WO2022112724A2 - Extrait fermenté de miel d'ikaria - Google Patents

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WO2022112724A2
WO2022112724A2 PCT/FR2021/052109 FR2021052109W WO2022112724A2 WO 2022112724 A2 WO2022112724 A2 WO 2022112724A2 FR 2021052109 W FR2021052109 W FR 2021052109W WO 2022112724 A2 WO2022112724 A2 WO 2022112724A2
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honey
ikaria
fermented extract
skin
loss
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PCT/FR2021/052109
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Patrick Choisy
Lorène GOURGUILLON
Robin Kurfurst
Olivier JEANNETON
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L V M H Recherche
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Publication date
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A61K8/987—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of species other than mammals or birds
    • A61K8/988—Honey; Royal jelly, Propolis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
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    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/85—Products or compounds obtained by fermentation, e.g. yoghurt, beer, wine

Definitions

  • TITLE Fermented extract of Ikaria honey
  • the present invention relates to the cosmetics field and in particular to a fermented extract of Ikaria honey as well as the fermentation process for obtaining it, a cosmetic composition containing said fermented extract of Ikaria honey, and its use in a cosmetic process. for caring for and/or making up keratin materials.
  • the skin is the body's first protective barrier against the environment.
  • our skin is thus daily subjected to stresses of exogenous or endogenous origin likely to induce unsightly non-pathological skin reactions and/or discomfort that can lead to an acceleration of skin ageing.
  • Exogenous stresses are numerous: they are in particular of chemical origin (e.g. xenobiotics, antigens, allergens) or of environmental origin (temperature, climate, UV radiation, atmospheric pollution, cigarette smoke, etc.) or even of mechanics (injuries, friction, shaving, cleaning, etc.).
  • the integrity of the skin is notably mediated by the cell cytoskeleton, composed of actin filaments, microtubules and intermediate filaments.
  • the cell cytoskeleton is responsible for various structural and mechanical properties of cells but also of the skin, which are essential for its homeostasis.
  • the cellular cytoskeleton also helps generate contractile forces. These forces are then exploited as a driving force to bend and give their active forms to the cellular constituents and thus ensure cellular functions as crucial as cellular metabolism, the conversion of keratinocyte stem cells and the interactions between cells and the extracellular matrix, necessary to achieve tensegrity.
  • This integrity allows the cells of the skin to form a whole that is more resistant and solid than the sum of its constituents.
  • the cytoskeleton plays an important role in maintaining homeostasis and the quality of the skin.
  • agents capable of preventing and/or reducing the signs of skin aging in particular making it possible to combat stress and/or making it possible to stimulate and/or promote homeostasis and skin renewal.
  • the Applicant demonstrated the 'anti-aging' effects of a fermented extract of Ikaria honey in vitro on fibroblast cultures.
  • the fermented extract of Ikaria honey has a tightening effect on fibroblasts, making it possible to increase the number and organization of F-actin filaments present in the cytoskeleton, as well as the radius of curvature and the contractile forces of fibroblasts on a collagen matrix, ultimately promoting cellular integrity and skin cell homeostasis.
  • the Applicant has also demonstrated that the fermented extract of Ikaria honey, and compared to the same non-fermented honey, makes it possible to significantly increase the production of intracellular ATP, and therefore increase the cellular energy of the cells of the skin.
  • the fermented extract of Ikaria honey is in particular used according to the invention as a cosmetic active ingredient intended to promote and/or stimulate cutaneous homeostasis and/or epidermal renewal and/or cutaneous regeneration and/or the integrity of the skin and/or prevent and/or reduce the signs of skin aging, in particular loss of firmness, loss of elasticity, loss of density, loss of skin suppleness, loss of tone, alteration of barrier function of the skin, and/or the appearance of wrinkles and/or fine lines.
  • the first object of the invention therefore relates to a fermented extract of Ikaria honey comprising a lactic acid content of between 0.01 and 0.08%, a pyruvic acid content of between 0.05 and 0.5%, and an acetic acid content of between 1 and 20%, by weight relative to the dry extract weight of the fermented extract.
  • Another object of the invention relates to a process for the fermentation of Ikaria honey comprising the following steps: a) incubation of a consortium of microorganisms in a solution comprising a carbohydrate for 1 to 10 days at 17 to 38° C in order to obtain a culture of microorganisms, said consortium comprising at least one lactic bacterium belonging to the genus Lactobacillus or Pediococcus, at least one yeast belonging to the genus Saccharomyces, Schyzosaccharomyces or Torulaspora, and at least one acetic bacterium belonging to the genus Acetobacter , Gluconobacter or Komagataeibacter; b) adding the culture obtained in step a) to a fermentation medium comprising Ikaria honey at a content by weight of 20 to 300 g/kg of water in order to obtain a fermentation mixture, said culture being added at a concentration of between 0.5 and 15% by weight relative to the total weight of the fermentation mixture; c)
  • Another object of the invention relates to a fermented extract of Ikaria honey obtained by the process as described according to the invention.
  • the invention also relates to a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising, in a physiologically acceptable medium, a fermented extract of Ikaria honey.
  • Another object of the invention relates to a cosmetic process for caring for and/or making up keratin materials, in particular the skin and/or the lips, comprising the application to said keratin materials of at least one layer of the composition cosmetic as described according to the invention.
  • the invention finally relates to the cosmetic use of a fermented extract of Ikaria honey according to the invention as an active ingredient for promoting and/or stimulating skin homeostasis and/or epidermal renewal and/or skin regeneration and/or the integrity of the skin, and/or preventing and/or reducing the signs of skin aging, in particular the loss of firmness, loss of elasticity, loss of density, loss of suppleness, loss of tone, alteration of the barrier function of the skin and/or the appearance of wrinkles and/or fine lines.
  • Figure 1 Evaluation of the geometry and cytoskeleton of human dermal fibroblasts after 16 hours under the following conditions: (1) no treatment (negative control), (2) treatment with TGF-B at 10 ng/ml_ (positive control for cellular contraction), (3) treatment with cytochalasin D at 1 mM (positive control for cellular relaxation), (4) treatment with fermented extract of Ikaria honey at 0.1%.
  • Figure 2 Evaluation of cell contraction induced by the cytoskeleton of human dermal fibroblasts after 16 hours of treatment with fermented extract of Ikaria honey at 0.1%: (A) stretching ratio ), (B) radius of curvature.
  • Figure 3 Evaluation of the actin fiber network in human dermal fibroblasts after 16 hours of treatment with 0.1% fermented Ikaria honey extract: (A) number of actin fibers, (B) average network actin fiber length, (C) total network actin fiber length.
  • Figure 4 Force-gross indentation curve acquired on the collagen matrix around the fibroblast.
  • Z (pm) is the distance traveled by the AFM probe. The area between the blue lines allows the calculation of the mechanical properties. The elastic modulus is extracted on the 50% of the maximum force applied.
  • Figure 5 Evaluation of intracellular ATP synthesis in human dermal fibroblasts after 24 hours of treatment with fermented extract of Ikaria honey at 0.01%, or unfermented Ikaria honey at 0.01 % or in the absence of treatment.
  • Honey is one of the products derived from beekeeping like royal jelly, propolis, pollen, bee venom and wax. However, these products are distinct from each other, both in their mode of production within the hive and in their composition and properties. Honey and pollen are substances that constitute the food of bees throughout the year, the first providing sugars, the second proteins. Honey and pollen can be stored for long periods in the hive.
  • Honey is produced by foraging bees, which collect nectar from flowers and manufacture it by successive digestions and regurgitations.
  • Honey is also low in fat, fiber and protein. Depending on the variety of bees and the environment in which they evolve, the different honeys can present a great variability.
  • honey there are thus different types of honey that can be distinguished according to the floral type or even according to its geographical area of origin, each having a characteristic flavor and appearance.
  • nectar honey when the honey is made by bees from the nectar of the flowers that they forage, and in particular of "monofloral" honey when it comes mainly from a single variety of flowers, while the other honeys will be qualified as “polyfloral”.
  • the "honey from Ikaria” or “honey from the island of Ikaria” used in the context of the invention is a honey originating from the Greek island of Ikaria, which is made by the Greek bee Apis mellifera cecropia . Preferably, it is harvested in the hills of the western part of the island.
  • Ikaria honey is preferably an "Ikaria forest honey", made mainly from summer heather (Erica manipuliflora) and holm oaks (Quercus ilex) by the Greek bee Apis mellifera cecropia.
  • Ikaria honey preferably Ikaria forest honey
  • Ikaria forest honey is used in a fermentation process to generate a fermented extract of Ikaria honey, object of the present invention.
  • the expression "fermented extract” designates the product resulting from the fermentation process by fermentation, with or without filtration, therefore both with and without the microbial biomass of the fermentation medium, as well as any product having undergone additional steps, such as a formulation step (eg by adding a preservative).
  • the fermented extract of Ikaria honey according to the invention is in the form of an aqueous solution of fermented extract comprising the fermented dry extract, water and a preservative.
  • the fermented extract in the form of an aqueous solution is also called 'raw material' in the description, as opposed to 'dry matter' or fermented dry extract.
  • the aqueous solution of fermented extract comprises the fermented extract in an active content (dry matter) ranging from 2 to 5% by weight, in particular 3 to 4% by weight and in particular 3.2% by weight of active material relative to the total weight of raw material (aqueous solution of fermented extract), water and a preservative, preferably propanediol.
  • the water content will generally range from 60 to 70% by weight, in particular from 65% to 70% in particular from 66.8% by weight relative to the total weight of raw material (aqueous solution of fermented extract) and the content of preservative (eg: propanediol) will generally range from 25 to 50% by weight, in particular from 30 to 40% by weight, in particular 30% by weight relative to the total weight of raw material (aqueous solution of fermented extract).
  • preservative eg: propanediol
  • the invention also relates to a fermented extract of Ikaria honey in the form of a solution comprising 3 to 4% by weight of active ingredient of fermented extract of Ikaria honey, 30 to 35% by weight of propanediol and 60 to 70% by weight of water.
  • the aqueous solution of fermented extract otherwise called 'raw material' in the characterization which is illustrated below, comprises 3.2% in active matter (dry matter) of fermented extract, 30% of propanediol and 66.8% water relative to the total weight of raw material (aqueous solution of fermented extract).
  • the fermented extract of Ikaria honey comprises a lactic acid content of between 0.001% and 1%, a pyruvic acid content of between 0.01% and 1% and an acetic acid content of between 1 and 20% by weight relative to the weight of dry extract (dry matter) of the fermented extract.
  • the fermented extract of Ikaria honey comprises a lactic acid content of between 0.005% and 0.5%, more preferably 0.01 and 0.08%, even more preferably between 0.03 and 0, 05% by weight relative to the dry extract weight of the fermented extract.
  • the fermented extract of Ikaria honey comprises a pyruvic acid content of between 0.05 and 0.5%, more preferably between 0.1 and 0.2% by weight relative to the weight of extract dry of the fermented extract.
  • the fermented extract of Ikaria honey comprises an acetic acid content of between 1 and 20%, preferably between 5 and 15%, more preferably between 10 and 14%, even more preferably approximately 12, 13, or 14% by weight relative to the weight of dry extract of the fermented extract.
  • the fermented extract of Ikaria honey may include other organic acids, such as citric acid, gluconic acid, malic acid, quinic acid, and/or shikimic acid. Also, the fermented extract of Ikaria honey may include:
  • citric acid content of between 0.001 and 0.1%, preferably between 0.005 and 0.08%, more preferably between 0.01 and 0.06%, %, even more preferably between 0.03 or 0.06 % by weight relative to the dry extract weight of the fermented extract,
  • gluconic acid content of between 1 and 15%, preferably between 5 and 10%, more preferably between 6 and 9%, by weight relative to the dry extract weight of the fermented extract
  • a malic acid content of between 0.001 and 1%, preferably between 0.01 and 1%, more preferably between 0.005 and 0.5% more preferably between 0.1 and 0.2% by weight relative to the weight dry extract of the fermented extract,
  • a quinic acid content of between 0.001 and 1%, preferably between 0.01 and 0.5%, more preferably between 0.01 and 0.05% even more preferably between 0.2 and 0.3% by weight relative to the dry extract weight of the fermented extract, and/or
  • a shikimic acid content of between 0.001 and 0.20%, preferably between 1 and 15%, more preferably between 5 and 10%, even more preferably between 6 and 8%, by weight relative to the weight of dry extract of the fermented extract.
  • the fermented extract of Ikaria honey does not include glucuronic acid, propionic acid, and/or tartaric acid.
  • sugars, polyphenols, vitamins and minerals are expressed in % by weight of raw material within the meaning of raw material as defined above (aqueous solution comprising 3.2% dry extract, 30% propanediol and 66 .8% water).
  • the quantity of sugars present in the fermented extract of Ikaria honey is reduced compared to the quantity present in the Ikaria honey before fermentation.
  • the content of Ikaria honey in the fermented extract of Ikaria honey is in particular between 0.1 and 50 g/kg of raw material (i.e. between 0.01 and 5%), preferably between 0.5 and 40 g/kg of raw material (ie between 0.05 and 4%), more preferably between 20 and 30 g/kg of raw material (ie between 2 and 3%).
  • the glucose content in the fermented extract of Ikaria honey is in particular between 0.1 and 100 g/kg of raw material (i.e.
  • the fructose content in the extract fermented Ikaria honey is in particular between 0.1 and 100 g/kg of raw material (i.e. between 0.01 and 10%), preferably between 0.5 and 20 g/kg of raw material (i.e. between 0 .05 and 2%).
  • the total polyphenol content may be between 50 and 2000 mg/kg of raw material, preferably between 75 and 1000 mg/kg of raw material, more preferably between 100 and 500 mg/kg of raw material (i.e. between 0.01 and 0.05%).
  • the fermented extract of Ikaria honey also comprises at least one of the following compounds (secondary metabolites): succinic acid, 2-hydroxyhepanoic acid, syringaldehyde, 2- isopropyl, catechin, epigallocatechin gallate, syringic acid, piceide, cinnamic acid, protocatechuicaldehyde, quercetin, and mixtures thereof.
  • the fermented extract of Ikaria honey also includes vitamins and minerals, more particularly potassium.
