurs est suffisamment élevée pour rendre le broyage inutile.

En revanche, lorsque la matière végétale de départ est trop épaisse ou composée de fragments de grande taille, par exemple la partie fructifiante d’un champignon, une algue entière ou une racine, de préférence elle est préalablement broyée avant l’étape a).

A l’étape a) le rapport matière végétale / eau est de préférence compris entre 3 à 30 % en poids/poids, plus préférentiellement compris entre 3 et 15 %, encore plus préférentiellement il est de 3 %, 5 % ou 15 %.

Au début de l’étape b) le pH est contrôlé et ajusté à une valeur comprise entre 4 et 9, préférentiellement entre 6 et 8 et encore plus préférentiellement à pH 7, par l’ajout d’acide chlorhydrique (HCl), d’acide citrique ou de soude (NaOH). Le pH est ensuite contrôlé régulièrement tout au long de l’étape b) et éventuellement réajusté.

Lorsque de l’acide citrique est utilisé à cette étape, cette quantité d’acide citrique est retirée dans les calculs finaux de concentration en acides organiques de l’extrait.

A l’étape c), l’agitation du mélange est avantageusement une agitation modérée de type brassage. La température est ajustée et maintenue entre 20 et 60°C, plus préférentiellement entre 20 et 40 °C, et encore plus préférentiellement entre 30 et 40°C. Ces plages de températures sont idéales pour assurer le développement optimal des micro-organismes, en effet en dessous de 20°C la croissance microbienne est ralentie et au-dessus de 60°C la viabilité des micro-organismes diminue.

L’étape c) doit être réalisée à un pH et à température optimaux pour permettre d’enrichir la solution d’extraction aqueuse en phytomolécules et créer les conditions de croissance du phytobiote présent dans le mélange. Pendant cette étape le pH ne doit pas descendre en dessous de 5.

L’étape c) d’autofermentation se déroule pendant une durée comprise entre 1 et 48h, préférentiellement entre 6 et 30 h, et plus préférentiellement entre 15 et 30h. Une étude de la cinétique de croissance microbienne a démontré que la croissance est forte, dans les conditions du procédé, pendant une période d’au moins 30 heures, puis atteint un plateau.

Optionnellement, à la fin de l’étape c) une étape c’) de broyage de la matière solide résiduelle peut être réalisée, afin de libérer le contenu cellulaire des micro-organismes et d’augmenter ainsi le rendement d’extraction des phytomolécules.

Optionnellement, le procédé peut être poursuivi par les étapes suivantes :

d) on purifie le mélange obtenu en c) pour éliminer la matière végétale solide résiduelle et récolter la partie liquide,

e) on réalise au moins une filtration de la partie liquide obtenue à l’étape précédente,

f) on contrôle et réajuste le pH du filtrat, si nécessaire, à une valeur comprise entre 4 et 8, et préférentiellement à une valeur comprise entre 4 et 7.

g) On stérilise le filtrat.

h) L’extrait brut ainsi obtenu peut être dilué dans un solvant physiologiquement acceptable pour un usage cosmétique.

L’étape d) de purification du mélange obtenu à la fin de l’étape c) permet d’éliminer la matière solide résiduelle et récolter la partie liquide. Toute méthode connue par l’homme du métier pourra être utilisée. Le mélange obtenu en c) peut par exemple être filtré sur des filtres de porosité supérieure à 30 µm. Préférentiellement le mélange obtenu en c) est centrifugé à faible vitesse, par exemple pendant au moins 10 min à 4000 g.

A l’étape e), la partie liquide obtenue à l’étape d) est soumise de préférence à des filtrations successives en abaissant le seuil de filtration de 30 à 1 μm afin de clarifier la solution. De préférence, au moins 4 filtrations sont réalisées avec des filtres de porosité allant de 30µm, 4µm, 2 et 1µm.

A l’étape f), on ajuste le pH du mélange obtenu à l’étape précédente à une valeur comprise entre 4 et 8, et préférentiellement entre 4 et 7. Le pH peut être ajusté par ajout d’une solution ou de soude (NaOH) ou d’acide chlorhydrique (HCl) ou tout autre acide équivalent, compatible avec une utilisation cosmétique, tel que de l’acide citrique. Cette étape est indispensable pour éviter la précipitation des phytomolécules d’intérêt comme les sucres, les composés phénoliques, les acides organiques, les protéines, les acides aminés et ainsi obtenir un extrait stable.

A l’étape g), le filtrat peut être stérilisé par toute méthode connue de l’homme du métier, par exemple par étuvage ou préférentiellement par filtration stérilisante sur filtre de 0,2 à 0,45 µM.

A la fin de l’étape g) on obtient un extrait brut concentré.

Le procédé d’autofermentation permet l’enrichissement de l’extrait en acides phénoliques issus de la transformation des polyphénols et en acides organiques tels que l’acide lactique, succinique et shikimique.

De préférence, les extraits bruts concentrés obtenus par le procédé décrit ci-dessus contiennent au moins 300 mg/kg de composés phénoliques et au moins 300 mg/kg d’acide organiques.

En utilisant le procédé de l’invention selon les étapes a) à g) on obtient des extraits bruts concentrés ayant un poids sec de 4 à 60 g/kg, contenant 0,5 à 40 g/kg de sucres, 50 à 5000 g/kg d’acides organiques, 50 à 5000 mg/kg de composés phénoliques et 30 à 3000 mg/L d’acides aminés. Néanmoins, ayant subi différents traitements, les extraits obtenus peuvent présenter une variabilité importante en fonction de facteurs tels que le lieu ou l’année de récolte, la saison, les conditions climatiques, le stress biotique, etc.

A l’étape h) parmi les solvants physiologiquement acceptables, on peut citer l’eau, le glycérol, l’éthanol, le propanediol ainsi que sa version naturelle issue du maïs, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants. Un des avantages d’une telle dilution, outre d’obtenir exactement les concentrations en phytomolécules recherchées, est d’améliorer la stabilité et la conservation de l’extrait végétal autofermenté.

Préférentiellement, l’extrait brut concentré est dilué par du butylène glycol, du propanediol ou encore de la glycérine et encore plus préférentiellement dilué par ajout de 30 % de propanediol pour assurer sa stabilité et sa conservation dans le temps en empêchant les contaminations. L’extrait brut peut également être dilué par ajout de 30 % de glycérine associée à tous types de conservateurs hydrosolubles tels que du sodium benzoate ou du potassium sorbate à la concentration finale de 0,5 % ou encore du phénoxyethanol à la concentration finale de 1,5 %.

Cet extrait dit dilué comprend en poids du poids total de l’extrait de 2 à 40 g/kg d’extrait sec, 0,2 à 30 g/kg de sucres, 10 à 4000 mg/kg d’acides organiques, 10 à 4000 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 2000 mg/L d’acides aminés.

En outre, entre l’étape c) ou c’) et l’étape g), des étapes supplémentaires d’extraction peuvent être réalisées selon tout procédé connu de l’homme de métier.

Parmi ces étapes supplémentaires d’extraction, on peut citer un procédé d’extraction permettant l’enrichissement en ARN de petits poids moléculaires décrit dans les brevets FR 1670672 et US 11,021,505.

Pour réaliser ce procédé, on met en présence la matière végétale autofermentée obtenue à l’étape c), c’est-à-dire comprenant la fraction liquide et les résidus végétaux broyés, auquel on ajoute de l'acide phytique à une concentration comprise entre 1 et 5 mM, à un pH compris entre 10 et 11, on ajuste le pH du mélange obtenu à une valeur comprise entre 6 et 8. On sépare la matière végétale résiduelle et on purifie la fraction liquide obtenue par des filtrations successives pour clarifier l’extrait.