  • the potassium content can be between 25 and 500 mg/kg of raw material, preferably between 75 and 250 mg/kg, even more preferably between 100 and 175 mg/kg.
  • the fermented extract of Ikaria honey may also include one or more preservatives.
  • preservative we mean a compound whose purpose is to preserve the composition of the extract or the cosmetic containing it from any physico-chemical and/or microbial alteration.
  • At least one preservative is chosen from propanediol, glycerin, butylene glycol, preferably from propanediol and glycerin, more preferentially propanediol.
  • the fermented extract may in particular comprise one or more preservative(s) at a final concentration of between 25 and 50%, preferably between 30 and 40%, more preferably 30% by weight relative to the total weight (of the fermented extract under form of solution), preferably at least one of the preservatives described above chosen from propanediol, glycerin and butylene glycol.
  • This fermented extract of Ikaria honey is obtained by a fermentation process comprising steps of: a) incubation of a consortium of micro-organisms in a solution comprising a carbohydrate at a temperature between 17 and 38° C in order to obtaining a culture of microorganisms; b) adding the culture obtained in step a) to a fermentation medium comprising Ikaria honey in order to obtain a fermentation mixture; c) incubation of the fermentation mixture obtained in step b) at a temperature between 12 and 42° C. for 2 to 20 days; d) filtration of the fermentation mixture, in order to obtain a fermented extract of Ikaria honey; and, optionally, e) adding at least one preservative.
  • Fermentation process is meant a process making it possible to obtain a fermented extract of Ikaria honey by culturing a consortium of micro-organisms as defined here in a medium containing Ikaria honey and allowing their growth.
  • the fermentation can take place under conditions of discontinuous culture (in “batch”), of continuous culture, or in continuous-discontinuous (in “Fed batch”). Fermentation can be carried out aerobic, micro-aerobic and/or anaerobic.
  • consortium of microorganisms is meant an assembly of at least three species of microorganisms that can coexist in a stable and reproducible manner.
  • the microorganisms make it possible to combine complementary activities.
  • the use or assimilation of a carbon source by a first species makes it possible to produce metabolites which can then be metabolized by a second species.
  • the consortium of microorganisms according to the present invention comprises: i) at least one microorganism belonging to the group of lactic acid bacteria, ii) at least one microorganism belonging to the group of yeasts, and iii) at least one microorganism belonging to the group of acetic acid bacteria.
  • At least one microorganism belonging to the group of lactic acid bacteria is a microorganism of the order Lactobacillales of the Lactobacillaceae family, in particular those belonging to the genera Lactobacillus and Pediococcus, such as Lactobacillus plantarum and/or Lactobacillus acidophilus , more preferably L. plantarum.
  • At least one microorganism belonging to the yeast group is a microorganism of the order Saccharomycetales of the family Saccharomycetaceae or of the order Schyzosaccharomycetales of the family Schyzosaccharomycetaceae, in particular those belonging to the genera Saccharomyces, Schyzosaccharomyces or Torulaspora.
  • at least one microorganism belonging to the yeast group is Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces boulardii and/or Schyzosaccharomyces pombe.
  • At least one microorganism belonging to the group of acetic acid bacteria is a microorganism of the order Rhodospirillales of the Acetobacteraceae family, in particular those belonging to the genera Acetobacter, Gluconobacter and Komagataeibacter (also called Gluconacetobacter).
  • Acetic acid bacteria can originate from cider vinegar or unpasteurized wine with an acidity level of 4% to 5%, preferably from commercial cider vinegar, labeled "organic farming" according to the definition of the European Union.
  • the addition of acetic acid bacteria to the consortium is done by direct addition of an aliquot of vinegar in the composition comprising the other species of microorganisms.
  • the consortium includes:
  • At least one yeast belonging to the genus Saccharomyces, Schyzosaccharomyces or Torulaspora more preferably chosen from Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Schyzosaccharomyces pombe and Torulaspora delbrueckii, and
  • acetic bacterium from cider vinegar or wine vinegar, preferably belonging to the genus Acetobacter, Gluconobacter or Komagataeibacter.
  • a culture of microorganisms (in other words, a consortium comprising the microorganisms as described above) is prepared.
  • This step advantageously makes it possible to activate and multiply the microorganisms while establishing a stable and balanced consortium.
  • the different microorganisms that will be present in the consortium are introduced into a solution comprising a carbohydrate (otherwise called a “nutrient medium”) in order to generate a microbial suspension.
  • the suspension is then incubated for 1 to 21 days in order to prepare the culture of the microorganisms (in other words, the consortium).
  • the solution comprises at least one carbohydrate, generally one or more mono- or disaccharides. It can be a pure sugar, such as sucrose, glucose or fructose, or a processed or co-produced product, such as molasses. Also, according to a preferential mode, the solution comprises a carbohydrate chosen from sucrose, glucose or fructose, molasses, or a mixture of one or more of these. Preferably, the carbohydrate is sucrose or a mixture of glucose and fructose. Preferably, at least one carbohydrate is present at a concentration of 50 to 95 g/l of solution.
  • the microorganisms can be introduced into the nutrient medium in dry and/or wet form; the inoculation rate may in particular be between 10 3 CFU/g and 10 5 CFU/g of solution.
  • the microbial suspension can then be incubated between 12°C and 45°C, preferably between 25°C and 35°C, more preferably at 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, or 35°C even more preferably at 26°C.
  • the incubation takes place in an open reactor, without the need to ensure aseptic conditions.
  • the suspension can be incubated for 1 to 21 days, preferably for 1 to 10 days, more preferably for 3 to 4 days, even more preferably for 3 days or 4 days.
  • the total flora in the suspension may be between 10 4 and 10 7 CFU/g.
  • the consortium thus obtained is able to react with a natural substrate, such as Ikaria honey, in an aqueous medium.
  • a natural substrate such as Ikaria honey
  • it is capable of directing the extractive fermentation of honey, to make accessible, and possibly transform, a great diversity of the compounds it contains.
  • step b) of the process the culture obtained in step a) above is then added to a fermentation medium comprising Ikaria honey in order to obtain a fermentation mixture.
  • the culture of microorganisms is added to the fermentation medium at a rate of between 10 2 CFU/g and 10 4 CFU/g of fermentation medium.
  • the culture of microorganisms is added to the fermentation medium at a concentration of between 0.5% and 15% by weight based on the weight of fermentation medium, preferably between 0.75 and 10%, more preferably 5%.
  • the fermentation medium comprises dechlorinated water as well as Ikaria honey at a concentration of between 20 and 300 g/kg of water, preferably between 50 and 150 g/kg of water, more preferably 60 and 100 g/kg of water, even more preferably at 75 g/kg of water.
  • the Brix degree of the fermentation medium is between 2 and 10.
  • the latter can be heated before or after adding the honey, for example at a temperature between 25° C. and 90° C., preferably 35° C.
  • the fermentation mixture is obtained by adding the culture according to step a) in dechlorinated water at a temperature of 35° C. comprising 50 to 150 g of Ikaria honey relative to the kg of water at a concentration of 5% by weight based on the weight of fermentation medium.
  • Ikaria honey corresponds to the only component providing carbohydrates to the fermentation medium.
  • step c) the fermentation mixture obtained in step b) is then incubated in order to ensure the fermentation of the Ikaria honey.
  • the incubation takes place at a temperature between 12°C and 45°C, preferably between 25°C and 35°C, more preferably at 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C. C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, or 35°C, even more preferably at 26°C.
  • the incubation is carried out for a period of 2 to 20 days, preferably for 10 to 15 days, more preferably for 10, 11, 12, 13, 14 or 15 days, even more preferably 10 days.
  • the incubation takes place in an open reactor, without the need to ensure aseptic conditions.
  • the incubation takes place at a humidity level of between 20% to 60%, preferably between 30% to 50%, more preferably 40%.
  • filtration is meant here a step making it possible to separate the solid and liquid fractions.
  • the filtration makes it possible to remove all of the microorganisms present in the mixture, in order to obtain a fermented extract of sterile Ikaria honey.
  • Filtration can be achieved by the use of one or more filters.
  • step d) corresponds to one or more filtration steps, preferably comprising at least one sterilizing filtration step, preferably on a filter having an average pore size of between 0.1 ⁇ m to 0.2 ⁇ m, preferably 0.2 ⁇ m.
  • sterilizing filtration makes it possible to remove any cellular debris quickly and inexpensively.
  • the filter is a cellulose filter.
  • the process described above makes it possible to obtain a fermented extract of clarified Ikaria honey. However, in some cases, it may be advantageous to carry out one or more additional steps, for example concentration or formulation.
  • the process according to the invention can thus also comprise at least one additional step and subsequent to step d) of concentration or formulation.
  • the method according to the invention further comprises, after step d) of filtration, one or more of the following steps aimed in particular at adapting the composition to a particular formulation:
  • the fermentation process comprises a step e) of adding at least one preservative to the fermented extract of Ikaria honey.
  • said preservative is chosen from propanediol, glycerin, butylene glycol, more preferentially propanediol.
  • two or more preservatives may be added to the fermented extract of Ikaria honey.
  • the preservative is added to the fermented extract of Ikaria honey from step d) at a final concentration of between 25 and 50%, preferably between 30 and 40%, more preferably 30%, by weight compared to the total weight.
  • the preservative is added to the fermented extract of Ikaria honey from step d) at a final concentration of between 25 and 50%, said preservative is selected from propanediol, glycerine and butylene glycol.
  • the fermented extract of Ikaria honey is preferably stored at approximately 4°C (4 ⁇ 2°C) and/or in the dark at the end of stage d) of filtration or at the end of any another step when an additional step is present after step d).
  • the fermented extract of Ikaria honey is preferably stored at room temperature.
  • the fermented extract of honey is referenced under the international nomenclature, INCI: Aqua, propanediol, yeast ferment extract, lactobacillus ferment lysate, honey.
  • This product contains in particular 3.2% by weight of dry extract of fermented honey extract in a water/propanediol mixture.
  • the inventors have demonstrated that the fermented extract of Ikaria honey has beneficial effects on fibroblasts in vitro, making it possible to increase the number and organization of F-actin filaments present in the cytoskeleton, as well as the radius of curvature and contractile forces of fibroblasts.
  • the fermented extract of Ikaria honey makes it possible to fight against the signs of skin aging linked to age and/or stress, in particular the loss of firmness and/or of elasticity.
  • the fermented extract of Ikaria honey is used in an effective amount to obtain the desired effect. It can be used as it is or advantageously incorporated into a cosmetic composition suitable for topical application to keratin materials.
  • the fermented extract of Ikaria honey is used as is or is present in a cosmetic composition.
  • Another object of the invention relates to a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising, in a physiologically acceptable medium, a fermented extract of Ikaria honey according to the invention.
  • cosmetic composition is meant any composition for cosmetic purposes, that is to say aesthetic, which can be brought into contact with the superficial parts of the human body and more particularly with keratin materials, in particular the skin and / or the human lips.
  • physiologically acceptable medium is meant any excipient suitable for topical use, in contact with keratin materials, without risk of toxicity, incompatibility, instability and/or allergic response.
  • keratinous materials according to the invention is meant the skin and/or its appendages, and more particularly the human skin and/or lips. In particular, it will be the skin of the face and/or the neck and/or the body, and the lips.
  • the keratin materials according to the invention are in particular healthy keratin materials (“healthy” subjects), that is to say not exhibiting disorders or disorders which would be part of a pathological state (“non-healthy” subjects, affected of a pathology). Reference will be made indiscriminately to healthy skin and/or lips or to healthy skin and/or lips in the rest of the description.
  • the fermented extract of Ikaria honey is present in the composition of the invention in a content ranging from 0.0001 to 2% by weight, in particular from 0.01 to 1% by weight and in particular from 0.1 to 0 5% by weight of raw material (solution of fermented extract obtained according to the method described above) relative to the total weight of the composition.
  • the fermented extract of Ikaria honey is present in the composition of the invention in a content ranging from 0.0000032% to 0.64%, preferably from 0.00032% to 0.032%, more preferably from 0, 0032% to 0.016% by weight of active ingredient (dry matter of fermented extract of honey) relative to the total weight of the composition.
  • the additional ingredients advantageously used in the composition of the invention may be present in a content ranging from 0.0001% to 10%, preferably from 0.001% to 5% by weight (of raw material) relative to the total weight of the composition.
  • the physiologically acceptable medium generally represents from 1 to 99% by weight, relative to the total weight of said composition.
  • the physiologically acceptable medium of the composition according to the invention comprises water and optionally the preservative as defined above.
  • said cosmetic composition comprising a fermented Ikaria honey extract according to the invention is a composition for caring for and/or making up keratin materials, in particular the skin and/or the lips and in particular the face and/or neck skin.
  • the cosmetic composition of the invention generally comprises, in addition to the fermented extract of Ikaria and the physiologically acceptable medium, one or more cosmetic excipients acceptable from those known to those skilled in the art with a view to obtaining a composition for topical application, for example in the form of milk, cream, ointment, water-in-oil or oil-in-water emulsion, balm, stick, gel, lotion, serum, or even powder.
  • the cosmetic composition of the invention may also be in the form of a patch or a mask, in particular a mask in the form of a thick cream, or even in the form of a cellulose mask soaked in fermented extract of honey. of Ikaria or a composition containing it.
  • said composition is in the form of a cream, emulsion, solution, suspension, gel, milk, lotion, or serum.
  • the emulsion may be an oil-in-water or water-in-oil emulsion or multiple emulsion.
  • the cosmetic composition of the invention may be in any galenic form suitable for topical application to keratin materials, in particular of the skin and/or of the lips and in particular of the skin of the face and/or of the neck comprising the fermented extract of Ikaria honey and at least one cosmetic ingredient chosen from antioxidants, perfumes, vitamins, thickening agents, emollient agents, moisturizing agents, anti-aging agents, lifting agents, tensing agents, plumping agents, soothing agents, antipollution agents, lightening or depigmenting agents, fillers, nacres and mixtures thereof.
  • the cosmetic composition may also comprise at least one cosmetic adjuvant chosen from the group consisting of antioxidants, emollients, moisturizing agents, anti-aging agents, and mixtures thereof. .