L’extrait peut ensuite être stérilisé et dilué selon des étapes g) et h) identique à celle du procédé décrit précédemment.

Dans ce mode de réalisation particulier, la matière végétale est avantageusement une fleur comme la fleur de jasmin de l’espèceJasminum grandiflorumou la violette de l’espèceViola odorata.

Un des avantages de coupler le procédé d’autofermentation avec un procédé d’extraction complémentaire permettant l’enrichissement en petits ARN est d’augmenter d’un facteur 2 ou 3 le rendement de l’extraction en comparaison avec un extrait obtenu par autofermentation. La concentration en protéines, en sucres, acides organiques et en composés phénoliques totaux est également augmentée d’au moins un facteur 2.

Ainsi les extraits bruts concentrés obtenus par le procédé décrit ci-dessus ont un poids sec au moins 2 fois supérieur au poids sec des extraits obtenus par simple autofermentation et contiennent au moins 400 mg/kg de composés phénoliques et au moins 500 mg/kg d’acide organiques.

Parmi ces étapes supplémentaires d’extraction, on peut encore citer un des nombreux procédés d’extraction connus de l’homme du métier mettant en œuvre une hydrolyse enzymatique ou plusieurs hydrolyses enzymatiques successives.

Extraits végétaux obtenus

L’invention a pour deuxième objet un extrait végétal obtenu par le procédé d’autofermentation comprenant les étapes a) à g) et comprenant au moins 300 mg/ kg de composés phénoliques.

L’invention a également pour objet un extrait végétal concentré, caractérisé en ce qu’il comprend en poids du poids total de l’extrait de 4 à 20 g/kg d’extrait sec, 0,5 à 40 g/kg de sucres, 50 à 4000 mg/kg d’acides organiques, 50 à 4000 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 2000 mg/kg d’acides aminés, susceptible d’être obtenu par le procédé décrit ci-dessus.

L’invention a encore pour objet un extrait végétal, caractérisé en ce qu’il comprend en poids du poids total de l’extrait, 4 à 20 g/kg d’extrait sec, 0,5 à 40 g/kg de sucres, 50 à 4000 mg/kg d’acides organiques, 50 à 4000 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 2000 mg/kg d’acides aminés, obtenu par le procédé décrit ci-dessus.

L’extrait de l’invention comprend ainsi une large gamme de phytomolécules pouvant présenter des effets bénéfiques sur la peau, sans présenter de risque d’irritation cutanée ou autre dommage pour la santé.

Dans un mode de réalisation particulier, l’extrait de l’invention contient au moins 300 mg/kg d’acides organiques.

Dans un mode de réalisation particulier, l’extrait de l’invention contient au moins 100 mg/kg d’acides spécifiques de la fermentation, choisi parmi l’acide lactique et l’acide shikimique.

En particulier, l’extrait de l’invention contient au moins 300 mg/kg de composés phénoliques.

Dans un mode de réalisation particulier, l’invention a pour objet un extrait dilué qui comprend en poids du poids total de l’extrait de 2 à 40 g/kg d’extrait sec, 0,2 à 30 g/kg de sucres, 10 à 4000 mg/kg d’acides organiques, 10 à 4000 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 2000 mg/L d’acides aminés.

L’extrait de l’invention ne contient pas d’éthanol puisque le procédé de l’invention n’est pas une fermentation de type alcoolique.

Dans un mode de réalisation particulier, l’invention a pour objet un extrait végétal obtenu par le procédé d’autofermentation comprenant les étapes a) à c) couplé à des étapes d’extraction supplémentaires pour permettre l’enrichissement en ARN de petits poids moléculaires, mais également augmenter par un facteur 2 ou 3 le rendement d’extraction.

Avantageusement dans ce mode de réalisation particulier l’extrait est obtenu à partir de fleurs fraîches de jasmin (Jasminum grandiflorum) ou de fleurs fraîches de violette (Viola odorata), et a un poids sec au moins 2 fois supérieur au poids sec des extraits obtenus par simple autofermentation et comprend au moins 400 mg/kg de composés phénoliques et au moins 500 mg/kg d’acide organiques.

Compositions cosmétiques

Un troisième objet de l’invention est une composition cosmétique comprenant une quantité efficace d’au moins un extrait végétal obtenu selon le procédé décrit dans la présente demande.

Avantageusement, les extraits végétaux de l’invention sont utilisés sous forme dluée et sont ajoutés dans un milieu physiologiquement acceptable à une concentration de 0,05 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition, préférentiellement à une concentration de 0,1 à 2,5 % en poids par rapport au poids total de la composition.

La composition utilisable selon l'invention est formulée pour être appliquée par toute voie appropriée, notamment orale, ou topique externe, et la formulation des compositions sera adaptée par l'homme du métier.

Préférentiellement, les compositions selon l'invention se présentent sous une forme adaptée à l’application par voie topique. Ces compositions doivent donc contenir un milieu physiologiquement acceptable, c’est-à-dire compatible avec la peau et les phanères, sans risque d’inconfort lors de leur application et couvrent toutes les formes cosmétiques adaptées.

Les compositions pour la mise en œuvre de l’invention pourront notamment se présenter sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile-dans-eau, eau-dans-huile ou émulsions multiples ; elles peuvent aussi se présenter sous forme de suspensions, ou encore poudres, adaptées à une application sur la peau, les muqueuses, les lèvres et/ou les cheveux.

Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir également l’aspect d’une crème, d’une lotion, d’un lait, d’un sérum, d’une pommade, d’un gel, d’une pâte ou d’une mousse. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, comme un stick ou être appliquées sur la peau sous forme d’aérosol.

A titre de milieu physiologiquement acceptable communément utilisé dans le domaine d'application envisagé, on peut citer par exemple des adjuvants nécessaires à la formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des antioxydants, des colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d’odeur, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, etc.

Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l’invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre à 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition selon l’invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids par rapport au poids total de la composition.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de l’invention, les extraits végétaux de l’invention peuvent être encapsulés ou inclus dans un vecteur cosmétique tels que les liposomes ou toute autre nano capsule ou microcapsule utilisée dans le domaine de la cosmétique ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites.

Avantageusement, la composition selon l’invention peut comprendre, outre l’extrait végétal selon l'invention, au moins un autre agent actif présentant des effets cosmétiques similaires et/ou complémentaires à ceux de l'invention.

Par exemple, le ou les agents actifs additionnels peuvent être choisis parmi : les agents anti-âge, raffermissants, éclaircissants, hydratants, drainants, favorisant la microcirculation, exfoliants, desquamants, stimulant la matrice extracellulaire, activant le métabolisme énergétique, antibactériens, antifongiques, apaisants, anti-radicalaires, anti-UV, anti-acné, anti-inflammatoires, anesthésiques, procurant une sensation de chaleur, procurant une sensation de fraîcheur, amincissants.

De tels agents actifs additionnels peuvent être choisis dans les groupes comprenant :
- les vitamines (vitamine A et ses dérivés ; vitamines B3, B5, B6 et B12 ; vitamine C ; vitamines E, F, H, K, PP ou encore le coenzyme Q10) ;
- les inhibiteurs de métalloprotéinase, ou les activateurs des TIMP ;
- la DHEA, ses précurseurs et dérivés ;
- les acides aminés, les peptides naturels ou de synthèse,
- l’extrait d’Artémia salina, commercialisé sous le nom GP4G™ (FR2817748, ASHLAND®) ;
- les extraits peptidiques végétaux, les extraits de levures, les extraits de polyphénols ;
- l’acide déhydroacétique (DHA) ;
- les phystostérols d'origine synthétique ou naturelle ;
- l’acide salicylique et ses dérivés, les alpha- et bêta-hydroxyacides, les silanols ;
- les sucres aminés et les polysaccharides ;
- les lipides tels que les céramides ou les phospholipides ;
- l'AMP cyclique et ses dérivés, les méthyls xanthines.

Utilisations cosmétiques

L’invention a pour quatrième objet l’utilisation cosmétique d’une composition comprenant les extraits végétaux de l’invention pour le soin de la peau, plus particulièrement pour lutter contre les signes du vieillissement cutané, la perte de fermeté ou de tonicité, améliorer la fonction barrière et l’hydratation, éclaircir la peau, atténuer la diminution liée à l’âge du nombre ou de l'activité des récepteurs mécano-sensoriels du toucher (Piezo1) et des récepteurs à l’ocytocine (OXTR), ou encore améliorer les défenses immunitaires innées de la peau et le bien-êtrein vivo.

Préférentiellement, les utilisations cosmétiques selon la présente invention concernent des méthodes de traitement cosmétiques par applications topiques sur des peaux saines.

En particulier, l’invention a pour objet l’utilisation d’extraits autofermentés de fleurs fraîches de jasmin (Jasminum grandiflorum) ou de fleurs fraîches de violette (Viola odorata).

Les extraits végétaux de l’invention ont été testés sur des marqueurs biologiques associés au vieillissement et à l’hydratation, tels que l’expression du collagène et de l‘acide hyaluronique, et ont démontré une efficacité supérieure à des extraits végétaux conventionnels contrôles.

Les extraits végétaux de l’invention ont été testés sur des marqueurs biologiques associés à la fermeté ou tonicité de la peau, tels que la e-cadhérine et ont démontré une efficacité supérieure à des extraits végétaux conventionnels contrôles.

Les extraits végétaux de l’invention ont été testés sur la tyrosinase, une enzyme associée à la synthèse de mélanine, et donc à la pigmentation de la peau, et ont démontré une activité inhibitrice de la tyrosinase supérieure à des extraits végétaux conventionnels contrôles.

Dans un mode de réalisation particulier, l’invention a pour objet l’utilisation cosmétique d’une composition comprenant un extrait autofermenté de fleurs fraîches de jasmin (Jasminum grandiflorum) obtenu par un procédé d’autofermentation couplé à un procédé d’extraction permettant l’enrichissement spécifique en ARN de petits poids moléculaires (procédé décrit dans les brevets FR 1670672 et US 11,021,505).

Dans ce mode de réalisation particulier, l’extrait autofermenté puis extrait de fleurs fraîches de jasmin (Jasminum grandiflorum) est utilisé pour atténuer la diminution liée à l’âge du nombre ou de l'activité des récepteurs mécano-sensoriels du toucher (Piezo1) et des récepteurs à l’ocytocine (OXTR), améliorer les défenses immunitaires innées de la peau et le bien-êtrein vivo.

Dans ce mode de réalisation particulier, les extraits de fleurs jasmin ont démontré leur capacité à moduler positivement les récepteurs du toucher présents dans la peau (Piezo1).

Dans ce mode de réalisation particulier, les extraits de fleurs jasmin ont démontré leur capacité à stimuler l’expression du récepteur à l’ocytocine, une molécule impliquée dans la prévention du vieillissement cutané.

Dans ce mode de réalisation particulier, les extraits de fleurs jasmin ont démontré leur capacité à stimuler l’expression de la vipérine.

En effet, les kératinocytes sont la première ligne de défense de l'organisme, initiant une réponse immunitaire innée en reconnaissant les agents pathogènes. L’extrait de jasmin de l’invention a été testé sur l’expression de la vipérine, qui est un de ces facteurs de la défense immunitaire innée synthétisé par les kératinocytes.

Dans ce mode de réalisation particulier, une composition comprenant 2% d’extraits de fleurs jasmin, appliquée topiquement par des volontaires sains a produit un effet positif sur le bien-êtrein vivo. Dans ce test, l’état émotionnel a été évalué à travers trois composantes distinctes : le sentiment subjectif de bien-être, la production salivaire d’ocytocine et la mesure du comportement ou de l’expression émotionnels (Don Hockenbury et Sandra E. Hockenbury, Discovering psychology, 5eme édition, Page 344, chapitre 8, éditions Worth Publishers).

Exemples

A titre illustratif, des exemples de mode de réalisation du procédé selon l’invention sont décrits ci-dessous.

Exemple 1 : Préparation d’un extrait de fleurs de jasmin (Jasminum grandiflorum ) fraîches autofermentées

L’espèceJasminum grandiflorumappartient au genre Jasminum et est largement utilisée dans l’industrie en tant que fragrance ou arôme.

Dans une première étape a), 200 g de fleurs fraîches entières de jasmin sont mélangés à 1800 g d’eau distillée, soit 10 % de matière première engagée dans le procédé et 90 % d’eau pour un poids total de 2 kg.

b) Le pH est ajusté à 7.

c) Le mélange est maintenu à 30°C, dans un bécher ouvert pour maintenir une atmosphère aérobie, favorable au développement des micro-organismes pendant 24h. Pendant cette étape, le pH est contrôlé régulièrement permettant de noter une acidification du milieu lié au développement des micro-organismes, sans que celui-ci ne descende en dessous de 5.

d) Le mélange obtenu est centrifugé 10 min à 4000 g, de manière à sédimenter la matière végétale résiduelle dans le culot et récolter le surnageant.

e) Le mélange obtenu est ensuite soumis à des filtrations successives en abaissant le seuil de filtration de 30 à 0,2 μm.

f) Le pH du filtrat obtenu est ajusté à 6,3 en utilisant de l’acide citrique concentré à 10 %.

g) Le filtrat est stérilisé par filtration.

L’extrait non dilué a un poids sec de 11,7 g/kg et contient une concentration de 5,2 g/kg de sucres totaux, 3,7 g/kg de protéines, 411,1 mg/kg d’acides organiques totaux, 630 mg/kg de composés phénoliques totaux.

h) L’extrait est dilué avec de la glycérine dérivée de plante de manière à obtenir une concentration finale de 30 % de glycérine et 70 % d’extrait de fleurs de jasmin autofermentées.

L’extrait dilué a un poids sec de 8,1 g/kg, et présente une concentration de 3,6 g/kg de sucres totaux, 2,6 g/kg de protéines, 287,7 mg/kg d’acides organiques totaux, 441 mg/kg de composés phénoliques totaux.

Exemple 2 : Préparation d’un extrait de fleurs de jasmin fraîches autofermentées (Jasminum grandiflorum ) par autofermentation couplé à un deuxième procédé d’extraction permettant l’enrichissement spécifique en petits ARN

Une fois l’autofermentation réalisée selon les étapes a) à c) de l’exemple 1, on ajoute 2g/L soit 3 mM d’acide phytique à ce milieu autofermenté.

Le pH est ajusté à pH 11 afin de permettre un enrichissement de l’extrait en ARN de petits poids moléculaires ainsi qu’en diverses phytomolécules.

Le mélange est chauffé 2h à 80°C sous agitation.

Le mélange est ensuite filtré à l’aide de filtres de porosité de 30 µm, pour séparer la matière solide du filtrat.

Des filtrations séquentielles sur filtres de porosité décroissante sont alors réalisées afin de clarifier l’extrait végétal autofermenté jusqu’à une filtration à 1 µm de porosité.

Le pH est ajusté à 6,3 avec une solution d’acide citrique.

A cette étape, l’extrait a un poids sec de 17,5 g/kg, et présente une concentration de 6,4 g/kg de sucres totaux, de 6,6 g/kg de protéines, de 651,8 mg/kg d’acides organiques totaux, de 1301 mg/kg de composés phénoliques totaux et de 45 mg/kg d’ARN de petits poids moléculaires et dépourvu d’ADN.