  • one or more cosmetically acceptable excipients will be selected from emulsifiers, polymers, surfactants, rheology agents, electrolytes, pH adjusters, antioxidants, preservatives, colorants, and their mixtures.
  • the cosmetic composition may comprise hydrophilic gelling agents, antioxidants, preservatives and mixtures thereof.
  • the cosmetic composition of the invention may also comprise a fatty (solid fatty substance) or oily phase.
  • oily phase means an oil or a mixture of oils which may or may not be miscible with one another.
  • oil is meant, within the meaning of the invention, a fatty substance, insoluble in water, liquid at 25° C. and atmospheric pressure. These oils can be volatile or non-volatile, vegetable, mineral or synthetic.
  • An oily phase according to the invention can comprise natural oils, hydrocarbons, silicones, and mixtures thereof.
  • the fatty or oily phase content in the cosmetic composition of the invention will generally range from 0.2% to 45%, preferably from 0.5% to 30%, and more preferably from 2% to 25% by weight per relative to the total weight of said composition.
  • the present invention also relates to a cosmetic process for caring for and/or making up keratin materials, in particular the skin and/or the lips and in particular the skin of the face and/or the neck, comprising the topical application on said keratin materials, of at least one layer of the fermented extract of Ikaria honey or of a cosmetic composition containing it as described according to the invention.
  • the cosmetic process of the present invention is in particular intended to promote and/or stimulate skin homeostasis and/or epidermal renewal and/or skin regeneration and/or skin integrity, and/or prevent and/or reduce the signs of skin aging, in particular loss of firmness, loss of elasticity, loss of density, loss of suppleness, loss of tone, alteration of the barrier function of the skin and/or the appearance of wrinkles and/or fine lines.
  • Ikaria forest honey is intended to maintain the functional balance of the skin and/or lips to preserve its normal optimal functioning.
  • promoting and/or stimulating epidermal renewal we mean that the fermented extract of Ikaria honey is intended to promote keratinocyte differentiation.
  • promoting and/or stimulating skin regeneration we mean in particular that the fermented extract of Ikaria honey is intended to promote the renewal and development of skin cells and tissues, in particular of the skin and/or lips.
  • the fermented extract of Ikaria honey is intended to promote the general condition of the skin, its radiance.
  • preventing and/or reducing the signs of skin ageing we mean in particular that the fermented extract of Ikaria honey is intended to reduce and/or delay the loss of firmness, the loss of elasticity, the loss of density, loss of suppleness, loss of tone and/or appearance of fine lines and/or wrinkles, which are associated with changes in the cell cytoskeleton (e.g. reduction in the number of actin fibers per skin cell ).
  • the fermented extract of Ikaria honey is intended to reduce and/or delay changes in the integrity of the skin, which may be associated, for example, with changes in the interactions between cells and/or between cells and the extracellular matrix, likely to generate an alteration in the various functions of the skin barrier (e.g.: mechanical, water, antioxidant, etc.) .
  • said fermented extract of Ikaria honey according to the invention or said cosmetic composition containing it is applied to aged skin or showing signs of aging and/or skin exposed to stress, preferably aged skin or showing signs of aging.
  • skin exposed to stress we mean that the skin is subjected to stress of endogenous or exogenous origin, in particular mechanical or chemical stress likely to induce unsightly non-pathological skin reactions - e.g. the skin is visibly tired and/or more sensitive to stimuli.
  • the skins and lips to which the compositions of the invention are applied are healthy, that is to say not showing any disorders or disorders that would be related to a pathological state (“non-healthy” subjects, suffering from pathology).
  • compositions comprising fermented extract of Ikaria honey used in the context of the cosmetic process of the invention are those described above.
  • Another object of the invention relates to the cosmetic use of the fermented extract of Ikaria honey according to the invention for topical application to keratin materials, in particular the skin and/or the lips and in particular the skin face and/or neck, as a cosmetic active ingredient intended to promote and/or stimulate skin homeostasis and/or epidermal renewal and/or skin regeneration and/or skin integrity, and/or prevent and/or reduce the signs of skin aging, in particular the loss of firmness, loss of elasticity, loss of density, loss of suppleness, loss of tone, alteration of the barrier function of the skin and/or the appearance of wrinkles and/or fine lines.
  • the invention is illustrated by the following non-limiting examples.
  • the % are expressed by weight of raw material relative to the total weight of the composition, unless otherwise indicated.
  • the Ikaria Honey used in the fermentation process below is honey from the Greek island of Ikaria.
  • microorganisms that are part of the consortium include:
  • acetic bacterium belonging to the genus Acetobacter, Gluconobacter or Komagataeibacter.
  • a fermentation of Ikaria honey was carried out according to the following process: a) incubation of a consortium of microorganisms in a solution comprising a carbohydrate at 26° C. for 3 to 4 days in order to obtain a culture; b) addition of the culture obtained in step a) at a concentration of 5% by weight to a fermentation medium comprising dechlorinated water and Ikaria honey at a weight content of 75 g/kg of water at 35°C in order to obtain a fermentation mixture; c) incubation of the fermentation mixture obtained in step b) in a fermenter at 26° C.
  • An extract of fermented honey from Ikaria is obtained in the form of a solution containing 3.2% by weight of active ingredient of fermented honey, 30% propanediol and 66.8% water.
  • Example 2 Characterization of the fermented extract of Ikaria honey
  • the analysis was performed on an Agile 1260 HPLC coupled to the MSD iQ mass spectrometer.
  • the extract previously freeze-dried in a stationary phase mobile phase mixture, is injected in CPC into a previously equilibrated column (FCPE300® (Rousselet Robatel Kromaton)).
  • FCPE300® previously equilibrated column
  • the flow rate was 20mL/min and the column rotation speed was 1200 rpm.
  • the two-phase solvent system is ethyl acetate/acetonitrile/water (3/3/4, v/v).
  • the stationary phase corresponds to the lower phase of the two-phase solvent system (bottom-up mode) while the mobile phase corresponds to the upper phase of the two-phase solvent system.
  • each 13C NMR chemical shift cluster obtained by HCA was manually submitted to the structure search engine of the ACD/NMR Workbook Suite 2012 database management software (ACD/Labs, Ontario, Canada). understanding the structures and predicted chemical shifts of low molecular weight natural products.
  • 2D NMR experiments (HSQC, HMBC and COZY) were carried out on fractions containing supposedly identified compounds in order to confirm the molecular structures proposed by the database at the end of the dereplication process.
  • LC-HRMS analysis of organic fractions was performed using an Accela ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) system connected to an LTQ-Orbitrap Discovery XL hybrid mass spectrometer (Thermo Scientific, Brehmen, Germany), equipped an electrospray ionization (ESI) source.
  • UHPLC Accela ultra-high performance liquid chromatography
  • LTQ-Orbitrap Discovery XL hybrid mass spectrometer Thermo Scientific, Brehmen, Germany
  • ESI electrospray ionization
  • the fermentation process generates a fermented extract of Ikaria honey with a very different composition from unfermented Ikaria honey.
  • the fermented extract of Ikaria honey includes different organic acids, as shown in Table 1 below. Glucuronic acid, propionic acid and tartaric acid were not detected, neither in the unfermented Ikaria honey nor in the fermented extract of Ikaria honey.
  • Table 1 Organic acids present in the fermented extract of Ikaria honey compared to non-fermented honey (in us compared to g of dry extract).
  • Example 3 Characterization of the activity of the fermented extract of Ikaria honey Material and methods
  • CTYOOplateTM type plate containing “X-Large fluorescent L micropatterns”. The cells are cultured in a controlled environment at 37° C. and 5% CO2.
  • the cells are left in culture medium for 4 hours so that they adhere and stretch on the micro-patterns before treatment. Then, the culture medium was replaced with culture medium supplemented with the fermented extract of fermented Ikaria honey at a final concentration of 0.1%. The treatment was applied for 16 hours. Culture medium without additional ingredient is added to certain wells and therefore represents the control control.
  • the cells were fixed with formalin, permeabilized with a buffer containing saponin, and labeled with Hoechst (for nuclei) and phalloidin (for F-actin). Images of the cells were acquired using the Operetta instrument at 20X magnification with 3 channels (for micropatterns, nuclei, and F-actin).
  • Stretching ratio ratio between the cell surface and the convex envelope of the cell on the micro-pattern
  • Curvature radius radius of curvature of the hypotenuse of a cell between the two ends of the “L” shaped micro-pattern
  • Total average length of F-actin fibers of the cellular network (sum of the lengths of F-actin fibers in a cell);
  • Average length of an F-actin fiber per cell (sum of the lengths of F-actin fibers in a cell/the number of fibers present).
  • Human dermal fibroblasts are cells with high contractile ability, which can easily stretch in L-shaped micro-patterns by forming a network of actin fibers, as shown in Figure 1 (see condition (1), corresponding to a cell that has not undergone any particular treatment).
  • Example 4 Evaluation of the effect of the fermented extract of Ikaria honey on the contractile forces of fibroblasts
  • the culture medium was replaced by culture medium supplemented with the control or the active ingredient: either TGF-B (positive control) at a final concentration of 10 ng/mL or the fermented extract of honey from 'Ikaria at a final concentration of 0.1%.
  • TGF-B positive control
  • the treatment was applied for 48 hours. Then the cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes. The fibroblasts were maintained in 1X PBS at 4°C before immediate measurement by Atomic Force Microscopy.
  • the measurements were taken by Atomic Force Microscopy (AFM) using a Resolve-Bruker® Bioscope on which an epifluorescence microscope (Leica DM18) is mounted to correlate the mechanical measurement with the fluorescent signal.
  • AFM Atomic Force Microscopy
  • PeakForce® QNM Quantitative Nanomechanical Mapping Fluid mode and Force-Volume mode were used for this study.
  • the selected MFA tip had a theoretical stiffness constant of 0.35 N/m and the pyramidal tip had a radius of curvature ⁇ 10 nm.
  • the deflection sensitivity of the lever is calibrated on Sapphire and its stiffness constant is also calibrated by the thermal noise method.
  • a complete MFA analysis consists of force-volume (FV) acquisition on the area of interest (cytoplasmic extension of the fibroblasts) in liquid medium (1X PBS).
  • a VF consists of the acquisition of 16384 force-indentation curves (force applied 50 nN) over an area of 50x50 pm, i.e. one measurement point every 500 nm around the extensions of the fibroblast. 15 fibroblasts were measured per condition (5 randomly selected fibroblasts per dish, 3 dishes).
  • the quantifications of the elastic modulus from the raw force curves are carried out using the BioMeca Analysis® processing software.
  • the inventors observed a change in the contractile forces of the fibroblasts after the application of the treatments compared to the untreated control.
  • the contractile force of fibroblasts was increased by treatment with TGF-B (positive control) by approximately 8%.
  • the contractile force of fibroblasts treated with the fermented extract of Ikaria honey was also greatly increased, and is approximately 2-fold greater than the effect observed for TFG-6 (i.e. approximately 17.6%) (data not available). demonstrated).
  • Example 5 Effect of Ikaria honey on intracellular ATP synthesis in normal human fibroblasts
  • the objective of this study was to compare the effects of unfermented Ikaria honey and fermented Ikaria honey on cellular energy production by evaluating intracellular ATP synthesis in normal human fibroblasts.
  • 2- Fermented Ikaria honey this is a fermented extract of honey prepared according to the process described in Example 1 above from honey from Greek bees (Apis mellifera cecropia), harvested on the Greek island of Ikaria.
  • Fibroblasts were seeded in 100mm petri dishes at a density of 26,000 cells per cm 2 in DMEM medium (+10% FCS), then cultured under standard conditions (incubator at 37° C, 5% C02 ) for experimentation.
  • Each extract was evaluated at a concentration of 0.01% (% weight of active ingredient) diluted in the culture medium, for a period of 24 hours.
  • the control condition corresponds to the culture medium alone (untreated).
  • the CellTiter-Glo® luminescent cell viability assay determines the number of viable cells in culture based on the quantification of ATP present which is an indicator of metabolically active cells. This test involves the addition, directly into the cell culture medium, of a single reagent causing cell lysis, thus generating a luminescent signal proportional to the amount of ATP present.
  • the CellTiter-Glo® test is based on the properties of a thermostable luciferase: “Ultra-GloTM Recombinant Luciferase”, which generates a stable luminescent signal according to the following reaction:
  • results reported in FIG. 5 correspond to the mean of the quantified fluorescence normalized to the total quantity of proteins ⁇ SEM (Standard Error of the Mean) (95% confidence interval).
  • the comparison between the control conditions and the treated conditions was made by performing a paired Student's t test where any difference was considered significant at p ⁇ 0.05 (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0, 01, ***p ⁇ 0.001).
  • ATP is a key molecule of cellular energy, it is essential for cell survival and involved in many signaling pathways as well as in many cellular mechanisms. ATP is particularly essential for the polymerization of cytoplasmic actin filaments, and is therefore involved in maintaining the morphology and architecture of skin cells. Through its many cellular functions, ATP plays an essential role in maintaining homeostasis and the quality of the skin. In particular, the fermented extract of Ikaria honey according to the invention promotes the tensegrity of the fibroblasts and helps to maintain the firmness of the skin.
  • the glycerin and water are mixed with stirring until homogeneous.
  • the acrylate/C10-30 alkyl acrylate crosspolymer and xanthan gum gelling agents are dispersed with turbulent stirring.
  • This phase is heated to 80°C and the cetyl alcohol/glyceryl stearate/PEG-75/ceteth/steareth-2 assembly; C10-C18 triglycerides, hydrogenated coco-glycerides, cetyl alcohol and hydrogenated polyisobutene previously heated to 80°C are added and the whole is emulsified with vigorous stirring.
  • the citric acid/trisodium citrate couple and the neutralizer are added, then the powders are added.
  • the fermented honey from Ikaria prepared according to example 1 and the royal jelly are added before the flavor.
  • this composition provides an anti-aging action with beneficial effects on the firmness and/or elasticity of the skin.
  • the serum is applied all over the face and especially on areas showing signs of aging.
  • the skin is more supple, firmer and more toned.