L’absence d’ADN a été démontré par un test à la DNAse, enzyme qui dégrade spécifiquement l’ADN et non l’ARN. Le profil électrophorétique après action de la DNase n’est pas modifié, ce qui démontre que l’acide nucléique présent dans l’extrait n’est pas sensible à la DNase et n’est donc pas de l’ADN.

L’extrait est ensuite dilué par de la glycérine dérivée de plante de manière à obtenir une concentration finale de 30 % de glycérine et 70 % d’extrait de fleurs de jasmin autofermentées.

L’extrait dilué a un poids sec de 11,7 g/kg, et présente une concentration de 4,1 g/kg de sucres totaux, 4,6 g/kg de protéines, 413,7 mg/kg d’acides organiques totaux, 874 mg/kg de composés phénoliques totaux et 31 mg/kg d’ARN de petits poids moléculaires.

Exemple 3 : Préparation d’un extrait de fleurs de violette fraîches autofermentées (viola odorata )

Les plantes du genre Viola sont des plantes herbacées appartenant à la famille des Violaceae. L’espèceViola odorata, est connue pour être la seule du genre Viola à être parfumée et est de ce fait largement utilisée dans l’industrie des parfums, dans les confiseries et en cuisine. Cette espèce a également des vertus médicinales reconnues en herboristerie.

Dans une première étape a), 200 g de fleurs entières et fraîches de violette sont mélangées à 1800 g d’eau distillée, soit 10% de matière première engagée dans le procédé et 90 % d’eau pour un poids total de 2 kg.

Les étapes b) à g) sont strictement identiques à l’exemple 1.

L’extrait obtenu a un poids sec de 7,1 g/kg, et une concentration de 1,0 g/kg de sucres totaux, 1278,0 mg/kg d’acides organiques totaux, 444,5 mg/kg de composés phénoliques totaux et 2,1 g/Kg de protéines.

L’extrait est ensuite dilué avec de la glycérine dérivée de plante de manière à obtenir une concentration finale de 30 % de glycérine et 70 % d’extrait de fleurs de violettes autofermentées.

L’extrait ainsi dilué a un poids sec de 5,0 g/kg, et présente une concentration de 0,7 g/kg de sucres totaux, 894,6 mg/kg d’acides organiques totaux, 344,4 mg/kg de composés phénoliques totaux et de 1,5 g/Kg de protéines.

Exemple 4 : Préparation d’un extrait de fleurs de violette fraîches ( viola odorata ) par une autofermentation couplée à un deuxième procédé d’extraction permettant l’enrichissement spécifique en petits ARN

Une fois l’autofermentation réalisée selon les étapes a) à c) de l’exemple 3, on ajoute 2g/L soit 3 mM d’acide phytique à ce milieu phytofermenté.

Le pH est ajusté à pH 11 afin de permettre un enrichissement de l’extrait en ARN de petits poids moléculaires ainsi qu’en diverses phytomolécules.

Le mélange est chauffé 2h à 80°C sous agitation.

Des filtrations séquentielles sur filtres de porosité décroissante sont alors réalisées afin de clarifier l’extrait végétal autofermenté jusqu’à une filtration à 1 µm de porosité.

Le pH est ajusté à 6,3 avec une solution d’acide citrique.

A ce stade, l’extrait a un poids sec de 14,8 g/kg, et une concentration de 2,45 g/kg de sucres totaux, 1336,9 mg/kg d’acides organiques totaux, 492,2 mg/kg de composés phénoliques totaux, 3,95 g/Kg de protéines et 26 mg/kg d’ARN de petits poids moléculaires et ne contient pas d’ADN.

L’extrait est ensuite dilué avec du propanediol dérivé de plante de manière à obtenir une concentration finale de 30 % de propanediol et 70 % d’extrait de fleurs de violette autofermentées.

L’extrait ainsi dilué a un poids sec de 10,36 g/kg, et une concentration de 1,7 g/kg de sucres totaux, 935,8 mg/kg d’acides organiques totaux, 344,4 mg/kg de composés phénoliques totaux, 2,8 g/Kg de protéines et 18 mg/kg d’ARN de petits poids moléculaires et ne contient pas d’ADN.

Exemple 5 : Préparation d’extraits conventionnels de fleurs fraîches en tant qu’éléments comparatifs

Dans un but comparatif, des extraits conventionnels ont été réalisés en engageant la même quantité de fleurs entières et fraîches que dans les exemples 1 à 4 soit 10 % de matière première végétale dans de l’eau distillée.

Le mélange est ensuite chauffé 1 h à 25°C, puis filtré par une première filtration sur filtres à large porosité de 30 µm afin d’ôter la matière végétale résiduelle solide de la partie liquide. Puis des filtrations séquentielles sur filtres de porosité décroissante sont alors réalisées afin de clarifier l’extrait végétal jusqu’à une filtration stérilisante à 0,2 µm de porosité.

La partie liquide obtenue à l’étape précédente constitue un extrait conventionnel contrôle.

Des données analytiques comparatives ont ainsi pu être générées, comme illustrées dans les figures , , , , et les exemples 6, 7, 9 et 10.

Exemple 6 : Analyse des extraits de fleurs de jasmin des exemples 1 et 2 versus un extrait conventionnel

Les analyses ont été réalisées sur les extraits des exemples 1 et 2 avant dilution et sur un extrait conventionnel de l’exemple 5.

Méthodologies

La teneur totale en composés phénoliques des extraits a été mesurée par spectrophotométrie à 760 nm après réduction du réactif de Folin-Ciocalteu par les phénols. La quantification est effectuée à l’aide d’une courbe standard d’acide gallique, les résultats sont exprimés en équivalent acide gallique.

La teneur totale en protéines a été mesurée par spectrophotométrie à 550 nm après réaction colorimétrique du Biuret combiné avec celle du réactif de Folin-Ciocalteu. La quantification a été effectuée à l’aide d’une courbe standard de BSA (Bovine Sérum Albumine).

Le détail de la composition en composés phénoliques a été réalisé par chromatographie liquide couplée à un détecteur UV fixé à 254 nm. Les échantillons ont été séparés sur une colonne UPTISPHERE CS EVOLUTION C18-AQ par un système HPLC Agilent 1200 (Agilent Technologies). Les phases mobiles consistaient en une solution d’acide formique à 0,1 % et de méthanol.

Le profil de distribution des poids moléculaires des protéines a été réalisé par chromatographie d’exclusion stérique couplée à un détecteur UV fixé à 254 nm. Les échantillons ont été séparés sur une colonne YMC Pack Diol 60 (DL06503-2543WT) par un système HPLC Agilent 1200 (Agilent Technologies). La phase mobile consistait en une solution aqueuse 0,05 % NaN3, 0,2 M NaCl, 0,1 M tampon phosphate à pH 7.

La caractérisation et la quantification des acides organiques est réalisée par chromatographie liquide haute performance, couplée à une détection par spectromètre de masse (Acquity Qda, Waters) équipé d’une source d’ions électrospray en mode négatif. Les échantillons ont été séparés sur une colonne EC 150 / 4,6 Nucleoshell RP 18plus-5µm (Macherey Nagel : 763236.46) par un système HPLC Agilent 1260 (Agilent Technologies). Le débit était de 0,3 ml / min. Les phases mobiles consistaient en une solution d’acide formique à 0,01 % et d’acétonitrile.

Résultats

Le profil protéique des extraits est illustré à la figure . Les poids moléculaires de l’extrait conventionnel sont répartis entre 7200 et 170g/mol. En comparaison, le procédé d’autofermentation de l’exemple 1 apporte un élargissement de la distribution en poids moléculaires des protéines de l’extrait avec des masses allant de 15800 à 170 g/mol. Les analyses de quantifications globales et les comparaisons de profils protéiques mettent donc en évidence l’augmentation de la quantité de protéines lors du processus de fermentation par rapport à un extrait conventionnel, notamment pour les masses supérieures à 1000 g/mol.

L’extrait de l’exemple 2 (autofermentation couplé à une extraction) augmente la complexité de l’extrait avec l’apparition de protéines de poids moléculaire vers 19 000 g/mol et une augmentation du signal pour les petites molécules ayant un poids moléculaire vers 1000g/mol.

L’analyse met en évidence une diminution de la quantité de composés phénoliques lors du processus d’autofermentation tel qu’illustré dans les tableaux [Tableau 1] et [Tableau 2].

L’extrait de l’exemple 2 (autofermentation couplé à une extraction) contient plus de composés phénoliques qu’un extrait conventionnel (exemple 5). La figure montre une consommation ciblée des composés phénoliques complexes (flavonoïdes ou flavonoïdes glycosylés) et l’apparition de composés phénoliques simples tels que acides phénoliques lors de la fermentation. La figure indique une augmentation de 54 % de la présence des acides phénoliques et une diminution de 87 % de la présence des flavonoïdes et flavonoïdes glycosylés dans l’extrait autofermenté de jasmin comparé à un extrait conventionnel.

L’extrait autofermenté suivi d’une extraction (selon exemple 2) montre une augmentation de 41 % en acides phénoliques qu’un extrait autofermenté et 78 % de moins de flavonoïdes et de flavonoïdes glycosylés qu’un extrait autofermenté.

L’analyse des acides organiques contenus dans les extraits, telle qu’illustrée par La figure , montre une augmentation de 42 % en acide succinique et de 44 % de la concentration en acide shikimique qui sont des composés spécifiques issus de la fermentation par les micro-organismes dans les extraits autofermentés et autofermentés suivis d’une extraction versus un extrait conventionnel.

[Tableau 1] : Analyse des composés des extraits de fleurs de jasmin

	Extrait conventionnel	Extrait autofermenté	Extrait autofermenté + Extraction
Composés phénoliques (mg/kg)	783	630	1301
Protéines (g/kg)	4,7	3,7	6,6
Acide shikimique (mg/Kg)	135,7	243,2	241,4
Acide succinique (mg/Kg)	23,4	40,2	50,7

[Tableau 2] : Analyse des composés phénoliques des extraits de fleurs de jasmin (aire sous la courbe)

	Extrait conventionnel	Extrait autofermenté	Extrait autofermenté + Extraction
Acides phénoliques (mAU)	2304	5078	8749
Flavonoïdes et flavonoïdes glycosylés (mAU)	2606	329	71

Exemple 7 : Analyse des extraits de fleurs de violette des exemples 3 et 4 versus un extrait conventionnel (exemple 5)

Les analyses ont été réalisées sur les extraits des exemples 3 et 4 avant dilution et sur un extrait conventionnel de l’exemple 5.

Méthodologie

La teneur totale en sucres de l’extrait a été déterminée par dosage spectrophotométrique. À 490 nm des complexes colorés formés par les sucres dissouts dans de l’acide sulfurique et sont mis en présence de phénol. La teneur en sucre est déterminée à l’aide d’une courbe standard de glucose.

L’identification et la quantification détaillée des sucres présents a été effectuée par chromatographie liquide haute performance, couplée à un spectromètre de masse ACQUITY Qda (WATERS) équipé d’une sonde electrospray en mode négatif. Les échantillons ont été séparés sur une colonne Luna Omega SUGAR 100A (Phenomenex : H21-180323) par un système HPLC Agilent 1260 (Agilent Technologies). Le débit était de 0,8 ml / min. Les phases mobiles consistaient en une solution aqueuse 20 mmol d’acétate d’ammonium et 95/5 (ACN/H20) 20 mmol d’acétate d’ammonium.

La caractérisation et la quantification des acides organiques a été effectuée selon la méthode décrite dans l’exemple 6.

Résultats

Les analyses mettent en évidence une consommation de 67 % des sucres totaux (illustré ) et en particulier la consommation de la totalité des sucres impliqués dans les processus de fermentation (fructose et glucose) dans les extraits de l’invention (exemples 3 et 4) comparativement à un extrait conventionnel (exemple 5).

L’analyse des acides organiques contenus dans les différents extraits (illustré ) montre une augmentation de 97 % de la concentration en acides lactique et succinique et de 99 % en acide propionique dans l’extrait autofermenté de violette comparé à un extrait conventionnel. L’extrait autofermenté suivi d’une extraction contient 11 % d’acide succinique et 15 % d’acide propionique de plus qu’un extrait autofermenté.

[Tableau 3] : Analyse des sucres et des acides organiques dans des extraits de fleurs de violette

	Extrait conventionnel	Extrait autofermenté	Extrait autofermenté + Extraction
Sucres totaux (g/Kg)	3,1	1,0	2,5
Fructose (mg/Kg)	132,0	<LD	<LD
Glucose (mg/Kg)	243,0	<LD	<LQ
Acide lactique (mg/Kg)	19,2	552,7	544,8
Acide succinique (mg/Kg)	6,3	235,1	263,6
Acide propionique (mg/Kg)	<LQ	241,5	286,4

Exemple 8 : Mise en évidence du rôle du phytobiote dans l’autofermentation des fleurs de jasmin ( Jasminum grandiflorum )

Des fleurs de jasmin fraîches ont été stérilisées par autoclavage pendant 10 minutes à 121°C pour tuer les micro-organismes. Cette matière végétale dépourvue de phytobiote a ensuite été engagée dans le procédé décrit à l’exemple 1 pour constituer un extrait contrôle.

L’analyse physico-chimique montre que les taux de composés phénoliques et de protéines diminuent fortement pendant le processus d’autofermentation, alors qu’ils sont stables dans la condition contrôle.

Ces résultats démontrent que les micro-organismes du phytobiote sont directement responsables de la consommation métabolique des composés phénoliques et des protéines lors du processus d’autofermentation décrit dans la présente demande et en particulier dans l’exemple 1.

[Tableau 4] : Comparaison de la consommation de composés phénoliques et de protéines en situation autofermentative ou contrôle (phytobiote tué)

	Extrait de fleurs de jasmin autofermentées	Extrait de fleurs de jasmin stérilisées
	Début fermentation	Fin fermentation	Début fermentation	Fin fermentation
Composés phénoliques (mg/kg)	912	486	1046	980
Protéines (g/kg)	4,1	2,9	5	5,1

Exemple 9 : Evaluation in vitro de la capacité inhibitrice de la hyaluronidase des extraits de fleurs de jasmin fraîches obtenus selon les exemples 1 et 5

La hyaluronidase catalyse la dégradation de l’acide hyaluronique (un glycosaminoglycane fortement présent au niveau du derme de la peau ayant des propriétés hydratantes et anti-âge) en mono ou disaccharides ainsi qu’en fragments plus petits d’acide hyaluronique.

L'acide hyaluronique a la capacité de provoquer une turbidité en présence d’une solution d'albumine acide, qui peut être mesurée au spectrophotomètre à 600 nm.

Protocole : L’enzyme est incubée avec les extraits obtenus selon les exemples 1 et 5 à la concentration choisie (dilution vol/vol) à une température de 37°C. Le substrat de l’enzyme, l’acide hyaluronique est ajouté au mélange. L’ensemble est homogénéisé lentement puis laissé à incuber pendant exactement 45 minutes à 37°C. L’acide hyaluronique restant dans le mélange est ensuite mis en contact avec une solution d’albumine acide pendant 10 minutes avant que la transmittance ne soit lue à 600 nM au spectrophotomètre.