Abstract

La présente invention concerne un extrait fermenté de miel d'Ikaria ainsi que sa méthode de préparation et des compositions cosmétiques le comprenant. L'extrait fermenté de miel d'Ikaria peut notamment être utilisé comme actif pour favoriser et/ou stimuler l'homéostasie cutanée et/ou le renouvellement épidermique et/ou la régénération cutanée et/ou l'intégrité de la peau, et/ou prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment la perte de fermeté, la perte d'élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse, la perte de tonicité, l'altération de la fonction barrière de la peau et/ou l'apparition de rides et/ou ridules.

Description

DESCRIPTION
TITRE : Extrait fermenté de miel d’Ikaria
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le domaine cosmétique et en particulier un extrait fermenté de miel d’Ikaria ainsi que le procédé de fermentation permettant de l’obtenir, une composition cosmétique contenant ledit extrait fermenté de miel d’Ikaria, et son utilisation dans un procédé cosmétique de soin et/ou de maquillage des matières kératiniques.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La peau est la première barrière de protection de l'organisme vis-à-vis de l'environnement. En plus du vieillissement chronologique, notre peau est ainsi quotidiennement soumise à des stress d’origine exogène ou endogène susceptibles d’induire des réactions cutanées non pathologiques inesthétiques et/ou d’inconfort pouvant entraîner une accélération du vieillissement cutané. Les stress exogènes sont nombreux : ils sont notamment d'origine chimique (ex : xénobiotiques, antigènes, allergènes) ou d'origine environnementale (température, climat, rayonnement UV, pollution atmosphérique, fumée de cigarette...) ou encore d’origine mécanique (blessures, frottements, rasages, nettoyages...).
L’intégrité de la peau est notamment médiée par le cytosquelette des cellules, composé de filaments d’actine, de microtubules et de filaments intermédiaires. En effet, le cytosquelette des cellules est responsable de diverses propriétés structurelles et mécaniques des cellules mais aussi de la peau, qui sont essentielles pour son homéostasie. Le cytosquelette cellulaire permet également de générer les forces contractiles. Ces forces sont ensuite exploitées comme force motrice pour plier et donner leurs formes actives aux constituants cellulaires et ainsi assurer des fonctionnalités cellulaires aussi cruciales que le métabolisme cellulaire, la conversion des cellules souches kératinocytaires et les interactions entre des cellules et la matrice extra-cellulaire, nécessaires pour obtenir une tenségrité. Cette intégrité permet aux cellules de la peau de former un ensemble plus résistant et solide que la somme de ses constituants.
Toutefois, les stress notamment exogènes, peuvent rompre cet équilibre et entraîner la perte de fonctionnalité cellulaire. Afin de réparer et/ou redensifier la peau, les cellules doivent immédiatement reformer les forces contractiles à travers leur cytosquelette. Toutefois, avec l’âge, on observe une diminution de la résilience des cellules aux stress ainsi que leur capacité à maintenir l’homéostasie de la peau. Cette diminution peut être attribuée, entre autres, à une perturbation de la polymérisation des filaments d’actine et dans leur renouvellement, ainsi qu’à une réduction des forces contractiles des cellules.
On comprend donc que le cytosquelette joue un rôle important dans le maintien de l’homéostasie et de la qualité de la peau. Il existe donc un besoin constant de trouver des agents capables de prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment permettant de lutter contre les stress et/ou permettant de stimuler et/ou favoriser l’homéostasie et le renouvellement cutané. De manière inattendue, la Demanderesse a mis en évidence les effets ‘anti-âge’ d’un extrait fermenté de miel d’Ikaria in vitro sur des cultures de fibroblastes. En effet, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria a un effet tenseur sur les fibroblastes, permettant d’augmenter le nombre et l’organisation de filaments d’actine- F présents dans le cytosquelette, ainsi que le rayon de courbure et les forces contractiles des fibroblastes sur une matrice de collagène, favorisant in fine l’intégrité cellulaire et l’homéostasie des cellules de la peau. La Demanderesse a également mis en évidence que l’extrait fermenté de miel d’Ikaria, et comparativement au même miel non fermenté, permet d’augmenter de manière significative la production d’ATP intracellulaire, et donc accroître l’énergie cellulaire des cellules de la peau. Ces effets permettent donc d’envisager l’utilisation de cet extrait fermenté de miel d’Ikaria pour prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané. L’extrait fermenté de miel d’Ikaria est notamment utilisé selon l’invention comme actif cosmétique destiné à favoriser et/ou stimuler l’homéostasie cutanée et/ou le renouvellement épidermique et/ou la régénération cutanée et/ou l’intégrité de la peau et/ou prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment la perte de fermeté, la perte d’élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse de la peau, la perte de tonicité, l’altération de la fonction barrière de la peau, et/ou l’apparition de rides et/ou ridules.
EXPOSE DE L'INVENTION
Le premier objet de l’invention concerne donc un extrait fermenté de miel d’Ikaria comprenant une teneur en acide lactique comprise entre 0,01 et 0,08 %, une teneur en acide pyruvique comprise entre 0,05 et 0,5 %, et une teneur en acide acétique comprise entre 1 et 20 %, en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté. Un autre objet de l’invention porte sur un procédé de fermentation de miel d’Ikaria comprenant les étapes suivantes : a) incubation d’un consortium de micro-organismes dans une solution comprenant un glucide pendant 1 à 10 jours à 17 à 38° C afin d’obtenir une culture de micro-organismes, ledit consortium comprenant au moins une bactérie lactique appartenant au genre Lactobacillus ou Pediococcus, au moins une levure appartenant au genre Saccharomyces, Schyzosaccharomyces ou Torulaspora, et au moins une bactérie acétique appartenant au genre Acetobacter, Gluconobacter ou Komagataeibacter ; b) ajout de la culture obtenue à l’étape a) dans un milieu fermentaire comprenant du miel d’Ikaria à une teneur en poids de 20 à 300 g/kg d’eau afin d’obtenir un mélange de fermentation, ladite culture étant ajoutée à une concentration comprise entre 0,5 et 15 % en poids par rapport au poids total du mélange de fermentation ; c) incubation du mélange de fermentation obtenu à l’étape b) à une température comprise entre 25 et 35° C pendant 10 à 15 jours ; d) filtration du mélange de fermentation, afin d’obtenir un extrait fermenté de miel d’Ikaria, et optionnellement, e) ajout d’au moins un conservateur, de préférence choisi parmi le propanediol, la glycérine, et le butylène glycol, plus préférentiellement le propanediol, à l’extrait fermenté de miel d’Ikaria à une concentration finale de 25 à 50 % en poids par rapport au poids total.
Aussi, un autre objet de l’invention porte sur un extrait fermenté de miel d’Ikaria obtenu par le procédé tel que décrit selon l’invention.
L’invention concerne également une composition cosmétique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, un extrait fermenté de miel d’Ikaria.
Un autre objet de l’invention concerne un procédé cosmétique de soin et/ou maquillage des matières kératiniques, en particulier de la peau et/ou des lèvres, comprenant l’application sur lesdites matières kératiniques, d’au moins une couche de la composition cosmétique telle que décrite selon l’invention.
L’invention concerne enfin l’utilisation cosmétique d’un extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’invention comme actif pour favoriser et/ou stimuler l’homéostasie cutanée et/ou le renouvellement épidermique et/ou la régénération cutanée et/ou l’intégrité de la peau, et/ou prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment la perte de fermeté, la perte d’élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse, la perte de tonicité, l’altération de la fonction barrière de la peau et/ou l’apparition de rides et/ou ridules.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Évaluation de la géométrie et du cytosquelette des fibroblastes dermiques humains après 16 heures dans les conditions suivantes : (1 ) absence de traitement (témoin négatif), (2) traitement par le TGF-B à 10 ng/ml_ (témoin positif pour la contraction cellulaire), (3) traitement par la cytochalasine D à 1 mM (témoin positif pour la relaxation cellulaire), (4) traitement par l’extrait fermenté de miel d’Ikaria à 0,1 %.
Figure 2 : Évaluation de la contraction cellulaire induit par le cytosquelette des fibroblastes dermiques humains après 16 heures de traitement par l’extrait fermenté de miel d’Ikaria à 0,1 % : (A) ratio d’étirement (ou « stretching ratio »), (B) rayon de courbure.
Figure 3 : Évaluation du réseau des fibres d’actine dans les fibroblastes dermiques humains après 16 heures de traitement par l’extrait fermenté de miel d’Ikaria à 0,1 % : (A) nombre de fibres d’actine, (B) longueur moyenne des fibres d’actine du réseau, (C) longueur totale des fibres d’actine du réseau.
Figure 4 : Courbe Force-indentation brute acquise sur la matrice de collagène autour du fibroblaste. Z (pm) est la distance parcourue par la sonde AFM. La zone entre les lignes bleues permet le calcul des propriétés mécaniques. Le module élastique est extrait sur les 50 % de la force maximale appliquée.
Figure 5 : Evaluation de la synthèse intracellulaire d’ATP dans des fibroblastes dermiques humains après 24 heures de traitement par l’extrait fermenté de miel d’Ikaria à 0,01 %, ou par le miel d’Ikaria non fermenté à 0, 01% ou en l’absence de traitement.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Miel d’Ikaria
Le miel est l'un des produits issus de l'apiculture comme la gelée royale, la propolis, le pollen, le venin d'abeille et la cire. Ces produits sont toutefois distincts les uns des autres, tant par leur mode de production au sein de la ruche que par leur composition et leurs propriétés. Le miel et le pollen sont des substances qui constituent l'alimentation des abeilles pendant toute l'année, le premier apportant les sucres, le second les protéines. Le miel et le pollen peuvent être stockés pendant de longues périodes dans la ruche.
Le miel est produit par les abeilles qui butinent, qui collectent le nectar des fleurs et le fabriquent par des digestions et régurgitations successives. Le pH acide de l'estomac des abeilles ainsi que les activités enzymatiques de l'invertase, la diastase et l'amylase, donnent lieu à une solution aqueuse supersaturée, composée de plus de 80 % de sucres, principalement du fructose (environ 38 %) et du glucose (environ 31 %), avec des quantités plus faibles de sucrose, maltose et autres sucres complexes. Le miel est par ailleurs pauvre en graisses, fibres et protéines. Selon la variété des abeilles et l'environnement dans lequel elles évoluent, les différents miels peuvent présenter une grande variabilité.
Il existe ainsi différents types de miels que l’on distingue en fonction du type floral ou encore en fonction de sa zone géographique d’origine, chacun présentant une saveur et un aspect caractéristique. On parle notamment de miel de nectar lorsque le miel est fabriqué par les abeilles à partir du nectar des fleurs qu’elles butinent, et en particulier de miel « monofloral » lorsque qu’il provient en grande partie d’une seule variété de fleurs, tandis que les autres miels seront qualifiés de « polyfloraux ».
Le « miel d’Ikaria » ou « miel de l’île d’Ikaria » utilisé dans le cadre de l’invention est un miel originaire de l’île grecque d’Ikaria, qui est confectionné par l’abeille grecque Apis mellifera cecropia. De préférence, il est récolté dans les collines de la partie ouest de l’île. Le miel d’Ikaria est de préférence un « miel de forêt d’Ikaria », confectionné majoritairement à partir des bruyères d’été ( Erica manipuliflora) et des chênes verts ( Quercus ilex) par l’abeille grecque Apis mellifera cecropia.
Extrait fermenté de miel d’Ikaria
Le miel d’Ikaria, de préférence le miel de forêt d’Ikaria, est utilisé dans un procédé de fermentation afin de générer un extrait fermenté de miel d’Ikaria, objet de la présente invention.
Il est précisé que dans la présente description, l’expression « extrait fermenté » désigne le produit issu du procédé de fermentation par la fermentation, avec ou sans filtration, donc aussi bien avec que sans la biomasse microbienne du milieu fermentaire, ainsi que tout produit ayant subi des étapes supplémentaires, tel qu’une étape de formulation (par ex par ajout d’un conservateur). Selon un mode particulier, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’invention se présente sous la forme d’une solution aqueuse d’extrait fermenté comprenant l’extrait sec fermenté, de l’eau et un conservateur. L’extrait fermenté sous forme de solution aqueuse est également nommé ‘matière première’ dans la description, par opposition à ‘matière sèche’ ou extrait sec fermenté.
Selon un mode particulier, la solution aqueuse d’extrait fermenté comprend l’extrait fermenté en une teneur active (matière sèche) allant de 2 à 5 % en poids, notamment 3 à 4 % en poids et en particulier 3,2 % en poids de matière active par rapport au poids total de matière première (solution aqueuse d’extrait fermenté), de l’eau et un conservateur, de préférence le propanediol. La teneur en eau ira généralement de 60 à 70 % en poids, notamment de 65 % à 70 % en particulier de 66,8 % en poids par rapport au poids total de matière première (solution aqueuse d’extrait fermenté) et la teneur en conservateur (par ex : propanediol) ira généralement de 25 à 50 % en poids, notamment de 30 à 40 % en poids, en particulier 30 % en poids par rapport au poids total de matière première (solution aqueuse d’extrait fermenté).
Ainsi, l’invention porte également sur un extrait fermenté de miel d’Ikaria sous la forme d’une solution comprenant 3 à 4 % en poids de matière active d’extrait fermenté de miel d’Ikaria, 30 à 35 % en poids de propanediol et 60 à 70 % en poids d’eau.
Selon un mode particulier, la solution aqueuse d’extrait fermenté, autrement nommée ‘matière première’ dans la caractérisation qui est illustrée ci-après, comprend 3,2 % en matière active (matière sèche) d’extrait fermenté, 30 % de propanediol et 66,8 % d’eau par rapport au poids total de matière première (solution aqueuse d’extrait fermenté).
Selon un mode particulier, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria comprend une teneur en acide lactique comprise entre 0,001 % et 1 %, une teneur en acide pyruvique comprise entre 0,01 % et 1 % et une teneur en acide acétique comprise entre 1 et 20 % en poids par rapport au poids d’extrait sec (matière sèche) de l’extrait fermenté. De préférence, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria comprend une teneur en acide lactique comprise entre 0,005 % et 0,5 %, plus préférentiellement 0,01 et 0,08 %, encore plus préférentiellement comprise entre 0,03 et 0,05 % en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté. De préférence, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria comprend une teneur en acide pyruvique comprise entre 0,05 et 0,5 %, plus préférentiellement comprise entre 0,1 et 0,2 % en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté. De préférence, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria comprend une teneur en acide acétique comprise entre 1 et 20 %, de préférence entre 5 et 15 %, plus préférentiellement entre 10 et 14 %, encore plus préférentiellement environ 12, 13, ou 14 % en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté.