L’extrait de fleurs de jasmin autofermentées préparé selon l’exemple 1 présente un pouvoir inhibiteur de l’enzyme significativement plus fort que l’extrait préparé de manière conventionnelle selon l’exemple 5. Les résultats sont présentés dans le [Tableau 5].

[Tableau 5] : Comparaison des pourcentages d’inhibition de la hyaluronidase obtenus,in vitro, entre les extraits de jasmin conventionnel et autofermenté

	Extrait conventionnel	Extrait autofermenté
Concentration d’extrait	0,5 %	1 %	2 %	0,5 %	1 %	2 %
Pourcentage d’inhibition de la hyaluronidase	4	1	15	57,4	86,6	100

Exemple 10 : Evaluation in vitro du pouvoir inhibiteur de la tyrosinase des extraits de fleurs de violette fraîches obtenus selon les exemples 3 et 5

La tyrosinase est une enzyme impliquée dans la synthèse de mélanine produite par les mélanocytes de la peau. Son inhibition entraine une diminution de la production de mélanine dans la peau.

Protocole : L’enzyme est incubée avec les extraits obtenus selon les exemples 3 et 5 à une concentration choisie (dilution vol/vol), pendant 25 minutes à température ambiante, dans un tampon à pH neutre. Juste avant la mesure de la fluorescence au spectrophotomètre à 490 nm, le substrat de l’enzyme, le L-tyrosine à 2,5 mM, est ajouté au mélange. La cinétique de mesure de la fluorescence émise par le substrat non dégradé, est suivie pendant 45 minutes à 490 nm.

L’extrait de fleurs de violette autofermenté préparé selon l’exemple 3 présente un pouvoir inhibiteur de l’enzyme significativement plus fort que l’extrait préparé de manière conventionnelle selon l’exemple 5 qui ne présente,in vitro, aucun effet inhibiteur sur la tyrosinase. Résultats présentés au [Tableau 6].

[Tableau 6] : Comparaison des pourcentages d’inhibition de la tyrosinase obtenus,in vitro, entre les extraits de violette conventionnels et autofermentés

	Extrait conventionnel	Extrait autofermenté
	0,5 %	1 %	2 %	0,5 %	1 %	2 %
Pourcentage d’inhibition de la tyrosinase	0	0	0	24,8	56,9	92,7

Exemple 11 : Formule d’une crème riche

Ingrédients (Nom de marque) INCI	% w/w
Phase A
Eau purifiée	Aqua	Qsp 100 100
Optiphen™ Plus preservative	Phenoxyethanol (and) Caprylyl Glycol (and) Sorbic Acid	1,50
Phase B
Stabileze™ QM polymer	PVM/MA Decadiene Crosspolymer	0,15
Phase C
ProLipid™ 141 lamellar gel	Glyceryl Stearate (and) Behenyl Alcohol (and) Palmitic Acid (and) Stearic Acid (and) Lecithin (and) Lauryl Alcohol (and) Myristyl Alcohol (and) Cetyl Alcohol	5,00
Ceraphyl™ 494 ester	Isocetyl Stearate	4,00
Ceraphyl™ SLK ester	Isodecyl Neopentanoate	4,00
DC 580 Wax	Stearoxytrimethylsilane (and) Stearyl Alcohol	2,00
Emulsynt™ GDL ester	Glyceryl Dilaurate	3,00
Phase D
Gransil DM-5	Dimethicone (and) Polysilicone-11	3,00
Phase E
Hydroxyde de sodium	Sodium Hydroxide	0,04
Eau purifiée	Aqua	0,50
Phase F
PF Bois Précieux	Parfum/Fragrance	0,30
Unipure* Red LC 381 ADT-C	CI 77491 (Iron oxides) (and) Isopropyl Titanium Triisostearate (and) Bis-Hydroxyethoxypropyl Dimethicone (and) PEG-2-Soyamine (and) Isophorone Diisocyanate	0,03
Phase G
Extrait selon l’exemple 2	propanediol (and) Jasminum Grandiflorum Flower Extract	2,00
Ronaflair Balance Gold	CI 77891 (Titanium Dioxide) (and) Mica (and) Tin Oxide	0,30
Covabead Velvet 10	Polymethyl Methacrylate	1,00
Ronaflair Balance Red	CI 77891 (Titanium Dioxide) (and) Mica (and) Tin Oxide	1,20
Phase H
Eau purifiée	Aqua	15,00
Natrosol™ Plus 330 CS HMHEC	Cetyl Hydroxyethylcellulose	0,50

Procédé de préparation

1. Homogénéiser la phase A dans le récipient principal et commencer à chauffer à 75-80°C ;

2. A 30°C, saupoudrer dans la Phase B et homogénéiser tout en chauffant ;

3. Dans un bécher à part, préparer la phase C, chauffer à 75-80°C jusqu'à homogénéité ;

4. A 75°C, ajouter la phase C dans le récipient principal et homogénéiser pendant 10 minutes ;

5. Laisser refroidir la température et ajouter la phase D à 65°C. Bien mélanger pour homogénéiser pendant 10 minutes ;

6. Prémélanger la phase E avant de l'ajouter dans le récipient principal ;

7. Ajouter la phase E à 60°C. Bien mélanger pour homogénéiser pendant 10 minutes ;

8. A 35°C, prémélanger la phase F avant de l'ajouter et de bien mélanger ;

9. Prémélanger la phase G avant de l'ajouter dans le récipient principal ;

10. Ajouter la phase G à 35°C. Bien mélanger pour homogénéiser ;

11. Dans un bécher à part, préparer la phase H : saupoudrer Natrosol™ dans l'eau à température ambiante et homogénéiser tout en chauffant à 60°C ;

12. Ajouter la phase H à 30°C. Bien mélanger pour homogénéiser ;

13. Arrêter à 25°C.

La composition se présente ainsi sous forme d’une crème beurre rose, avec un pH compris entre 4,90 et 5,40 et une viscosité (D0) de 160000 – 210000 cps (Brookfield RVT/Spindle D/5 RPM/1 minute/25°C).

Exemple 12 : Evaluation de l’extrait de jasmin obtenu selon l’exemple 2 sur l’expression du récepteur piezo1 dans des épidermes reconstruits

Les protéines piezo1 et piezo2 ont été identifiées comme des canaux ioniques médiant la transduction mécano-sensorielle dans les cellules de mammifères (Coste, Bertrandet al.“Piezo1 and Piezo2 are essential components of distinct mechanically activated cation channels.” Science (New York, N.Y.) vol. 330,6000 (2010): 55-60). Dans la peau, les kératinocytes participent à médier la sensation tactile en détectant et en codant ces informations pour les neurones sensoriels. Piezo1 est le principal mécanotransducteur des kératinocytes (Holt, Jesse Ret al.Spatiotemporal dynamics of PIEZO1 localization controls keratinocyte migration during wound healing. eLife vol. 10 e65415. 27 Sep. 2021).

Principe : L’extrait de jasmin obtenu selon l’exemple 2 a été évalué pour sa capacité à moduler l’expression du mécanorécepteur piezo1 dans la peau humaineex vivo.

Protocole : L’expression du récepteur piezo1 est évaluée par immunofluorescence indirecte sur des coupes d’épiderme reconstruit, traitées au préalable par application topique de l’extrait de jasmin de l’exemple 2 dilué à 2 % (vol/vol) pendant 48 heures (1 fois par jour). Des épidermes reconstruits contrôles incubés en parallèle dans les mêmes conditions reçoivent le placebo (Phosphate Buffer Saline, PBS). Au terme de l’incubation, les épidermes reconstruits sont fixés et inclus en paraffine pour la réalisation de coupes histologiques. La détection du récepteur piezo1 est réalisée par incubation avec un anticorps primaire anti-piezo1 (Proteintech). Après une heure et demie d’incubation suivie de rinçages, les coupes sont incubées en présence de l’anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorophore (Alexa Fluor® 488, Invitrogen). Les coupes sont ensuite examinées au microscope à Epi-fluorescence (Zeiss Axiovert 200M microscope). L’expression du récepteur piezo1 est alors observée et quantifiée par analyse d’image (Volocity® image analysis software, Improvision).

Résultats : Comme illustré par la figure , lorsque les biopsies ont été traitées par l’extrait de jasmin à 2 %, l’expression du récepteur piezo1 a augmenté de 39 %.

Conclusion : L’extrait de jasmin a montré un effet positif sur l’expression du récepteur piezo1.

Exemple 13 : Evaluation de l’extrait de jasmin obtenu selon l’exemple 2 sur l’expression du récepteur à l’ocytocine (OXTR) sur des biopsies de peau humaine

Principe : Le but de cette expérience est de démontrer un effet de l’extrait de jasmin sur la synthèse du récepteur à l’ocytocine dans des biopsies de peau humaine en culture.

Protocole : L’expression du récepteur à l’ocytocine (OXTR) est évaluée par immunofluorescence indirecte sur des biopsies de peau, traitées au préalable par application topique de l’extrait de jasmin de l’exemple 2 dilué à 2 % (vol/vol) pendant 48 heures (2 fois par jour). Des biopsies contrôles incubées en parallèle dans les mêmes conditions reçoivent le placebo (Phosphate Buffer Saline, PBS). Au terme de l’incubation, les biopsies sont fixées et incluses en paraffine pour la réalisation de coupes histologiques. La détection du récepteur OXTR est réalisée par incubation avec de l’anticorps anti-OXTR (Proteintech). Après une heure et demie d’incubation suivie de rinçages, les coupes sont incubées en présence de l’anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorophore (Alexa Fluor® 488, Invitrogen). Les coupes sont ensuite examinées au microscope à Epi-fluorescence (Zeiss Axiovert 200M microscope). L’expression du récepteur OXTR est alors observée et quantifiée par analyse d’image (Volocity® image analysis software, Improvision).

Résultats : Comme illustré par la figure , lorsque les biopsies ont été traitées par l’extrait de jasmin à 2 %, l’expression du récepteur OXTR a augmenté de 63 %.

Conclusion : L’extrait de jasmin a montré un effet positif sur l’expression du récepteur olfactif à l’ocytocine OXTR.

Exemple 14 : Evaluation de l’extrait de jasmin obtenu selon l’exemple 2 sur l’expression des ARN messagers du récepteur à l’ocytocine (OXTR) dans des kératinocytes en culture

L’ocytocine est un peptide naturel contrôlant un large éventail d'actions spécifiques dans ses tissus cibles, allant de la croissance et la différenciation cellulaire, à la reproduction et au comportement social (Carter, C Sueet al. “Is Oxytocin "Nature's Medicine Pharmacological reviews vol. 72,4 (2020): 829-861). Un grand nombre de publications scientifiques soutiennent le rôle bénéfique de l'ocytocine dans la physiologie de la peau et le vieillissement (Hayre, Nicole. “Oxytocin Levels Inversely Correlate with Skin Age Score and Solar Damage.” Journal of drugs in dermatology : JDD vol. 19,12 (2020): 1146-1148). D’autres recherches soulignent également l’importance du récepteur à l’ocytocine dans la prévention du vieillissement cutané (Cho, S-Y et al. “Oxytocin alleviates cellular senescence through oxytocin receptor-mediated extracellular signal-regulated kinase/Nrf2 signalling.” The British journal of dermatology vol. 181,6 (2019): 1216-1225).

Principe : Le but de cette expérience est de démontrer un effet de l’extrait de jasmin sur la synthèse de l’ARN messager du récepteur à l’ocytocine dans des kératinocytes de peau humaine.

Protocole : Le niveau d’expression des ARN messagers du récepteur à l’ocytocine OXTR est évaluée par qPCR (réaction de polymérisation en chaine quantitative) sur des kératinocytes de peau en culture, traités au préalable avec de l’extrait de jasmin obtenu selon l’exemple 2 pendant 48 heures à 1 % (dilution vol/vol) dans le milieu de culture (1 fois par jour). Au terme de la culture, les cellules sont lysées, les ARN totaux sont extraits puis convertis en ADN complémentaire (ADNc) par une réaction de reverse transcription. La quantification des ADNc du récepteur OXTR a été effectuée par qPCR en utilisant une sonde TaqMan pour la détection. La méthode de quantification des delta-delta Ct a permis de comparer la différence d'expression (ΔCt) entre le gène d'intérêt (OXTR) et le gène de référence (GADPH).

Résultats : Comme illustré par la figure , lorsque les kératinocytes en culture ont été traitées par l’extrait de jasmin obtenu à l’exemple 2 à 1 %, l’expression des ARN messagers du récepteur OXTR est augmenté de 26 %.

Conclusion : L’extrait de jasmin a montré un effet positif sur l’expression des ARN messagers du récepteur OXTR.

Exemple 15 : Evaluation de l’extrait de jasmin obtenu selon l’exemple 2 sur l’expression de la vipérine dans des kératinocytes en culture

La vipérine est un des facteurs de la défense immunitaire innée synthétisé par les kératinocytes (Garcia, Magaliet al. “Innate Immune Response of Primary Human Keratinocytes to West Nile Virus Infection and Its Modulation by Mosquito Saliva.” Frontiers in cellular and infection microbiology vol. 8 387. 2 Nov. 2018,). Il a été démontré que la vipérine catalyse la conversion de la cytidine triphosphate (CTP) en 3′-désoxy-3′,4′-didéhydro-CTP (ddhCTP), un analogue de ribonucléotide jusqu'alors inconnu. L'incorporation de ddhCTP provoque l'arrêt prématuré de la synthèse d'ARN de certains virus (Gizzi, Anthony Set al. “A naturally occurring antiviral ribonucleotide encoded by the human genome.” Nature vol. 558,7711 (2018): 610-614.).

Principe : Le but de cette expérience est de démontrer un effet de l’extrait de jasmin sur le niveau d’expression de la vipérine dans des kératinocytes en culture.

Protocole : L’expression de la vipérine est évaluée par immunofluorescence indirecte sur des kératinocytes. Les kératinocytes en culture ont été traités par application de l’extrait de jasmin obtenu selon l’exemple 2 à 1 % (dilution vol/vol) pendant 48 heures (1 fois par jour). Au terme de la culture, les cellules sont fixées. La détection de la vipérine est réalisée par incubation avec un anticorps anti-vipérine (Sigma). Après une heure et demie d’incubation suivie de rinçages, les cellules sont incubées en présence d’un anticorps secondaire anti-souris couplé à un fluorophore (Alexa Fluor® 488, Invitrogen). Les cellules sont ensuite examinées au microscope à Epi-fluorescence (Zeiss Axiovert 200M microscope). L’expression de la vipérine est alors observée et quantifiée par analyse d’image (Volocity® image analysis software, Improvision).

Résultats : Comme illustré par la figure , l’extrait de jasmin obtenu selon l’exemple 2 a montré un effet positif de +40 % sur l’expression de la vipérine dans des kératinocytes en culture.

Conclusion : L’extrait de jasmin a montré un effet positif sur l’expression de la vipérine.

Exemple 16 : Evaluation de l’extrait de jasmin obtenu selon l’exemple 2 sur le niveau d’expression de la E-cadhérine, sur des biopsies de peau humaine prétraitées avec un bloqueur de l’activité de piezo1 (Dooku1)

Principe : Le but de cette expérience est de démontrer un effet de l’extrait de jasmin sur le niveau d’expression de la E-cadhérine, une molécule impliquée dans la tonicité tissulaire, dans des biopsies de peau humaine en culture.