L’extrait fermenté de miel d’Ikaria peut comprendre d’autres acides organiques, tels que l’acide citrique, l’acide gluconique, l’acide malique, l’acide quinique, et/ou l’acide shikimique. Aussi, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria peut notamment comprendre :
- une teneur en acide citrique comprise entre 0,001 et 0,1 %, de préférence entre 0,005 et 0,08 %, plus préférentiellement entre 0,01 et 0,06 %, %, encore plus préférentiellement entre 0,03 ou 0,06 % en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté,
- une teneur en acide gluconique comprise entre 1 et 15 %, de préférence entre 5 et 10 %, plus préférentiellement comprise entre 6 et 9 %, en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté,
- une teneur en acide malique comprise entre 0,001 et 1 %, de préférence entre 0,01 et 1 %, plus préférentiellement entre 0,005 et 0,5 % plus préférentiellement comprise entre 0,1 et 0,2 % en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté,
- une teneur en acide quinique comprise entre 0,001 et 1 %, de préférence entre 0,01 et 0,5 %, plus préférentiellement entre 0,01 et 0,05 % encore plus préférentiellement entre 0,2 et 0,3 % en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté, et/ou
- une teneur en acide shikimique comprise entre 0,001 et 0,20 %, de préférence entre 1 et 15 % plus préférentiellement entre 5 et 10 %, encore plus préférentiellement entre 6 et 8 %, en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté.
De préférence, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria ne comprend pas d’acide glucuronique, d’acide propionique, et/ou d’acide tartrique.
Les quantités de sucres, de polyphénols, vitamines et minéraux sont exprimés en % en poids de matière première au sens de matière première telle que définie ci-dessus (solution aqueuse comprenant 3,2 % d’extrait sec, 30 % de propanediol et 66,8 % d’eau).
La quantité des sucres présente dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est réduite par rapport à la quantité présente dans le miel d’Ikaria avant fermentation. Selon un mode particulier, la teneur en miel d’Ikaria dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est notamment comprise entre 0,1 et 50 g/kg de matière première (soit entre 0,01 et 5 %), de préférence entre 0,5 et 40 g/kg de matière première (soit entre 0,05 et 4 %), plus préférentiellement entre 20 et 30 g/kg de matière première (soit entre 2 et 3 %). Selon un mode particulier, la teneur en glucose dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est notamment comprise entre 0,1 et 100 g/kg de matière première (soit entre 0,01 et 10 %), de préférence entre 0,5 et 20 g/kg de matière première (soit entre 0,05 et 2 %). La teneur en fructose dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est notamment comprise entre 0,1 et 100 g/kg de matière première (soit entre 0,01 et 10 %), de préférence entre 0,5 et 20 g/kg de matière première (soit entre 0,05 et 2 %). La teneur totale en polyphénols peut être comprise entre 50 et 2000 mg/kg de matière première, de préférence entre 75 et 1000 mg/kg de matière première, plus préférentiellement entre 100 et 500 mg/kg de matière première (soit entre 0,01 et 0,05 %).
Selon un mode particulier, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria comprend également au moins l’un des composés suivants (métabolites secondaires) : l’acide succinique, l’acide 2- hydroxyhépanoique, le syringaldéhyde, l’acide malique 2-isopropyle, la catéchine, le gallate d’epigallocatéchine, l’acide syringique, le picéide, l’acide cinnamique, le protocatéchuicaldéhyde, la quercétine, et leurs mélanges.
Selon un mode particulier, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria comprend également des vitamines et minéraux, plus particulièrement du potassium. La teneur en potassium peut être comprise entre 25 et 500 mg/kg de matière première, de préférence entre 75 et 250 mg/kg, encore plus préférentiellement entre 100 et 175 mg/kg.
L’extrait fermenté de miel d’Ikaria peut également comprendre un ou plusieurs conservateurs. Par « conservateur » on entend un composé qui a pour but de préserver la composition de l’extrait ou la cosmétique le contenant de toute altération physico-chimique et/ou microbienne.
De préférence, au moins un conservateur est choisi parmi le propanediol, la glycérine, le butylène glycol, de préférence parmi le propanediol et la glycérine, plus préférentiellement le propanediol. L’extrait fermenté peut notamment comprendre un ou plusieurs conservateur(s) à une concentration finale comprise entre 25 et 50 %, préférentiellement entre 30 et 40 %, plus préférentiellement 30 % en poids par rapport au poids total (de l’extrait fermenté sous forme de solution), de préférence au moins un des conservateurs décrits ci-dessus choisi parmi le propanediol, la glycérine et le butylène glycol.
Procédé de fermentation
Cet extrait fermenté de miel d’Ikaria est obtenu par un procédé de fermentation comprenant des étapes de : a) incubation d’un consortium de micro-organismes dans une solution comprenant un glucide à une température comprise entre 17 à 38° C afin d’obtenir une culture de micro organismes ; b) ajout de la culture obtenue à l’étape a) dans un milieu fermentai re comprenant du miel d’Ikaria afin d’obtenir un mélange de fermentation ; c) incubation du mélange de fermentation obtenu à l’étape b) à une température comprise entre 12 et 42° C pendant 2 à 20 jours ; d) filtration du mélange de fermentation, afin d’obtenir un extrait fermenté de miel d’Ikaria ; et, optionnellement, e) ajout d’au moins un conservateur.
Par « procédé de fermentation » on entend un procédé permettant d’obtenir un extrait fermenté de miel d’Ikaria par la mise en culture d’un consortium des micro-organismes tel que défini ici dans un milieu contenant du miel d’Ikaria et permettant leur croissance. La fermentation peut avoir lieu dans des conditions de culture discontinue (en « batch »), de culture continue, ou en continu-discontinu (en « Fed batch »). La fermentation peut être réalisée en aérobie, micro-aérobie et/ou anaérobie.
Par « consortium de micro-organismes » on entend un assemblage d’au moins trois espèces de micro-organismes pouvant coexister de manière stable et reproductible. Avantageusement, les micro-organismes permettent d’associer des activités complémentaires. À titre d’exemple non-limitatif, l’utilisation ou assimilation d’une source de carbone par une première espèce permet de produire des métabolites pouvant ensuite être métabolisés par une deuxième espèce.
Le consortium de micro-organismes selon la présente invention comprend : i) au moins un micro-organisme appartenant au groupe des bactéries lactiques, ii) au moins un micro-organisme appartenant au groupe des levures, et iii) au moins un micro-organisme appartenant au groupe des bactéries acétiques.
De préférence, au moins un micro-organisme appartenant au groupe des bactéries lactiques est un micro-organisme de l’ordre des Lactobacillales de la famille des Lactobacillaceae, notamment ceux appartenant aux genres Lactobacillus et Pediococcus, tel que Lactobacillus plantarum et/ou Lactobacillus acidophilus, plus préférentiellement L. plantarum.
De préférence, au moins un micro-organisme appartenant au groupe des levures est un micro-organisme de l’ordre des Saccharomycetales de la famille des Saccharomycetaceae ou de l’ordre des Schyzosaccharomycetales de la famille des Schyzosaccharomycetaceae, notamment ceux appartenant aux genres Saccharomyces, Schyzosaccharomyces ou Torulaspora. De préférence, au moins un micro-organisme appartenant au groupe des levures est Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces boulardii et/ou Schyzosaccharomyces pombe.
De préférence, au moins un micro-organisme appartenant au groupe des bactéries acétiques est un micro-organisme de l’ordre des Rhodospirillales de la famille des Acetobacteraceae, notamment ceux appartenant aux genres Acetobacter, Gluconobacter et Komagataeibacter (aussi appelé Gluconacetobacter). Les bactéries acétiques peuvent être originaires d'un vinaigre de cidre ou de vin non pasteurisé ayant un taux d'acidité de 4% à 5%, de préférence d’un vinaigre de cidre du commerce, labélisés « Agriculture biologique » selon la définition de l'Union Européenne. De préférence, l’ajout des bactéries acétiques au consortium se fait par ajout direct d’un aliquot de vinaigre dans la composition comprenant les autres espèces de micro-organismes. Il existe dans les vinaigres, à côté des bactéries acétiques dominantes, une flore indigène naturelle complexe dont une partie va pouvoir cohabiter avec les micro organismes ajoutés. Une autre partie va péricliter lors de l'établissement du consortium, de la même manière que le développement en symbiose de l’ensemble des micro-organismes formant le consortium empêche le développement des espèces indésirables, dont les espèces pathogènes.
Selon un mode préférentiel, le consortium comprend :
- au moins une bactérie lactique appartenant au genre Lactobacillus ou Pediococcus, plus préférentiellement choisie parmi Lactobacillus plantarum et Lactobacillus acidophilus,
- au moins une levure appartenant au genre Saccharomyces, Schyzosaccharomyces ou Torulaspora plus préférentiellement choisie parmi Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Schyzosaccharomyces pombe et Torulaspora delbrueckii, et
- au moins une bactérie acétique provenant d’un vinaigre de cidre ou d'un vinaigre de vin, préférentiellement appartenant au genre Acetobacter, Gluconobacter ou Komagataeibacter.
Étape a) : préparation d’une culture de micro-organismes
Selon une première étape, a), du procédé, une culture de micro-organismes (autrement dit, un consortium comprenant les micro-organismes tels que décrits ci-dessus) est préparée. Cette étape permet avantageusement d’activer et faire multiplier les micro-organismes tout en établissant un consortium stable et équilibré. Lors de cette étape, les différents micro organismes qui seront présents dans le consortium sont introduits dans une solution comprenant un glucide (autrement appelé un « milieu nutritif ») afin de générer une suspension microbienne. La suspension est ensuite incubée pendant 1 à 21 jours afin de préparer la culture des micro-organismes (autrement dit, le consortium).
La solution comprend au moins un glucide, généralement un ou plusieurs mono- ou disaccharides. Il peut s'agir d'un sucre pur, tel que le saccharose, le glucose ou le fructose, ou bien d'un produit transformé ou coproduit, tel que de la mélasse. Aussi, selon un mode préférentiel, la solution comprend un glucide choisi parmi le saccharose, le glucose ou le fructose, la mélasse, ou un mélange d’un ou plusieurs de ceux-ci. De préférence, le glucide est le saccharose ou un mélange de glucose et de fructose. De préférence, au moins un glucide est présent à une concentration de 50 à 95 g/l de solution.
Les micro-organismes peuvent être introduits dans le milieu nutritif sous forme sèche et/ou humide ; le taux d'inoculation peut notamment être compris entre 103 CFU/g et 105 CFU/g de solution. La suspension microbienne peut ensuite être incubée entre 12°C et 45° C, de préférence entre 25° C et 35° C, plus préférentiellement à 25° C, 26° C, 27° C, 28° C, 29° C, 30°C, 31 °C, 32°C, 33°C, 34°C, ou 35°C encore plus préférentiellement à 26°C. Selon un mode particulièrement avantageux, l’incubation a lieu dans un réacteur ouvert, sans avoir besoin d’assurer des conditions aseptiques.
La suspension peut être incubée pendant 1 à 21 , de préférence pendant 1 à 10 jours, plus préférentiellement pendant 3 à 4 jours, encore plus préférentiellement pendant 3 jours ou 4 jours. À la fin de la durée d’incubation, la flore totale dans la suspension peut être comprise entre 104 et 107 CFU/g.
Le consortium ainsi obtenu est apte à réagir avec un substrat naturel, tel que le miel d’Ikaria, en milieu aqueux. Avantageusement, il est capable de diriger la fermentation extractive du miel, pour rendre accessible, et éventuellement transformer, une grande diversité des composés qu'il renferme.
Étape b) : préparation d’un mélange de fermentation
Aussi, selon l’étape b) du procédé, la culture obtenue à l’étape a) ci-dessus est ensuite ajoutée dans un milieu fermentaire comprenant du miel d’Ikaria afin d’obtenir un mélange de fermentation.
De préférence, la culture de micro-organismes est ajoutée dans le milieu fermentaire à un taux compris entre 102 CFU/g et 104 CFU/g de milieu fermentaire. De préférence, la culture de micro-organismes est ajoutée au milieu fermentaire à une concentration comprise entre 0,5 % et 15 % en poids rapporté au poids de milieu fermentaire, de préférence entre 0,75 et 10 %, plus préférentiellement à 5 %.
Le milieu fermentaire comprend de l’eau déchlorée ainsi que du miel d’Ikaria à une concentration comprise entre 20 à 300 g/kg d’eau, de préférence compris entre 50 et 150 g/kg d’eau, plus préférentiellement 60 et 100 g/kg d’eau, encore plus préférentiellement à 75 g/kg d’eau. Selon un aspect particulier, le degré Brix du milieu fermentaire est compris entre 2 et 10. Afin de faciliter la dissolution du miel d’Ikaria, qui est une substance visqueuse, dans le milieu fermentaire, ce dernier peut être chauffé avant ou après ajout du miel, par exemple à une température comprise entre 25° C et 90° C, préférentiellement 35° C. De préférence, en cas de chauffage du milieu fermentaire, ceci est fait avant ajout de la culture de micro-organismes ou alors à une température inférieure ou égale à 45° C, de préférence inférieure ou égale à 35° C, si après ajout de la culture. De préférence, le mélange de fermentation est obtenu par l’ajout de la culture selon l’étape a) dans de l’eau déchlorée à une température de 35°C comprenant 50 à 150 g de miel d’Ikaria par rapport au kg d’eau à une concentration de 5 % en poids rapporté au poids de milieu fermentaire. Selon un aspect, le miel d’Ikaria correspond au seul composant apportant des glucides au milieu fermentaire.
Étape c) : incubation
Selon la prochaine étape, c), du procédé, le mélange de fermentation obtenu à l’étape b) est ensuite incubé afin d’assurer la fermentation du miel d’Ikaria.