Protocole : L’expression de la E-cadhérine est évaluée par immunofluorescence indirecte sur des biopsies de peau prétraitées avec un bloqueur de l’activité de piezo1 (Dooku1), puis traitées par application topique de l’extrait de jasmin obtenu selon l’exemple 2 pendant 48 heures (2 fois par jour), ou avec un activateur de piezo1 (Jedi1) pendant 48 heures (1 fois par jour). Des biopsies contrôles incubées en parallèle dans les mêmes conditions reçoivent le placebo (Phosphate Buffer Saline, PBS). Au terme de l’incubation, les biopsies sont fixées et incluses en paraffine pour la réalisation de coupes histologiques. La détection de l’E-cadhérine est réalisée par incubation avec des anticorps anti-E-cadhérine (Abcam). Après une heure et demie d’incubation, suivi de rinçages, les coupes sont incubées en présence de l’anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorophore (Alexa Fluor® 488, Invitrogen). Les coupes sont ensuite examinées au microscope à Epi-fluorescence (Zeiss Axiovert 200M microscope). L’expression du récepteur OXTR est alors observée et quantifiée par analyse d’image (Volocity® image analysis software, Improvision).

Résultats : Comme illustré par la figure , lorsque les biopsies ont été prétraitées avec un bloqueur de l’activité de piezo1 (Dooku1), une diminution de -44 % de l’expression de la E-cadhérine est observée. Lorsque les biopsies ont été traitées par l’activateur de piezo1 (Jedi1), l’expression de la E-cadhérine est augmenté de 23 %. Lorsque les biopsies ont été traitées avec l’extrait de jasmin, l’expression de la E-cadhérine est augmenté de 95 %.

Conclusion : L’extrait de jasmin obtenu selon l’exemple 2 a montré un effet positif sur l’expression de E-cadhérine, en mimant l’effet de l’activateur du récepteur piezo1 (Jedi1).

Exemple 17 : Evaluation de l’extrait de jasmin obtenu selon l’exemple 2 sur le niveau d’expression des ARN messagers de l’enzyme 11 β -HSD1, dans des kératinocytes en culture

Principe : Le but de cette expérience est de démontrer un effet de l’extrait de jasmin sur le niveau d’expression de l’ARN messager de l’enzyme 11β-HSD1, connu également sous le nom de cortisone réductase, dans des kératinocytes de peau humaine en culture.

Protocole : Le niveau d’expression des ARN messagers de l’enzyme 11β-HSD1 est évaluée par qPCR (réaction de polymérisation en chaine quantitative) sur des kératinocytes de peau humaine en culture, traités au préalable avec de l’extrait de jasmin obtenu selon l’exemple 2 pendant 48 heures à 1 % dans le milieu de culture (1 fois par jour). Au terme de la culture, les cellules sont lysées, les ARN totaux sont extraits puis convertis en ADN complémentaire (ADNc) par une réaction de reverse transcription. La quantification des ADNc de l’enzyme 11β-HSD1 a été effectuée par polymérisation en chaîne quantitative en utilisant une sonde TaqMan pour la détection. La méthode de quantification des delta-delta Ct a permis de comparer la différence d'expression (ΔCt) entre le gène d'intérêt (11β-HSD1) et le gène de référence (GADPH).

Résultats : Comme illustré par la figure , lorsque les kératinocytes en culture ont été traitées par l’extrait de jasmin obtenu selon l’exemple 2 à 1 %, le niveau d’expression des ARNm de l’enzyme 11β-HSD1 est diminuée de -24 %.

Conclusion : L’extrait de jasmin a montré un effet d’inhibition sur le niveau d’expression de l’enzyme 11β-HSD1.

Claims (11)

1. Procédé d’obtention d’extraits végétaux enrichis en acides organiques et en composés phénoliques, comprenant les étapes suivantes :
   a) on met en présence la matière végétale avec de l’eau,
   b) on ajuste si nécessaire le pH à une valeur comprise entre 4 et 9,
   c) on maintient le mélange sous agitation douce pendant un temps compris entre 6 heures et 48 heures, à une température comprise entre 20 et 60°C, à un pH compris entre 4 et 7, pour permettre le processus d’autofermentation, dans une enceinte permettant les échanges gazeux avec l’atmosphère.
2. Procédé de préparation d’extraits végétaux selon la revendication 1 caractérisé en ce que les matières végétales utilisées sont des plantes de la famille des oleaceae, poaceae, fabaceae ou des champignons de la famille des tuberaceae.
3. Procédé de préparation d’extraits végétaux selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l’étape c) d’autofermentation se déroule pendant une durée comprise entre 15 et 30 h, à une température comprise entre 30 et 40°C.
4. Procédé de préparation d’extraits végétaux selon l’une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le procédé est poursuivi par les étapes suivantes :
   d) on purifie le mélange obtenu en c) pour éliminer la matière végétale solide résiduelle et récolter la partie liquide,
   e) on réalise au moins une filtration de la partie liquide obtenue à l’étape précédente,
   f) on contrôle et réajuste le pH du filtrat, si nécessaire, à une valeur comprise entre 4 et 8, et préférentiellement à une valeur comprise entre 4 et 7.
   g) on stérilise le filtrat,
   h) on dilue l’extrait par un solvant physiologiquement acceptable.
5. Procédé de préparation d’extraits végétaux selon l’une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu’il comprend les étapes ultérieures suivantes : à la matière végétale autofermentée obtenue à l’étape c), on ajoute de l'acide phytique à une concentration comprise entre 1 et 5 mM, à un pH compris entre 10 et 11, on ajuste le pH du mélange obtenu à une valeur comprise entre 6 et 8, on sépare ensuite la matière végétale résiduelle, on purifie la fraction liquide obtenue par des filtrations successives pour clarifier l’extrait et on dilue l’extrait par un solvant physiologiquement acceptable.
6. Procédé de préparation d’extraits végétaux selon la revendication 5, caractérisé en ce que la matière végétale utilisée est une fleur fraîche choisie parmi le jasmin de l’espèceJasminum grandiflorumou la violette de l’espèceViola odorata.
7. Extraits végétaux dilués obtenus par le procédé de la revendication 5 caractérisé en ce qu’il comprend au moins 400 mg/kg de composés phénoliques et au moins 500 mg/kg d’acide organiques.
8. Extraits végétaux dilués obtenus par le procédé de la revendication 4 caractérisé en ce qu’il comprend en poids du poids total de l’extrait, de 2 à 40 g/kg d’extrait sec, 0,2 à 30 g/kg de sucres, 10 à 4000 mg/kg d’acides organiques, 10 à 4000 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 2000 mg/L d’acides aminés.
9. Composition comprenant une quantité efficace d’extrait obtenus selon l’un des procédés des revendications 4 ou 5, comprenant préférentiellement de 0,05 à 5 % dudit extrait, et encore plus préférentiellement de 0,1 à 2,5 dudit extrait en poids par rapport au poids total de la composition, et un milieu physiologiquement acceptable.
10. Utilisation cosmétique de la composition de la revendication 9 pour lutter contre les signes du vieillissement cutané, la perte de fermeté ou de tonicité, améliorer la fonction barrière et l’hydratation, éclaircir la peau ou encore améliorer les défenses immunitaires innées de la peau et le bien-êtrein vivo.
11. Utilisation cosmétique de la composition comprenant une quantité efficace d’extrait obtenu selon le procédé de la revendication 5 pour atténuer la diminution liée à l’âge des récepteurs du toucher (Piezo1) et des récepteurs à l’ocytocine (OXTR), améliorer les défenses immunitaires de la peau et le bien-êtrein vivo.