L’incubation a lieu à une température comprise entre 12°C et 45° C, de préférence entre 25°C et 35°C, plus préférentiellement à 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31 °C, 32°C, 33°C, 34°C, ou 35°C, encore plus préférentiellement à 26°C. L’incubation est effectuée pendant une durée de 2 à 20 jours, de préférence pendant 10 à 15 jours, plus préférentiellement pendant 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 jours, encore plus préférentiellement 10 jours.
Selon un aspect particulier, l’incubation a lieu dans un réacteur ouvert, sans avoir besoin d’assurer des conditions aseptiques. Selon un aspect particulier, l’incubation a lieu à un taux d’humidité compris entre 20 % à 60 %, de préférence entre 30 % à 50 %, plus préférentiellement de 40 %.
Étape d) : filtration Le mélange de fermentation est ensuite filtré lors de l’étape d). Par « filtration » on entend ici une étape permettant de séparer les fractions solides et liquides. Avantageusement, la filtration permet de retirer l’ensemble des micro-organismes présents dans le mélange, afin d’obtenir un extrait fermenté de miel d’Ikaria stérile. La filtration peut être réalisée par l’utilisation d’un ou plusieurs filtres. Aussi, selon un mode de réalisation, l’étape d) correspond à une ou plusieurs étapes de filtration, de préférence comprenant au moins une étape de filtration stérilisante, de préférence sur un filtre ayant une taille moyenne de pores compris entre 0,1 pm à 0,2 pm, de préférence de 0,2 pm. De façon avantageuse, une filtration stérilisante permet de retirer tout débris cellulaire de manière rapide et peu coûteuse. De préférence, le filtre est un filtre de cellulose.
Étape e) : concentration et/ou formulation (optionnelle)
Le procédé décrit ci-dessus permet d’obtenir un extrait fermenté de miel d’Ikaria clarifié. Toutefois, dans certains cas, il peut être avantageux d’effectuer une ou plusieurs étapes supplémentaires, par exemple de concentration ou de formulation. Le procédé selon l'invention peut ainsi en outre comprendre au moins une étape supplémentaire et postérieure à l’étape d) de concentration ou de formulation.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend en outre, après l'étape d) de filtration, une ou plusieurs des étapes suivantes visant notamment à adapter la composition à une formulation particulière :
- une étape de concentration ; et/ou
- une étape de formulation.
Chaque étape optionnelle identifiée ci-dessus peut être présente en tant qu 'étape supplémentaire unique du procédé, ou en combinaison avec une ou plusieurs autres étapes optionnelles. De préférence, le procédé fermentation comprend une étape e) d’ajout d’au moins un conservateur à l’extrait fermenté de miel d’Ikaria. De préférence, ledit conservateur est choisi parmi le propanediol, la glycérine, le butylène glycol, plus préférentiellement le propanediol. Dans certains cas, au moins deux conservateurs peuvent être ajoutés à l’extrait fermenté de miel d’Ikaria. De préférence, le conservateur est ajouté à l’extrait fermenté de miel d’Ikaria de l’étape d) à une concentration finale compris entre 25 et 50 %, de préférence compris entre 30 et 40 %, plus préférentiellement 30 %, en poids par rapport au poids total. Lorsque le conservateur est ajouté à l’extrait fermenté de miel d’Ikaria de l’étape d) à une concentration finale compris entre 25 et 50 %, ledit conservateur est sélectionné parmi le propanediol, la glycérine et le butylène glycol. L’extrait fermenté de miel d’Ikaria est préférablement conservé à environ 4°C (4 ± 2°C) et/ou à l'obscurité à l’issue de l’étape d) de filtration ou à l’issue de toute autre étape lorsqu’une étape supplémentaire est présente après l’étape d). Lorsque le procédé comprend l’ajout d’au moins un conservateur, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est préférablement conservé à température ambiante.
L’extrait fermenté de miel est référencé sous la nomenclature internationale, INCI : Aqua, propanediol, yeast ferment extract, lactobacillus ferment lysate, honey. Ce produit contient notamment 3,2 % en poids d’extrait sec d’extrait fermenté de miel dans un mélange eau/propanediol.
Composition cosmétique
De façon surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que l’extrait fermenté de miel d’Ikaria présente in vitro des effets bénéfiques sur les fibroblastes, permettant d’augmenter le nombre et l’organisation de filaments d’actine-F présents dans le cytosquelette, ainsi que le rayon de courbure et les forces contractiles des fibroblastes. Ainsi, de par ses effets tenseurs sur le cytosquelette des cellules, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria permet de lutter contre les signes du vieillissement cutané liés à l’âge et/ou aux stress, notamment la perte de fermeté et/ou d’élasticité.
Selon l’invention, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est utilisé dans une quantité efficace pour obtenir l’effet recherché. Il peut être utilisé tel quel ou avantageusement incorporé dans une composition cosmétique adaptée à une application topique sur les matières kératiniques.
En particulier, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est utilisé tel quel ou est présent dans une composition cosmétique.
Aussi, un autre objet de l’invention porte sur une composition cosmétique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, un extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’invention.
Par « composition cosmétique » on entend toute composition à visée cosmétique, c’est à dire esthétique, pouvant être mise en contact avec les parties superficielles du corps humain et plus particulièrement avec les matières kératiniques, en particulier la peau et/ou les lèvres humaines. Par « milieu physiologiquement acceptable » on entend tout excipient convenant à une utilisation topique, en contact avec les matières kératiniques, sans risque de toxicité, d'incompatibilité, d'instabilité et/ou de réponse allergique.
Par « matières kératiniques » selon l’invention, on entend la peau et/ou ses phanères, et plus particulièrement la peau et/ou les lèvres humaines. En particulier, il s’agira de la peau du visage et/ou du cou et/ou du corps, et des lèvres.
Les matières kératiniques selon l’invention sont notamment des matières kératiniques saines (sujets « sains »), c’est-à-dire ne présentant pas de troubles ou de désordres qui relèveraient d’un état pathologique (sujets « non sains », atteints d’une pathologie). On parlera indifféremment de peaux et/ou lèvres saines ou de peaux et/ou lèvres dans le reste de la description.
L’extrait fermenté de miel d’Ikaria est présent dans la composition de l’invention en une teneur allant 0,0001 à 2 % en poids, notamment de 0,01 à 1 % en poids et en particulier de 0,1 à 0,5 % en poids de matière première (solution d’extrait fermenté obtenue selon le procédé décrit ci-dessus) par rapport au poids total de la composition. Ainsi l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est présent dans la composition de l’invention en une teneur allant de 0,0000032 % à 0,64 %, de préférence de 0,00032 % à 0,032 %, plus préférentiellement de 0,0032 % à 0,016 % en poids de matière active (matière sèche d’extrait fermenté de miel) par rapport au poids total de la composition.
Les ingrédients additionnels utilisés avantageusement dans la composition de l’invention peuvent être présents en une teneur allant de 0,0001 % à 10 %, de préférence de 0,001 % à 5 % en poids (de matière première) par rapport au poids total de la composition.
Le milieu physiologiquement acceptable représente généralement de 1 à 99 % en poids, par rapport au poids total de ladite composition. Le milieu physiologiquement acceptable de la composition selon l'invention comprend de l'eau et éventuellement le conservateur tel que défini précédemment.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition cosmétique comprenant un extrait fermenté miel d’Ikaria selon l’invention est une composition de soin et/ou de maquillage des matières kératiniques, en particulier de la peau et/ou des lèvres et notamment de la peau du visage et/ou du cou.
La composition cosmétique de l’invention comprend généralement, outre l’extrait fermenté d’Ikaria et le milieu physiologiquement acceptable, un ou plusieurs excipients cosmétiques acceptables parmi ceux connus de l’homme du métier en vue d’obtenir une composition pour l’application topique par exemple sous forme de lait, de crème, de pommade, d’émulsion eau-dans-huile ou huile-dans-eau, de baume, de stick, de gel, de lotion, de sérum, ou encore de poudre.
La composition cosmétique de l’invention peut également se présenter sous forme d’un patch ou d’un masque, notamment un masque sous forme d’une crème épaisse, ou encore sous forme d’un masque cellulosique imbibé d’extrait fermenté de miel d’Ikaria ou d’une composition en contenant.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite composition est sous la forme d’une crème, émulsion, solution, suspension, gel, lait, lotion, ou sérum. Lorsque la composition est sous la forme d’une émulsion, l’émulsion peut être une émulsion huile-dans-eau, ou eau-dans- huile ou émulsion multiple.
La composition cosmétique de l’invention peut se présenter sous toute forme galénique adaptée à une application topique sur les matières kératiniques en particulier de la peau et/ou des lèvres et notamment de la peau du visage et/ou du cou comprenant l’extrait fermenté de miel d’Ikaria et au moins un ingrédient cosmétique choisi parmi les antioxydants, les parfums, les vitamines, les agents épaississants, les agents émollients, les agents hydratants, les agents anti-âge, les agents liftants, les agents tenseurs, les agents repulpants, les agents apaisants, les agents antipollution, les agents éclaircissants ou dépigmentants, les charges, les nacres et leurs mélanges.
Aussi, selon un objet préféré de l’invention, la composition cosmétique peut comprendre en outre au moins un adjuvant cosmétique choisi dans le groupe constitué par des agents antioxydants, des agents émollients, des agents hydratants, des agents anti-âge, et leurs mélanges.
Selon la nature de la composition, on sélectionnera un ou plusieurs excipients cosmétiquement acceptables parmi des émulsionnants, des polymères, des agents tensioactifs, des agents de rhéologie, des électrolytes, des ajusteurs de pH, des agents anti oxydants, des conservateurs, des colorants, et leurs mélanges.
À titre d’exemple particulier, la composition cosmétique peut comprendre des gélifiants hydrophiles, des antioxydants, des conservateurs et leurs mélanges.
La composition cosmétique de l’invention peut comprendre en outre une phase grasse (corps gras solides) ou huileuse. On entend par « phase huileuse » une huile ou un mélange d'huiles miscibles entre elles, ou non. Par « huile », on entend, au sens de l'invention, un corps gras, non soluble dans l'eau, liquide à 25° C et pression atmosphérique. Ces huiles peuvent être volatiles ou non volatiles, végétale, minérale ou synthétique.
Une phase huileuse selon l’invention peut comprendre des huiles naturelles, hydrocarbonées, siliconées, et leurs mélanges.
La teneur en phase grasse ou huileuse dans la composition cosmétique de l’invention ira généralement de 0,2 % à 45 %, de préférence de 0,5 % à 30 %, et de préférence encore de 2 % à 25 % en poids par rapport au poids total de ladite composition.
Procédé cosmétique
La présente invention a également pour objet un procédé cosmétique de soin et/ou de maquillage des matières kératiniques, en particulier de la peau et/ou des lèvres et notamment de la peau du visage et/ou du cou, comprenant l’application topique sur lesdites matières kératiniques, d’au moins une couche de l’extrait fermenté de miel d’Ikaria ou d’une composition cosmétique en contenant telle que décrite selon l’invention.
Le procédé cosmétique de la présente invention est notamment destiné à favoriser et/ou stimuler l’homéostasie cutanée et/ou le renouvellement épidermique et/ou la régénération cutanée et/ou l’intégrité de la peau, et/ou prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment la perte de fermeté, la perte d’élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse, la perte de tonicité, l’altération de la fonction barrière de la peau et/ou l’apparition de rides et/ou ridules.
Par « favoriser et/ou stimuler l’homéostasie cutanée », on entend on entend notamment que le miel de forêt d’Ikaria est destiné à maintenir les équilibres fonctionnels de la peau et/ou des lèvres pour en préserver son fonctionnement optimal normal.
Par « favoriser et/ou stimuler le renouvellement épidermique » on entend que l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est destiné à promouvoir la différenciation kératinocytaire.
Par « favoriser et/ou stimuler la régénération cutanée », on entend notamment que l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est destiné à promouvoir le renouvellement et le développement cellulaire et tissulaire cutané, notamment de la peau et/ou des lèvres.
Par « favoriser et/ou stimuler l’intégrité de la peau », on entend notamment que l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est destiné à promouvoir l’état général de la peau, son éclat. Par « prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané » on entend notamment que l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est destiné à diminuer et/ou retarder la perte de fermeté, la perte d’élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse, la perte de tonicité et/ou l’apparition de rides et/ou ridules, qui sont associées à des modifications de la cytosquelette cellulaire (par ex. la réduction du nombre de fibres d’actine par cellule de la peau).
Par « prévenir et/ou diminuer l’altération de la fonction barrière de la peau » on entend notamment que l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est destiné à diminuer et/ou retarder des modifications de l’intégrité de la peau, qui peuvent être associés, par exemple, à des modifications des interactions entre les cellules et/ou entre des cellules et la matrice extracellulaire, susceptibles de générer une altération des différentes fonctions de la barrière cutanée (ex : mécanique, hydrique, antioxydante...).
Selon un mode particulier, ledit extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’invention ou ladite composition cosmétique en contenant est appliqué sur une peau âgée ou présentant des signes de vieillissement et/ou une peau exposée à un stress, de préférence une peau âgée ou présentant des signes de vieillissement.
Par « peau exposée à un stress », on entend que la peau est soumise à un stress d’origine endogène ou exogène, notamment un stress mécanique ou chimique susceptible d’induire des réactions cutanées non pathologiques inesthétiques - par ex. la peau est visiblement fatiguée et/ou plus sensible aux stimuli.
Les peaux et lèvres sur lesquelles sont appliquées les compositions de l’invention, sont saines, c’est-à-dire ne présentant pas de troubles ou de désordres qui relèveraient d’un état pathologique (sujets « non sains », atteints d’une pathologie).
De façon avantageuse, les compositions comprenant de l’extrait fermenté de miel d’Ikaria employées dans le cadre du procédé cosmétique de l’invention sont celles décrites ci-dessus.
Utilisation de l’extrait fermenté de miel d’Ikaria
Un autre objet de l’invention porte sur l’utilisation cosmétique de l’extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’invention pour une application topique sur les matières kératiniques, en particulier la peau et/ou les lèvres et notamment de la peau du visage et/ou du cou, en tant qu’actif cosmétique destiné à favoriser et/ou stimuler l’homéostasie cutanée et/ou le renouvellement épidermique et/ou la régénération cutanée et/ou l’intégrité de la peau, et/ou prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment la perte de fermeté, la perte d’élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse, la perte de tonicité, l’altération de la fonction barrière de la peau et/ou l’apparition de rides et/ou ridules.
Exemples
L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Les % sont exprimés en poids de matière première par rapport au poids total de la composition, sauf indication contraire.
Exemple 1 : Procédé de fermentation du miel d’Ikaria
Matériel et méthodes
Matériel source
Le Miel d’Ikaria utilisé dans le procédé de fermentation ci-après est un miel provenant de l’île grecque d’Ikaria.
Les micro-organismes faisant partie du consortium comprennent :
- au moins une bactérie lactique appartenant au genre Lactobacillus ou Pediococcus,
- au moins une levure appartenant au genre Saccharomyces, Schyzosaccharomyces ou Torulaspora, et
- au moins une bactérie acétique appartenant au genre Acetobacter, Gluconobacter ou Komagataeibacter.
Procédé de fermentation
Une fermentation du miel d’Ikaria a été effectué selon le procédé suivant : a) incubation d’un consortium de micro-organismes dans une solution comprenant un glucide à 26° C pendant 3 à 4 jours afin d’obtenir une culture ; b) ajout de la culture obtenue à l’étape a) à une concentration de 5 % en poids à un milieu fermentaire comprenant de l’eau déchloré et du miel d’Ikaria à une teneur en poids de 75 g/kg d’eau à 35°C afin d’obtenir un mélange de fermentation ; c) incubation du mélange de fermentation obtenu à l’étape b) dans un fermenteur à 26°C pendant 10 jours, et à 40 % d’humidité ; d) filtration du mélange de fermentation sur un filtre de cellulose ayant une taille moyenne de pores de 0,2 pm, et, e) ajout du propanediol à l’extrait fermenté de miel d’Ikaria à une concentration finale de 30 % en poids par rapport au poids total. On obtient un extrait de miel fermenté d’Ikaria sous la forme d’une solution à 3,2 % en poids de matière active de miel fermenté, 30 % de propanediol et 66,8 % d’eau.
L’effet de cet extrait va être illustré dans les exemples suivants.
Exemple 2 : Caractérisation de l’extrait fermenté de miel d’Ikaria
Matériel et méthodes
Quantification des acides organiques par analyse HPLC
L’analyse a été réalisée sur une HPLC agilent 1260 couplée au spectromètre de masse MSD iQ.
Les paramètres dans la méthode d’acquisition citée ci-dessus sont les suivants :
Volume d’injection : 5 pL Température : 30° C
Colonne : Phenomenex Hydro-RP 150x4, 6mm 4pm (n°8)
Solvants :
Isocratique 100 % A : H2O + 0,1% acide formique Débit : 0,400mL/min Durée d’analyse 25 min
RMN
Fractionnement par Chromatographie de Partage Centrifuge (CPC)
L’extrait préalablement lyophilisé dans un mélange phase stationnaire phase mobile, est injecté en CPC dans une colonne préalablement équilibrée (FCPE300® (Rousselet Robatel Kromaton)). Le taux de débit a été de 20mL/min et la vitesse de rotation de la colonne de 1200 rpm. Le système de solvant à deux phases correspond à l’acétate d’éthyle/acétonitrile/eau (3/3/4, v/v). La phase stationnaire correspond à la phase inférieure du système de solvants à deux phases (mode ascendant) alors que la phase mobile correspond à phase supérieure du système de solvants à deux phases.
Des fractions de 20 ml ont été collectées pendant toute l’expérience (élution et extrusion) et combinées selon leurs profils de chromatographie sur couche mince. 8 fractions ont ainsi été obtenues.
Identification des principaux métabolites Un aliquot de chaque fraction de F1 à F08 a été dissoute dans du DMSO-d6 et analysée par RMN 13C à 298 K sur un spectromètre Bruker Avance AVIII-600 (Karlsruhe, Allemagne) équipé d'une cryosonde. Après le traitement des spectres, les intensités absolues de tous les signaux RMN 13C ont été automatiquement collectées et regroupées sur les spectres des séries de fractions en utilisant un script informatique développé par Natexplore. Le tableau résultant a été soumis à une analyse de regroupement hiérarchique (PermutMatrix, 1.9.3, LIRMM, Montpellier, France). Les grappes de déplacement chimique RMN 13C résultantes ont été visualisées sous forme de dendrogrammes sur une carte bidimensionnelle. Pour l'identification des métabolites, chaque grappe de décalage chimique RMN 13C obtenue par HCA a été manuellement soumise au moteur de recherche de structure du logiciel de gestion de base de données ACD/NMR Workbook Suite 2012 (ACD/Labs, Ontario, Canada) comprenant les structures et les décalages chimiques prévus des produits naturels de faible poids moléculaire. Des expériences de RMN 2D (HSQC, HMBC et COSY) ont été réalisées sur des fractions contenant des composés supposés identifiés afin de confirmer les structures moléculaires proposées par la base de données à la fin du processus de déréplication.
LC-HRMS
L’extrait est évaporé puis dissous dans l'eau et soumis à une extraction liquide-liquide. Les solvants d'extraction étaient de l’acétate d’éthyle/dichlorométhane (8:2, v/v).
L'analyse LC-HRMS des fractions organiques a été réalisée en utilisant un système Accela de chromatographie liquide à ultra-haute performance (UHPLC) relié à un spectromètre de masse hybride LTQ-Orbitrap Discovery XL (Thermo Scientific, Brehmen, Allemagne), équipé d'une source d'ionisation par électrospray (ESI).
Résultats
Le procédé de fermentation génère un extrait fermenté de miel d’Ikaria ayant une composition très différente du miel d’Ikaria non fermenté.
En particulier, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria comprend différents acides organiques, comme illustré dans le Tableau 1 ci-dessous. L’acide glucuronique, l’acide propionique et l’acide tartrique n’ont pas été détectés, ni dans le miel d’Ikaria non-fermenté ni dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria. Tableau 1 : Acides organiques présentes dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria par rapport au miel non-fermenté (en us par rapport au g d’extrait sec).
[Table 11
Figure imgf000023_0001
nd : non détecté Les sucres ont été quantifiés par dosage enzymatique selon la technique d’Eurofins. Une diminution importante est observée dans la teneur en sucres dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria par rapport au miel d’Ikaria non fermenté, comme l’illustre le Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 : Quantité de sucres dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria par rapport au miel d’Ikaria non-fermenté (en g/kg de matière première) [Table 2]
Figure imgf000023_0002
On observe également une diminution de la teneur en polyphénols totaux dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria (0,0331 %), par rapport à l’extrait de miel d’Ikaria non fermenté (0,6201 %). L’analyse des métabolites secondaires fait par LC-HRMS démontre également des différences entre le miel d’Ikaria non fermenté et l’extrait fermenté, comme l’illustre le Tableau ci-dessous. Tableau 3 : Présence ou absence des métabolites secondaires dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria par rapport au miel d’Ikaria non-fermenté
[Table 3]
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
nd : non détecté
Enfin, l’étude RMN a permis d’identifier les métabolites suivants dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria : Acide succinique (CAS 110-15-6) ; Mannono-1 ,4-lactone (CAS 22430-23-5) ; Acide shikimique (CAS 138-59-0) ; Dihydroxyacétone (CAS 96-26-4) ; Acide lactique (CAS 50- 21 -5) ; Acide 2-hydroxyglutarique (CAS 2889-31 -8) ; Acide hydroxyméthyl glutarique (CAS 503-49-1 ) ; Acide 3-hydroxypropanoïque (CAS 503-66-2) ; Acide phénylacétique (CAS 103-82- 2) ; Acide 4-hydroxyphénylacetique (CAS 156-38-7) ; Tyrosol (CAS 501 -94-0) ; p- hydroxybenzaldéhyde (CAS 123-08-0) ; 1 -(4-méthoxyphényl)-1 ,2-éthanediol (CAS 13603-63- 9) ; Caféine (CAS 58-08-2) ; Mévalonolactone (CAS 674-26-0) ; Acide glutarique (CAS 110-94- 1 ) ; Acide 3 -hydroxy butyrique (CAS 300-85-6) ; 1 ,2-propylène glycol (CAS 57-55-6) ; Acide glycolique (CAS 79-14-1 ) ; a-D-glucose (CAS 492-62-6) ; b-D-glucose (CAS 492-61 -5) ; a-D- fructofuranose (CAS 10489-79-9) ; b-D-fructofuranose (CAS 470-23-5) ; 6-D-fructopyranose (CAS 7660-25-5).
Exemple 3 : Caractérisation de l’activité de l’extrait fermenté de miel d’Ikaria Matériel et méthodes
Des fibroblastes primaires dermiques humains ont été ensemencés dans une plaque 96 puits dans laquelle des micro-motifs fluorescents en forme de « L » ont été photolithographiés (plaque de type « CTYOOplate™ » contenant « X-Large fluorescent L micropatterns »). Les cellules sont cultivées en environnement contrôlé à 37° C et 5 % de CO2.
Les cellules sont laissées dans du milieu de culture pendant 4h afin qu’elles adhèrent et s’étirent sur les micro-motifs avant traitement. Ensuite, le milieu de culture a été remplacé par du milieu de culture complémenté avec l’extrait fermenté d miel fermenté d’Ikaria à une concentration finale de 0,1 %. Le traitement a été appliqué pendant 16h. Du milieu de culture sans ingrédient supplémentaire est ajouté à certains puits et représente donc le témoin contrôle.
Ensuite, les cellules ont été fixées avec du formol, perméabilisées avec un tampon contenant de la saponine, et marquées par Hoechst (pour les noyaux) et phalloidine (pour la F-actine). Des images des cellules ont été acquises en utilisant l’instrument Operetta à un grossissement 20X avec 3 canaux (pour les micro-motifs, les noyaux, et la F-actine).
Les images ont ensuite été analysées afin de déterminer les caractéristiques suivantes des cellules appartenant à chaque groupe de traitement :
Ratio d’étirement (ou « stretching ratio ) : ratio entre la superficie cellulaire et l’enveloppe convexe de la cellule sur le micro-motif ;
Rayon de courbure : rayon de courbure de l’hypoténuse d’une cellule entre les deux extrémités du micro-motif en forme de « L » ;
Nombre de fibres de F-actine par cellule ;
Longueur moyenne totale des fibres de F-actine du réseau cellulaire (somme des longueurs des fibres de F-actine dans une cellule) ;
Longueur moyenne d’une fibre de F-actine par cellule (somme des longueurs des fibres de F-actine dans une cellule/le nombre de fibres présentes).
Entre 56 et 116 cellules ont été détectées par puits. Les données brutes ont été moyennées utilisant 5 réplicats de puits. Les résultats des différents traitements sont exprimés en pourcentage par rapport au témoin négatif (cellules non-traitées). Les résultats obtenus pour les cellules traitées ont été comparées aux résultats obtenus pour le témoin négatif par le t-test de Welch (* p<0,05, ** p<0,01 , *** p<0,001 ).
Résultats
Les fibroblastes dermiques humains sont des cellules ayant une grande capacité de contraction, qui peuvent facilement s’étirer sur des micro-motifs en forme de L en formant un réseau de fibres d’actine, comme l’illustre la Figure 1 (voir la condition (1 ), correspondant à une cellule n’ayant pas subi de traitement particulier).
Lorsque les cellules étirées sont traitées avec le TGF-b, connu pour induire la contraction cellulaire par le renforcement du cytosquelette d’actine, on observe un renforcement dans le réseau d’actine par rapport au témoin négatif comme l’illustre la Figure 1 (compare les conditions (1 ) et (2)). À titre d’exemple, le rayon de courbure des cellules traitées avec du TGF-b est augmenté de 36% (+36 %, p<0,001 ) tout comme le ratio d’étirement. Le nombre de fibres de F-actine par cellule est également augmenté (+43 %, p<0,001 ), ainsi que la longueur totale des fibres (+47 %, p<0,001 ) (données non illustrées).
Par contraste, le traitement par la cytochalasine D, connu pour son activité inhibitrice sur la polymérisation de l’actine, provoque un effondrement des cellules sur les micro-motifs comme l’illustre la Figure 1 (compare les conditions (1 ) et (3)) et la détection de très peu de fragments d’actine. Aussi, le rayon de courbure est réduit de 66 % (-66 %, p<0,001 ) tout comme le ratio d’étirement. Enfin, on observe également une réduction dans le nombre de fibres de F-actine par cellule (-31 %, p<0,001 ) et la longueur totale des fibres (-46 %, p<0,001 ) (données non illustrées).
Ainsi, les effets des traitements TGF-6 et cytochalasine D sur les fibroblastes dermiques humains démontrent que des effets contractiles/relaxants peuvent être détectés de façon sensible et robuste dans ce modèle de micro-motifs.
Lorsque les fibroblastes sont traités avec l’extrait fermenté de miel d’Ikaria, on observe une activité sur le réseau d’actine, comprenant une augmentation du nombre de fibres de F- actine (Figure 1 , compare les conditions (1) et (4)). Par ailleurs, le rayon de courbure des cellules traitées avec l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est augmenté de 33 % (+33 %, p<0,01 , voir la Figure 2 B) tout comme le ratio d’étirement (p<0,001 , voir la Figure 2 A) par rapport aux cellules non-traitées, démontrant l’augmentation de la contraction cellulaire induit par le cytosquelette. De façon notable, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria a un effet sur l’étirement des cellules quasi-identique au TGF-6.
En ce qui concerne les fibres d’actine elles-mêmes, les inventeurs ont observé une augmentation dans leur nombre par cellule (+25 %, p<0,05, voir la Figure 3 A), une diminution dans le longueur moyenne par fibre (p<0,01 , voir la Figure 3 B), et une augmentation de la somme des longueurs de toutes les fibres par cellule (+29 %, p<0,001 , voir la Figure 3 C), révélant la stimulation, la mise en tension et la réorganisation du cytosquelette.
Exemple 4 : Évaluation de l’effet de l’extrait fermenté de miel d’Ikaria sur les forces contractiles des fibroblastes
L’effet de l’extrait fermenté de miel d’Ikaria sur les forces contractiles des fibroblastes humains a été étudié.
Matériel et méthodes
Préparation et traitement des fibroblastes
Les fibroblastes primaires humains ont été cultivés en flacon T75 jusqu’à ce qu’ils soient confluents à 90 %. Ensuite, une trypsinisation est réalisée afin de transférer les cellules du flacon vers des boîtes de Pétri 33 mm préalablement coatées avec du collagène de type I (15pL/cm2). Les cellules ont été ensemencées à hauteur de 2 000 cellules par boîte de Pétri. Les cellules sont laissées dans le milieu de culture pendant 24h, en environnement contrôlé à 37° C et 5 % de CO2, afin qu’elles adhèrent à leur matrice et qu’elles se stabilisent dans leur environnement avant le traitement. Ensuite, le milieu de culture a été remplacé par du milieu de culture complémenté avec le témoin ou l’ingrédient actif : soit du TGF-B (témoin positif) à une concentration finale de 10 ng/mL soit l’extrait fermenté de miel d’Ikaria à une concentration finale de 0,1 %.
Le traitement a été appliqué pendant 48h. Ensuite, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4 % pendant 15 minutes. Les fibroblastes ont été maintenus dans du PBS 1X à 4°C avant mesure immédiate par Microscopie de Force Atomique.
Mesure par Microscopie de Force Atomique (MFA)
Les mesures ont été effectuées par Microscopie de Force Atomique (MFA) au moyen d’un Bioscope Résolve- Bruker® sur lequel est monté un microscope épifluorescence (Leica DM18) pour corréler la mesure mécanique au signal fluorescent.
Le mode PeakForce® QNM (Quantitative Nanomechanical Mapping) Fluid et le mode Force- Volume ont été utilisés pour cette étude. La pointe MFA sélectionnée avait une constante de raideur théorique de 0,35 N/m et la pointe pyramidale avait un rayon de courbure <10nm. Avant chaque expérience, la sensibilité de déflexion du levier est calibrée sur du Saphir et sa constante de raideur est également calibrée par la méthode du bruit thermique (en anglais, le « thermal noise method »).
Une analyse MFA complète consiste en l’acquisition de force-volume (FV) sur la zone d’intérêt (prolongement cytoplasmique des fibroblastes) en milieu liquide (PBS 1X). Un FV consiste en l’acquisition de 16384 courbes de force-indentation (force appliquée 50 nN) sur une superficie de 50x50 pm, soit un point de mesure tous les 500 nm autour des prolongements du fibroblaste. 15 fibroblastes ont été mesurés par condition (5 fibroblastes sélectionnées au hasard par boite, 3 boites).
Analyse des courbes
Les quantifications du module élastique à partir des courbes de force brutes sont réalisées à l’aide du logiciel de traitement BioMeca Analysis®.
Dans cette étude, le module élastique (Ea) a été extrait au niveau des prolongements cytoplasmiques des fibroblastes. Il est exprimé en KiloPascal (KPa). Cette extraction précise permet de quantifier les forces contractiles exercées par le fibroblaste sur la matrice de collagène environnante.
La quantification du Ea, qui se fait par l’application du modèle de Sneddon sur chaque courbe à partir du point de contact jusqu’à 50 % de la force appliquée, est présentée dans la Figure 4. Les pourcentages d’augmentation des forces contractiles sont calculés par rapport à la moyenne de chaque condition.
Résultats
De façon surprenante, les inventeurs ont observé une évolution des forces contractiles des fibroblastes après l’application des traitements par rapport au témoin non-traité. Comme attendu, la force contractile des fibroblastes a été augmentée par le traitement avec le TGF-B (contrôle positif) d’environ 8 %. La force contractile des fibroblastes traités avec l’extrait fermenté de miel d’Ikaria a également été largement augmentée, et est environ 2- fois supérieure à l’effet observé pour le TFG-6 (soit environ 17,6 %) (données non démontrées).
Exemple 5 : Effet du miel d’Ikaria sur la synthèse intracellulaire d’ATP dans les fibroblastes humains normaux
Objectif de l’étude
L'objectif de cette étude était de comparer les effets du miel d’Ikaria non fermenté et du miel d’Ikaria fermenté sur la production d’énergie cellulaire en évaluant la synthèse intracellulaire d’ATP dans les fibroblastes humains normaux.
Extraits évalués
1 - Miel d’Ikaria : il s’agit d’un miel provenant d’abeilles grecques ( Apis mellifera cecropia), récolté sur l’île grecque d’Ikaria.
2- Miel d’Ikaria fermenté : il s’agit d’un extrait fermenté de miel préparé selon le procédé décrit à l’Exemple 1 ci-dessus à partir d’un miel provenant d’abeilles grecques ( Apis mellifera cecropia), récolté sur l’île grecque d’Ikaria.
Culture cellulaire Les cellules utilisées pour cette étude étaient des Fibroblastes Humain Normaux. Les Fibroblastes ont été ensemencés dans des boites de pétri de 100mm à une densité de 26 000 cellules par cm2 en milieu DMEM (+10% de SVF), puis cultivées dans des conditions classiques (incubateur à 37° C, 5% de C02) en vue des expérimentations.
Chaque extrait a été évalué à la concentration de 0,01% (% poids de matière active) dilué dans le milieu de culture, pour une durée de 24 heures.
La condition contrôle correspond au milieu de culture seul (non traité).
Quantification de la synthèse intracellulaire d’ATP
Après l’incubation, le réactif CellTiter-Glo a été ajouté dans chaque puits selon les instructions du fournisseur (Kit Promega : CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay). La luminescence a ensuite été enregistrée par le spectrophotomètre FluoStar Oméga BMG Labtech à 485-520 nm et les résultats ont été analysés avec un logiciel spécifique de luminescence.
Le test de viabilité cellulaire luminescent CellTiter-Glo® détermine le nombre de cellules viables en culture en se basant sur la quantification de l'ATP présent qui est un indicateur des cellules métaboliquement actives. Ce test comprend l’ajout, directement dans le milieu de culture cellulaire, d’un unique réactif entraînant la lyse des cellules, générant ainsi un signal luminescent proportionnel à la quantité d'ATP présente.
Le test CellTiter-Glo® s'appuie sur les propriétés d'une luciférase thermostable : « Ultra- Glo™ Recombinant Luciferase », qui génère un signal luminescent stable selon la réaction suivante :
ATP + luciférine + 02 oxyluciférine + AMP + PPi + C02 + lumière.
Les résultats reportés sur la figure 5 correspondent à la moyenne de la fluorescence quantifiée normalisée à la quantité totale de protéines ± ESM (Erreur Standard de la Moyenne) (intervalle de confiance de 95%). La comparaison entre les conditions de contrôle et les conditions traitées a été faite en effectuant un test t de Student apparié où toute différence a été considérée comme significative à p<0,05 (*p<0,05, **p<0,01 , ***p<0,001 ).
Résultats Dans les conditions expérimentales de cette étude et testé à la concentration de 0.01% (% poids de matière active), le miel d'Ikaria fermenté et le miel d'Ikaria non fermenté ont présenté une augmentation significative de la production d'ATP (+ 27 % et + 15 %, respectivement par rapport à la condition de contrôle).
Ces résultats montrent donc que le miel d'Ikaria fermenté selon l’invention est plus efficace que le miel d'Ikaria non fermenté pour déclencher la production d'ATP dans les fibroblastes humains normaux. En effet, le miel d'Ikaria fermenté semble potentialiser la synthèse intracellulaire d'ATP faisant du miel fermenté une meilleure alternative dans la formulation de cosmétiques pour stimuler les actions énergétiques cellulaires.
L’ATP est une molécule clef de l’énergie cellulaire, elle est essentielle à la survie des cellules et impliquée dans de très nombreuses voies de signalisation ainsi que dans de nombreux mécanismes cellulaires. L’ATP est notamment indispensable à la polymérisation des filaments d’actine cytoplasmique, et est donc impliquée dans le maintien de la morphologie et l'architecture des cellules de la peau. A travers ses nombreuses fonctions cellulaires l’ATP joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie et de la qualité de la peau. En particulier, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’invention favorise la tenségrité des fibroblastes et aide à maintenir la fermeté de la peau.
Exemple 6 : Formulations cosmétiques
6.1. Composition sous la forme d’une crème riche [Table 4]
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0002
‘préparé selon l’exemple 1 La composition est préparée selon le mode opératoire suivant :
La glycérine et l’eau sont mélangés sous agitation jusqu’à homogénéité. Les gélifiants acrylates/C10-30 alkyl acrylate crosspolymer et gomme xanthane sont dispersés sous agitation turbulente.
Cette phase est chauffée à 80° C et l’ensemble cetyl alcool/glyceryl stéarate/ PEG- 75/ceteth/steareth-2 ; C10-C18 triglycérides, hydrogenated coco-glycerides, cetyl alcohol et hydrogenated polyisobutene préalablement chauffé à 80° C est ajouté et l’ensemble est émulsionné sous forte agitation. À 60 °C, le couple acide citrique/ citrate trisodique et le neutralisant sont additionnés, puis les poudres sont ajoutées. A la température de 35° C, le miel fermenté d’Ikaria préparé selon l’exemple 1 et la gelée royale sont ajoutés avant le parfum. Appliquée sur la peau, en particulier sur le visage, seule ou à la suite de l’application d’un sérum, cette composition apporte une action anti-âge avec des effets bénéfiques sur la fermeté et/ou l’élasticité de la peau. 6.2. Composition sous la forme d’un sérum
[Table 5]
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
‘préparé selon l’exemple 1
Le sérum est appliqué sur l’ensemble du visage et en particulier sur les zones présentant des signes de vieillissement. La peau est plus souple, plus ferme et plus tonique.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Extrait fermenté de miel d’Ikaria comprenant :
- une teneur en acide lactique comprise entre 0,01 et 0,08 %,
- une teneur en acide pyruvique comprise entre 0,05 et 0,5 %, et
- une teneur en acide acétique comprise entre 1 et 20 %, en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté.
2. Extrait fermenté de miel d’Ikaria selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu’il comprend en outre au moins l’un des composés suivants : l’acide succinique, l’acide 2-hydroxyhépanoique, le syringaldéhyde, l’acide malique 2-isopropyle, la catéchine, le gallate d’epigallocatéchine, l’acide syringique, le picéide, l’acide cinnamique, le protocatéchuicaldéhyde, la quercétine, et leurs mélanges.
3. Extrait fermenté de miel d’Ikaria selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu’il comprend au moins un conservateur, de préférence choisi parmi le propanediol, la glycérine, le butylène glycol, plus préférentiellement le propanediol.
4. Procédé de fermentation de miel d’Ikaria comprenant les étapes suivantes : a) incubation d’un consortium de micro-organismes dans une solution comprenant un glucide pendant 1 à 10 jours à 17 à 38° C afin d’obtenir une culture de micro-organismes, ledit consortium comprenant au moins une bactérie lactique appartenant au genre Lactobacillus ou Pediococcus, au moins une levure appartenant au genre Saccharomyces, Schyzosaccharomyces ou Torulaspora, et au moins une bactérie acétique appartenant au genre Acetobacter, Gluconobacter ou Komagataeibacter ; b) ajout de la culture obtenue à l’étape a) dans un milieu fermentaire comprenant du miel d’Ikaria à une teneur en poids de 20 à 300 g/kg d’eau afin d’obtenir un mélange de fermentation, ladite culture étant ajoutée à une concentration comprise entre 0,5 et 15 % en poids par rapport au poids total du mélange de fermentation ; c) incubation du mélange de fermentation obtenu à l’étape b) à une température comprise entre 25 et 35° C pendant 10 à 15 jours ; d) filtration du mélange de fermentation, afin d’obtenir un extrait fermenté de miel d’Ikaria, et optionnellement, e) ajout d’au moins un conservateur, de préférence choisi parmi le propanediol, la glycérine, le butylène glycol, plus préférentiellement le propanediol, à l’extrait fermenté de miel d’Ikaria à une concentration finale de 25 à 50 % en poids par rapport au poids total.
5. Extrait fermenté de miel d’Ikaria obtenu par le procédé selon la revendication 4.
6. Extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou 5, caractérisé en ce qu’il est sous la forme d’une solution comprenant 3 à 4 % en poids de matière active d’extrait fermenté de miel d’Ikaria, 30 à 35 % en poids de propanediol et 60 à 70 % en poids d’eau.
7. Composition cosmétique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, un extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’une quelconque des revendication 1 à 3, 5 ou 6.
8. Composition cosmétique selon la revendication 7, caractérisée en que l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est présent en une teneur allant de 0,0000032% à 0,64 %, de préférence de 0,00032 % à 0,032 %, plus préférentiellement de 0,0032% à 0,016% en poids de matière active (matière sèche d’extrait fermenté de miel) par rapport au poids total de la composition.
9. Composition cosmétique selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre au moins un adjuvant cosmétique choisi dans le groupe constitué par des agents antioxydants, des agents émollients, des agents hydratants, des agents anti-âge, des parfums, et leurs mélanges.
10. Composition cosmétique selon l’une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisée en ce qu’elle est sous la forme d’une crème, émulsion huile-dans-eau, ou eau-dans-huile ou émulsion multiple, solution, suspension, gel, lait, lotion, ou sérum.
11. Procédé cosmétique de soin et/ou maquillage des matières kératiniques, en particulier de la peau et/ou des lèvres, comprenant l’application sur lesdites matières kératiniques, d’au moins une couche d’une composition cosmétique telle que définie dans l’une quelconque des revendications 7 à 10.
12. Procédé cosmétique selon la revendication 11 , caractérisé en ce qu’il est destiné à favoriser et/ou stimuler l’homéostasie cutanée et/ou le renouvellement épidermique et/ou la régénération cutanée et/ou l’intégrité de la peau, et/ou prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment la perte de fermeté, la perte d’élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse, la perte de tonicité, l’altération de la fonction barrière de la peau et/ou l’apparition de rides et/ou ridules.
13. Utilisation cosmétique d’un extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, 5 ou 6, comme actif pour favoriser et/ou stimuler l’homéostasie cutanée et/ou le renouvellement épidermique et/ou la régénération cutanée et/ou l’intégrité de la peau, et/ou prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment la perte de fermeté, la perte d’élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse, la perte de tonicité, l’altération de la fonction barrière de la peau et/ou l’apparition de rides et/ou ridules.
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